Research Article
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Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung, Verarbeitung und Analyse einer Reihe von NMR-Experimenten zur Charakterisierung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen in Lösung beschreibt. Es werden die gängigsten ligandenbasierten und proteinbasierten Methoden skizziert, die zweifellos zu den Bereichen der strukturellen Glykobiologie und der molekularen Erkennungsstudien beitragen.
Die Wechselwirkungen von Glykanen mit Proteinen modulieren viele Ereignisse, die mit Gesundheit und Krankheit zusammenhängen. Tatsächlich sind die Etablierung dieser Erkennungsereignisse und ihre biologischen Konsequenzen eng mit den dreidimensionalen Strukturen beider Partner sowie mit ihren dynamischen Merkmalen und ihrer Präsentation auf den entsprechenden Zellkompartimenten verbunden. NMR-Techniken sind einzigartig, um diese Eigenschaften zu entwirren, und in der Tat wurden verschiedene NMR-basierte Methoden entwickelt und angewendet, um die Bindungsereignisse von Glykanen mit ihren assoziierten Rezeptoren zu überwachen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erfassung, Verarbeitung und Analyse von zwei der leistungsfähigsten NMR-Methoden , dieim Bereich der NMR-Glykobiologie eingesetzt werden, 1 H-Sättigungstransferdifferenz (STD) und 1 H,15N-Heteronukleare Single Quantum Kohärenz (HSQC) Titrationsexperimente, die komplementär Informationen aus der Glykan- bzw. Proteinperspektive liefern. In Kombination bieten sie ein leistungsfähiges Instrumentarium, um sowohl die strukturellen als auch die dynamischen Aspekte molekularer Erkennungsprozesse aufzuklären. Dieser umfassende Ansatz verbessert unser Verständnis der Glykan-Protein-Wechselwirkungen und trägt dazu bei, die Forschung auf dem Gebiet der chemischen Glykobiologie voranzutreiben.
Die molekulare Erkennung von Glykanen ist für viele Prozesse im Zusammenhang mit Gesundheit und Krankheit unerlässlich. Die Spezifität und Selektivität biologischer Rezeptoren (Lektine, Antikörper, Enzyme) für Glykane hängt stark davon ab, wie das prekäre Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Komponenten der Enthalpie (CH-π und van der Waals, Wasserstoffbrückenbindungen, Elektrostatik) und der Entropie (Hydrophobie, Dynamik, Solvatations-Desolvatation)1 eingestellt wird.
Angesichts der großen chemischen Vielfalt und dynamischen Natur von Glykanen werden NMR-Methoden seit mehr als 25 Jahren in großem Umfang eingesetzt, um Glykanwechselwirkungenzu analysieren 2, da diese Methoden hervorragende Informationen über molekulare Erkennungsereignisse mit präzisen Details bei atomarer Auflösung 3,4 liefern, selbst wenn die erforderlichen Wechselwirkungsnachweise nicht mit anderen Methoden abgerufen werden können. Ein wichtiger Punkt ist, dass die NMR vielseitig ist und die Untersuchung dynamischer Ereignisse auf atomarer Ebene auf verschiedenen Zeitskalen ermöglicht, was bei weitem die beste Technik für die Untersuchung der Struktur, Konformation und Dynamik von Glykanen in Lösung darstellt. Nichtsdestotrotz kann die Entflechtung dieser Informationen ein recht komplexer Prozess sein, der den Einsatz klar definierter Strategien in Verbindung mit einer sorgfältigen Datenanalyse erfordert5.
NMR-Techniken sind vielfältig und in der Tat gibt es viele Methoden, die eingesetzt werden können, um Glykan-Protein-Wechselwirkungen zu entschlüsseln6. Wir beschreiben hier zwei grundlegende NMR-Ansätze, die derzeit zur Entschlüsselung von Glykan-Rezeptor-Wechselwirkungen eingesetzt werden 7,8, wobei der Schwerpunkt darauf liegt, wie die Darstellung des Schlüssel-Glykan-Epitops sowie der Proteinbindungsstelle 9 entwirrt werdenkann.
Bei jedem molekularen Erkennungsereignis, wenn ein Rezeptor an einen gegebenen Liganden bindet, findet ein chemischer Austauschprozess statt, der viele NMR-Parameter der an der Bindung beteiligten Teilnehmer beeinflusst10. Aus der NMR-Perspektive kann die Interaktion daher entweder aus der Sicht des Glykanliganden oder aus der des Proteinrezeptors11 überwacht werden. Im Allgemeinen handelt es sich bei dem Proteinrezeptor um ein großes Biomolekül (langsame Rotationsbewegung mit Raten in der ns-Zeitskala und daher schnelle transversale Relaxation), während das interagierende Glykan als kleines bis mittelgroßes Molekül betrachtet werden kann (schnelle Rotationsbewegung mit Raten auf der ps-Zeitskala und langsame transversale Relaxation)12. Aus der Standardperspektive sind die NMR-Signale des Glykans schmal, während die des Rezeptors breit sind13.
Ligandenbasierte NMR-Methoden beruhen auf der dramatischen Veränderung, die viele Glykan-NMR-Parameter beim Übergang vom freien in den gebundenen Zustanderfahren 14. STD-NMR ist die am häufigsten eingesetzte experimentelle NMR-Technik zur Bewertung verschiedener Glykanbindungsmerkmale15, von der Ableitung des Vorhandenseins einer Bindung im Lösungszustand bis zur Bestimmung des Glykanbindungshetops; das heißt, die Atome des Liganden, die mit dem Proteinrezeptor16 in Kontakt stehen.
Alternativ dazu überwachen rezeptorbasierte NMR-Methoden die Veränderungen, die in den Signalen des Proteinrezeptors in Gegenwart des Glykans im Vergleich zu den für den Apo-Zustand17 aufgezeichneten Veränderungen stattfinden. Diese konzentrieren sich hauptsächlich auf das Screening der chemischen Verschiebungsstörungen der Proteinsignale zwischen beiden Zuständen. Das am häufigsten verwendete Experiment ist 1 H-15N HSQC oder seine TROSY-Alternativen18.
Die Kombination beider Ansätze ermöglicht die Anwendung der NMR auf viele verschiedene Systeme, die ein breites Spektrum an Affinitäten aufweisen. Für die rezeptorbasierten NMR-Methoden muss jedoch im Gegensatz zu denen, die auf dem Liganden basieren, eine relativ große Menge an löslichem, nicht aggregiertem, stabilisotopenmarkiertem (15N) Protein zur Verfügung stehen.
Im Folgenden beschreiben wir beide Methoden und heben ihre Stärken und Schwächen hervor. Beachten Sie, dass die im Protokoll beschriebenen grundlegenden Schritte als Beispiele für die Verwendung von Bruker-Spektrometern dienen. Folglich stimmen die Namen von Befehlen und Parametern mit denen überein, die in TopSpin (der Spektrometersteuerungssoftware von Bruker) verwendet werden.
1. Sättigungstransferdifferenz NMR (STD-NMR)
HINWEIS: In den folgenden Zeilen werden grundlegende Verfahren zur Erfassung, Verarbeitung und Analyse von STD-NMR-Experimenten beschrieben. Diese Schritte dienen als Beispiel für die Nützlichkeit der Technik für den Nachweis der Ligandenbindung und für die Aufklärung des Ligandenbindungsepitops. Für ein tieferes Verständnis des Designs und der Erfassung von NMR-Experimenten lesen Sie bitte das entsprechende Herstellerhandbuch, das dem NMR-Gerät beiliegt.
2. 1 H-15N HSQC-Experimente
HINWEIS: In den folgenden Zeilen wird die Anwendung von 1 H-15N HSQC-Experimenten beschrieben, um die Veränderungen der chemischen Verschiebungen der 1H- und 15N NMR-Resonanzen des Rezeptors (Lektin) als Reaktion auf das Vorhandensein zunehmender Mengen des Liganden (Oligosaccharid) zu überwachen19. Die auf den extrahierten Daten basierende Chemical Shift Perturbation (CSP)-Analyse ist sehr wertvoll für die Identifizierung von Bindungspartnern, aber auch für die Kartierung der Proteinbindungsgrenzfläche und die Bestimmung von Bindungsaffinitäten. Für ein tieferes Verständnis des Designs und der Erfassung von NMR-Experimenten lesen Sie bitte das entsprechende Herstellerhandbuch, das dem NMR-Gerät beiliegt.
Darin stellen wir ein Protokoll für die Auswertung von 1H-STD NMR- und 1 H-15N HSQC-Experimenten vor, um die Details der Bindungsinteraktion zwischen Lektinen und kleinen Oligosacchariden zu entschlüsseln. Die Ergebnisse, die bei der Analyse der molekularen Erkennung von LacNAc durch hGalectin-7 (hGal-7) erzielt wurden, sind enthalten und dienen als illustratives Beispiel für die erfolgreiche Implementierung des Protokolls und die Wirksamkeit dieser NMR-Methoden zur Untersuchung der feinen Details des molekularen Erkennungsprozesses. Abbildung 3 zeigt das 1H-STD NMR-Spektrum für die Wechselwirkung von LacNAc mit hGal-7. Das Vorhandensein von STD-NMR-Signalen deutet auf eine Bindung hin (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigen sich nur die Signale, die zu Protonen gehören, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen, was die Abgrenzung des Bindungsepitops ermöglicht (Abbildung 3B). Abbildung 4 zeigt, wie das 1 H-15N HSQC-Spektrum eines Proteins als Fingerabdruck verwendet werden kann, und Abbildung 5 zeigt die Anwendung von 1 H-15N heteronuklearen Single Quantum Kohärenz (HSQC) Titrationsexperimenten zur Definition der chemischen Verschiebungsstörung von hGalectin-7-Rückgrat-Amidgruppen bei LacNAc-Bindung. Diese Daten zeigen nicht nur die Existenz einer Interaktion, sondern beschreiben auch die Bindungsschnittstelle des Lektins. Abbildung 6 zeigt, wie die Analyse der Titrationsdaten die Abschätzung der Bindungsaffinität von LacNAc durch hGalectin-7 ermöglicht, die im hohen mikromolaren Bereich liegt. Dieser Befund steht im Einklang mit den Ergebnissen, die mit alternativen Techniken erzielt wurden.
Abbildung 1: Die Auswahl der On-Resonanz-Frequenz. 1H-NMR-Spektrum von LacNAc:hGal-7 im Verhältnis 50:1 in deuterierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 ist dargestellt. Die Signale des Liganden (LacNAc) sind im Bereich zwischen 2,0 und 5,2 ppm begrenzt. Die Sättigungsfrequenz wird sorgfältig ausgewählt, um die Abwesenheit von Ligandenprotonen in einem Bereich von 1-2 ppm zu gewährleisten, was eine selektive Bestrahlung der Protonen des Proteins ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das STD-NMR-Experiment. Schematische Darstellung des STD-Experiments: Das erste Spektrum (Off-Resonanz) dient als Referenz, während im zweiten (On-Resonanz) die Proteinsättigung durchgeführt wird. Die Sättigung wird effizient über das gesamte Protein propagiert und auf die Ligandenprotonen übertragen, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen. Das resultierende Differenzspektrum (STD-Spektrum) liefert nur solche Resonanzen, die eine Sättigung erfahren haben. Die Analyse des STD-Experiments ermöglicht die Epitopkartierung des bindenden Zuckers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bindungsanalyse aus der Perspektive des Liganden. (A) Überlagerung der Off-Resonanz und des 1H STD-NMR-Spektren für die Wechselwirkung von LacNAc mit hGal-7. Im STD-Spektrum tauchen nur die Signale auf, die zu Protonen gehören, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen. Die Annotation der 1H-Resonanzen des Liganden wird im Off-Resonanz-Spektrum berichtet. (B) Die relativen STD-Intensitäten wurden in die chemische Struktur von LacNAc eingefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Das 1 H-15N HSQC-Spektrum eines Proteins stellt seinen Fingerabdruck dar. (A) 1 H-15N HSQC-Spektrum von 100 μM von hGal-7 in der Apo-Form. Das Spektrum wurde bei 25 °C aufgezeichnet. Einige NH-Cross-Peaks wurden mit der Markierung ihrer entsprechenden Aminosäure annotiert. (B) Jedes NH-Paar weist eine einzigartige chemische Verschiebung auf, die von der chemischen Umgebung und damit von der 3D-Struktur des Proteins abhängt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bindungsanalyse aus der Perspektive des Proteins. (A) Die Überlagerung der 1 H-15N HSQC-Spektren, die für die Titration von LacNAc in hGal-7-Lösung aufgezeichnet wurden, ist dargestellt. Die Untersuchung der Spektren, bei denen mehrere Cross-Peaks chemische Verschiebungsänderungen erfahren, deutet eindeutig auf eine Wechselwirkung hin. (B) Die Darstellung der maximalen chemischen Verschiebungsstörungen (maxCSP) der Rückgratamidsignale, abgeleitet aus der Titration von LacNAc (15 Äquivalente) mit hGal-7. (C) Die am stärksten gestörten Aminosäuren von hGal-7 werden gemäß der CSP-Analyse in die 5gal PDB-Struktur abgebildet. Im 3D-Modell bezieht sich die rote Färbung auf einen CSP-Wert über 2σ, während sich die rosa Färbung auf Werte zwischen 1σ und 2σ bezieht. Der farbige Bereich stellt wahrscheinlich die Bindungsstelle dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: KD-Bestimmung basierend auf 1 H-15N HSQC-Titrationsexperimenten. (A) Darstellung des Musters der 1 H-15N HSQC-basierten Titration in Abhängigkeit von der chemischen Austauschrate auf der NMR-Zeitskala des Systems in der Studie (schnell, mittel oder langsam). Ein schnelles Austauschregime wurde im Fall der LacNAc/h-Gal-7-Interaktion beobachtet. (B) Anpassungskurve und KD-Schätzung aus der CSP-Analyse bei unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen für das Modellsystem von hGal-7 und LacNAc-Disaccharid. Die geschätzte KD wird mit dem entsprechenden Fehler als Durchschnitt der Daten für 20 verschiedene Aminosäuren angegeben; (C) Ausschnitte aus den 1 H,15N-HSQC-Spektren, die die Verschiebung ausgewählter Querpeaks während der Titration zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung, Verarbeitung und Analyse einer Reihe von NMR-Experimenten zur Charakterisierung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen in Lösung beschreibt. Es werden die gängigsten ligandenbasierten und proteinbasierten Methoden skizziert, die zweifellos zu den Bereichen der strukturellen Glykobiologie und der molekularen Erkennungsstudien beitragen.
Wir danken der spanischen Agencia Estatal de Investigación für die Akkreditierung des Severo Ochoa Center of Excellence CEX2021-001136-S, finanziert von MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, und CIBERES, einer Initiative des Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spanien). Wir danken auch der Europäischen Kommission für das Projekt GLYCOTWINNING.
| 5 mm Shigemi Mikroröhrchen-Set Matte | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Laktose-Agarose | Sigma-Aldrich Quí mica S.L. | 7634-5ML | |
| Ammoniumchlorid (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologí als Analí ticas S.L | |
| Ampicillin (Natriumsalz) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery Studio | BIOVIA, Dassault Systè mes | ||
| BL21(DE3) Chemisch kompetente Zellen | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Zentrifuge | Beckman Schar | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Inkubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Bouillon | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrö dinger | |
| Sonicator | Sonics & Materialien, Inc. | VC 505 | |
| Supraleitender NMR-Magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Supraleitender NMR-Magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
