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Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation

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DOI:

10.3791/66522

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14. Juni 2024

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir einige etablierte Methoden zur Bestimmung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort (UPR), mit besonderem Schwerpunkt auf HIV-1-Infektionen. In diesem Artikel wird auch eine Reihe von Protokollen beschrieben, um die Auswirkungen von ER-Stress/UPR auf die HIV-1-Replikation und die Infektiosität der Virionen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Virusinfektionen können aufgrund einer abnormalen Proteinakkumulation Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) verursachen, was zu einer ungefalteten Proteinantwort (UPR) führt. Viren haben Strategien entwickelt, um die UPR des Wirts zu manipulieren, aber es fehlt in der Literatur an einem detaillierten Verständnis der UPR-Modulation und ihrer funktionellen Bedeutung während einer HIV-1-Infektion. In diesem Zusammenhang beschreibt der vorliegende Artikel die in unserem Labor verwendeten Protokolle zur Messung des ER-Stressniveaus und der UPR während einer HIV-1-Infektion in T-Zellen sowie die Wirkung der UPR auf die Virusreplikation und Infektiosität.

Die Thioflavin-T-Färbung (ThT) ist eine relativ neue Methode, die zum Nachweis von ER-Stress in den Zellen durch den Nachweis von Proteinaggregaten verwendet wird. Hier haben wir das Protokoll für die ThT-Färbung in HIV-1-infizierten Zellen zum Nachweis und zur Quantifizierung von ER-Stress veranschaulicht. Darüber hinaus wurde ER-Stress auch indirekt nachgewiesen, indem die Spiegel von UPR-Markern wie BiP, phosphoryliertem IRE1, PERK und eIF2α, das Spleißen von XBP1, die Spaltung von ATF6, ATF4, CHOP und GADD34 in HIV-1-infizierten Zellen unter Verwendung von konventionellem Immunblotting und quantitativer reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gemessen wurden. Wir haben festgestellt, dass die ThT-Fluoreszenz mit den Indikatoren der UPR-Aktivierung korreliert. In diesem Artikel werden auch die Protokolle zur Analyse des Einflusses von ER-Stress und UPR-Modulation auf die HIV-1-Replikation durch Knockdown-Experimente sowie die Verwendung pharmakologischer Moleküle vorgestellt. Die Wirkung von UPR auf die HIV-1-Genexpression/-replikation und die Virusproduktion wurde mittels Luciferase-Reporterassays bzw. p24-Antigen-Capture-ELISA analysiert, während die Wirkung auf die Infektiosität der Virionen durch Färbung infizierter Reporterzellen analysiert wurde. Insgesamt bietet dieser Methodensatz ein umfassendes Verständnis der entfalteten Proteinantwortwege während einer HIV-1-Infektion und enthüllt seine komplizierte Dynamik.

Einleitung

Das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) ist gekennzeichnet durch eine allmähliche Verringerung der Anzahl der CD4+ T-Lymphozyten, was zu einem fortschreitenden Versagen der Immunantwort führt. Das humane Immundefizienz-Virus-1 (HIV-1) ist der Erreger von AIDS. Es handelt sich um ein umhülltes, einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn und zwei RNA-Kopien pro Virion und gehört zur Familie der Retroviridae. Die Produktion hoher Konzentrationen viraler Proteine in der Wirtszelle belastet die Proteinfaltungsmaschinerie der Zelleübermäßig 1. ER ist das erste Kompartiment im sekretorischen Weg eukaryotischer Zellen. Es ist verantwortlich für die Produktion, Veränderung und Abgabe von Proteinen an den sekretorischen Weg und die Zielstellen im extrazellulären Raum. Proteine durchlaufen zahlreiche posttranslationale Veränderungen und falten sich im ER in ihre natürliche Konformation, einschließlich der Asparagin-gebundenen Glykosylierung und der Bildung intra- und intermolekularer Disulfidbindungen2. Daher sind hohe Konzentrationen von Proteinen im ER-Lumen vorhanden, die sehr anfällig für Aggregation und Fehlfaltung sind. Verschiedene physiologische Zustände wie Hitzeschock, mikrobielle oder virale Infektionen, die eine verstärkte Proteinsynthese oder Proteinmutation erfordern, führen aufgrund einer erhöhten Proteinakkumulation im ER zu ER-Stress, wodurch die ER-Lumen-Homöostase gestört wird. Der ER-Stress aktiviert ein Netzwerk von hochkonservierten adaptiven Signaltransduktionswegen, die Unfolded Protein Response (UPR)3. UPR wird eingesetzt, um den normalen physiologischen Zustand des ER wiederherzustellen, indem seine entfaltete Proteinlast und Faltungskapazität aufeinander abgestimmt werden. Dies wird durch die Erhöhung der ER-Größe und der ER-residenten molekularen Chaperone und Foldasen erreicht, was zu einer Erhöhung der Faltungsfähigkeit des ER führt. UPR verringert auch die Proteinlast des ER durch globale Proteinsynthese-Dämpfung auf translationaler Ebene und erhöht die Clearance von ungefalteten Proteinen aus dem ER durch Hochregulierung des ER-assoziierten Abbaus (ERAD)4,5.

ER-Stress wird von drei ER-residenten Transmembranproteinen wahrgenommen: Proteinkinase R (PKR)-ähnliche endoplasmatische Retikulumkinase (PERK), aktivierender Transkriptionsfaktor 6 (ATF6) und Inositol-erforderndes Enzym Typ 1 (IRE1). Alle diese Effektoren werden inaktiv gehalten, indem sie an das Chaperon Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 (HSPA5) binden, das auch als Bindungsprotein (BiP)/78-kDa-glukosereguliertes Protein (GRP78) bekannt ist. Bei ER-Stress und Akkumulation von ungefalteten/fehlgefalteten Proteinen dissoziiert HSPA5 und führt zur Aktivierung dieser Effektoren, die dann eine Reihe von nachgeschalteten Zielen aktivieren, die bei der Auflösung des ER-Stresses helfen und unter extremen Bedingungen den Zelltod fördern6. Nach der Dissoziation von HSPA5 autophosphoryliert PERK, und seine Kinaseaktivität wird aktiviert7. Seine Kinaseaktivität phosphoryliert eIF2α, was zu einer translationalen Abschwächung führt und die Proteinlast des ER8 senkt. In Gegenwart des phospho-eukaryotischen Initiationsfaktors 2α (eIF2α) werden jedoch nicht-translatierte offene Leserahmen auf spezifischen mRNAs, wie z. B. ATF4, bevorzugt translatiert und regulieren stressinduzierte Gene. ATF4 und C/EBP homologes Protein (CHOP) sind Transkriptionsfaktoren, die stressinduzierte Gene regulieren und die Apoptose und den Zelltod regulieren 9,10. Eines der Ziele von ATF4 und CHOP ist das Wachstumsarrest und DNA-Schadens-induzierbare Protein (GADD34), das zusammen mit der Proteinphosphatase 1 peIF2α dephosphoryliert und als Rückkopplungsregulator für die translationale Dämpfung fungiert11. Unter ER-Stress dissoziiert ATF6 von HSPA5 und sein Golgi-Lokalisierungssignal wird exponiert, was zu seiner Translokation in den Golgi-Apparat führt. Im Golgi-Apparat wird ATF6 durch die Protease an Stelle 1 (S1P) und an der Protease an Stelle 2 (S2P) gespalten, um die gespaltene Form von ATF6 (ATF6 P50) freizusetzen. ATF6 p50 wird dann in den Zellkern transloziert, wo es die Expression von Genen induziert, die an der Proteinfaltung, -reifung und -sekretion sowie am Proteinabbau beteiligt sind12,13. Während ER-Stress dissoziiert IRE1 von HSPA5, multimerisiert und autophosphoryliert14. Die Phosphorylierung von IRE1 aktiviert seine RNase-Domäne und vermittelt spezifisch das Spleißen von 26 Nukleotiden aus dem zentralen Teil der mRNA des X-Box-Bindungsproteins 1 (XBP1)15,16. Dies erzeugt einen neuartigen C-Terminus, der eine Transaktivierungsfunktion verleiht, und erzeugt ein funktionelles XBP1s-Protein, einen potenten Transkriptionsfaktor, der mehrere ER-Stress-induzierte Gene steuert17,18. Die kombinierte Aktivität dieser Transkriptionsfaktoren schaltet genetische Programme ein, die darauf abzielen, die ER-Homöostase wiederherzustellen.

Es gibt verschiedene Methoden, um ER-Stress und UPR zu erkennen. Dazu gehören die herkömmlichen Methoden zur Analyse der UPR-Marker 19,20. Zu den verschiedenen unkonventionellen Methoden gehören die Messung des Redoxzustands des UPR und der Calciumverteilung im ER-Lumen sowie die Beurteilung der ER-Struktur. Die Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um zu sehen, wie stark sich das ER-Lumen als Reaktion auf ER-Stress in Zellen und Geweben vergrößert. Diese Methode ist jedoch zeitaufwändig und hängt von der Verfügbarkeit eines Elektronenmikroskops ab, das möglicherweise nicht jeder Forschungsgruppe zur Verfügung steht. Auch die Messung des Calciumflusses und des Redoxzustands des ER ist aufgrund der Verfügbarkeit von Reagenzien eine Herausforderung. Darüber hinaus sind die Ergebnisse dieser Experimente sehr empfindlich und könnten von anderen Faktoren des Zellstoffwechsels beeinflusst werden.

Eine leistungsfähige und einfache Technik zur Überwachung der UPR-Ausgänge ist die Messung der Aktivierung der verschiedenen Signalwege der UPR und wird seit Jahrzehnten in verschiedenen Stressszenarien eingesetzt. Diese herkömmlichen Methoden zur Messung der UPR-Aktivierung sind wirtschaftlich, praktikabel und liefern die Informationen in kürzerer Zeit als andere bekannte Methoden. Dazu gehören Immunblotting zur Messung der Expression von UPR-Markern auf Proteinebene, wie z. B. die Phosphorylierung von IRE1, PERK und eIF2α und die Spaltung von ATF6 durch Messung der P50-Form von ATF6 und die Proteinexpression anderer Marker wie HSPA5, gespleißtes XBP1, ATF4, CHOP und GADD34 sowie RT-PCR zur Bestimmung der mRNA-Spiegel sowie das Spleißen von XBP1-mRNA.

Dieser Artikel beschreibt eine validierte und zuverlässige Reihe von Protokollen zur Überwachung von ER-Stress und UPR-Aktivierung in HIV-1-infizierten Zellen und zur Bestimmung der funktionellen Relevanz von UPR für die HIV-1-Replikation und Infektiosität. Die Protokolle verwenden sowohl leicht verfügbare als auch kostengünstige Reagenzien und liefern überzeugende Informationen über die UPR-Ausgänge. ER-Stress ist das Ergebnis der Akkumulation von ungefalteten/fehlgefalteten Proteinen, die zur Bildung von Proteinaggregaten neigen21. Hiermit beschreiben wir eine Methode, um diese Proteinaggregate in HIV-1-infizierten Zellen nachzuweisen. Die Thioflavin-T-Färbung ist eine relativ neue Methode, die zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Proteinaggregate verwendet wird22. Beriault und Werstuck beschrieben diese Technik zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinaggregaten und damit von ER-Stress in lebenden Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass das kleine fluoreszierende Molekül Thioflavin T (ThT) selektiv an Proteinaggregate, insbesondere Amyloidfibrillen, bindet.

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von ThT zum Nachweis und zur Quantifizierung von ER-Stress in HIV-1-infizierten Zellen und korrelieren sie mit der herkömmlichen Methode zur Überwachung der UPR, indem wir die Aktivierung verschiedener Signalwege der UPR messen.

Da es auch an umfassenden Informationen über die Rolle der UPR während der HIV-1-Infektion mangelt, stellen wir eine Reihe von Protokollen zur Verfügung, um die Rolle der UPR bei der HIV-1-Replikation und der Virioninfektiösität zu verstehen. Diese Protokolle umfassen sowohl den Lentivirus-vermittelten Knockdown von UPR-Markern als auch die Behandlung mit pharmakologischen ER-Stressinduktoren. Dieser Artikel zeigt auch die Arten von Auslesungen, die zur Messung der HIV-1-Genexpression, der Virusproduktion sowie der Infektiosität der produzierten Virionen verwendet werden können, wie z. B. der Long Terminal Repeat (LTR)-basierte Luciferase-Assay, der p24-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bzw. der β-Gal-Reporterfärbe-Assay.

Unter Verwendung der meisten dieser Protokolle haben wir kürzlich über die funktionelle Bedeutung einer HIV-1-Infektion auf die UPR in T-Zellenberichtet 23, und die Ergebnisse dieses Artikels deuten auf die Zuverlässigkeit der hier beschriebenen Methoden hin. Daher stellt dieser Artikel eine Reihe von Methoden zur Verfügung, um umfassende Informationen über das Zusammenspiel von HIV-1 mit ER-Stress und UPR-Aktivierung zu erhalten.

Protokoll

HINWEIS: Bei den hier verwendeten Zelllinien handelt es sich um HEK-293T und Jurkat J6 (eine CD4+T-Zelllinie), die aus dem Cell Repository, NCCS, Pune, Indien, bezogen wurden; TZM-bl, eine von HeLa abgeleitete Zelllinie, die Kopien der β-Galactosidase- und Luciferase-Gene unter dem HIV-1-Long Terminal Repeat (LTR)-Promotor24 und CEM-GFP (einer weiteren CD4+ T-Reporterzelllinie)25 enthält, wurden aus dem NIH AIDS Repository, USA, gewonnen.

1. Vorbereitung und Lagerung von HIV-1-Virus-Vorräten

  1. HIV-1 Virus Stammaufbereitung
    HINWEIS: Es wird empfohlen, bei allen Experimenten mit HIV-1 die internationalen Richtlinien zur biologischen Sicherheit zu befolgen, wie sie im Handbuch der Weltgesundheitsorganisation (WHO) oder der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) verfügbar sind. Der Umgang mit dem Virus und alle Experimente mit dem lebenden Virus sollten nur in einer geeigneten Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, die mindestens in einem Containment-Labor der Stufe BSL2 untergebracht ist. Die Herstellung von infektiösen HIV-1-Partikeln unter Verwendung eines Calciumphosphat-Transfektionskits für Säugetiere wird in diesem Abschnitt des Protokolls beschrieben.
    1. HEK-293T-Zellen in 90-mm-Schalen mit 10 ml vollständigem (ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin) DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II Typ A2 säen und ca. 12 h in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C aufbewahren, so dass der Zusammenfluss der Zellen zwischen 50 % und 60 % liegt.
    2. Am nächsten Tag stellen Sie die Transfektionsmischung her: Bereiten Sie Lösung A vor, die 25 μg pNL4.3 (ein molekularer Klon von HIV-1) Plasmid-DNA in sterilem Puffer, 86,8 μl 2 M CaCl 2 und das restliche sterile Wasser enthält, um das endgültige Volumen von 700 μl für jede Platte zu erhalten. Bereiten Sie Lösung B mit 700 μl 2x HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS) für 1 Platte vor. Passen Sie dann die Berechnung für die Gesamtzahl der Platten an.
    3. Geben Sie nun Lösung B tropfenweise zu Lösung A, während Sie Lösung A kontinuierlich vortexen. Das Gesamtvolumen der Transfektionsmischung beträgt nun 1,4 mL für eine Platte.
      HINWEIS: Die präzise tropfenweise Zugabe von Lösung B zu Lösung A während des kontinuierlichen Vortexens führt zur Bildung perfekter Transfektionskomplexe.
    4. Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur (RT) für ca. 20 min. Geben Sie dann die Mischung langsam tropfenweise auf jede Platte mit frischen 9 ml vollständigem DMEM und geben Sie die Platten in den CO2 -Inkubator. Tauschen Sie das vorhandene Medium nach 8-10 h durch frische 10 mL vollständiges DMEM aus.
    5. Nach 24 Stunden nach dem Medienwechsel den Überstand (der die Viruspartikel enthält) von allen Platten in konischen Röhrchen sammeln. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 600 x g mit einer Tischzentrifuge mit niedriger Drehzahl (Materialtabelle), um Zellreste zu entfernen.
    6. Der Überstand wird in Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen überführt und in den Ausschwingrotor einer Ultrazentrifuge eingesetzt (Materialtabelle). Überprüfen Sie die Gewichte der Röhrchenhalter auf Gleichgewicht und stellen Sie sie bei Bedarf mit einem sterilen Medium ein.
    7. Ultrazentrifuge bei 1,41,000 x g für 2,5 h bei 4 °C. Nehmen Sie danach die Röhrchen vorsichtig heraus und dekantieren Sie den Überstand langsam in der Biosicherheitswerkbank.
    8. Fügen Sie dem Pellet (das jetzt das konzentrierte Virus ist) in jedem Röhrchen 1 ml unvollständiges RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 Medium hinzu und pipettieren Sie kräftig, um das Pellet zu entfernen.
      HINWEIS: Das Pellet nach der Ultrazentrifuge ist für das bloße Auge fast unsichtbar. Es muss also darauf geachtet werden, RPMI 1640 in die Mitte des Rohrs zu geben, damit das Pellet richtig gelöst wird.
    9. Fügen Sie anschließend 25 μl 1 M HEPES pH 7,4 zu den 1 ml Virussuspension hinzu. Aliquotieren Sie 50 μl der Suspension in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und lagern Sie sie sofort in einem -80 °C Gefrierschrank zur Langzeitlagerung.
  2. Quantifizierung der Viruskonzentration und der Infektiosität des Virions
    HINWEIS: Für die Berechnung der Infektiosität des Virus ist es wichtig, zunächst seine Konzentration zu quantifizieren, was mit dem p24 Antigen Capture ELISA erfolgt (gemäß den Anweisungen des Herstellers und wird daher hier nicht beschrieben; siehe Materialtabelle). Dieser Prozess gibt die Konzentration des Virus in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μL) des Stammes an, die dann verwendet wird, um die infektiöse Virionzahl im Stamm durch das folgende Experiment in TZM-bl-Reporterzellen26 zu identifizieren.
    1. Zählen und säen Sie 0,1 x 106 TZM-bl-Zellen in einer 24-Well-Platte mit 500 μl vollständigem DMEM für jede Vertiefung und bewahren Sie sie 10-12 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator auf.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Zellen zu 50 % bis 60 % konfluent sind, bevor Sie mit der Infektion für die Virusquantifizierung beginnen. Wechseln Sie das vorhandene Medium mit 250 μl frischem vollständigem DMEM in jede Vertiefung.
      HINWEIS: Bewahren Sie eine Positivkontrolle gut auf, um einen experimentellen Fehler auszuschließen.
    3. Berechnen Sie die Menge an Stammviren, die für Infektionen von 1 ng, 0,1 ng und 0,01 ng in Duplikaten benötigt wird. Geben Sie die entsprechende Menge Virus in die Vertiefungen und halten Sie die Platte im Inkubator 4 h lang bei 37 °C.
    4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 μl unvollständigem DMEM und fügen Sie dann 500 μl vollständiges DMEM hinzu.
    5. Fahren Sie nach 36 Stunden Medienwechsel mit dem β-Gallonen-Färbeverfahren fort.
      1. Entsorgen Sie das vorhandene Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml PBS. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 500 μl der Fixierlösung (0,25 % Glutaraldehyd in PBS) in jede Vertiefung geben und 5-7 Minuten lang bei RT in der Biosicherheitswerkbank inkubieren.
      2. Bereiten Sie die Färbelösung wie in Tabelle 1 angegeben vor. Halten Sie es von Licht fern, da X-Gal lichtempfindlich ist.
      3. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL PBS. Die Zellen mit 500 μl frisch zubereiteter Färbelösung überlagern und bei 37 °C im Dunkeln 2-18 h inkubieren.
      4. Um die Reaktion danach zu stoppen, spülen Sie die Zellen zweimal mit 500 μl 3 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in PBS und halten Sie die Zellen dann in 500 μl frischem PBS.
      5. Zählen Sie die blauen infizierten Zellen (wie in Abbildung 1A gezeigt) unter dem Mikroskop in 10-facher Vergrößerung für 5 zufällige Felder. Nehmen Sie eine durchschnittliche Zählung der 5 Felder und multiplizieren Sie diese mit dem Feldfaktor und dem Verdünnungsfaktor. Damit werden die infektiösen Virionpartikel im Virusbestand quantifiziert.
        HINWEIS: Bei einer 24-Well-Platte beträgt der Feldfaktor 75.
KomponentenPräparatErforderliches Volumen
PBSBereiten Sie 1x PBS aus einem Vorrat von 10x PBS zu14 mL
Kalium-Ferri-FerrocyanidLösen Sie 0,82 g Kaliumferricyanid und 1,06 g Kaliumferrocyanid in 25 mL 1x PBS0,75 mL
Magnesiumchlorid1 M in 1 mL von 1x PBS15 μL
X-Gal30 mg in 0,6 ml N,N-Dimethylformamid (in dunklem Zustand) auflösen0,3 mL
Gesamt = 15 mL

Tabelle 1: Liste der Komponenten, die für die β-Gal-Färbung in TZM-bl-Zellen erforderlich sind.

2. HIV-1-Infektion von T-Zelllinien

  1. Tauen Sie eine immortalisierte T-Zelllinie auf und kultivieren Sie sie. In dieser Studie wurde eine CEM-GFP-Zelllinie verwendet, die in einem vollständigen RPMI 1640-Medium kultiviert wurde, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 500 μg/ml G418 ergänzt wurde.
  2. Zählen und entnehmen Sie 2 Millionen Zellen für jeden Zeitpunkt (nicht infiziert, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h). Ernten Sie die nicht infizierten Zellen sofort, indem Sie 5 Minuten lang bei 100 x g zentrifugieren und Zelllysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % NP40, 0,5 mM NaF, 1 mM DTT), ergänzt mit Proteaseinhibitor-Cocktail, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1x Phosphatase-Inhibitor (50 μl für 1-3 Millionen Zellen) oder lysieren Sie in Trizol-Reagenz (1 mL für 1-3 Millionen Zellen) zur RNA-Isolierung (siehe Tabelle von Materialien).
  3. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL vollständigem RPMI 1640-Medium, das Polybren (5 μg/ml) bei 100 x g für 5 min bei RT enthält. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL vollständigem Medium.
    HINWEIS: Polybren ist ein kationisches Polymer, das zur Verbesserung retroviraler Infektionen in Säugetierzellen verwendet wird.
  4. Resuspendieren Sie die 8 Millionen Zellen in 1 ml Polybrene, das das vollständige Medium enthält. Berechnen Sie nun das Volumen der Virusbrühe, die für 4 Millionen Virionpartikel benötigt wird, fügen Sie die Virusbrühe hinzu und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 2 ml, indem Sie das gesamte Medium hinzufügen. Dies macht es zu einem Trägheitsmoment von 0,5.
  5. Halten Sie die Zellen im CO2 -Inkubator 4 h lang bei 37 °C, wobei alle 30-45 Minuten intermittierend geklopft wird.
  6. Nach 4 Stunden schleudern Sie die Zellen herunter und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig in der Biosicherheitswerkbank mit geeigneten Entsorgungsmethoden.
    HINWEIS: Ab diesem Schritt zentrifugieren Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min bei RT.
  7. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml unvollständigem Medium. Resuspendieren Sie die Zellen in 8 ml vollständigem Medium, was 1 Million Zellen/ml ergibt.
  8. In einer 6-Well-Gewebekulturplatte wird die gleiche Anzahl von Zellen in der erforderlichen Anzahl von Wells ausgesät und die Platte in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C gehalten.
  9. In den nächsten 4 Tagen ernten Sie die Zellen alle 24 Stunden durch Zugabe von Zelllysepuffer. Sammeln Sie auch den Überstand und geben Sie ihn sofort in den -80 °C heißen Gefrierschrank.
  10. Um zu überprüfen, ob eine Infektion stattgefunden hat, fahren Sie mit dem p24-Antigen-Capture-ELISA für alle Zeitpunkte fort. Nehmen Sie die richtigen Verdünnungen für die Zeitpunkte vor, d.h. eine niedrigere Verdünnung für die Anfangszeitpunkte und eine höhere für spätere Zeitpunkte zwischen 1:50 und 1:500. Stellen Sie die Messwerte in einer Grafik dar, die den Verlauf der Infektion darstellt (Abbildung 1B).

3. Thioflavin-T-Färbung zur Bestimmung des ER-Stresses

  1. Fixieren Sie jeweils 1 Million nicht infizierte und 0,5 MOI infizierte CEM-GFP-Zellen (72 h infizierte Zellen) mit 200 μl 4% Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei RT.
  2. Pelletieren Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min und behandeln Sie 5 Minuten lang mit 500 μl 0,1 M Glycin, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 500 μl PBS. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl PBS.
  3. Montieren Sie die Objektträger, Filterkarten und Probenkammern. Geben Sie die 100 μl resuspendierten Zellen in die Probenkammern und drehen Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 1000 x g , um die Zellen an den Objektträgern in einer Zytozentrifuge zu haften (Materialtabelle).
    HINWEIS: Nach der Zytozentrifugenzentrifugation wären nicht genügend Zellen auf dem Objektträger immobilisiert, wenn die Zellsuspension zu stark verdünnt ist. Es ist wahrscheinlich, dass die Zellen nach der Zytozentrifuge verklumpen und schlecht verteilt sind, wenn die Zellsuspension sehr konzentriert ist.
  4. Permeabilisieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit Tropfen von 0,1 % Triton-X-100 in PBS (genug, um den Bereich abzudecken, an dem die Zellen anhaften) und waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie tropfenweise PBS auftragen und das PBS mit einem Gewebe abwischen, indem Sie den Objektträger kippen.
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit 10 μl 5 μM Thioflavin T für 30 min.
    HINWEIS: Nach der Inkubation mit ThT nicht waschen.
  6. Montieren Sie die Objektträger mit 5 μl Eindeckmedium (80 % Glycerin v/v, 20 % PBS v/v und 8 mg/ml 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan [DABCO]), legen Sie Deckglas auf und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Lassen Sie die Folien trocknen.
    HINWEIS: Achten Sie bei all diesen Schritten darauf, dass die Zellen nicht austrocknen.
  7. Nehmen Sie die konfokalen Bilder von fixierten Zellen mit einer 63-fachen Glycerin-Immersionslinse an einem konfokalen Mikroskop auf (siehe Materialtabelle). Passen Sie die folgenden Anregungs- und Emissionseinstellungen an: GFP (z. B. 494 nm, Em. 519 nm) und ThT (z. B. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    HINWEIS: Jeder Fluoreszenzkanal sollte sequenziell und nicht gleichzeitig abgebildet werden, um Kanalüberlappungen zu vermeiden. GFP wurde als Hinweis auf eine HIV-1-Infektion gewertet, da CEM-GFP-Zellen GFP unter der Regulation des LTR-Promotors aufweisen, der bei einer HIV-1-Infektion feuert25.
  8. Konvertieren Sie die Fluoreszenzbilder in 8-Bit, bevor Sie sie durch Schwellenwertanalyse quantifizieren. Quantifizieren Sie die Intensität jeder Zelle manuell mit einer Software wie Image J (~50 Zellen)27. Zeichnen Sie das Diagramm mit der Intensität der einzelnen Zellen als Punkte auf der Y-Achse anhand der Kriterien für nicht infizierte und infizierte Zellen.
  9. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu demonstrieren, nehmen Sie eine Positivkontrolle, z. B. eine Thapsigargin-Behandlung (bekannter ER-Stressinduktor), in diesem Fall28. Behandeln Sie 1 Million CEM-GFP-Zellen mit jeweils 1 μl DMSO (Fahrzeugkontrolle) und 100 nM Thapsigargin für 12 Stunden.
  10. Ernten Sie die Zellen und verfahren Sie die ThT-Färbung, wie bei infizierten Proben beschrieben (Schritte 3.1-3.8).
    HINWEIS: Für diese Proben ist keine GFP-Fluoreszenz erforderlich. Daher wird in der konfokalen Mikroskopie nur die ThT-Fluoreszenz erfasst.

4. Bestimmung der Aktivierung und Expression verschiedener UPR-Marker

HINWEIS: Um die Expression von UPR-Markern zu bestimmen, werden zwei Methoden verwendet: Immunoblotting und RT-PCR. Für das Immunblotting ernten Sie die 0,5 MOI HIV-1-infizierten CEM-GFP-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion (24 h, 48 h, 72 h und 96 h nach der Infektion) und resuspendieren Sie das Zellpellet in Lysepuffer (wie in Schritt 2.2 erwähnt). Alternativ werden die Zellpellets für die RT-PCR in Trizol-Reagenz (1 mL für 1-3 Millionen Zellen) lysiert (siehe Materialtabelle). Die in Lysepuffer und Trizol-Reagenz resuspendierten Zellen können bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert werden.

  1. Immunoblotting zur Analyse von UPR-Markern.
    1. Halten Sie die resuspendierten Zellen 45 Minuten lang im Lysepuffer auf Eis mit intermittierendem Mischen mit einem Wirbel.
    2. Pelletieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 18000 x g mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie den Überstand in einer frischen Tube.
    3. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration in jeder Probe mit Bradford oder einem ähnlichen Reagenz.
    4. Nehmen Sie für jede Probe eine gleiche Proteinkonzentration und bereiten Sie die Proteinproben in Laemmli-Puffer vor (6x Puffer: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 10 % SDS, 30 % Glycerin und 0,02 % Bromphenolblau; 5 % β-Mercaptoethanol).
      HINWEIS: Für das Immunblotting wurde für jeden UPR-Marker ein Minimum von 60-80 μg Protein verwendet.
    5. Die Proteinproben bei 96 °C 5 min kochen und kurz schleudern.
    6. Lösen Sie die Proteinproben auf einem 10%-12% SDS-PAGE-Gel auf und übertragen Sie die Proteine auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (siehe Materialtabelle).
    7. Mit 5 % fettfreier Trockenmilch oder Rinderserumalbumin (BSA) für 1-2 h blockieren, zweimal mit TBST (20 mM Tris pH7,4 und 0,137 M NaCl; 0,1 % Tween 20) waschen und mit proteinspezifischen Primärantikörpern gegen UPR-Marker (siehe Materialtabelle) in einer Wippe über Nacht bei 4 °C untersuchen. Am nächsten Tag nach zweimaligem Waschen der Blots mit TBST 1,5 h lang mit den entsprechenden Sekundärantikörpern sondieren.
    8. Waschen Sie die Blots erneut mit TBST und visualisieren Sie die Proteinbanden mit einem Chemilumineszenz-detektierenden Substrat (siehe Materialtabelle) in einem Western Blot Imaging Instrument.
  2. RT-PCR
    1. Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus den Zellen mit dem Trizol-Reagenz (siehe Materialtabelle).
    2. Bereiten Sie die cDNA aus gleicher RNA-Konzentration mit der Reverse-Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV-RT) vor (siehe Materialtabelle).
    3. Analysieren Sie die Modulation der mRNA-Expression von HSPA5, gespleißtem XBP1, ATF4, CHOP und GADD34 mittels qRT-PCR mit genspezifischen Primern (Tabelle 2). Kurz gesagt, bereiten Sie 10 μl Reaktionsgemische vor, die cDNA-Template (100 ng), 5 μl SYBR Green Farbstoff (siehe Materialtabelle) und 10 pmol jedes genspezifischen Oligonukleotid-Primerpaares enthalten. Stellen Sie die Lautstärke mit sterilem H2O ein.
    4. Lassen Sie die Mischungen auf einer Real-Time-PCR-Maschine mit dem folgenden Programm laufen: Erstdenaturierung bei 95 °C für 3 Minuten und 40 Zyklen von 95 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von der Schmelzkurvenanalyse. Berechnen Sie die Faltungsänderung in der Expression des Zielgens relativ zum Haushaltsgen (z. B. β-Aktin) wie folgt:
      Faltenänderung = 2-Δ(ΔCT)
      Dabei ist ΔCT = CT (Ziel) − CT (Haushaltsgen)
      und Δ(ΔCT) = ΔCT (behandelt) -ΔCT (Kontrolle)
    5. Um das Spleißen von XBP1 weiter zu bestätigen, wird eine semiquantitative RT-PCR mit nicht infizierten und 72 h infizierten Proben durchgeführt.
      HINWEIS: Das Spleißen der XBP-1-mRNA wird mittels RT-PCR an der Spleißstelle untersucht.
    6. Die cDNA wird mit XBP1-Primern (Tabelle 2) unter Verwendung eines High-Fidelity-PCR-Mastermixes (siehe Materialtabelle) unter folgenden Bedingungen amplifiziert: 1 Zyklus mit 98 °C für 30 s, gefolgt von 5 Zyklen mit 98 °C für 15 s, 65*Δ-5 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von 30 Zyklen mit 98 °C für 15 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung um 72 °C für 10 min und Halten bei 4 °C.
    7. Trennen Sie die Amplikons auf einem 2,5%igen Agarose-Gel, das 50 ng Ethidiumbromid/ml enthält, und visualisieren Sie sie in einem Gel-Doc-Instrument. Die gespleißte XBP1-Bande ist um 26 Nukleotide kleiner.

5. Knockdown von UPR-Markern und Analyse der HIV-1-LTR-gesteuerten Genexpression und Virusproduktion

  1. Präparation von shRNA-Konstrukten für den Knockdown von UPR-Markern
    1. Erstellung von shRNA-Konstrukten unter Verwendung des pLKO.1-TRC-Vektorrückgrats (lentiviraler Klonierungsvektor)29.
    2. Konstruieren Sie zwei shRNA-Konstrukte für jedes Gen (IRE1, PERK, ATF6 und HSPA5). Sense- und Anti-Sense-Oligonukleotide, die auf die mRNA des jeweiligen Gens abzielen, wurden vom RNAi-Konsortium (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) entwickelt (Tabelle 3).
      HINWEIS: Auf ähnliche Weise können shRNA-Konstrukte für andere UPR-Marker hergestellt werden.
    3. Die Primer (je 100 nM Vorwärts- und Rückwärts) werden bei 95 °C geglüht und anschließend schrittweise auf RT abgekühlt.
    4. Dann ligieren Sie es mit einer T4-DNA-Ligase in die Age1 - und EcoRI-Stellen des pLKO.1-Vektors (siehe Materialtabelle). Bestätigen Sie die Sequenz durch DNA-Sequenzierung.
      HINWEIS: Ein shRNA-Konstrukt, das auf das LacZ-Gen abzielt, wird als Nicht-Targeting-Kontrolle verwendet.
  2. Knockdown von PERK, ATF6, IRE1 und HSPA5 in HEK-293T-Zellen, Luciferase-Assay und p24-ELISA
    1. Eine Mischung aus shRNA-Konstrukt (0,9 μg) und einem Transfektionsreagenz wie Polyethylenimin (PEI) (3 μl PEI für 1 μg DNA) (siehe Materialtabelle) in 50 μl serumfreiem Medium durch Vortexen vorbereiten und 20 min inkubieren.
    2. Aus konfluenten HEK-293T-Zellen, die einen Kolben enthalten, trypsinisieren und säen ~0,25 x 106 Zellen zusammen mit der Transfektion, mischen Sie sie in einer 24-Well-Platte, wodurch ein Gesamtvolumen von 125 μl entsteht, und inkubieren Sie für 6 Stunden bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator. Diese Methode wird als umgekehrte Transfektion bezeichnet, bei der die Zellen zusammen mit der Transfektionsmischung ausgesät werden.
    3. Geben Sie nach 6 Stunden 125 μl des vollständigen Mediums in die Vertiefungen und resuspendieren Sie die Zellen für eine gleichmäßige Aussaat.
      HINWEIS: Bei Knockdown-Experimenten führt die umgekehrte Transfektion (Schritte 5.2.1-5.2.3) zu einer besseren Effizienz sowohl bei shRNAs als auch bei siRNAs.
    4. Nach 24 h führen Sie eine zweite Transfektion durch. Bereiten Sie eine Mischung aus pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) und pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0,5) Konstrukten mit PEI (3 μl PEI für 1 μg DNA) in 50 μl unvollständigem Medium durch Vortexen vortexen. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei RT. Tauschen Sie das vorhandene Medium durch 250 μl frisches, unvollständiges Medium aus und geben Sie die Mischung in die Zellen.
      HINWEIS: Ein Reportervektor für die HIV-1-LTR wurde durch Subklonierung von LTR von pU3RIII30,31 in pGL3basic im Labor früher32 entwickelt. Die GFP-Expression mit pEGFP-N1 wurde verwendet, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren32.
    5. Wechseln Sie das Medium nach 6 h nach der Transfektion mit 500 μl vollständigem DMEM. Ernten Sie die Zellen nach 36 Stunden für Immunblotting und Luciferase-Assay.
    6. Für den Luciferase-Assay pelletieren Sie die Zellen und resuspendieren sie in einem kommerziell erhältlichen Luciferase-Substrat (50 μl) (siehe Materialtabelle). Geben Sie das resuspendierte Zelllysat in eine undurchsichtige 96-Well-Platte und inkubieren Sie es 10-15 Minuten lang. Ermitteln Sie den Luziferase-Messwert in einem Luminometer. Messen Sie auch die GFP-Fluoreszenz in denselben Proben, um den Luciferase-Messwert in einem Mikroplatten-Mikromoden-Plattenleser zu normalisieren (z. B. 494 nm, Em: 519 nm).
    7. Zeichnen Sie das Diagramm als Luziferase-Einheit/GFP auf der Y-Achse.
      HINWEIS: Der Knockdown der jeweiligen UPR-Marker sollte überprüft werden, und zwar entweder durch Immunblotting oder qRT-PCR unter Verwendung von genspezifischen Antikörpern bzw. Primern.
    8. Sammeln Sie die Überstände, um sie wie oben erwähnt für den p24-ELISA zu verarbeiten.
  3. Bildung stabiler Zellen mit Knockdown von UPR-Markern und HIV-1-Infektion.
    1. Bereiten Sie die Lentivirus-Partikel vor, indem Sie HEK-293T-Zellen, die in einer 6-Well-Platte ausgesät wurden, mit den entsprechenden shRNA-Konstrukten (1 μg) zusammen mit pMD2.G (VSV-G-Hüllvektor) (0,75 μg) und psPAX2 (Lentivirales Verpackungsplasmid) (0,25 μg) (siehe Materialtabelle) unter Verwendung von PEI im Verhältnis 1 μg DNA: 3 μl PEI transfizieren. Bereiten Sie die Mischung in 100 μl unvollständigem DMEM vor und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT. Geben Sie die Mischung zu 1,8 ml vollständigem Medium in den ausgesäten HEK-293T-Zellen.
      HINWEIS: HEK-293T-Zellen mindestens 12 Stunden vor der Transfektion in einer 6-Well-Platte säen, bis sie Morphologie gewinnen und zu etwa 60-70 % konfluent sind.
    2. Nach 24 Stunden Transfektion geben Sie 1 ml vollständiges DMEM in jede Vertiefung.
    3. Die Überstände werden nach 48 Stunden gesammelt, bei -80 °C im Gefrierschrank gelagert und p24-ELISA durchgeführt, um das Vorhandensein des Virus in diesen Überständen zu bestätigen. Verwenden Sie diesen rohen lentiviralen Überstand für die Transduktion von J6-Zellen.
    4. Inkubieren Sie 2 Millionen Zellen in einer 6-Well-Platte mit einem gleichen Volumen an lentiviralem Überstand (500 μl) für jedes Kontroll- und genspezifische Knockdown-Lentivirus und fügen Sie frisches, vollständiges RPMI 1640-Medium in Gegenwart von Polybren (5 μg/ml) hinzu, um das Volumen auf 2 ml aufzufüllen.
    5. Nach 24 Stunden geben Sie Puromycin (1 μg/ml) in jede Vertiefung, um stabile Zellen auszuwählen. Nach der Zugabe von Puromycin pelletieren Sie die Zellen alle 24 Stunden und fügen Sie 2 ml frisches Medium mit Puromycin hinzu.
    6. Tun Sie dies, bis kein Zelltod mehr auftritt (~1 Woche). Die überlebenden Zellen sind die stabilen Zellen mit dem gewünschten Gen-Knockdown.
      HINWEIS: Der Knockdown der jeweiligen Gene kann in regelmäßigen Abständen und schließlich, wenn nur überlebende Zellen in Puromycin-haltigen Medien sichtbar sind, mittels Immunblotting oder qRT-PCR überprüft werden.
    7. Infizieren Sie die LacZ- und genspezifischen Knockdown-Zellen mit 0,5 MOI HIV-1, wie in Abschnitt 2 beschrieben, und ernten Sie die Zellen 48 Stunden nach der Infektion.
    8. Sammeln Sie den Überstand aus jeder Probe und verarbeiten Sie ihn für p24-ELISA, wie zuvor beschrieben, und bearbeiten Sie die Zellen, um den Knockdown-Pegel durch Immunblotting zu überprüfen.

6. Behandlung mit ER-Stressinduktor und Analyse seiner Wirkung auf die HIV-1-Replikation

HINWEIS: Um die Wirkung einer Überstimulation von UPR während der HIV-1-Replikation zu bestimmen, kann das pharmakologische Induktormolekül Thapsigargin verwendet werden.

  1. Bestimmung der prozentualen Zellviabilität nach Behandlung mit Thapsigargin.
    HINWEIS: Die Zytotoxizität von Thapsigargin wird durch das MTT-Reagenz bestimmt (siehe Materialtabelle).
    1. 25.000-30.000 CEM-GFP-Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit 100 μl vollständigem RPMI 1640 aussäen. Geben Sie 100 nM Thapsigargin in das Medium und inkubieren Sie bei 37 °C in einem Inkubator.
      HINWEIS: Zellen, die mit 1 μl DMSO behandelt wurden, wurden als Vehikelkontrolle entnommen.
    2. Nach 48 h 10 μl MTT (5 mg/ml) in jede Vertiefung geben und 4 h im Dunkeln inkubieren, um Formazankristalle bei 37 °C mit 5 % CO2 zu bilden.
    3. Nach 4 h lösen Sie die Kristalle mit 100 μl Isopropanol auf, um eine violette Farbe zu bilden, und messen Sie die Extinktion bei 570 nm mit einem Spektralphotometer.
    4. Berechnen Sie die prozentuale Zellviabilität basierend auf der unten angegebenen Gleichung
      % Zellviabilität = (KontrolleOD570 - BehandlungOD570)/ KontrolleOD570 x 100
  2. Vorbehandlung mit Thapsigargin und Analyse des Fortschreitens der HIV-1-Infektion mittels p24 ELISA.
    1. 1 Million CEM-GFP-Zellen werden in einer 12-Well-Platte mit 1 ml vollständigem RPMI 1640 gesät und mit 100 nM Thapsigargin oder 1 μl DMSO (Vehikelkontrolle) für 12 Stunden in einem CO2 -Inkubator behandelt, der bei 37 °C gehalten wird. Nach 12 Stunden waschen Sie die Zellen mit vollständigem RPMI 1640 und infizieren Sie mit 0,5 MOI HIV-1, wie zuvor beschrieben.
    2. Ernten Sie die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten, z. B. 24 h, 48 h und 72 h nach der Infektion, für das Immunblotting.
    3. Entnehmen Sie die Überstände aus jeder Probe und führen Sie den p24-ELISA wie zuvor beschrieben durch.
    4. Plotten Sie das Diagramm mit der p24-Konzentration in der Probe als Y-Achse und den entsprechenden Zeitpunkten als X-Achse.
    5. Analysieren Sie mit Hilfe des Immunblottings die ER-Stressinduktion aufgrund der Thapsigargin-Behandlung, indem Sie den Spiegel aller UPR-Marker messen. In dieser Studie wurde HSPA5 als Marker verwendet.

7. TZM-bl β-Gal-Infektiositätstest zur Bestimmung der Wirkung von UPR auf die Virioninfektiösität

HINWEIS: Um die Rolle von UPR bei der Infektiosität des Virions zu verstehen, kann der Überstand aus dem Knockdown sowie die Behandlung mit Thapsigargin für den TZM-bl β-Gal-Infektiositätstest wie in Abschnitt 1.2 beschrieben verwendet werden, basierend auf der durch p24-ELISA bestimmten p24-Konzentration.

  1. Infizieren Sie TZM-bl-Zellen mit einer gleichen Konzentration von p24 aus jeder Probe und führen Sie eine β-Gallen-Färbung durch. Zählen Sie die blauen infizierten Zellen unter dem Mikroskop in 10-facher Vergrößerung für 5 zufällige Felder.
  2. Nehmen Sie einen Durchschnitt der Anzahl der 5 Felder für jede Stichprobe aus den obigen Schritten.
  3. Berechnen Sie die Falzänderung wie unten erwähnt:
    Faltenänderung = Durchschnittliche Anzahl blauer Zellen in den Testproben/Durchschnittliche Anzahl blauer Zellen in der Kontrollprobe.

Ergebnisse

In dieser Arbeit haben wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung von in vitro ER-Stress und UPR-Aktivierung nach einer HIV-1-Infektion in T-Zellen beschrieben (Abbildung 2). In dieser Studie werden auch Methoden zur Analyse der funktionellen Relevanz von UPR bei der HIV-1-Replikation und der Virioninfektiösität beschrieben (Abbildung 3).

Zu diesem Zweck analysierten wir den durch eine HIV-1-Infektion verursachten ER-Stress, indem wir die Proteinaggregate im Inneren der Zelle durch Färbung mit Thioflavin T beobachteten. Wie in Abbildung 4A gezeigt, repräsentiert die Intensität von ThT die Proteinaggregate in den nicht infizierten und infizierten Zellen. In ähnlicher Weise zeigt Abbildung 4B als Positivkontrolle die ThT-Färbung in mit Thapsigargin behandelten Zellen. Die erhöhte ThT-Intensität deutet auf das Vorhandensein von mehr Proteinaggregaten hin, was mit erhöhtem ER-Stress korreliert.

Um diese Beobachtung zu validieren, wurde eine konventionellere Methode verwendet, die die Analyse von UPR-Markern beinhaltete. Die UPR-Aktivierung wurde zunächst durch die Aktivierung der primären Effektoren -IRE1, ATF6 und PERK analysiert. Die Aktivierung von IRE1 wurde durch Analyse der Phospho-IRE1-Spiegel durch Immunblotting der Lysate von nicht infizierten und infizierten Zellen gemessen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion entnommen wurden, wie in Abbildung 5A dargestellt. Der Anstieg der pIRE1/Gesamt-IRE1-Spiegel deutet auf die Aktivierung von IRE1 hin. In ähnlicher Weise wurde die Aktivierung von PERK anhand der Phospho-PERK-Spiegel in nicht infizierten und infizierten Zellen gemessen (Abbildung 5B). Die Aktivierung von ATF6 wurde durch das Expressionsniveau der ATF6 P50-Form durch Immunblotting quantifiziert (Abbildung 5C). Ein weiterer wichtiger Marker für UPR ist der Master-Regler und ein ER-Chaperon, HSPA5. Der HSPA5-Spiegel wurde ebenfalls durch Immunblotting analysiert, wie in Abbildung 5D dargestellt. Ein ähnliches Protokoll wurde für andere UPR-Marker wie sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP und GADD34 unter Verwendung ihrer spezifischen Antikörper befolgt (Ergänzende Abbildung 1). Das Spleißen von XBP1 mRNA kann sowohl mittels quantitativer RT-PCR (Abb. 5E) als auch mittels semiquantitativer RT-PCR analysiert werden. Da die quantitative RT-PCR das Spleißen nicht spezifisch identifizieren konnte, wurde sie mit dem Spleißassay kombiniert, bei dem eine semiquantitative RT-PCR verwendet wurde (Abbildung 5F). Bei dem oben genannten Protokoll haben wir beobachtet, dass die qRT-PCR-Daten mit den semi-qRT-PCR-Daten übereinstimmen. Ähnlich wie die qRT-PCR für sXBP1 wurde das Protokoll für die Analyse anderer UPR-Marker wie HSPA5, ATF4, CHOP und GADD34 auf mRNA-Ebene verwendet (Ergänzende Abbildung 2)

Um die Rolle von UPR bei der HIV-1-Replikation und der Virioninfektiösität zu untersuchen, führten wir als Nächstes einen Knockdown bestimmter UPR-Marker durch: PERK und HSPA5. Mit den genannten Protokollen erreichten wir den Knockdown dieser Marker auf ein signifikantes Niveau sowohl in HEK-293T-Zellen (Abbildung 6A) als auch in J6-Zellen (Abbildung 6B). Anhand dieser Knockdown-Zellen untersuchten wir den Effekt des Knockdowns der HIV-1-LTR-gesteuerten Genaktivität (Abbildung 6A), der in den jeweiligen Proben als Luc/GFP-Expressionsverhältnis dargestellt wird. Die Virusproduktion wurde mittels p24-ELISA des Überstands gemessen, wie in Abbildung 6B dargestellt. Die Infektiosität der produzierten Virionen kann auch mit dem β-Gal-Färbeprotokoll auf die gleiche Weise analysiert werden, wie in Abbildung 1A gezeigt.

Des Weiteren kann unter Verwendung eines chemischen Induktors von ER-Stress, Thapsigargin, die Wirkung einer Überstimulation von UPR auf die HIV-1-Replikation, die Virusproduktion und die Virioninfektiösität untersucht werden. Die Zytotoxizität von Thapsigargin bei der gegebenen Konzentration wurde mit einem MTT-Assay analysiert (Abbildung 7A), der zeigt, dass die Zytotoxizität bei der gewünschten Konzentration nicht signifikant ist. Das Immunblotting für HSPA5 wurde durchgeführt, um die Wirkung des Medikaments auf den ER-Stress zu analysieren (Abbildung 7B). Die Ergebnisse zeigen, dass eine 12-stündige Vorbehandlung mit 100 nM Thapsigargin die Expression von HSPA5 zu allen Zeitpunkten induzierte. Der p24-ELISA zeigt den Effekt auf die Virusproduktion und die Infektiosität der produzierten Virionen, die wie zuvor beschrieben analysiert werden können.

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Abbildung 1: Quantifizierung der Virioninfektiösität und Analyse des Infektionsverlaufs. (A) Quantifizierung der Virioninfektiösität mittels TZM-bl basiertem β-Gal-Assay. Die Infektiosität des Virus wurde durch Zugabe von 1 ng, 0,1 ng und 0,01 ng des Virus zu den TZM-bl-Zellen bestimmt, gefolgt von einer β-Gal-Färbung und Zählung der Anzahl der blauen Blutkörperchen. Vergrößerung: 10x. (B) Analyse des Infektionsverlaufs in 0,5 MOI HIV-1-infizierten CEM-GFP-Zellen basierend auf dem p24-Antigen-Capture-ELISA der Kulturüberstände. CEM-GFP-Zellen wurden mit 0,5 MOI HIV-1 infiziert, und die Überstände wurden für p24-ELISA prozessiert. Die Fehlerbalken werden als mittlere ± S.E-Werte angezeigt. Sternchen geben das Signifikanzniveau an, das in den Abbildungen als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 und ****=p ≤ 0,0001 angegeben wird, analysiert durch den Student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung der Schritte, die zur Analyse der Auswirkungen einer HIV-1-Infektion auf ER-Stress und UPR zu befolgen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Flussdiagramm der Schritte, die befolgt werden müssen, um die Wirkung von UPR auf die HIV-1-Replikation, die Virusproduktion und die Infektiosität der Virionen zu analysieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Analyse des ER-Stressniveaus in T-Zellen aufgrund einer HIV-1-Infektion mittels ThT-Färbung. (A) CEM-GFP-Zellen wurden mit 0,5 MOI HIV-1 infiziert und 72 h nach der Infektion geerntet. Die Zellen wurden fixiert und mit Thioflavin T gefärbt. Die GFP-Expression weist auf infizierte CEM-GFP-Zellen hin. Die Grafik zeigt die Intensität von Thioflavin T bei nicht infizierten und HIV-1-infizierten Zellen. Daten von ~50 Zellen aus n = 3 biologischen Replikaten sind in der Grafik dargestellt. (B) CEM-GFP-Zellen wurden 12 Stunden lang mit DMSO und TG behandelt. Die Zellen wurden fixiert und mit Thioflavin T gefärbt. Die Grafik zeigt die Intensität von Thioflavin T im Fall von DMSO- und TG-behandelten Zellen. Daten von ~50 Zellen aus n = 3 biologischen Replikaten sind in der Grafik dargestellt. Die Fehlerbalken werden als mittlere ± S.E-Werte angezeigt. Sternchen geben das Signifikanzniveau an, das in den Abbildungen als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 und **** = p ≤ 0,0001 angegeben wird, analysiert durch den Student's t-Test. UN: Nicht infiziert; IN: Infiziert; TG: Thapsigargin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Analyse der Expression verschiedener UPR-Marker in HIV-1-infizierten T-Zellen. (A-E) HIV-1 (0,5 MOI) infizierte CEM-GFP-Zellen wurden bis zum Tag 4 alle 24 h geerntet und für verschiedene Analysen aufbereitet, wie im Folgenden beschrieben. (A) Die Aktivierung von IRE1 wurde durch Immunblotting von pIRE1 analysiert. (B) Die Aktivierung von PERK wurde durch Immunblotting von pPERK analysiert. (C) Die Aktivierung von ATF6 wurde durch Immunblotting der ATF6 P50-Form analysiert. (D) Die Expression von ER-Chaperon HSPA5 wurde durch Immunblotting HSPA5 analysiert. (E) Das Spleißen von XBP1 wurde mittels qRT-PCR von sXBP1 unter Verwendung spezifischer real-time Primer analysiert. (F) Um das Spleißen von XBP1 mittels semi-qRT-PCR zu analysieren, wurde xbp-1 mRNA mittels RT-PCR über die Spleißstelle amplifiziert und die Banden visualisiert. Die Fehlerbalken werden als mittlere ± S.E-Werte angezeigt. UN: Nicht infiziert. IN: Infiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Analyse der Rolle von UPR auf die HIV-1-Replikation und Virusproduktion. (A) PERK (linkes Bild) und HSPA5 (rechtes Bild) wurden in HEK-293T-Zellen ausgeschaltet, und es wurde ein Luciferase-Assay durchgeführt, um die HIV-1-LTR-gesteuerte Genaktivität zu analysieren. Die Immunoblots zeigen die Knockdown-Niveaus der jeweiligen Proteine. (B) PERK (linkes Bild) und HSPA5 (rechtes Bild) wurden in J6-Zellen ausgeschaltet, und es wurde ein p24-ELISA mit dem gesammelten Überstand durchgeführt, um die Virusproduktion zu analysieren. Die Immunoblots zeigen die Knockdown-Niveaus der jeweiligen Proteine. Die Fehlerbalken werden als mittlere ± S.E-Werte angezeigt. Sternchen geben das Signifikanzniveau an, das in den Abbildungen als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 und ****=p ≤ 0,0001 angegeben wird, analysiert durch den Student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Analyse der Wirkung des chemischen ER-Stressinduktors Thapsigargin auf das Fortschreiten der HIV-1-Infektion. (A) Zellviabilität von CEM-GFP-Zellen nach Behandlung mit 100 nM Thapsigargin. Die Zellviabilität wird mittels MTT-Assay analysiert. (B) CEM-GFP-Zellen, die 12 h lang mit 100 nM TG vorbehandelt wurden, wurden mit 0,5 MOI HIV-1 infiziert und zu Zeitpunkten 24 h, 48 h und 72 h nach der Infektion geerntet. Das Immunoblot zeigt den Effekt von TG auf die Expression von HSPA5, während das Diagramm die Virusproduktion zeigt, wie sie mit dem p24-ELISA analysiert wurde. Die Fehlerbalken werden als mittlere ± S.E-Werte angezeigt. Sternchen geben das Signifikanzniveau an, das in den Abbildungen als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 und ****= p ≤ 0,0001 angegeben wird, analysiert durch den Student's t-Test. TG: Thapsigargin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Analyse der Expression verschiedener nachgeschalteter Marker der UPR. Expression von (A) sXBP1, (B) Phosphorylierung von eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP und (E) GADD34, analysiert durch Immunblotting. (A-E) CEM-GFP-Zellen, die mit 0,5 MOI HIV-1 infiziert waren, wurden 24 h, 48 h, 72 h und 96 h nach der Infektion geerntet und für das Immunblotting verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Analyse verschiedener UPR-Marker auf mRNA-Ebene mittels qRT-PCR. (A-D) CEM-GFP-Zellen, die mit 0,5 MOI HIV-1 infiziert waren, wurden alle 24 Stunden bis zum Tag 4 geerntet und für die qRT-PCR von (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP und (D) GADD34 verwendet. Die Fehlerbalken werden als mittlere ± S.E-Werte angezeigt. Sternchen geben das Signifikanzniveau an, das in den Abbildungen als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 und **** = p ≤ 0,0001 angegeben wird, analysiert durch den Student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

BauenPrimer-Sequenz 5' bis 3'
XBP1 SPLEIẞEN ASSAY FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
XBP1 SPLEIẞEN ASSAY RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
Gespleißt XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
Gespleißt XBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTGTCAGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RGAAGGTCATCTGGCATGGTT
CHOP FCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
CHOP RCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
GADD34 FATGGACAGTGACCTTCTCGG
GADD34 RCTGGGCTCCTCCTAGGCT
AKTIN FAGAAAATCTGGCACCACACC
AKTIN RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

Tabelle 2: Liste der für die RT-PCR-Analyse verwendeten Primer. F: Vorwärts; R: Rückwärts

shRNA-KonstruktPrimer-Sequenz 5' bis 3'
PERK SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
PERK SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG
PERK SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
PERK SH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGAGAGG
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTCTTCTGTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGGTTTTTG
IRE1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
LacZ FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
LacZ RAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA

Tabelle 3: Liste der Primer, die zur Erzeugung von shRNA-Konstrukten verwendet werden. F: Vorwärts; R: Rückwärts

Diskussion

Der Geltungsbereich des vorliegenden Protokolls umfasst (i) den Umgang mit HIV-1-Virusbeständen und die Messung der Viruskonzentration und der Virioninfektiösität, (ii) die Infektion von T-Zellen mit HIV-1 und die Bewertung ihrer Wirkung auf ER-Stress und verschiedene UPR-Marker, (iii) die Wirkung des Knockdowns von UPR-Markern und ihre Wirkung auf die HIV-1-LTR-gesteuerte Genaktivität, Virusproduktion und Virion-Infektiosität und (iv) Überstimulation der UPR mit pharmakologischen Molekülen und Analyse ihrer Wirkung auf die HIV-1-Replikation. Mit den vorliegenden Protokollen können umfassende Informationen über das Zusammenspiel von HIV-1 und UPR gewonnen werden. Die in dieser Studie aufgeführten Protokolle sind einfach durchzuführen, kostengünstig und äußerst zuverlässig.

Da es sich bei der UPR um einen stresssensitiven Signalweg handelt, sind die Arbeit daran in recht heiklen Schritten erforderlich. Bei allen Experimenten empfehlen wir, lange Zellen zu vermeiden, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Es ist auch wichtig, bei allen Zellkulturtechniken sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, um bakterielle und Hefekontaminationen zu vermeiden, da diese die Experimente und die entsprechenden Ergebnisse behindern können. Vermeiden Sie außerdem beim Umgang mit Zellen während der Experimente, einschließlich der anschließenden Kultivierung, starke oder anhaltende Temperaturschwankungen und stellen Sie sicher, dass die Zellen von Anfang an gesund und unbelastet sind. Andernfalls können die Veränderungen zu zusätzlichem Stress für die Zellen führen, was die Ergebnisse verändern kann. Versuchen Sie, die Zeitpunkte so fest wie möglich zu halten, da UPR ein empfindlicher Signalweg ist und eine geringfügige Änderung der Zeitpunkte die Ergebnisse variieren kann.

Die ThT-Färbemethode, die Proteinaggregate nachweist und zur Bestimmung von ER-Stress verwendet wird22, zeigt sehr deutlich das ER-Stressniveau in den HIV-1-infizierten Zellen. Die ThT-Färbung basiert auf dem Nachweis von Proteinaggregaten, der mit ER-Stress korreliert. Es ist jedoch zu beachten, dass die UPR-Aktivierung nicht immer mit Proteinaggregaten korreliert werden kann, da die einzelnen UPR-Signalwege direkt aktiviert werden können, ohne dass Proteinaggregate beteiligt sind. Auch wenn diese ThT-Färbemethode eine Vorstellung von den ER-Stressniveaus gibt, sollte sie für eine eingehende Analyse der UPR-Aktivierung immer mit einer weiteren Analyse der UPR-Marker validiert werden. Um die subzelluläre Lokalisation der ThT-Färbung weiter zu definieren, können auch Marker wie KDEL im Falle der Markierung des ER verwendet werden. Darüber hinaus führt ER-Stress in vielen Fällen zu einer Veränderung der Zellgröße und -form, so dass man bei der Quantifizierung der ThT-Intensität auch die Fläche der Zellen berücksichtigen kann. Die Verfügbarkeit von hochempfindlichen, zuverlässigen und kostengünstigen kommerziellen genspezifischen Antikörpern hat viele Aspekte des Bereichs der Lebenswissenschaften revolutioniert und ermöglicht eine einfachere Analyse des Proteingehalts in den Zellen. Heutzutage stehen auch hochempfindliche Geräte zur Verfügung, um die Proteinbanden auf den Blots sichtbar zu machen und die Quantifizierung schnell und einfacher zu gestalten. Somit kann die Aktivierung von UPR-Markern leicht durch Immunblotting analysiert werden. Da die Expression von UPR-Markerproteinen jedoch relativ gering ist, muss man eine signifikante Proteinkonzentration verwenden, um ihre Expression zu analysieren. Darüber hinaus sollte die Verdünnung der Primärantikörper auf der Grundlage der Proteinexpression in den verwendeten Zellen richtig optimiert werden, um unspezifische Bindungen und das Hintergrundrauschen in den Blots zu vermeiden. Außerdem, wie in Abbildung 4C, ist der ATF6-Antikörper polyklonal und weist eine Reihe unspezifischer Banden auf. Die richtige Optimierung der Wasch- und Antikörperkonzentration ist erforderlich, um diese unspezifischen Banden bis zu einem gewissen Grad zu reduzieren. Die Blots sollten nach der Inkubation in Blocklösung, Primärantikörper und Sekundärantikörper ordnungsgemäß gewaschen werden, um den Hintergrund und die unspezifischen Banden zu reduzieren. Bei der Entwicklung der Blots sollte eine Übersättigung der Banden vermieden werden, um eine korrekte Visualisierung des Musters in den erzielten Ergebnissen zu erhalten. Wenn wir uns den breiten Fokus dieses Methodenartikels ansehen, haben wir uns nicht auf detaillierte Methoden und die Fehlerbehebung für allgemeine Immunblotting-Techniken konzentriert. man kann sich jedoch auf Methodenartikel von Mahmood und Yang beziehen33 sowie Ghosh et al.34 für dasselbe. Da die RT-PCR heutzutage eine sehr häufig verwendete Methode ist, liefern die leicht verfügbaren Primer und RT-PCR-Geräte Daten zur Analyse bestimmter UPR-Marker. Bei der Vorbereitung der RNA und cDNA für die RT-PCR sollten jedoch Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, da es sich um eine sehr empfindliche Methode handelt und geringfügige Schwankungen in der Qualität der Proben und des Pipettierens zu großen Schwankungen bei der Auslesung führen können. Jegliche DNA- oder Proteinkontamination sollte aus den RNA-Proben entfernt werden. Entnehmen Sie die Proben für die qRT-PCR immer in dreifacher Ausfertigung, damit der Pipettierfehler reduziert werden kann. Die Konzentration der für die qRT-PCR verwendeten DNA sollte so optimiert werden, dass der CT-Wert für jede Probe unter 30 liegt, da alles über 30 als nicht ideal angesehen wird. Für die qRT-PCR sollte immer eine Negativkontrolle aufbewahrt werden, um ein falsch positives Auslesen zu vermeiden. Das Spleißen von XBP1 kann sowohl mittels qRT-PCR als auch mittels semi-qRT-PCR analysiert werden. Da die qRT-PCR das Spleißen nicht genau zeigen würde, sollte die semi-qRT-PCR immer getrennt von der qRT-PCR durchgeführt werden, um die Daten zu validieren und das relative Verhältnis von gespleißtem XBP1 zu ungespleißtem XBP1 zu bestimmen. Da der Unterschied zwischen der Größe von gespleißtem und nicht gespleißtem XBP1 nur 26 nt beträgt, sollte ein höherer Prozentsatz an Agarosegel verwendet werden, um das Gel aufzulösen. Außerdem sollten die Banden bei niedriger Spannung und längerer Dauer aufgelöst werden, um eine bessere Trennung zu gewährleisten. Eine weitere Methode, die heutzutage populärer ist, um das Spleißen von XBP1 zu beobachten, ist der Spleiß-Assay, bei dem die Pst1 Restriktionsenzymverdau der cDNA und ermöglicht eine bessere Visualisierung des XBP1-Spleißens35. Diese Methode kann auch verwendet werden, um das Spleißen von XBP1 in HIV-1-infizierten Proben sichtbar zu machen. Die Ergebnisse aus Immunblotting und RT-PCR können zur Validierung der ThT-Färbeergebnisse verwendet werden.

Die in Abbildung 5 gezeigten repräsentativen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die UPR-Aktivierung nach einer HIV-1-Infektion mit der in Abbildung 4 gezeigten verstärkten ThT-Färbung korreliert. Die Einschränkungen bei der Verwendung von Immunblotting und RT-PCR zur Analyse von UPR bestehen jedoch darin, dass sie streng sind und man mehrere Genprodukte überwachen muss, da die einzelnen UPR-Gene unabhängig voneinander durch Nicht-ER-Stressfaktoren modifiziert werden können. Außerdem messen diese Methoden indirekt die ER-Spannung, indem sie sich die verschiedenen UPR-Marker ansehen. Aus diesem Grund können die ThT-Färbung und die Analyse von UPR-Markern mittels Immunblotting und RT-PCR zusammen verwendet werden, um den Effekt einer HIV-1-Infektion auf den ER-Stress und die UPR-Aktivierung in T-Zellen zu analysieren.

Der zweite Teil dieses Artikels befasst sich mit den Protokollen, die zum Verständnis der Auswirkungen von UPR auf die HIV-1-Replikation erforderlich sind. Es wurde festgestellt, dass die in diesem Artikel beschriebene reverse-Transfektionsmethode, die für den Knockdown von UPR-Markern verwendet wird, zu einer signifikanten Verringerung der Expression von UPR-Markern führt. Wie im Protokoll erwähnt, wurde die GFP-Fluoreszenz verwendet, um den Luciferase-Messwert für den Luciferase-Assay zu normalisieren. In vielen Fällen kann die GFP-Lesung aber auch durch die spezifische Gentransfektion beeinflusst werden36, so dass man in diesem Fall andere Fluoreszenzmarker wie RFP, YFP oder die Gesamtproteinkonzentration verwenden kann, um den Luciferase-Messwert zu normalisieren. In einigen Fällen, in denen die Zellen schwer zu lysieren sind, wie z. B. bei TZM-bl-Zellen, kann vor der Zugabe des Luciferase-Substrats zusätzliches Lysereagenz hinzugefügt werden. Wie in den Ergebnissen dargestellt, sind die Luziferase-Ergebnisse (Abbildung 6A Linkes Feld) mit den p24-ELISA-Ergebnissen im Fall von PERK (Abbildung 6B Linkes Bild), wo der PERK-Knockdown die Aktivität des HIV-1-Gens und die Virusproduktion signifikant reduziert. Während im Fall von HSPA5 der Knockdown von HSPA5 die LTR-gesteuerte Genaktivität nicht beeinflusst (Abbildung 6A Rechtes Bild) gemäß den Ergebnissen des Luciferase-Assays, während es die Virusproduktion gemäß p24 ELISA (Abbildung 6B Rechter Bereich). Auf diese Weise deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass verschiedene UPR-Marker unterschiedliche Auswirkungen auf die HIV-1-LTR-gesteuerte Genaktivität und die Virusproduktion haben können. Das im Überstand mittels ELISA gemessene p24-Antigen ist in erster Linie ein Hinweis auf die Konzentration der Viruspartikel, die im Kulturüberstand freigesetzt werden. Daher haben Forscher routinemäßig die Ergebnisse des p24-Antigen-Capture-ELISA als indirekten Hinweis auf die Virusproduktion im Zellüberstand verwendet37. Somit können der Luciferase-Assay in Zellen und der p24-ELISA des Überstands zusammen verwendet werden, um die Wirkung auf die HIV-1-LTR-gesteuerte Genaktivität und die Virusproduktion zu bestimmen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die Wirkung anderer UPR-Marker auf die HIV-1-LTR-gesteuerte Genaktivität und die Virusproduktion unter Verwendung genspezifischer shRNAs zu analysieren. Bei allen Experimenten, bei denen p24-ELISA und Luciferase-Assays ausgelesen werden, ist es wichtig sicherzustellen, dass die richtigen Verdünnungen und Inkubationszeiten beibehalten werden und Werte, die in die Kategorie des Ausreißers fallen, nicht berücksichtigt werden sollten. Während der Ausführung von p24 ELISA kann beispielsweise ein OD450 Ein Wert zwischen 0,1 und 2 gilt als ideal. Der zweite Ansatz, um die Rolle von UPR bei der HIV-1-Replikation zu untersuchen, ist die Verwendung von pharmakologischen Molekülen wie Thapsigargin, einem ER-Stressinduktor oder TUDCA, einem ER-Stresshemmer. Diese Medikamente werden sehr häufig verwendet, um UPR in verschiedenen Kontexten zu untersuchen38,39,40,41. In diesem Artikel haben wir das Protokoll für die Behandlung mit Thapsigargin demonstriert und seine Wirkung auf das Fortschreiten der HIV-1-Infektion in T-Zellen analysiert. Vor der Verwendung des Arzneimittels für ein Experiment wird dringend empfohlen, die Zellviabilität für eine Reihe von Dosen für das Arzneimittel in der zu verwendenden Zelllinie zu testen. Die Konzentration, die weniger als ~80% Zellviabilität in der gegebenen Zelllinie ergibt, sollte vermieden werden. Darüber hinaus sollten für Zellviabilitätsassays immer gesunde Zellen entnommen werden, da Zellen, die bereits gestresst sind, nicht die richtige Messwerte anzeigen und Zelltrümmer Trübungen verursachen und falsche Messwerte liefern können. Das in dieser Studie erwähnte Protokoll zeigt die Wirkung von Thapsigargin auf die Virusreplikation über 72 Stunden nach der Infektion, was ein besseres Verständnis der Wirkung des Arzneimittels auf die Virusreplikation über einen bestimmten Zeitraum ermöglicht. Man kann auch kürzere Zeitintervalle wie 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h und 72 h nach der Infektion verwenden, um den frühesten Zeitpunkt weiter zu analysieren, zu dem das Medikament seine Wirkung auf die Virusreplikation zeigt.

Da UPR auch am Proteinabbau und der Membrandynamik beteiligt ist42,43, ist es möglich, dass UPR eine Rolle bei der Infektiosität von Virionen spielen kann. Auch die Infektiosität der von den Zellen produzierten Virionen kann mit dem gegebenen Protokoll analysiert werden. Die oben genannten Protokolle können auch verwendet werden, um die Wirkung einer HIV-1-Infektion auf ER-Stress und UPR und ihre funktionelle Relevanz in humanen PBMCs für biologisch relevantere Studien zu bestimmen. Das Verständnis der Funktion von ER-UPR bei HIV-1-Infektionen ist aufgrund des zunehmenden Bewusstseins für seine Beteiligung an der Entwicklung zahlreicher schwerer Krankheiten von entscheidender Bedeutung. Die Informationen, die mit diesen Methoden gewonnen werden, werden dieses unerforschte Feld erweitern, indem sie ein wichtiges Verständnis der Interaktion zwischen HIV-1 und UPR vermitteln.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken dem National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, der indischen Regierung, für die interne Unterstützung. AT und AD sind dankbar für die Unterstützung der Doktorandenforschung, die sie vom National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India, erhalten haben. DM ist dankbar für das JC Bose National Fellowship von SERB, der indischen Regierung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcrylamamidBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
AmmoniumpersulfatSigma-Aldrich, USAA3678
Anti-ATF4-AntikörperCell Signaling Technology, USA11815Western Blot Nachweis Verdünnung - 1:1000
Anti-ATF6 AntikörperAbcam, UKab122897Western-Blot-Nachweis Verdünnung-1:1000
Anti-CHOP-AntikörperCell Signaling Technology, USA2897Western-Blot-Nachweis Verdünnung-1:1000
anti-eIF2&alpha AntikörperSanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western-Blot-Nachweis Verdünnung-1:2000 
Anti-GADD34-AntikörperAbcam, Großbritannienab236516Western-Blot-Nachweis Verdünnung - 1:1000
Anti-GAPDH-AntikörperSanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western-Blot-Nachweis Verdünnung - 1:3000
Anti-HSPA5-AntikörperCell Signaling Technology, USA3177Western-Blot-Nachweis Verdünnung-1:1000
anti-IRE1-AntikörperCell Signaling Technology, USA3294Western-Blot-Nachweis Verdünnung-1:2000
Anti-Maus-HRP-Konjugat-AntikörperBiorad, USA1706516Western Blot Nachweis Verdünnung - 1:4000
anti-peIF2 & alpha AntikörperInvitrogen, USA44-728GWestern Blot Nachweis Verdünnung - 1:1000
anti-PERK AntikörperCell Signaling Technology, USA5683Western Blot Nachweis Verdünnung - 1:2000
anti-pIRE1 AntikörperAbcam, UKab243665Western Blot Nachweis Verdünnung - 1:1000
Anti-pPERK-AntikörperInvitrogen, USAPA5-40294Western-Blot-Nachweis Verdünnung-1:2000
Anti-Kaninchen-HRP-Konjugat-AntikörperBiorad, USA1706515Western-Blot-Nachweis Verdünnung - 1:4000
Anti-XBP1-AntikörperAbcam, UKab37152Western-Blot-Nachweis Verdünnung-1:1000
Tisch-HochgeschwindigkeitszentrifugeEppendorf, USA5804RBremsscheibe - F-45-30-11
Tischzentrifuge mit niedriger DrehzahlEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamidBiorad, USA1610201
Rinderserumalbumin (BSA)MP biomedicals, USA160069 Bradford-Reagenz
Biorad, USA5000006
CalPhos Säugetier-TransfektionskitClontech, Takara Bio, USA631312Virus Lager Vorbereitung
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL-SubstratBiorad, USA1705061Chemilumineszenz-Detektion Substrat
Clarity max ECLSubstrat Biorad, USA1705062Chemilumineszenz-Detektion Substrat
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopOlympus, JapanModell:FV3000
Cytospin-ZentrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA15585011
Fötales RinderserumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyd 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infektiositätsassay
GlycinThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, Indien
HIV-1 infektiöser molekularer Klon pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverses MikroskopNikon, JapanModell: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, Indien
MagnesiumchloridSigma-Aldrich, USAM8266Infektiosität Assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013 MTT-Reagenz
Sigma-Aldrich, USAM5655Zellviabilitätsassay
N,N-DimethylformamidFluka Chemika40255Infektiositätsassay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24-Antigen-Capture-ELISA-KitABL, USA5421
PageRuler vorgefärbte ProteinleiterSci-Fi Biologicals, IndienPGPMT078
ParaformaldehydSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase-InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-Fidelity PCR-Mastermix mit GC-PufferNEB, USAM05532
pLKO.1-TRCAddgen, USA10878Lentiviraler Klonierungsvektor
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G Hüllvektor
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimin (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
KaliumferricyanidSigma-Aldrich, USA244023Infektiositätsassay
KaliumferrocyanidSigma-Aldrich, USAP3289Infektiositätsassay
ProteasehemmerSigma-Aldrich, USA 
psPAX2Addgen, USA12260Lentivirales Verpackungsplasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Auswahl stabiler Zellen
PVDF-MembranBiorad, USA1620177
Zufällige PrimerInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo SubstratPromega, USAE2510Luciferase Assay
T4 DNA LigaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltrazentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infektiositätstest
5056489001

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

T Zell InfektionThioflavin T F rbungUPR MarkerImmunoblottingRT PCRLuciferase Reporter Assayp24 ELISA
Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation
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