Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein Verfahren zur Affinitätsreinigung eines humanen rekombinanten Proteins, der Lappen-Endonuklease 1 (FEN1), vor, das mit einem 6X-Histidin-Tag markiert wurde. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von zwei unterschiedlichen immobilisierten Metallionensäulen für die Aufreinigung des markierten Proteins.

Zusammenfassung

Die funktionelle Charakterisierung von Proteinen erfordert, dass sie in erheblichen Mengen mit hoher Reinheit exprimiert und gereinigt werden, um biochemische Assays durchführen zu können. Das Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)-System ermöglicht die hochauflösende Trennung komplexer Proteingemische. Durch die Anpassung verschiedener Parameter in der FPLC, wie z. B. die Auswahl der geeigneten Aufreinigungsmatrix, die Regulierung der Temperatur der Proteinprobe und die Steuerung der Flussrate der Probe auf die Matrix und der Elutionsrate, ist es möglich, die Stabilität und Funktionalität des Proteins sicherzustellen. In diesem Protokoll werden wir die Vielseitigkeit des FPLC-Systems zur Aufreinigung von 6X-His-markiertem Lappen-Endonuklease 1 (FEN1)-Protein demonstrieren, das in Bakterienkulturen hergestellt wird. Um die Effizienz der Proteinaufreinigung zu verbessern, werden wir uns auf mehrere Aspekte konzentrieren, darunter die richtige Packung und Vorbereitung der Säule, die Probeninjektion mit einer Probenschleife, die Flussrate der Probenapplikation in die Säule und die Parameter der Probenelution. Schließlich wird das Chromatogramm analysiert, um Fraktionen mit hohen Proteinausbeuten zu identifizieren und Überlegungen zur ordnungsgemäßen Langzeitlagerung rekombinanter Proteine zu treffen. Die Optimierung der Proteinaufreinigungsmethoden ist entscheidend für die Verbesserung der Präzision und Zuverlässigkeit der Proteinanalyse.

Einleitung

Für das Verständnis der Zellbiologie stehen zahlreiche Strategien zur Verfügung. Ein Ansatz beinhaltet eine Top-down-Strategie, bei der genetische Mutationen in ein Gen eingebracht werden, gefolgt von der Bewertung der daraus resultierenden phänotypischen Veränderungen in einem Modellorganismus. Umgekehrt beinhaltet ein reduktionistischer Ansatz die anfängliche Aufklärung der molekularen Mechanismen und enzymatischen Funktionen eines bestimmten Proteins, begleitet von der Charakterisierung seiner Wechselwirkungen mit anderen zellulären Komponenten. Anschließend wird der Einfluss dieses Proteins auf einen biologischen Signalweg bewertet. Obwohl jeder Forschungsansatz seine inhärenten Vorteile und Grenzen hat, erfordert ein umfassendes Verständnis eines biologischen Signalwegs interdisziplinäre Untersuchungen.

Da die DNA der genetische Bauplan des Lebens ist, ist das Verständnis der Mechanismen der DNA-Duplikation und der Genomerhaltung seit über sieben Jahrzehnten ein Bereich von aktivem Interesse. Untersuchungen auf dem Gebiet der DNA-Replikation haben umfangreiche Daten über die individuellen Strukturen und Funktionen zahlreicher Replikationsproteine erbracht. Diese Untersuchungen, die mechanistische Aspekte und biochemische Aktivitätstests umfassen, wurden durch die Aufreinigung dieser Proteine ermöglicht, die eine sorgfältige Untersuchung in einem In-vitro-Milieu ermöglicht. Folglich erweist sich die Proteinreinigung als unverzichtbare und allgegenwärtige Technik in den meisten Forschungsbemühungen, die darauf abzielen, mechanistische Erkenntnisse über die DNA-Replikation zu entschlüsseln.

In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung eines DNA-Replikationsproteins vorgestellt, das mit 6X-Histidin markiert ist und in Bakterienzellen überexprimiert wurde. Das Protein von Interesse ist die humane Lappen-Endonuklease 1 (FEN1), eine strukturspezifische Nuklease, die eine zentrale Rolle bei der verzögerten Strangreplikation spielt und auch eine wichtige Rolle bei DNA-Reparaturwegen wie der Basenexzisionsreparatur (BER) ^spielt1,2,3. Die Hauptfunktion von FEN1 besteht darin, an der Basis einer 5'-verschobenen Lappenstruktur zu spalten, ein Zwischenprodukt, das während der DNA-Replikation oder BER entsteht. Ursprünglich deuteten biochemische Untersuchungen zur Bewertung der enzymatischen Aktivität von FEN1 auf einen "Tracking"-Mechanismus hin, bei dem die Nuklease das freie 5'-Phosphat-Ende einer Lappenstruktur erkennt und dann entlang des Lappens bis zu seiner Basis folgt, bevor sie es^{spaltet 4}. Spätere Untersuchungen ergaben, dass FEN1 über einen "Einfädel"-Mechanismus arbeitet, bei dem es zuerst an die Basis des Lappens bindet und dann das freie 5'-Ende vor der Spaltung durch sein aktives Zentrum fädelt (Abbildung 1)⁵. Die Fähigkeit, rekombinantes FEN1 zu überexprimieren und zu isolieren, hat diese Durchbrüche ermöglicht und ermöglicht es Forschern, es in biochemischen und strukturellen Untersuchungen einzusetzen.

Die Affinitätschromatographie ist eine häufig verwendete Trennmethode zur Aufreinigung von DNA. Diese Technik nutzt die reversible Bindungsaffinität von Zielproteinen zu Liganden, die auf einem Harz immobilisiert sind, um das gewünschte Protein spezifisch einzufangen. Eine der am weitesten verbreiteten Bioaffinitäten ist die robuste Wechselwirkung zwischen der Aminosäure Histidin und Metallionen wie Nickel und Kobalt und kann daher auf einem mit Ni²⁺ oder Co²⁺ geladenen Harz eingefangen werden.

Die DNA-Sequenz, die für eine Kette von 6-9 Histidresten (His) kodiert, wird häufig in das Plasmidkonstrukt eingebaut, das das Protein von Interesse kodiert (entweder am N-Terminus oder am C-Terminus), wodurch das Protein mit einem 6X-His-Tag oder einem Poly-His-Tag markiert wird. Das His-markierte Protein kann dann leicht durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) aufgereinigt werden, eine Unterart der Affinitätschromatographie, bei der Metallionen auf dem Harz Proteine mit einem Affinitätstag einfangen, die später mit geeigneten Elutionsmitteln eluiert werden können. Übergangsmetallionen wie Ni²⁺ und Co²⁺ können auf Agarose- oder Kieselgelmatrizen immobilisiert werden, die von N,N,N'-Tris-(Carboxymethyl)-ethylendiamin oder Nitrilotriacetinsäure (NTA)-Gruppen^{abgeleitet sind 6}.

Es ist bekannt, dass Metallliganden robust gegen Degradation durch physikalische, chemische und biologische Faktoren sind und diesen Vorteil gegenüber anderen Arten von Liganden haben ^6,7. Darüber hinaus ist der His-Tag ein relativ kleiner Tag und hat keinen signifikanten Einfluss auf die Proteinstruktur oder -funktion⁷. In einem bakteriellen Expressionssystem haben jedoch viele chromosomal exprimierte Proteine eine Affinität zu Metallionen und können mit dem Zielprotein co-reinigen. Nickel und Kobalt sind die typischen Metallionen, die in IMAC-Matrizen verwendet werden. Das Ni-NTA-Harz und das kobaltbasierte TALON-Harz werden häufig für die Aufreinigung von His-markierten Proteinen verwendet.

Ni-NTA gegen TALON
Die jeweiligen Metallionen sowohl von Ni-NTA als auch von TALON werden durch NTA-Liganden auf dem Harz immobilisiert. Es wird angenommen, dass Ni-NTA eine höhere Bindungskapazität hat und bis zu 100 mg/ml Protein bindet. Dies kann zu einer höheren Proteinausbeute führen, mit dem Vorbehalt, dass verunreinigte Proteine mitgereinigt werden können. Im Gegensatz dazu weist das Harz eine höhere Bindungsspezifität gegenüber His-markierten Proteinen auf und ist möglicherweise in der Lage, Fraktionen höherer Reinheit herzustellen. In dieser Studie versuchen wir, die Reinigungseffizienz beider Harze mit Hilfe des referenzierten automatisierten schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie-Systems, dem NGC-System, zu vergleichen (siehe Materialtabelle).

Puffer und Kompatibilität
Puffer werden während der Proteinaufreinigung für die Zelllyse, die Probenvorbereitung, die Harzäquilibrierung und die Elution des eingefangenen Proteins aus dem Harz benötigt. Tris-, MOPS- und HEPES-Puffer bis zu einer Konzentration von 100 mM sind die bekannten kompatiblen Puffer für das Ni-NTA-Harz. Puffer enthalten häufig Reduktionsmittel, um die Oxidation von Protein und Proteinaggregation zu verhindern. Oberhalb eines Schwellenwerts könnten Reduktionsmittel das Harz jedoch von Metallionen befreien. Die empfohlene Konzentration von Reduktionsmitteln wie Beta-Mercaptoethanol (BME) oder Dithiothreitol (DTT) liegt für die oben genannten Nickel- und Kobaltbasisharze unter 1 mM.

Die Puffer für die Aufreinigung von hFEN1 sind Tris-Puffer, die NaCl, BME, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), EDTA und Glycerin enthalten. NaCl hält das Protein in löslicher Form und stört molekulare Wechselwirkungen wie die DNA-Bindung. BME reduziert oxidierte Proteine und verhindert dadurch die Proteinaggregation. PMSF) ist ein Proteaseinhibitor, der den Protease-vermittelten Abbau des Zielproteins verhindert. EDTA eliminiert zweiwertige Kationen aus der Probe und verhindert so ihren Zugang zu Nukleasen und Proteasen. Glycerin erhöht die Stabilität des Proteins in wässriger Form. Zusätzlich enthält der Lysepuffer vollständige Proteasehemmer-Tabletten, um einen maximalen Schutz des Zielproteins vor dem Abbau von Proteasen während der Zelllyse zu gewährleisten. Die Äquilibrierungs- und Elutionspuffer enthalten Imidazol, wobei der Elutionspuffer höhere Mengen für das Imidazol enthält, um das gebundene Protein während der Elution aus dem Harz zu verdrängen.

Chromatographie-System der nächsten Generation (NGC)
Dieses automatisierte Mitteldruck-Chromatographiesystem, das für die schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) entwickelt wurde, verwendet zwei Pumpen, um gleichzeitig zwei verschiedene Puffer zu pumpen, und ist in der Lage, eine Vielzahl von Probenvolumina von 250 μl bis 100 ml zu injizieren. Die Sample-Schleife (in diesem System als Dynaloop bekannt) ermöglicht es, größere Probenvolumina zu injizieren. Das System kann mit der Chromlab-Software betrieben werden, die die Erstellung kundenspezifischer Methoden, die Manipulation von Reinigungsläufen und die Analyse von UV-Peaks und Proteinfraktionen ermöglicht.

Protokoll

1. Vorbereitung der Probe

1. Um rekombinantes FEN1 zu reinigen, exprimieren Sie das Konstrukt (pET-FCH-FEN1) in BL21(DE3)-Zellen, wie zuvor von Ononye et ^al.8 beschrieben.
   1. Beimpfen Sie das LB-Medium (Tabelle 1) mit 1 % Übernachtkultur und züchten Sie die Zellen bei 37 °C, bis der OD 0,6 erreicht.
   2. Induzieren Sie mit 0,4 M Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) und züchten Sie die Kultur für weitere 3 Stunden.
   3. Ernten Sie die Zellen, indem Sie die Kultur bei 5.000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Lagern Sie das Pellet in einem -80°C Gefrierschrank.
   4. Nehmen Sie das Zellpellet am Tag der Reinigung aus dem -80 °C-Gefrierschrank, lassen Sie es auf Eis auftauen und resuspendieren Sie das Pellet in 100 mL Lysepuffer (Tabelle 1).
      HINWEIS: Das Zelllysat sollte während der Handhabung immer auf Eis gelegt werden, um eine Proteolyse zu verhindern. Nach dem Auftauen muss der gesamte Reinigungsprozess am selben Tag abgeschlossen werden. Das Zelllysat sollte nicht über Nacht im Kühlschrank gelagert werden.
2. Die Suspension wird in ein 250-ml-Becherglas überführt und 15 Minuten lang auf Eis mit 30 s EIN und 30 s AUS bei 35 % Amplitude beschallt.
   HINWEIS: Konsultieren Sie die Einstellungen des Herstellers, um die Amplitude zu ermitteln.
3. Die beschallte Probe wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 30 Minuten lang bei 4 °C bei 27.000 × g geschleudert, um ein klares Lysat zu erhalten. Legen Sie das Zelllysat bis zur Probeninjektion auf Eis in den 4 °C heißen Kühlschrank.

2. Vorbereiten von Affinitätsspalten

1. Montieren Sie die Säulen (eine für das Ni-NTA-Harz und eine für das Kobaltharz) so auf einen Klemmständer, dass die Säulen so gerade wie möglich gehalten werden, ohne dass die Säulen geneigt werden. Stellen Sie sicher, dass der Boden der Säulen mit einem Stopfen verschlossen ist, und fügen Sie 1-2 ml Startpuffer an den Boden jeder Säule hinzu, um Luftblasen während des Bepackens der Säule zu vermeiden.
2. Schütteln Sie die Harzflaschen vorsichtig, bis das Harz vollständig resuspendiert ist. Öffnen Sie die Oberseite der Säulen und gießen Sie kontinuierlich 10 ml jeder Aufschlämmung ein, um den Einschluss von Luftblasen zu vermeiden. Gießen Sie das Harz gegen einen Metallspatel oder einen Glasstab, der am Rand der Säule gehalten wird, um Luftblasen in der Säule zu vermeiden.

3. Säulenpackung mit einem Durchflussadapter

1. Ziehen Sie den Stopfen aus der Säule und verbinden Sie den Boden mit einem Ende des Schlauchs. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit dem UV-Anschluss des FPLC-Systems.
2. Stellen Sie sicher, dass das Bettstützgehäuse in den Durchflussadapterkörper eingezogen wurde, und schieben Sie den Durchflussadapterkörper auf die Oberseite der Säule (Abbildung 2A). Wenn sich die Nockenverriegelung in Position 1 befindet, senken Sie den Durchflussadapter ab und achten Sie darauf, ihn nicht in den Puffer einzuführen (Abbildung 2B). Schalten Sie die Nockenverriegelung auf Position 2 (Abbildung 2B). Schließen Sie den Schlauch an das System an und starten Sie den Durchfluss des Startpuffers für 1-2 Minuten, um den Schlauch von Luft zu befreien und Luftblasen während des Verpackens zu verhindern.
3. Schalten Sie den Riegel zurück auf Position 1 und senken Sie den Durchflussadapter mit einer sanften Bewegung in den Puffer ab, um das Einschließen von Luftblasen zu vermeiden, und schalten Sie den Riegel wieder auf Position 2 ein. Dadurch kann etwas Puffer in den Durchflussadapter eindringen und verbleibende Blasen entfernt werden.
4. Schalten Sie die Falle in Position 3 und ziehen Sie die Nockenbasis und den Sicherungsring fest (Abbildung 2B).
5. Starten Sie den Pufferfluss bei 10 mL/min, um die Säule zu packen. Fahren Sie mit diesem Schritt für 3 Minuten fort oder bis das Harz gut verpackt ist.

4. Grundieren der Probenschleife des FPLC-Systems

1. Verbinden Sie den Schlauch von der Oberseite der Probenschleife mit der Schleife E des FPLC-Systems (Abbildung 3).
2. Verbinden Sie den Schlauch vom Boden der Probenschleife mit Abfall 2 des FPLC-Systems.
3. Führen Sie ein Ende des Schlauchs in die Säulenöffnung des FPLC-Systems ein und legen Sie das andere Ende in die Abfallflasche.
4. Den Schlauch von Pumpe A in gefiltertes doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O) einführen.
5. Doppelklicken Sie mit der Software auf die Pumpeneinstellungen (Abbildung 4A, Beschriftung 2) und wählen Sie die Einspritzschleife der Systempumpe (Abbildung 4C).
6. Klicken Sie auf die Flussrateneinstellungen (Abbildung 4A, mit 1 beschriftet) und ändern Sie die Durchflussrate auf 10 mL/min. Geben Sie 0 % in das Feld %B ein (Abbildung 4B).
7. Starten Sie den Durchfluss, um die Probenschleife mit Wasser zu spülen, wodurch die Gleitdichtung nach unten gedrückt wird.
8. Sobald die Gleitdichtung den Boden der Probenschleife erreicht hat, stoppen Sie den Durchfluss. Pumpe A von ddH₂O auf den Startpuffer umschalten. Verbinden Sie den Schlauch von der Oberseite der Probenschleife mit Abfall 2 und den von unten mit der Schleife E. Lassen Sie den Schlauch von der Säulenöffnung im Abfall.
9. Beginnen Sie den Fluss bei 10 mL/min. Sobald die Schiebedichtung, die durch den eingehenden Startpuffer nach oben gedrückt wird, den oberen Rand der Probenschleife erreicht, stoppen Sie den Durchfluss. Die Probenschleife ist nun bereit für die Probeninjektion.

5. Injektion der Probe

1. Doppelklicken Sie auf die Pumpeneinstellungen und wählen Sie Manuelle Lastschleife (Abbildung 4C).
2. Schrauben Sie den Schlauch von Loop E ab und legen Sie ihn in den Abfallbehälter.
3. Verbinden Sie den Schlauch vom Säulenanschluss mit dem Schlauch oben auf dem Durchflussadapter.
4. Entnehmen Sie die Probe mit einer 30-ml-Spritze; Befestigen Sie dann die Spritze am Adapter für den Injektionsanschluss.
5. Schrauben Sie die Spritze in den Injektionsanschluss und injizieren Sie die Probe, wobei Sie darauf achten, dass sie sichtbar in die Probenschleife injiziert wird. Lagern Sie 100 μl der Probe ( Label-Eingangslysat) in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei -20 °C für die SDS-PAGE-Analyse.
   HINWEIS: Abhängig vom Gesamtprobenvolumen können 2-3 Injektionen erforderlich sein.
6. Stecken Sie den Einspritzanschluss mit der Säulenkappe.
7. Schließen Sie den Schlauch von der Unterseite der Probenschleife wieder an den Anschluss der Schleife E an.
8. Legen Sie den Schlauch von Pumpe B in den Elutionspuffer.

6. Methodenerstellung und -analyse mit der systemgekoppelten FPLC-Software

1. Navigieren Sie zur Registerkarte Start, und wählen Sie Neue Methode aus.
2. Wählen Sie in der linken Spalte die Registerkarte Methodeneinstellungen aus, navigieren Sie zum Dropdown-Menü Spaltentyp , und wählen Sie Benutzerdefiniert aus (Abbildung 5).
3. Geben Sie das Säulenvolumen (5 ml) ein.
4. Geben Sie die gewünschte Durchflussrate für den Lauf ein (1 mL/min).
5. Navigieren Sie zur Einheitenauswahl und wählen Sie CV (Spaltenvolumen) als Methodenbasiseinheit aus.
6. Stellen Sie sicher, dass Eingang A auf Puffer A und Eingang B auf Puffer B (Standardeinstellung) eingestellt ist.
7. Wählen Sie im Menü auf der linken Seite die Registerkarte Methodengliederung aus. Fügen Sie die Schritte der Aufreinigung in der folgenden Reihenfolge hinzu: Äquilibrierung, Probenapplikation, Säulenwäsche und Elution.
   1. Stellen Sie unter Äquilibrierung das Äquilibrierungsvolumen auf 10 CV ein. Stellen Sie sicher, dass die Puffereinstellung bei 0 % B gehalten wird.
   2. Legen Sie auf der Registerkarte "Beispielanwendung " das Probenvolumen fest, indem Sie die Beispielschleife beobachten. Die Position der Schiebedichtung zeigt das Probenvolumen an.
   3. Stellen Sie unter Spaltenwäsche die Waschmenge auf 5 CV ein. Deaktivieren Sie die Bruchsammlung für diesen Schritt. Sammeln Sie die Wäsche während des Laufs als Ganzes in einem Becherglas, anstatt sie als Fraktionen zu sammeln.
   4. Stellen Sie für die Elution die Gradientenlautstärke auf 14 CV ein, beginnend mit 0 % Puffer B bis 100 % Puffer B.
8. Speichern Sie die Methode, und starten Sie die Ausführung.
9. Stellen Sie sicher, dass der Fraktionssammler an der Position des ersten Bruchs beginnt.
10. Geben Sie den Namen der Ausführung ein, und klicken Sie auf Start.
11. Überwachen Sie während der Äquilibrierungsphase die UV-Kurve in Echtzeit. Stellen Sie sicher, dass alle Verbindungen sicher sind und keine Leckagen auftreten. Bestätigen Sie einen vollständigen Kreislauf, indem Sie nach dem Puffer suchen, der in den Abfallbehälter fließt. Wenn sich die UV-Kurve in den letzten Minuten der Äquilibrierung nicht stabilisiert hat, verlängern Sie den Äquilibrierungsschritt, bis die Stabilisierung erreicht ist (Abbildung 6).
12. Schalten Sie zum Zeitpunkt der Probenapplikation die Röhrchen, die in den Abfallbehälter gelangen, auf ein sauberes Becherglas um. Sammeln Sie während dieses Schritts die ungebundenen Proteine, die als Durchfluss aus den Abfallröhrchen strömen (Bezeichnung als FT).
13. Achten Sie auf einen starken Anstieg der UV-Kurve, der wahrscheinlich den maximal möglichen Messwert von 3.000 mU erreicht (Abbildung 6).
    HINWEIS: Eine typische Kurve pendelt sich während des größten Teils des Beispielanwendungsschritts bei 3.000 mU ein.
14. Während der Säulenwäsche, wenn verbleibende ungebundene Proteine abgewaschen werden und nur gebundene Proteine auf dem Harz verbleiben, ist auf einen starken Abfall der UV-Kurve zu achten (Abbildung 6). Wenn die UV-Kurve am Ende des Waschschritts nicht gesunken ist, verlängern Sie den Schritt, indem Sie auf Schritt halten, bis der UV-Wert ausreichend gesunken ist. Zu Beginn dieses Schritts übertragen Sie die Abfallrohre aus dem FT-Becherglas in ein anderes sauberes Becherglas mit der Bezeichnung Wash.
15. Wenn der Elutionsschritt beginnt, stellen Sie sicher, dass sich der Fraktionssammler in Position bewegt und mit dem Sammeln von Fraktionen beginnt. Visualisieren Sie die Elution von Proteinen, indem Sie nach Peaks in der UV-Kurve suchen (Abbildung 6).
16. Navigieren Sie nach Abschluss der Ausführung zur Registerkarte Start , und wählen Sie Ausführung öffnen aus. Öffnen Sie den Lauf, um das Chromatogramm anzuzeigen, und wählen Sie im oberen Menü die Option Peak-Integration , um die während des Laufs erzielten Peaks zu markieren.
17. Wählen Sie die Registerkarte Fraktionen , um die Fraktionen zu visualisieren, die eluiertes Protein enthalten.

7. SDB PAGE-Analyse

1. Mischen Sie 15 μl jeder proteinhaltigen Fraktion mit 5 μl SDS-Probenladepuffer (Tabelle 1). Erhitzen Sie die Proben 5 Minuten lang bei 95 °C.
2. Laden Sie die Proben in vorgefertigte Gele und lassen Sie sie 45 Minuten lang bei 160 V zusammen mit dem vorgefärbten Proteinmarker laufen.
3. Färben Sie die Gele 30 Minuten lang in Coomassie Brilliant Blue Färbelösung (Tabelle 1).
4. Waschen Sie das Gel in ddH₂O (3x wiederholen).
5. Entfärben Sie das Gel 1 h lang in einer Entfärbungslösung (Tabelle 1).
6. Beobachten Sie die Proteinbanden; FEN1 bei der 42 kDa-Marke nachweisen.
7. Poolfraktionen, die FEN1 enthalten, und konzentrieren Sie das Pool mit einem 10 kDa-Zentrifugalfilter. Aliquotieren und im -80° °C Gefrierschrank aufbewahren.

Ergebnisse

BL21 (DE3)-Zelllysate, die hFEN1 exprimieren, wurden durch äquilibrierte Ni-NTA- und TALON-Harze geleitet. Das Ni-NTA-Harz ist mit Ni²⁺ -Ionen geladen und hat ein hohes Bindungsvermögen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Ni-NTA-Harz im Vergleich zum TALON-Harz eine höhere Menge an FEN1 ergibt (Abbildung 7). Es ist auch bekannt, dass das Ni-NTA-Harz unspezifisch an andere chromosomal exprimierte Proteine bindet. Das Zelllysat, das durch das kobaltbasierte Harz geleitet wurde, wurde mit hoher Reinheit, aber geringerer Ausbeute im Vergleich zu Ni-NTA gereinigt. Wie viele andere DNA-bindende Proteine wurde FEN1 weiter durch Größenausschlussharz geleitet, um die Verunreinigungen zu entfernen. hFEN1 kann an der 43 kDa-Marke identifiziert werden.

Abbildung 1: Mechanismus der Klappenspaltung durch hFEN1: Nachführung versus Einfädeln. Ursprünglich ging man davon aus, dass FEN1 (gelb dargestellt) an das 5'-Ende der Klappenstruktur bindet und durch dieses zur Klappenbasis (links) führt. Spätere Studien zeigten, dass FEN1 zuerst an die Lappenbasis bindet und die 5'-Klappe durch ihr aktives Zentrum fädelt (rechts). Abkürzung: hFEN1 = humane Lappenendonuklease 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Durchflussadapter. (A) Komponenten des Durchflussadapters, die für den Säulenpackungs- und Reinigungsprozess verwendet werden; (B) die drei Positionen der Nockenverriegelung, die zum Festziehen/Lösen des O-Rings und zum Fixieren des Adapters verwendet werden. Das vergrößerte Bild zeigt den Zustand des O-Rings (locker/fest) an den Positionen 1, 2 und 3 von oben nach unten. Die Bilder wurden mit Genehmigung von ⁹. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Injektionsmodul des Fast-Proteinflüssigkeitschromatographie-Systems. Die verschiedenen Anschlüsse des Injektionsmoduls verbinden das schnelle Proteinflüssigkeitschromatographiesystem mit der Säule, dem Probenkreislauf und dem Abfall. Das Bild wurde mit Genehmigung von ¹⁰. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Systemsteuerung. (A) Registerkarte Systemsteuerung, auf der die Durchflusseinstellungen manipuliert und der Durchflussweg angezeigt werden kann; (B) Fenster mit den Einstellungen der Durchflussmenge; (C) Fenster mit den Pumpeneinstellungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Fenster mit den Methodeneinstellungen. Ein Fenster zum Eingeben von Aufreinigungsdetails, wie z. B. Säulentyp, Säulenvolumen, Methodenbasiseinheit und Flussrate für den Lauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Schematische Darstellung der UV-Kurve während der FPLC : Die UV-Kurve steigt und fällt entsprechend der Reinigungsphase. Zu Beginn des Gleichgewichts kann die UV-Kurve aufgrund des Vorhandenseins von Luftblasen oder Verunreinigungen in den Schläuchen verzerrt werden. Wenn das Gleichgewicht fortschreitet, sollte sich die Kurve als flache Linie stabilisieren; Während der Probeninjektion, wenn Proteine, die nicht an das Harz gebunden sind, herausfließen, steigt die UV-Kurve an, bis ein maximaler Schwellenwert erreicht ist. Der Waschschritt, der verbleibende ungebundene Proteine ausspült, zeigt eine allmähliche Abnahme der UV-Messungen. Während der Elutionsphase, wenn das Zielprotein eluiert wird, ist schließlich ein Peak in der UV-Kurve zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: SDS PAGE Gelbild. Bahn 1 - Molekulargewichtsmarker; Spur 2-1 % Ni-NTA-Eingang (Zelllysat); Spur 3-1 % Durchfluss aus dem Ni-NTA-Harz; Spur 4-hFEN1 gereinigt aus Ni-NTA-Harz; Spur 5-1% Input (Zelllysat); Spur 6-1 % Durchfluss aus dem Harz auf Kobaltbasis; Spur 7-hFEN1, gereinigt aus kobaltbasiertem Harz; Der schwarze Pfeil stellt FEN1 bei 42,5 kDa dar. Abkürzungen: SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat; MW = Molekulargewicht; hFEN1 = humane Lappen-Endonuklease 1; NTA = Nitrilotriacetinsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Puffer und Lösungen	Komponenten
Lyse-Puffer	50 mM Tris–HCl [pH 8,0]
	500 mM NaCl
	1 mM Beta-Mercaptoethanol (BME)
	1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
	1 mM EDTA
	1 Tablette vollständiger Proteasehemmer
	10 mM Imidazol
	10% Glycerin
Äquilibrierung/Waschpuffer	50 mM Tris–HCl [pH 8,0]
	500 mM NaCl
	1 mM BME
	1 mM PMSF
	10 mM Imidazol
	10% Glycerin
Elutions-Puffer	50 mM Tris–HCl [pH 8,0]
	500 mM NaCl
	1 mM BME
	1 mM PMSF
	1 M Imidazol
	10% Glycerin
SDS-Puffer zum Laden von Proben	900 μL 4x Laemmli Probenpuffer
	100 μL BME
Coomassie Brillantblau-Färbelösung	50% ddH2O
	40% Methanol
	10% Essigsäure
	0.1% Coomassie Brillantblau R-250
Entfärbungslösung	50% ddH2O
	40% Methanol
	10% Essigsäure

Tabelle 1: Zusammensetzung des Puffers.

Diskussion

Die Affinitätschromatographie ist eine weit verbreitete Technik zur Aufreinigung von DNA-bindenden Proteinen. Die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) ist eine spezielle Art der Affinitätschromatographie, bei der Metallionen verwendet werden, um die Histidinreste einer Peptidsequenz einzufangen. Aus diesem Grund wird der "6X-His-Tag" oder "Poly-His-Tag" an den N-Terminus oder den C-Terminus von Proteinen angehängt, die gereinigt werden sollen. Nickel und Kobalt sind die am häufigsten verwendeten Metallionen und variieren in ihrer Verträglichkeit mit Reagenzien wie BME und DTT, die normalerweise bei der Reinigung verwendet werden. Obwohl Aufreinigungen bei Konzentrationen von 1 mM BME oder DTT durchgeführt wurden, kann die Verwendung dieser Reagenzien immer noch unzuverlässig sein. Während der Äquilibrierung kann eine Inkompatibilität beobachtet werden. Wenn der Puffer, der durch das Harz fließt, braun erscheint, deutet dies auf eine Oxidation der Metallionen hin und kann die Metallionen aus dem Harz entfernen. Dadurch könnte die Bindungskapazität des Harzes drastisch reduziert werden.

Um eine hohe Reinheit und Ausbeute des Proteins zu gewährleisten, sollten Affinitätswechselwirkungen zwischen Metallionen und dem His-Tag gegenüber anderen möglichen ladungsbasierten Wechselwirkungen bevorzugt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass das gesamte Protein auf einmal eluiert wird, anstatt über verschiedene Phasen der Elution zu eluieren. Um dies zu erreichen, sollte das Protein während der Aufreinigung eine sehr geringe Ladung tragen. Liegen die pH-Werte der Puffer näher am isoelektrischen Punkt des Zielproteins, kann die Ladung des Proteins niedrig gehalten werden. Da der isoelektrische Punkt von FEN1 bei etwa 8,8 liegt, werden unsere Puffer bei pH 8 gehalten.

Es wird angenommen, dass das mit Ni-Ionen beladene Ni-NTA-Harz eine größere Proteinbindungskapazität aufweist und im Vergleich zum kobaltbasierten Harz TALON eine höhere Proteinmenge liefert. Dies bedeutet auch, dass es ein größeres Potenzial für die Bindung unspezifischer Proteine und damit eine geringere Reinheit gibt. Die geringere Bindungskapazität von TALON wird durch eine höhere spezifische Bindung und die Ausbeute an hochreinem Protein ergänzt. Dies steht im Einklang mit unseren Ergebnissen, die eine höhere Ausbeute an aus Ni-NTA gereinigtem Protein im Vergleich zu TALON zeigen.

Unabhängig vom Harz werden Reinheit und Ausbeute erheblich durch die Säulenpackung beeinflusst. Eine effiziente Packung kann mit dem Durchflussadapter erreicht werden, der an das automatisierte Chromatographiesystem^{NGC 9} angeschlossen ist. Bei ausreichend hohen Durchflussraten kann der Durchflussadapter das Harz effektiv verpacken und die Ansammlung von Puffer in der Säule verhindern. Der Durchflussadapter ermöglicht zusammen mit dem NGC den genauen Vergleich beider Harze aufgrund der Regulierung von Flussrate, Druck und Elutionsgradient sowie die effiziente Sammlung von Proteinfraktionen.

Mit der Chromlab-Software können die Laufbedingungen in Echtzeit überwacht werden¹⁰. Die Durchflussmenge kann während des gesamten Laufs jederzeit geändert werden. Während der Probenanwendung kann der Systemdruck den Schwellenwert (600 psi) überschreiten. In diesem Fall kann durch Verringern der Durchflussrate während des Probenauftragsschritts der Druck reduziert werden. Die Software verfügt außerdem über eine Hold-Step-Funktion , über die jeder Schritt beliebig erweitert werden kann. Diese Funktion ist besonders hilfreich bei Säulenwasch- und Elutionsschritten. Während der Säulenwäsche wird erwartet, dass das UV-Diagramm absinkt und fast 0 erreicht - dies bedeutet, dass die meisten der ungebundenen Proteine aus dem Harz ausgewaschen wurden. Falls die UV-Linie weiter ansteigt oder nicht heruntergefahren wird, kann der Waschschritt verlängert werden, bis der erwartete Graph zu sehen ist. In ähnlicher Weise kann während der Elution die Elution des Zielproteins durch Peaks im UV-Diagramm visualisiert werden. Wenn unerwarteterweise keine Peaks sichtbar sind, kann der Elutionsschritt verlängert werden, bis erwartete Peaks beobachtet werden.

Tipps und Tricks
Während des Äquilibrierungsschritts muss der Puffer in die Säule injiziert werden, und der Abfallpuffer sollte kontinuierlich in die Abfallflasche abgegeben werden. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Verbindungen dicht und dicht sind. Im Falle eines Lecks an irgendeinem Ort des NGC müssen alle Öffnungen in der Umgebung überprüft werden, da der Ursprung des Lecks von dem Ort abweichen kann, an dem das Leck bemerkt wird. Wenn der Durchfluss gestartet wurde, aber kein Puffer in die Säule eintritt, ist es wahrscheinlich, dass Luft in den Rohren eingeschlossen ist. Spülen Sie das System, bevor Sie fortfahren.

Wenn während der Probeninjektion der Gegendruck des Systems der Injektion widersteht, muss der Schlauch von der Schleife E abgeschraubt und für die Dauer der Injektion in die Abfallflasche gelegt werden. Es ist wichtig, es wieder in Loop E zu schrauben, bevor Sie das Programm starten. Falls sich der Äquilibrierungspuffer oder die Probe während des Laufs in der Säule ansammelt, muss der Lauf pausiert und der Durchflussadapter entfernt werden. Der Schlauch muss vom Boden der Säule abgeschraubt und der Puffer oder die Probe durchgelassen werden. Wenn die Probe durchfließt, stellen Sie sicher, dass Sie sie als Durchfluss sammeln.

Wenn Fraktionen, die auf SDS PAGE-Gel ausgeführt werden, einen hohen Gehalt an Verunreinigungsproteinen aufweisen, können Fraktionen auf beiden Seiten der im Chromatogramm sichtbaren Peaks ausgeführt werden. Bei Proteinen mit geringer Expression zeigen reine Fraktionen häufig keine signifikanten Peaks im UV-Bereich.

Das Verständnis der Unterschiede zwischen den Eigenschaften des Nickelbasisharzes und des Kobaltbasisharzes ermöglicht die Auswahl des Harzes, das für die zukünftigen Anwendungen des gereinigten Proteins am besten geeignet ist. So wird beispielsweise erwartet, dass Proteine, die in biochemischen In-vitro-Assays verwendet werden, von höchstmöglicher Reinheit sind, eine Situation, in der das kobaltbasierte Harz geeignet ist. Wird das Protein jedoch für die Herstellung von Antikörpern verwendet, ist für den Prozess eine signifikante Ausbeute an gereinigtem Protein erforderlich. Das Ni-NTA-Harz könnte in diesem Fall als bessere Option dienen. Ziel dieses Artikels war es, die Unterschiede zwischen diesen Harzen durch die Reinigung von FEN1 herauszuarbeiten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4x Laemmli Probenpuffer	BioRad	1610747
Essigsäure	Merck	UN2789
Beta-Mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab Software Version 6.1.27.0	BioRad		betreibt das NGC-System
Complete MINI Proteasehemmer Tablette	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column Glas	BioRad	7371512
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow-Adapter	BioRad	7380014
Glycerin	Dot Scientific
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX Gele	BioRad	4561084
NGC Chromatographiesystem	BioRad		automatisiertes Flüssigkeitschromatographiesystem
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-Methyl-Sulfonylfluorid	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Natriumchlorid	Dot Scientific	DSS23020
TALON Metall-Affinitätsharz	Takara	635502
Tris Base		DST60040

DSG22020