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Glykan-Protein-Wechselwirkungen entwirren: Kernspinresonanz (NMR) als Rettung

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DOI:

10.3791/66530

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17. Mai 2024

 ,  ,  ,  , 
1CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), 2lkerbasque, Basque Foundation for Science, 3Centro de Investigacion Biomedica En Red de Enfermedades Respiratorias

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung, Verarbeitung und Analyse einer Reihe von NMR-Experimenten zur Charakterisierung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen in Lösung beschreibt. Es werden die gängigsten ligandenbasierten und proteinbasierten Methoden skizziert, die zweifellos zu den Bereichen der strukturellen Glykobiologie und der molekularen Erkennungsstudien beitragen.

Zusammenfassung

Die Wechselwirkungen von Glykanen mit Proteinen modulieren viele Ereignisse, die mit Gesundheit und Krankheit zusammenhängen. Tatsächlich sind die Etablierung dieser Erkennungsereignisse und ihre biologischen Konsequenzen eng mit den dreidimensionalen Strukturen beider Partner sowie mit ihren dynamischen Merkmalen und ihrer Präsentation auf den entsprechenden Zellkompartimenten verbunden. NMR-Techniken sind einzigartig, um diese Eigenschaften zu entwirren, und in der Tat wurden verschiedene NMR-basierte Methoden entwickelt und angewendet, um die Bindungsereignisse von Glykanen mit ihren assoziierten Rezeptoren zu überwachen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erfassung, Verarbeitung und Analyse von zwei der leistungsfähigsten NMR-Methoden , dieim Bereich der NMR-Glykobiologie eingesetzt werden, 1 H-Sättigungstransferdifferenz (STD) und 1 H,15N-Heteronukleare Single Quantum Kohärenz (HSQC) Titrationsexperimente, die komplementär Informationen aus der Glykan- bzw. Proteinperspektive liefern. In Kombination bieten sie ein leistungsfähiges Instrumentarium, um sowohl die strukturellen als auch die dynamischen Aspekte molekularer Erkennungsprozesse aufzuklären. Dieser umfassende Ansatz verbessert unser Verständnis der Glykan-Protein-Wechselwirkungen und trägt dazu bei, die Forschung auf dem Gebiet der chemischen Glykobiologie voranzutreiben.

Einleitung

Die molekulare Erkennung von Glykanen ist für viele Prozesse im Zusammenhang mit Gesundheit und Krankheit unerlässlich. Die Spezifität und Selektivität biologischer Rezeptoren (Lektine, Antikörper, Enzyme) für Glykane hängt stark davon ab, wie das prekäre Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Komponenten der Enthalpie (CH-π und van der Waals, Wasserstoffbrückenbindungen, Elektrostatik) und der Entropie (Hydrophobie, Dynamik, Solvatations-Desolvatation)1 eingestellt wird.

Angesichts der großen chemischen Vielfalt und dynamischen Natur von Glykanen werden NMR-Methoden seit mehr als 25 Jahren in großem Umfang eingesetzt, um Glykanwechselwirkungenzu analysieren 2, da diese Methoden hervorragende Informationen über molekulare Erkennungsereignisse mit präzisen Details bei atomarer Auflösung 3,4 liefern, selbst wenn die erforderlichen Wechselwirkungsnachweise nicht mit anderen Methoden abgerufen werden können. Ein wichtiger Punkt ist, dass die NMR vielseitig ist und die Untersuchung dynamischer Ereignisse auf atomarer Ebene auf verschiedenen Zeitskalen ermöglicht, was bei weitem die beste Technik für die Untersuchung der Struktur, Konformation und Dynamik von Glykanen in Lösung darstellt. Nichtsdestotrotz kann die Entflechtung dieser Informationen ein recht komplexer Prozess sein, der den Einsatz klar definierter Strategien in Verbindung mit einer sorgfältigen Datenanalyse erfordert5.

NMR-Techniken sind vielfältig und in der Tat gibt es viele Methoden, die eingesetzt werden können, um Glykan-Protein-Wechselwirkungen zu entschlüsseln6. Wir beschreiben hier zwei grundlegende NMR-Ansätze, die derzeit zur Entschlüsselung von Glykan-Rezeptor-Wechselwirkungen eingesetzt werden 7,8, wobei der Schwerpunkt darauf liegt, wie die Darstellung des Schlüssel-Glykan-Epitops sowie der Proteinbindungsstelle 9 entwirrt werdenkann.

Bei jedem molekularen Erkennungsereignis, wenn ein Rezeptor an einen gegebenen Liganden bindet, findet ein chemischer Austauschprozess statt, der viele NMR-Parameter der an der Bindung beteiligten Teilnehmer beeinflusst10. Aus der NMR-Perspektive kann die Interaktion daher entweder aus der Sicht des Glykanliganden oder aus der des Proteinrezeptors11 überwacht werden. Im Allgemeinen handelt es sich bei dem Proteinrezeptor um ein großes Biomolekül (langsame Rotationsbewegung mit Raten in der ns-Zeitskala und daher schnelle transversale Relaxation), während das interagierende Glykan als kleines bis mittelgroßes Molekül betrachtet werden kann (schnelle Rotationsbewegung mit Raten auf der ps-Zeitskala und langsame transversale Relaxation)12. Aus der Standardperspektive sind die NMR-Signale des Glykans schmal, während die des Rezeptors breit sind13.

Ligandenbasierte NMR-Methoden beruhen auf der dramatischen Veränderung, die viele Glykan-NMR-Parameter beim Übergang vom freien in den gebundenen Zustanderfahren 14. STD-NMR ist die am häufigsten eingesetzte experimentelle NMR-Technik zur Bewertung verschiedener Glykanbindungsmerkmale15, von der Ableitung des Vorhandenseins einer Bindung im Lösungszustand bis zur Bestimmung des Glykanbindungshetops; das heißt, die Atome des Liganden, die mit dem Proteinrezeptor16 in Kontakt stehen.

Alternativ dazu überwachen rezeptorbasierte NMR-Methoden die Veränderungen, die in den Signalen des Proteinrezeptors in Gegenwart des Glykans im Vergleich zu den für den Apo-Zustand17 aufgezeichneten Veränderungen stattfinden. Diese konzentrieren sich hauptsächlich auf das Screening der chemischen Verschiebungsstörungen der Proteinsignale zwischen beiden Zuständen. Das am häufigsten verwendete Experiment ist 1 H-15N HSQC oder seine TROSY-Alternativen18.

Die Kombination beider Ansätze ermöglicht die Anwendung der NMR auf viele verschiedene Systeme, die ein breites Spektrum an Affinitäten aufweisen. Für die rezeptorbasierten NMR-Methoden muss jedoch im Gegensatz zu denen, die auf dem Liganden basieren, eine relativ große Menge an löslichem, nicht aggregiertem, stabilisotopenmarkiertem (15N) Protein zur Verfügung stehen.

Im Folgenden beschreiben wir beide Methoden und heben ihre Stärken und Schwächen hervor. Beachten Sie, dass die im Protokoll beschriebenen grundlegenden Schritte als Beispiele für die Verwendung von Bruker-Spektrometern dienen. Folglich stimmen die Namen von Befehlen und Parametern mit denen überein, die in TopSpin (der Spektrometersteuerungssoftware von Bruker) verwendet werden.

Protokoll

1. Sättigungstransferdifferenz NMR (STD-NMR)

HINWEIS: In den folgenden Zeilen werden grundlegende Verfahren zur Erfassung, Verarbeitung und Analyse von STD-NMR-Experimenten beschrieben. Diese Schritte dienen als Beispiel für die Nützlichkeit der Technik für den Nachweis der Ligandenbindung und für die Aufklärung des Ligandenbindungsepitops. Für ein tieferes Verständnis des Designs und der Erfassung von NMR-Experimenten lesen Sie bitte das entsprechende Herstellerhandbuch, das dem NMR-Gerät beiliegt.

  1. Erwerb
    1. Bereiten Sie die Probe mit dem Protein-Liganden-Komplex vor. Verwenden Sie Glykan:Lektin-Molverhältnisse zwischen 10:1 und 100:1 mit Proteinkonzentrationen zwischen 0,01 und 0,2 mM. Für die Wechselwirkung von hGalectin-7 mit LacNAc ist ein Protein-Liganden-Verhältnis von 50:1 in deuterierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 zu verwenden.
      HINWEIS: Der Proteinrezeptor sollte rein und im Puffer der Wahl löslich sein (im Falle von STD-NMR-Experimenten sind deuterierte Versionen des entsprechenden Puffers vorzuziehen, um die mögliche 1-H-NMR-Signalinterferenz zu reduzieren). Die Konzentration des Proteins wird im Vorfeld mit einem Spektralphotometer überprüft, um die Extinktion bei 280 nm zu messen.
    2. Übertragen Sie aus der vorbereiteten Lösung mit einer Pipette ein Gesamtvolumen von 0,6 ml in ein 5-mm-NMR-Röhrchen.
    3. Bereiten Sie das NMR-Instrument auf die erforderliche Temperatur vor (übliche Experimenttemperaturen liegen zwischen 10 °C und 45 °C). Öffnen Sie den Temperaturkontrollmonitor mit dem Befehl edte und stellen Sie die gewünschte Temperatur ein. Für die hGalectin-7/LacNAc-Studie wurde die Temperatur auf 25 °C eingestellt.
    4. Generieren Sie einen neuen Datensatz, der die zg-Pulssequenz enthält.
      1. Öffnen Sie für einen einfachen Vorgang ein vorhandenes Experiment, und geben Sie den Befehl edc ein. Es erscheint ein Dialogfenster, in dem Sie den Titel, die Eigenschaften (Probenspezifikationen, Lösungsmittel) und einige Parameter des Experiments festlegen können.
      2. Wenn eine Änderung der ursprünglichen Impulssequenz erforderlich ist, navigieren Sie durch die Fenster ased (Parameter) und AcquPars (Erfassungsparameter). Wählen Sie an dieser Stelle das gewünschte Pulsprogramm aus der Bibliothek des Spektrometers aus.
      3. Für ein Standard-NMR-Spektrum von 1H wählen Sie die zg-Pulssequenz aus der verfügbaren Liste aus.
        HINWEIS: Bei Proben mit erhöhtem Wassergehalt kann die Verwendung von Wasserunterdrückungsschemata erforderlich sein, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Die Verwendung von Pulssequenzen wie zgesgp, die Anregungsformungsmodule bieten, die eine hervorragende Unterdrückung ermöglichen, aber die Phase der verbleibenden Signale steuern, sind wünschenswert. Weitere Informationen zu den Arten von Wasserunterdrückungsschemata und ihren Hauptmerkmalen finden Sie im NMR-Tutorial des Herstellers.
    5. Führen Sie die NMR-Probe in die Sonde ein, indem Sie die Probenliftluft aktivieren. Verwenden Sie den Befehl ej, positionieren Sie die Probe auf der Oberseite des Magneten und deaktivieren Sie den Probenlift mit dem Befehl ij.
      HINWEIS: Um die Probe mit einem Autosampler in den Magneten zu injizieren, verwenden Sie den Befehl sx gefolgt von der Positionsnummer n, die der Position des NMR-Röhrchens in der Autosampler-Schale entspricht.
    6. Sperren Sie das Lösungsmittelsignal, indem Sie den Befehl lock eingeben und dann das entsprechende Lösungsmittel aus dem Menü auswählen.
    7. Sobald die Probe in die Sonde eingeführt wurde, schließen Sie den Abstimmungs- und Abgleichsprozess mit dem automatischen Modul atma oder dem manuellen Modul atmm ab.
    8. Starten Sie das automatische Shimming über den Befehl topshim gui. Dadurch wird eine grafische Oberfläche geöffnet, in der die Unterlegscheibe Dimension 1D ausgewählt und gestartet wird.
      HINWEIS: Um Shimming-Instabilitäten aufgrund subtiler Feld- oder Temperaturschwankungen zu minimieren, kann Autoshim für die Versuchsaufnahme aktiviert werden. Dies kann durch Aufrufen des BSMS-Steuerungsfensters und Klicken auf Autoshim erfolgen. Die Verblendung in eine grüne Hervorhebung zeigt an, dass Autoshim aktiviert wurde. Bitte beachten Sie, dass bei der Verwendung von Autoshim potenzielle Probleme mit der Instabilität der Probe unbemerkt bleiben müssen. Daher ist beim Einsatz von Autoshim Vorsicht geboten.
    9. Ermitteln Sie den 1H 90° Impuls. Dies kann automatisch durch den Pulsecal-Befehl erfolgen.
    10. Ändern Sie verschiedene Parameter im AcquPars-Fenster. Für ein reguläres 1-H-NMR-Spektrum stellen Sie die Anzahl der Scans (NS) auf 32 und das gewünschte Spektralfenster (SW) auf ca. 12 Seiten/Minute.
      HINWEIS: Die zgesgp-Impulssequenz enthält ein Modul zur Lösungsmittelunterdrückung, um das verbleibende HDO-Signal zu eliminieren, das in der Mitte des Spektrums zentriert sein sollte. Zu diesem Zweck muss O1 in AcquPars genau definiert werden.
    11. Stellen Sie die Empfängerverstärkung ein, um ein Überlaufen mit dem automatischen Befehl rga zu vermeiden.
    12. Erfassen Sie nun das standardmäßige 1-H-NMR-Spektrum mit dem Befehl zg.
    13. Sobald die Erfassung abgeschlossen ist, verarbeiten Sie das Spektrum mit dem Befehl efp . Wenden Sie die Grundlinien- und Phasenkorrekturen über die TopSpin-Menüleiste an.
      HINWEIS: Es werden 1H NMR-Signale beobachtet, die vom Glykan und dem Protein ausgehen (Abbildung 1). Die detaillierte Analyse des erfassten NMR-Spektrums wird für die Durchführung des STD-NMR-Experiments empfohlen, wie in Abschnitt 1.1.14 beschrieben.
    14. Erstellen Sie einen neuen Datensatz und laden Sie die STD-NMR-Pulssequenz hoch, die auf die gleiche Weise verwendet werden soll, wie es für das 1-H-NMR-Experiment in Abschnitt 1.1.4 beschrieben ist. In Bruker-Geräten sind verschiedene Pulssequenzen im Pulsprogrammkatalog verfügbar, die alle mit dem Namen stddiffXXX bezeichnet werden. Die einfachste (stddiff) enthält kein Wasserunterdrückungsschema oder Proteinsuppressionsfilter.
      1. Für Proben mit signifikantem H2O-Gehalt wählen Sie entweder die stddiffgp19- oder stddiffesgp-Sequenzen, die ein Watergate- oder Anregungsformungsmodul enthalten. Im Falle eines Spektrums mit intensiven Protein-NMR-Signalen als Hintergrund wählen Sie die stddiffXXX.3-Sequenzen aus. Optimieren Sie in jedem Fall die entsprechenden spezifischen Parameter für jedes Wasserunterdrückungsmodul (z. B. d19 in Watergate-Schemata).
    15. Definieren Sie die Aus- und Ein-Resonanzfrequenzen für das STD-NMR-Experiment. Suchen Sie die Häufigkeitsliste in den AcquPars-Parametern des ased-Fensters unter dem Eintrag FQ2LIST. Die in Hertz definierten Ein- und Ausresonanzfrequenzen müssen manuell in die Liste geschrieben und unter einem neuen Namen gespeichert werden. Diese neue Liste wird im STD-NMR-Experiment verwendet.
      1. Wählen Sie die On-Resonanz-Frequenz in einem Spektralbereich ohne Glykansignale, normalerweise um δ(1H) 0 oder 6,6 ppm für typische Glykane (Abbildung 1). Stellen Sie die Off-Resonanzfrequenz auf einen Bereich ein, in dem kein Ligand oder Proteinproton zu sehen ist. Er kann sicher auf +18000 oder -18000 Hz eingestellt werden.
    16. Definieren Sie den geformten Impuls, der während der Sättigungszeit verwendet werden soll, in den AcquPars-Parametern des ased-Fensters .
      HINWEIS: Es gibt viele Möglichkeiten. Die Gauß- oder Eburp-Formen können sicher eingesetzt werden, mit einer 90° Breite des selektiven Impulses von 50 ms.
    17. Legen Sie die entsprechenden Parameter im Abschnitt AcquPars fest.
      1. Stellen Sie die Impulslänge von 1H 90° ein.
      2. Legen Sie den Leistungswert für den geformten Impuls fest (geschätzt mit dem Formwerkzeug).
      3. Legen Sie die Gesamtsättigungszeit fest. Es können regelmäßig Werte zwischen 1 s und 4 s verwendet werden.
      4. Stellen Sie die Entspannungsverzögerung auf 3 s ein.
      5. Legen Sie die Anzahl der Scans (NS) auf ein Vielfaches von 8 fest. Normalerweise wird es auf 256, 512 oder 1024 eingestellt, um das richtige Signal-Rausch-Verhältnis in 2er-Sätzen bei jeder Frequenz zu erhalten.
      6. Legen Sie die Anzahl der Dummy-Scans (DS) auf 8 fest.
      7. Legen Sie die Anzahl der Punkte in F2 auf 16k, 32k oder 64k fest.
        HINWEIS: Eine höhere Anzahl von Punkten in F2 führt zu einer verbesserten Auflösung und einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis. Aus diesem Grund ist es dringend ratsam, mindestens 16k Datenpunkte zu verwenden.
      8. Legen Sie die Anzahl der Punkte in F1 fest. Dies ist die Anzahl der zu verwendenden Frequenzen, in diesem Fall 2 (die Ein-Resonanz und die Aus-Resonanz).
        HINWEIS: Gemäß der Konvention bezieht sich F2 auf die direkte Dimension, d. h. die Dimension, entlang der der freie Induktionszerfall (FID) direkt abgetastet wird, während F1 die indirekte Dimension bezeichnet.
      9. Stellen Sie die Empfängerverstärkung (RG) ein, um ein Überlaufen mit dem automatischen Befehl rga zu vermeiden.
    18. Berechnen Sie die Zeit des gesamten Experiments mit dem Befehl expt.
    19. Senden Sie das Experiment zur Erfassung über den Befehl zg.
    20. Überprüfen Sie immer nach einigen Minuten, ob das Experiment ordnungsgemäß abläuft.
  2. Verarbeitung
    HINWEIS: Ein Pseudo-2D-Spektrum wird nach Anwendung des oben beschriebenen Protokolls erhalten. Die Anzahl der Reihen entspricht der Anzahl der verwendeten Frequenzen, typischerweise zwei: die Ein- und die Aus-Resonanz.
    1. Verarbeiten Sie die fid für das erste Experiment.
      1. Nehmen Sie die Fourier-Transformation der fid-Zahl 1 vor (mit dem Befehl efp) und wählen Sie das Ziel der verarbeiteten Spektren (wählen Sie die Prokno-Zahl). Alternativ können Sie den Befehl rser 1 verwenden, um die erste fid zu lesen.
      2. Passen Sie dann den Linienverbreiterungsfaktor mit dem Befehl lb (normalerweise 3-5 Hz) und die Phase an. Um eine manuelle Phase durchzuführen, klicken Sie auf die Registerkarte Prozess und dann auf das Untermenü Phase anpassen . Führen Sie Null- und Korrekturen erster Ordnung durch, indem Sie auf die entsprechende Schaltfläche klicken und ziehen. Speichern Sie die Phasenergebnisse. Führen Sie außerdem eine Baseline-Korrektur mit dem Befehl abs durch.
    2. Lesen Sie die fid für das zweite Experiment und führen Sie die Fourier-Transformation (durch den Befehl efp) mit dem gleichen Zeilenverbreiterungsfaktor durch. Passen Sie die Phase mit denselben Phasenparametern und der gleichen Baseline-Korrektur an und speichern Sie das bearbeitete Spektrum mit einem anderen Code.
    3. Lesen Sie die beiden bearbeiteten Spektren mit der Mehrfachfunktion (Befehl: .md) ab und subtrahieren Sie sie (Off-Resonanz - Ein-Resonanz) mit der in der Mehrfachvisualisierung verfügbaren Schaltfläche (Δ). Das neue Spektrum ist das STD-NMR-Spektrum, das unter einem anderen Code gespeichert wird.
    4. Nehmen Sie eine Überlagerung des STD-NMR-Spektrums mit dem Off-Resonanz-Spektrum vor.
      1. Öffnen Sie das Off-Resonance-Spektrum (fid 1) und geben Sie den Befehl .md ein, um das Fenster mit mehreren Anzeigen zu öffnen. Laden Sie dann das STD-Spektrum hoch.
      2. Vergleichen Sie die Frequenzen und Intensitäten (automatisch oben rechts angezeigt) der Signale im STD-NMR-Spektrum. Dies liefert die gewünschte Information über die Protonen, die sich in der Nähe des Proteins befinden, und ihre relative Nähe. Je höher die relative Intensität, desto näher sind sie am Protein (Abbildung 2).
    5. Messen Sie die Intensitäten (Integrale) im Off-Resonanz-Experiment mit der entsprechenden Software. Gehen Sie in TopSpin auf Analysieren > Integrieren. Definieren Sie die Regionen und schreiben Sie die Integrale in eine Datei (I0).
    6. Messen Sie die Intensitäten (Integrale) im STD-NMR-Experiment mit den gleichen Parametern und schreiben Sie sie in eine Datei (ISTD).
    7. Berechnen Sie den STD-Wert für jedes Protonensignal mit der folgenden Gleichung:
      STD = (ISTD)/I0.
      HINWEIS: HINWEIS: Die Verwendung der Signalintegration zur Berechnung von STD-Werten setzt voraus, dass die Protonensignale ausreichend getrennt sind. Wenn Signalüberlappungen auftreten, wie z. B. bei Oligosacchariden, können STD-Werte bestimmt werden, indem das Signalintensitätsverhältnis zwischen dem STD- und dem Off-Resonanz-Spektren bewertet wird.
    8. Berechnen Sie die relative STD in Prozent. Geben Sie dazu dem Proton einen Wert von 100 %, der die maximale Differenz zwischen den Intensitäten in der Off-Resonanz und dem STD-NMR-Spektrum aufweist. Berechnen Sie entsprechend die relativen STD-Intensitäten für die anderen Protonen.
      HINWEIS: Eine ordnungsgemäße Analyse von STD-Daten, insbesondere zur Bestimmung des Ligandenbindungseptops, erfordert die vollständige Zuordnung von 1H-Signalen des Liganden. Daher wird dringend empfohlen, diese Aufgabe vor der Aufnahme der STD-Spektren abzuschließen.

2. 1 H-15N HSQC-Experimente

HINWEIS: In den folgenden Zeilen wird die Anwendung von 1 H-15N HSQC-Experimenten beschrieben, um die Veränderungen der chemischen Verschiebungen der 1H- und 15N NMR-Resonanzen des Rezeptors (Lektin) als Reaktion auf das Vorhandensein zunehmender Mengen des Liganden (Oligosaccharid) zu überwachen19. Die auf den extrahierten Daten basierende Chemical Shift Perturbation (CSP)-Analyse ist sehr wertvoll für die Identifizierung von Bindungspartnern, aber auch für die Kartierung der Proteinbindungsgrenzfläche und die Bestimmung von Bindungsaffinitäten. Für ein tieferes Verständnis des Designs und der Erfassung von NMR-Experimenten lesen Sie bitte das entsprechende Herstellerhandbuch, das dem NMR-Gerät beiliegt.

  1. Erfassung und Verarbeitung
    1. Bereiten Sie die Probe mit dem gewünschten Lektin vor. Stellen Sie sicher, dass der Rezeptor in jedem Aminosäurerest, sowohl im Rückgrat als auch in der Seitenkette, vollständig 15N-markiert ist. Um die wasseraustauschbaren HN-Kreuzpeaks im Spektrum zu detektieren, wird typischerweise ein 90:10-Gemisch aus H2O: D2O verwendet, um die gepufferte Lösung herzustellen. Die erforderlichen Lektinkonzentrationen liegen zwischen 0,05 und 0,2 mM, abhängig von der Verfügbarkeit des 15N-markierten Rezeptors und dem erforderlichen Signal-Rausch-Verhältnis.
      HINWEIS: Das Protein sollte während der gesamten Versuchszeit stabil sein, ohne dass im NMR-Röhrchen sichtbarer Niederschlag entsteht. Darüber hinaus sollte es rein und löslich in dem ausgewählten Puffer sein. Die vollständige 1H und 15N Zuordnung der HSQC-Querpeaks sollte zuvor durchgeführt worden sein, so dass jeder Querpeak im HSQC-Spektrum mit einer Markierung gekennzeichnet ist, die dem spezifischen Aminosäurerest entspricht.
    2. Übertragen Sie von diesem Präparat ein Gesamtvolumen von 0,6 mL in ein 5-mm-NMR-Röhrchen.
    3. Stellen Sie das NMR-Gerät auf die gewünschte Temperatur ein. Siehe Schritt 1.1.3 und befolgen Sie die gleichen Vorgänge.
    4. Erstellen Sie ein neues Dataset. Sehen Sie sich Schritt 1.1.4 an und wiederholen Sie die Vorgänge.
    5. Führen Sie die NMR-Probe wie in Schritt 1.1.5 beschrieben in die Sonde ein.
    6. Sperren Sie das Lösungsmittelsignal. Um den Sperrvorgang zu starten, verwenden Sie die Befehlssperre und wählen Sie das entsprechende Lösungsmittel aus dem Menü aus. Das Sperrsignal kann im Verriegelungsfenster verfolgt werden. Stellen Sie die Sperrverstärkung so ein, dass das Sperrsignal im Sperrfenster sichtbar ist.
    7. Schließen Sie den Abstimmungs- und Anpassungsprozess automatisch (über den Befehl atma) oder manuell ab (der Befehl atmm öffnet das ATM-Steuerungsfenster, um die Wobble-Kurve anzupassen).
    8. Legen Sie die optimalen Unterlegscheiben mit dem TopShim-Werkzeug fest. Verwenden Sie den Befehl topshim gui. Siehe Anweisungen in Schritt 1.1.8.
    9. Bestimmen Sie die Impulslänge von 1H 90° (wie in Schritt 1.1.9 beschrieben) und die Offset-Frequenz (der Befehl o1calib führt eine interaktive O1-Kalibrierroutine aus, die die Offset-Frequenz abruft). Dieser letztere Parameter ist äußerst wichtig, wenn Experimente mit Lösungsmittelunterdrückungsschemata durchgeführt werden.
    10. Erstellen Sie einen neuen Datensatz, wie in Abschnitt 1.1.4 beschrieben. Um die Interferenz des H2O-Signals zu reduzieren oder zu eliminieren, verwenden Sie die Impulsfolge zgesgp.
    11. Richten Sie das Experiment ein, indem Sie verschiedene Parameter im AcquPars-Fenster ändern.
      1. Die Pulslänge und den Offset (o1) von 1H 90° werden wie zuvor bestimmt eingeführt und die Anzahl der Scans (NS) auf 32 und das Spektralfenster (SW) auf etwa 12 ppm eingestellt.
      2. Bestimmen Sie die Leistungsstärke des geformten Impulses mit dem Formwerkzeug, das in der Topspin-Menüleiste verfügbar ist.
      3. Stellen Sie die Empfängerverstärkung mit dem automatischen Befehl rga ein.
    12. Erfassen Sie das Experiment mit dem Befehl zg und verarbeiten Sie die resultierende FID, um das 1-H-NMR-Spektrum zu erhalten.
    13. Erstellen Sie einen neuen Datensatz, der für die Erfassung des 1 H-15N HSQC-NMR-Experiments verwendet werden soll. Wählen Sie auf der Registerkarte AcquPars das Impulsprogramm hsqcetfpf3gp aus, das im Impulsprogrammkatalog verfügbar ist.
    14. Richten Sie das Experiment ein. Laden Sie die Standardformen, -stärken und -zeiten mit dem Befehl getprosol. Aktualisieren Sie dann die Werte der Impulslänge und des Offsets von 1H 90°.
    15. Definieren Sie die folgenden Parameter.
      1. Stellen Sie die Entspannungsverzögerung auf 1-5 s ein.
      2. Legen Sie die Anzahl der Scans auf ein Vielfaches von 4 fest. Normalerweise wird es auf 8, 16, 32 oder 64 eingestellt, um das richtige Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
      3. Legen Sie die Anzahl der Dummy-Scans auf 128 fest.
      4. Legen Sie die Anzahl der Punkte in F2 auf 1k, 2k oder 4k fest.
      5. Legen Sie die Anzahl der Punkte in F1 fest: die Anzahl der zu verwendenden t1-Schritte . Diese liegt je nach Spektralfenster zwischen 128 und 256.
      6. Stellen Sie die Mitte des Spektralfensters in der 15-N-Dimensionauf δ 117 ppm ein und stellen Sie die entsprechende spektrale Breite auf 36 ppm ein. Diese Werte müssen für jedes einzelne System optimiert werden.
      7. Stellen Sie die Empfängerverstärkung ein, um einen Überlauf zu vermeiden (mit dem Befehl rga )
    16. Berechnen Sie die Zeit des gesamten Experiments. Eine typische Versuchszeit beträgt ca. 1 h.
    17. Geben Sie zg ein, um das Experiment zur Erfassung zu senden.
      HINWEIS: Überprüfen Sie immer nach einigen Minuten, ob das Experiment ordnungsgemäß ausgeführt wird.
    18. Verarbeiten Sie die FID mit dem Befehl xfb. Führen Sie die Basislinienkorrektur mit dem Befehl abs2 und Phasenkorrekturen auf der Registerkarte Prozess durch. Um die Phase manuell zu starten, klicken Sie auf das Untermenü Phase anpassen und wählen Sie dann mehrere Kreuzpeaks der 2D-Spektren aus. Wenden Sie anschließend nacheinander Null- und Korrekturen erster Ordnung auf Zeilen und Spalten an, indem Sie auf die entsprechende Schaltfläche klicken und ziehen. Speichern Sie die Phasenergebnisse.
    19. Speichern Sie das resultierende 2D-Spektrum.
    20. Bereiten Sie eine hochkonzentrierte Stammlösung des Liganden vor. Typische Werte liegen bei 50-100 mM.
    21. Übertragen Sie aus der hochkonzentrierten Stammlösung des Glykans das entsprechende Volumen (einige Mikroliter) in das NMR-Röhrchen, das den Rezeptor enthält, um das gewünschte Protein-Liganden-Molverhältnis zu erhalten und die Spektren aufzuzeichnen.
      HINWEIS: Dieser Schritt initiiert die Titrationsreihe, in der der Ligand in die Proteinprobe titriert wird. Die geeigneten Protein-zu-Liganden-Verhältnisse müssen für jeden Einzelfall bestimmt werden. Wenn die Bindungsaffinität völlig unbekannt ist, wird empfohlen, in den Anfangspunkten substöchiometrische Mengen des Liganden zu verwenden.
    22. Führen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.1.19 für die neu vorbereitete Probe durch.
    23. Die Schritte 2.1.21 und 2.1.22 sind für Proben mit zunehmendem Protein-Liganden-Verhältnis zu wiederholen.
      HINWEIS: Die genaue Anpassung der Titrationsreihendaten erfordert die Erfassung mehrerer 1 H-15N-HSQC-Experimente, die ein breites Spektrum an Protein-Liganden-Verhältnissen abdecken, einschließlich derjenigen, die zum Erreichen der Proteinsättigung erforderlich sind.
  2. Analyse
    1. Visualisieren Sie das verarbeitete 2D-HSQC-Spektrum für die Apo-Spezies mit der entsprechenden Software: TopSpin, MestReNova und CCPNMR sind geeignete Programme für den Umgang mit NMR-Daten.
      HINWEIS: Dies ist das Fingerabdruckspektrum des Proteins. Die beobachteten chemischen Verschiebungen von 1H und 15N hängen von der entsprechenden chemischen Umgebung jeder Aminosäure ab, die stark von der 3D-Struktur des Proteins abhängt. Dieses Spektrum wird als Protein-Fingerabdruck-Spektrum bezeichnet. Ein gut dispergiertes 2D 1 H-15N HSQC-Spektrum, in dem alle Kreuzpeaks gleichmäßige Intensitäten aufweisen, deutet stark auf das Vorhandensein eines gut gefalteten Proteins19 hin.
    2. Generieren Sie die Liste der Frequenzen 1H und 15N für alle Querpeaks. Der Einsatz von ergänzender Software, wie z.B. dem CCPNMR-Programm20, kann dabei helfen.
    3. Überlagern Sie das Spektrum für den ersten oder zweiten Titrationspunkt mit dem für das Apo-Protein.
      1. Öffnen Sie dazu das 2D-Spektrum, das dem Apo-Zustand entspricht, klicken Sie auf die Registerkarte Mehrfachanzeige und fügen Sie dann das zweite 2D-Spektrum hinzu. Die visuelle Inspektion beider Spektren gibt Aufschluss über das Vorhandensein einer Wechselwirkung zwischen dem Liganden und dem Protein.
        HINWEIS: Aus der Sicht des Proteins führt das Vorhandensein einer Bindung zu Veränderungen in der chemischen Umgebung der Aminosäuren, die direkt am Erkennungsereignis beteiligt sind, mit den damit einhergehenden chemischen Verschiebungsstörungen (CSP).
    4. Die Schritte 2.2.2 und 2.2.3 werden für jeden Titrationspunkt wiederholt und Listen der Frequenzen von 1H und 15N für alle Kreuzpeaks in den verschiedenen Spektren erstellt, die unterschiedlichen Protein-Liganden-Molverhältnissen entsprechen.
      HINWEIS: Die chemischen Verschiebungen an jedem Titrationspunkt können gemessen werden, ohne dass eine neue Cross-Peak-Zuweisung vorgenommen werden muss. Im Falle des schnellen Austauschregimes, das häufig bei Lektin-Glykan-Wechselwirkungen beobachtet wird, kann man einfach die fortschreitende Bewegung der Peaks während der Titration verfolgen.
    5. Prüfen Sie, ob es für den letzten Titrationspunkt grundsätzlich keine chemischen Verschiebungsstörungen in Bezug auf die vorherige Zugabe gibt. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass die Proteinbindungsstelle mit dem Liganden gesättigt ist, der in hohem Überschuss vorhanden ist.
    6. Berechnen Sie die maximalen chemischen Verschiebungsstörungen (maxCSP) mit der folgenden Gleichung:
      figure-protocol-1
      ΔH und Δδ N sind die chemischenVerschiebungsunterschiede in den Frequenzen von 1H und 15N zwischen dem Apo-Zustand bzw. dem letzten Titrationspunkt.
    7. Plotten Sie die maximalen chemischen Verschiebungsstörungen (maxCSP) in der vertikalen y-Achse eines 2D-Diagramms im Vergleich zum entsprechenden Aminosäurerest (in der horizontalen x-Achse).
    8. Führen Sie eine Sichtprüfung der Aminosäurereste durch, die den maximalen CSP zwischen dem gebundenen und dem Apo-Zustand des Proteins anzeigen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass sie zur Bindungsstelle gehören oder deren Nachbarn sind.
    9. Wenn die 3D-Struktur des Proteins verfügbar ist, öffnen Sie die entsprechende PDB mit der entsprechenden Software wie PyMOL oder BIOVIA Discovery Studio. Diese molekularen Visualisierungsprogramme sind in der Strukturbiologie weit verbreitet. Wählen Sie die Reste aus, die den höchsten maxCSP (über dem Doppelten der Standardabweichung) mit einer bestimmten Farbe aufweisen, um die vermeintliche Bindungsstelle zu lokalisieren.
    10. Im Falle eines schnellen Austauschregimes ist die Dissoziationskonstante (KD) aus einer nichtlinearen Anpassung der kleinsten Quadrate des beobachteten CSP für die 1 H-15N HSQC-Kreuzpeaks an jedem Punkt (Δδobs) im Vergleich zu der jeweiligen Protein- [P] und Ligandenkonzentration [L] an diesem Punkt zu schätzen:
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      HINWEIS: Diese Gleichung kann auf die Kreuzspitzen angewendet werden, die klare isolierte Signale anzeigen. Die erhaltenen Werte werden gemittelt, um die Schätzung von KD zu erhalten.

Ergebnisse

Darin stellen wir ein Protokoll für die Auswertung von 1H-STD NMR- und 1 H-15N HSQC-Experimenten vor, um die Details der Bindungsinteraktion zwischen Lektinen und kleinen Oligosacchariden zu entschlüsseln. Die Ergebnisse, die bei der Analyse der molekularen Erkennung von LacNAc durch hGalectin-7 (hGal-7) erzielt wurden, sind enthalten und dienen als illustratives Beispiel für die erfolgreiche Implementierung des Protokolls und die Wirksamkeit dieser NMR-Methoden zur Untersuchung der feinen Details des molekularen Erkennungsprozesses. Abbildung 3 zeigt das 1H-STD NMR-Spektrum für die Wechselwirkung von LacNAc mit hGal-7. Das Vorhandensein von STD-NMR-Signalen deutet auf eine Bindung hin (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigen sich nur die Signale, die zu Protonen gehören, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen, was die Abgrenzung des Bindungsepitops ermöglicht (Abbildung 3B). Abbildung 4 zeigt, wie das 1 H-15N HSQC-Spektrum eines Proteins als Fingerabdruck verwendet werden kann, und Abbildung 5 zeigt die Anwendung von 1 H-15N heteronuklearen Single Quantum Kohärenz (HSQC) Titrationsexperimenten zur Definition der chemischen Verschiebungsstörung von hGalectin-7-Rückgrat-Amidgruppen bei LacNAc-Bindung. Diese Daten zeigen nicht nur die Existenz einer Interaktion, sondern beschreiben auch die Bindungsschnittstelle des Lektins. Abbildung 6 zeigt, wie die Analyse der Titrationsdaten die Abschätzung der Bindungsaffinität von LacNAc durch hGalectin-7 ermöglicht, die im hohen mikromolaren Bereich liegt. Dieser Befund steht im Einklang mit den Ergebnissen, die mit alternativen Techniken erzielt wurden.

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Abbildung 1: Die Auswahl der On-Resonanz-Frequenz. 1H-NMR-Spektrum von LacNAc:hGal-7 im Verhältnis 50:1 in deuterierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 ist dargestellt. Die Signale des Liganden (LacNAc) sind im Bereich zwischen 2,0 und 5,2 ppm begrenzt. Die Sättigungsfrequenz wird sorgfältig ausgewählt, um die Abwesenheit von Ligandenprotonen in einem Bereich von 1-2 ppm zu gewährleisten, was eine selektive Bestrahlung der Protonen des Proteins ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Das STD-NMR-Experiment. Schematische Darstellung des STD-Experiments: Das erste Spektrum (Off-Resonanz) dient als Referenz, während im zweiten (On-Resonanz) die Proteinsättigung durchgeführt wird. Die Sättigung wird effizient über das gesamte Protein propagiert und auf die Ligandenprotonen übertragen, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen. Das resultierende Differenzspektrum (STD-Spektrum) liefert nur solche Resonanzen, die eine Sättigung erfahren haben. Die Analyse des STD-Experiments ermöglicht die Epitopkartierung des bindenden Zuckers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Bindungsanalyse aus der Perspektive des Liganden. (A) Überlagerung der Off-Resonanz und des 1H STD-NMR-Spektren für die Wechselwirkung von LacNAc mit hGal-7. Im STD-Spektrum tauchen nur die Signale auf, die zu Protonen gehören, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen. Die Annotation der 1H-Resonanzen des Liganden wird im Off-Resonanz-Spektrum berichtet. (B) Die relativen STD-Intensitäten wurden in die chemische Struktur von LacNAc eingefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Das 1 H-15N HSQC-Spektrum eines Proteins stellt seinen Fingerabdruck dar. (A) 1 H-15N HSQC-Spektrum von 100 μM von hGal-7 in der Apo-Form. Das Spektrum wurde bei 25 °C aufgezeichnet. Einige NH-Cross-Peaks wurden mit der Markierung ihrer entsprechenden Aminosäure annotiert. (B) Jedes NH-Paar weist eine einzigartige chemische Verschiebung auf, die von der chemischen Umgebung und damit von der 3D-Struktur des Proteins abhängt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Bindungsanalyse aus der Perspektive des Proteins. (A) Die Überlagerung der 1 H-15N HSQC-Spektren, die für die Titration von LacNAc in hGal-7-Lösung aufgezeichnet wurden, ist dargestellt. Die Untersuchung der Spektren, bei denen mehrere Cross-Peaks chemische Verschiebungsänderungen erfahren, deutet eindeutig auf eine Wechselwirkung hin. (B) Die Darstellung der maximalen chemischen Verschiebungsstörungen (maxCSP) der Rückgratamidsignale, abgeleitet aus der Titration von LacNAc (15 Äquivalente) mit hGal-7. (C) Die am stärksten gestörten Aminosäuren von hGal-7 werden gemäß der CSP-Analyse in die 5gal PDB-Struktur abgebildet. Im 3D-Modell bezieht sich die rote Färbung auf einen CSP-Wert über 2σ, während sich die rosa Färbung auf Werte zwischen 1σ und 2σ bezieht. Der farbige Bereich stellt wahrscheinlich die Bindungsstelle dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: KD-Bestimmung basierend auf 1 H-15N HSQC-Titrationsexperimenten. (A) Darstellung des Musters der 1 H-15N HSQC-basierten Titration in Abhängigkeit von der chemischen Austauschrate auf der NMR-Zeitskala des Systems in der Studie (schnell, mittel oder langsam). Ein schnelles Austauschregime wurde im Fall der LacNAc/h-Gal-7-Interaktion beobachtet. (B) Anpassungskurve und KD-Schätzung aus der CSP-Analyse bei unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen für das Modellsystem von hGal-7 und LacNAc-Disaccharid. Die geschätzte KD wird mit dem entsprechenden Fehler als Durchschnitt der Daten für 20 verschiedene Aminosäuren angegeben; (C) Ausschnitte aus den 1 H,15N-HSQC-Spektren, die die Verschiebung ausgewählter Querpeaks während der Titration zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die NMR (STD-NMR) hat sich zur am häufigsten verwendeten und vielseitigsten NMR-Methode zur Untersuchung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen entwickelt. Wie oben gezeigt, beruht es auf dem Phänomen des Sättigungstransfers, und der Versuchsaufbau beinhaltet die Aufnahme von zwei eindimensionalen (1D) 1H-Spektren: dem On-Resonanz- und dem Off-Resonanz-Spektro. Während des On-Resonanz-Experiments wird die Sättigung spezifischer Protonen des Proteins erreicht, indem eine Reihe von Radiofrequenzpulsen mit geringer Leistung während eines bestimmten Zeitraums angewendet wird (die Sättigungszeit liegt typischerweise zwischen 1 und 3 s). Um eine direkte Sättigung des Liganden zu vermeiden, sind die Frequenz und Länge der Sättigungspulse für die selektive Bestrahlung spezifischer Protonen des Proteins optimiert; d.h. sie müssen mit einer Frequenz angewendet werden, die frei von allen Ligandensignalen ist, und mit einer angemessenen Länge (Abbildung 1). Als Faustregel für 50 ms Sättigungspulse gilt, dass 1 ppm Differenz zwischen dem Sättigungsbereich und den nächstgelegenen Ligandensignalen eingehalten werden sollte. Im Allgemeinen führen selektive Sättigungsimpulse, die auf die aliphatische Region des Proteins angewendet werden, zu erhöhten Sättigungseffekten. Alternativ können auch aromatische Protonen (6-7 ppm) bestrahlt werden, wenn das Ligandenmolekül keine aromatischen Signale enthält. Dies ist sehr nützlich für natürlich vorkommende Glykane, da sie keine aromatischen Gruppen tragen. Sobald eine bestimmte Region des Proteins selektiv bestrahlt wird, breitet sich die Sättigung entlang des Proteins durch dipolare 1 H-1 H-Kreuzrelaxation(Spindiffusion) aus. Schließlich erreicht die Sättigung die Proteinprotonen an der Bindungsstelle, die dann über intermolekulare 1 H-1H NOEs auf die Zuckerprotonen übertragen wird, die in engem Kontakt (r < 5 Å) mit dem Rezeptor stehen. Offensichtlich nimmt die Intensität der Signale der gesättigten Liganden Protonen ab. Nach Erhalt der Sättigung dissoziieren die transient gebundenen Liganden aufgrund der Bindungskinetik (ein schneller Austausch ist erforderlich) und die Sättigungsinformation wird im freien Zustand akkumuliert. Aufgrund dieses Prozesses weisen die NMR-On-Resonanz-Spektren verminderte Signale auf (Abbildung 2).

Um diese Intensitätsstörung der 1-H-Kerne eines bindenden Glykans eindeutig darzustellen, wird ein Kontrollprotonen-NMR-Spektrum (Off-Resonanz) aufgenommen, bei dem die Sättigung weit entfernt von jedem Rezeptor- oder Kohlenhydratsignal (normalerweise zwischen 40-100 ppm) unter den gleichen Bedingungen angelegt wird. Das subtrahierte 1D-Spektrum zwischen der Off-Resonanz und der On-Resonanz zeigt ausschließlich die Signale der 1H-Kerne des Liganden, die modifizierte Intensitäten aufweisen: diejenigen, die nahe genug an der Rezeptorbindungsstelle waren, um die Magnetisierung zu empfangen (Abbildung 2).

Dennoch erhalten nicht alle 1H-Kerne des gebundenen Kohlenhydrats die gleiche Sättigung. Theoretisch ist der Magnetisierungstransfer vom Rezeptor zum gebundenen Liganden abstandsabhängig (1/r6). Dies bedeutet, dass die Intensitäten der übertragenen Sättigung zwischen den Glykan-1H-Kernen Informationen über die räumlichen Abstände zwischen den Protonen des Liganden und denen des Rezeptors enthalten, und die STD-NMR-Intensitäten für diejenigen Protonen, die näher am Rezeptor liegen, größer sind. Dementsprechend ermöglicht das STD-NMR-Experiment auch die Bestimmung des Bindungsepitops des Kohlenhydrats (Abbildung 2 und Abbildung 3), da Protonen des Liganden, die näher an der Proteinoberfläche sitzen, höhere Intensitäten aufweisen als solche, die nicht direkt an der Bindung beteiligt sind.

Das Experiment kann auf Systeme mit schwacher bis mittlerer Affinität angewendet werden, selten auf Systeme mit starken Affinitäten im niedrigen μM- oder nM-Bereich. In der Tat erfordert es, dass die Dissoziationsrate in der Entspannungszeitskala schnell ist. Andernfalls geht die Information des Sättigungstransfers durch Relaxation verloren, bevor der Ligand dissoziiert.

Auf der anderen Seite sind proteinbasierte NMR-Experimente einzigartig, um die Liganden-Protein-Interaktion mit Genauigkeit auf Aminosäureebene zu entschlüsseln, ohne die Strukturen der atomaren Auflösung zu lösen. Es untersucht molekulare Erkennungsphänomene direkt in Lösung, ohne dass eine Kokristallisation erforderlich ist. Das CSP-Analyse-Mapping ist außergewöhnlich leistungsfähig für die Entdeckung von Liganden und die Kartierung der Proteinbindungsstelle (Abbildung 4 und Abbildung 5). Diese Methode ist auf jeden Bereich von Affinitäten zwischen dem mM- und dem nM-Bereich anwendbar, selbst für Systeme, bei denen der Austauschkurs in der Zeitskala der chemischen Verschiebung21 langsam ist.

Nichtsdestotrotz wird dieser Ansatz bei Proteinen mit Molekulargewichten über 30-40 kDa aufgrund von Relaxationsproblemen wahrscheinlich nicht funktionieren. Anschließend kann die TROSY-Alternative18 verwendet werden, die in Verbindung mit der Proteindeuterierung besonders leistungsfähig ist. Darüber hinaus sollte das Protein einheitlich mit 15N markiert werden (und eine weitere Probe mit 13C und 15N doppelt markiert werden, um die erforderliche Rückgratzuordnung abschließen zu können). Daher sollten die Proteinexpressionsbedingungen, einschließlich des entsprechenden Expressionssystems, optimiert werden, um Milligrammmengen an Protein erhalten zu können. Proteine, die eine Tendenz zur Oligomerisierung oder Aggregation aufweisen, sind für diese Analyse ebenfalls nicht geeignet. Das hierin verwendete Instrument zur Aufzeichnung der NMR-Daten ist ein Bruker 800 MHz Spektrometer, das mit einer TCI-Kryosonde ausgestattet ist. Es wäre eine große Herausforderung, diese Methode mit Instrumenten unter 600 MHz oder ohne kryogene Sonde anzuwenden.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken der spanischen Agencia Estatal de Investigación für die Akkreditierung des Severo Ochoa Center of Excellence CEX2021-001136-S, finanziert von MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, und CIBERES, einer Initiative des Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spanien). Wir danken auch der Europäischen Kommission für das Projekt GLYCOTWINNING.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5 mm Shigemi Mikroröhrchen-Set MatteCortecNet SASS30BMS-005B
Alpha-Laktose-AgaroseSigma-Aldrich Quí mica S.L.7634-5ML
Ammoniumchlorid (15 N, 99%)LC-0179-N-50GTracer Tecnologí als Analí ticas S.L
Ampicillin (Natriumsalz) Melford Laboratories LTDA40040
BIOVIA Discovery Studio BIOVIA, Dassault Systè mes
BL21(DE3) Chemisch kompetente Zellen Merck Life Science, S.L.U.CMC0014-40X40UL
ZentrifugeBeckman ScharAllegra X-22R
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-1000
InkubatorEppendorfInnova 42
IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid)VWR International Eurolab S.L.
LacNAcElicitylGLY008
Luria Bertani (LB) BouillonMerck Life Science, S.L.U.3397-1KG
Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC VWR International Eurolab S.L.214-1137
PBS 10xBio-Rad1610780
PyMOLPyMOL Molecular Graphics SystemVersion 2.0 Schrö dinger
SonicatorSonics & Materialien, Inc.VC 505
Supraleitender NMR-MagnetBruker600 MHz AVANCE III
Supraleitender NMR-MagnetBruker800 MHz AVANCE III
VW437144N

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NMR SpektroskopieSaturation Transfer Differencechemische Shift PerturbationProtein Ligand Komplexmolekulare ErkennungGlykobiologieHSQC TitrationGalectin Bindungstrukturelle Dynamik
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