Methodenartikel

Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen

DOI:

10.3791/66532

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26. April 2024

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1Laboratory for Regeneration of Sensorimotor Systems, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), 2Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird ein zellbasiertes AAV-Produktionsprotokoll für HEK293-Suspensionen vorgestellt, das zu einem reduzierten Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion mit Komponenten führt, die für Forschungszwecke von kommerziellen Anbietern erhältlich sind.

Zusammenfassung

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Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) sind ein bemerkenswertes Werkzeug zur Untersuchung des zentralen Nervensystems (ZNS). Innovative Kapside, wie z. B. AAV. PHP.eB, zeigen eine ausgedehnte Transduktion des ZNS durch intravenöse Injektion bei Mäusen. Um eine vergleichbare Transduktion zu erreichen, ist ein 100-fach höherer Titer (mindestens 1 x 1011 Genomkopien/Maus) im Vergleich zur direkten Injektion in das ZNS-Parenchym erforderlich. In unserer Gruppe ist die AAV-Produktion, einschließlich AAV. PHP.eB setzt auf adhärente HEK293T Zellen und die dreifache Transfektionsmethode. Das Erreichen hoher AAV-Ausbeuten mit adhärenten Zellen erfordert einen arbeits- und materialintensiven Prozess. Diese Einschränkung veranlasste die Entwicklung eines Protokolls für suspensionsbasierte Zellkulturen in konischen Röhrchen. AAVs, die in adhärenten Zellen erzeugt wurden, wurden mit der Suspensionsherstellungsmethode verglichen. Kulturen in Suspension mit Transfektionsreagenzien Polyethylenimin oder TransIt wurden verglichen. AAV-Vektoren wurden durch Iodixanol-Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigt, gefolgt von Pufferaustausch und Konzentration mit einem Zentrifugalfilter. Mit der adhärenten Methode erreichten wir insgesamt durchschnittlich 2,6 x 1012 Genomkopien (GC), während die Suspensionsmethode und Polyethylenimin insgesamt 7,7 x 1012 GC und TransIt insgesamt 2,4 x 1013 GC ergaben. Es gibt keinen Unterschied in der In-vivo-Transduktionseffizienz zwischen Vektoren, die mit Adhärent hergestellt wurden, im Vergleich zum Suspensionszellensystem. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein auf Suspensionszellen HEK293-Zellen basierendes AAV-Produktionsprotokoll eingeführt wird, das zu einem geringeren Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion führt und gleichzeitig eine 3- bis 9-mal höhere Ausbeute mit Komponenten erzielt, die von kommerziellen Anbietern für Forschungszwecke erhältlich sind.

Einleitung

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Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wurde 1965 entdeckt und seitdem in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt1. AAVs wurden in der neurowissenschaftlichen Forschung eingesetzt, um Gen- und neuronale Funktionen zu untersuchen, Neuroschaltkreise zu kartieren oder Tiermodelle für Krankheitenherzustellen 2. Traditionell geschieht dies durch Injektion direkt an der interessierenden Stelle, da die meisten natürlichen Serotypen die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden oder dafür eine hohe Dosis benötigen 1,2,3.

Mit der Entdeckung von AAV. PHP.B4 und Kapside der nächsten Generation wie AAV. PHP.eB5 und AAV. CAP-B106 ist es möglich, das Zentralnervensystem (ZNS) mit einer einfachen systemischen Injektion anzugreifen. Die räumliche Kartierung zeigt die Zellen, auf die AAV abzielt. PHP.eB auf zellulärer Ebene 6,7. In Kombination mit spezifischen Promotoren/Enhancern bieten diese Kapside Neurowissenschaftlern umfangreiche Möglichkeiten, Gene und Gehirnfunktionen durch nicht-invasive AAV-Verabreichung zu untersuchen 4,8.

Während für AAV eine niedrigere Dosis erforderlich ist. PHP.eB (typischerweise 1 bis 5 x 1011 Genomkopien (GC)/Maus) im Vergleich zu AAV9 (4 x 1012 GC/Maus)7, es muss noch mehr Vektor hergestellt werden als bei Direktinjektionsstrategien (typischerweise 1 x 109 GC/μl Injektion). Die meisten natürlichen Serotypen können mit dem klassischen adhärenten Zellkultursystem in Kombination mit der Iodixanol-Aufreinigung hergestellt werden 9,10,11,12. Für AAV. PHP.eB Dies beinhaltet einen arbeitsintensiven Prozess zum Kultivieren und Transfizieren von Zellen, um genügend Vektoren für ein Experiment zu erhalten8. Daher wurde die Herstellung von AAV in Suspensionszellkultur in konischen Röhrchen entwickelt. Konische Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von bis zu 300 ml sind kompakt und sparen sowohl Platz im Inkubator als auch Kunststoff. Suspensionszellen sind in großen Mengen viel einfacher zu kultivieren und zu handhaben als adhärente Zellen auf 15-cm-Platten. Die Transfektionskomponenten des Protokolls bleiben gleich. Daher können Plasmide, die zuvor mit dem adhärenten System verwendet wurden, problemlos in diesem Protokoll verwendet werden, basierend auf der Produktion in Suspensionszellen. Das Protokoll wurde erfolgreich auf andere Forscher im Labor übertragen und erfolgreich für verschiedene Kapside und Konstrukte verwendet.

Protokoll

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Alle Versuchsverfahren wurden vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss der Königlich Niederländischen Akademie der Wissenschaften (KNAW) genehmigt und entsprachen dem niederländischen Tierversuchsgesetz unter der Projektnummer AVD8010020199126. In Abbildung 1 ist ein schematischer Überblick über das gesamte Protokoll gegeben. Von der Aussaat der Zellen bis zur AAV-Aufreinigung dauert das Protokoll 6 Tage.

1. Reagenzien-Vorbereitung

  1. Plasmid-Aufreinigung
    1. Führen Sie die Plasmidextraktion wie vom Hersteller beschrieben mit einigen Anpassungen durch, um die Sterilität der Plasmide zu gewährleisten.
    2. Bereiten Sie 70% Ethanol mit sterilem destilliertem Wasser und absolutem Ethanol zu.
    3. Nach dem Isopropanol-Zentrifugationsschritt trocknen Sie die Plasmide in der Durchflussschrankhaube und geben Sie steriles 70%iges Ethanol in die Röhrchen. Nach der Ethanolfällung trocknen Sie die Plasmide in der Haube des Durchflussschranks und resuspendieren Sie das Plasmid in sterilem destilliertem Wasser. Achten Sie darauf, sterilisierte Mikrozentrifugenröhrchen zu verwenden.
    4. Nehmen Sie ein Aliquot zur Quantifizierung, Restriktionsanalyse und, falls erforderlich, Sequenzierung. Es wird empfohlen, die Integrität der invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) zu überprüfen, da sich Mutationen negativ auf den Ertrag auswirken können. Stellen Sie die Probenkonzentration auf 1 μg/μl ein.
  2. Herstellung von 10x Tween-Lysepuffer
    1. Lösen Sie 30,3 g Tris-Puffer und 2,033 g MgCl 2,6H 2O in 400 ml sterilem destilliertem Wasser, stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 450 ml.
    2. Halten Sie Tween 20 steril, geben Sie 50 ml Tween 20 in die Pufferlösung in der Haube und sterilisieren Sie sie mit einem 0,2-μM-Vakuumfilter.
  3. Jodixanol-Verdünnungen
    1. Jodixanollösung wird in einer Konzentration von 60% bereitgestellt. Verwenden Sie die Ausgangslösung, um 15 %, 25 % und 40 % Lösungen herzustellen.
    2. Für eine 15%ige Lösung verdünnen Sie 60 ml 60% ige Lösung mit 48 ml 5 M NaCl und 48 ml PBS-MK (5x PBS mit 5 mM MgCl2 und 12,5 mM KCl) und fügen Sie destilliertes Wasser bis zu 240 ml hinzu.
    3. Für 25% ige Lösung verdünnen Sie 67 ml 60% ige Lösung und 32 ml PBS-MK. Fügen Sie destilliertes Wasser bis zu 160 ml hinzu. Gut mischen und 1,6 ml Phenolrotlösung hinzufügen.
    4. Für 40% ige Lösung 160 ml 60% ige Lösung mit 48 ml PBS-MK verdünnen und destilliertes Wasser bis zu 240 ml hinzufügen. Für eine 60%ige Lösung fügen Sie 1 ml Phenolrot zu 100 ml 60% iger Lösung hinzu.
  4. PBS 5%ige Saccharoselösung
    1. Geben Sie 25 g Saccharose in eine 500-ml-Flasche DPBS ohne Kalzium oder Magnesium. Gut schütteln und mit einem 0,2 μM Flaschenvakuumfilter filtrieren.
  5. Polyethylenglykol (PEG) 8000 Lösung
    1. 400 g PEG 8000 und 24 g NaCl in sterilem destilliertem Wasser auflösen und auf ein Endvolumen von 1000 ml einstellen. Unter Erhitzen umrühren, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie den pH-Wert mit pH-Papier auf 7,4 ein.
    2. Filtersterilisieren Sie mit einem 0,2-μM-Flaschenvakuumfilter, um eine 40%ige PEG 8000-Lösung zu erhalten. Beachten Sie, dass die Filtration aufgrund der Viskosität des Lösungslagers bei 4 °C eine Weile dauern kann.

2. Kultur von HEK293-Suspensionszellen

  1. Verwenden Sie zur Reinigung in 70% Ethanol getränkte Tücher. Reinigen Sie die Biosicherheitshaube, bereiten Sie alle Materialien vor, die für die Kultivierung von Zellen benötigt werden.
  2. 30 ml Suspensionszellenmedium in einem konischen 50-ml-Kultivierungsröhrchen auf 37 °C vorwärmen. Gewinnen Sie virale Produktionszellen aus flüssigem Stickstoff. Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auftauen. Reinigen Sie das Fläschchen kurz vor dem vollständigen Auftauen mit einem in 70 % Ethanol getränkten Tuch und geben Sie das Fläschchen in die Biosicherheitshaube.
    HINWEIS: Die Details der hier verwendeten viralen Produktionszellen sind in der Materialtabelle angegeben.
  3. Übertragen Sie die Zellen schnell in das vorgewärmte konische 50-ml-Kultivierungsröhrchen. Kultivieren Sie Zellen in einem Schüttelinkubator bei 37 °C, 80 % Luftfeuchtigkeit, 8 % CO2, 200 Umdrehungen pro Minute (RPM) und einem Schütteldurchmesser von 50 mm. Passagezellen, sobald die Lebensfähigkeit über 90% und die Zelldichte über 1-3 x 106 Zellen/ml liegt.
    HINWEIS: Der verwendete Inkubator hat einen Schütteldurchmesser von 50 mm; Die Kulturbedingungen sollten für einen anderen Schütteldurchmesser angepasst werden.
  4. Passagezellen 3-4 Tage nach dem Auftauen. Überprüfen Sie die Kulturröhrchen, um sicherzustellen, dass keine Anzeichen einer Kontamination vorliegen. Zum Beispiel erscheint der Pilz als verfärbter (schwarzer oder grüner) Ring.
  5. Bereiten Sie 400 μl 0,4%ige Trypanblaulösung pro Probe mit einer 1-ml-Stripette vor.
  6. Schnelle Entnahme von Suspensionszellen aus dem Inkubator. Extrahieren Sie sofort 500 μl mit einem 1-ml-Streifen aus dem Röhrchen. Vorsichtig auf und ab pipettieren.
  7. 100 μl Zellsuspension in das vorbereitete trypanblaue Röhrchen geben. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um es zu mischen; Pipettieren Sie nicht zum Mischen, da dies zum Zelltod führt. Zellen in den Inkubator zurücklegen.
  8. Nehmen Sie 50 μl mit Trypanblau behandelte Zellsuspension und tragen Sie sie auf den Hämozytometer-Objektträger auf. Zählen Sie die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen und berechnen Sie die Menge an Zellsuspension und Medium, die für die Passage oder Transfektion am nächsten Tag benötigt wird.
  9. Warmes Medium im Inkubator für 10-15 min. Geben Sie die Zellsuspension in das erwärmte Medium und kehren Sie zum Inkubator zurück. Für die Übergabe von Zellen für 3 Tage (d. h. Montag-Donnerstag) auf 0,5 x 106 Zellen/ml eingestellt; für die Passage von Zellen für 4 Tage (d. h. Donnerstag-Montag), eingestellt auf 0,3 x 106 Zellen/ml.
    HINWEIS: Laut Hersteller verdoppeln sich die Zellen der Virusproduktion alle 26 Stunden und sollten vor dem Passieren zwischen 3,5 x 106 und 5,5 x 106 liegen. Die Zellen können bis zum Durchgang 20 aufbewahrt werden.

3. Transfektion

  1. Tag 1
    1. 24 h vor der Transfektion 1 x 106 Zellen pro ml in 300 ml Medium kultivieren.
  2. Tag 2
    1. Warmes Medium, Plasmide und Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur. Die vorzubereitenden Beträge sind Tabelle 1 zu entnehmen.
    2. Kurz Plasmide und Reagenzien vortexen. Fügen Sie dem vorbereiteten Medium Plasmide hinzu, Vortex. Transfektionsreagenz zugeben und kurz vortexen. Rühren Sie die Mischung nach diesem Schritt nicht um. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. In der Zwischenzeit die am Tag 1 vorbereiteten Zellen zählen. Die Zellen sollten zwischen 2 und 2,5 x 106 Zellen pro ml und > 95% lebensfähig sein.
    4. Geben Sie nach der Inkubation die Transfektionsmischung tropfenweise in die Zellen, während Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. 72-96 h inkubieren.

4. Ernte der Zellen

  1. Tag 5
    1. 33 ml 10x Zelllysepuffer (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2) zugeben, durch leichtes Schütteln mischen und bei 37 °C 1,5 h unter Schütteln inkubieren.
    2. Zentrifugieren Sie bei 3428 x g bei 4 °C für 60 min. Filtrieren Sie durch einen 0,45 μM PES-Vakuumfilter, um das Zelllysat zu klären, und lassen Sie das geklärte Lysat im Behälter des Filters.
      HINWEIS: Optional nach der Filtration: Entnehmen Sie 50 μl Probe für die quantitative PCR (Q-PCR).
    3. 90 ml 40%ige PEG 8000-Lösung zu 360 ml gefiltertem Zelllysat geben.
    4. Reinigen Sie den Rührstab mit 70% Ethanol und geben Sie ihn in die Probe. Auf Eis oder im Kühlraum bei 300 U/min 1 h umrühren. Über Nacht bei 4 °C ohne Rühren inkubieren.
      HINWEIS: Es wurden Inkubationszeiten von 1 h bis 72 h getestet. Längere Inkubationszeiten wirken sich negativ auf die gesamte Proteinausfällung aus.

5. Jodixanol-Reinigung

  1. Tag 6
    1. Die gesamte PEG-gefällte Kulturvolumenprobe wird in ein sauberes, großes konisches Röhrchen überführt und 15 Minuten lang bei 2820 x g und 4 °C zentrifugiert.
    2. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das PEG-Pellet in 15 ml DPBS mit Kalzium und Magnesium. Das Pellet lässt sich nur schwer resuspendieren; Nehmen Sie sich die Zeit, dies sorgfältig zu tun.
    3. Übertragen Sie den resuspendierten Teil in ein sauberes 50-ml-Röhrchen. PEG verbleibt an den Seiten des Bioreaktorrohrs. Fügen Sie weitere 10 ml hinzu und achten Sie darauf, den gesamten PEG-Niederschlag zu sammeln. Alles in einen 50-ml-Behälter für ein Gesamtvolumen von 25-30 ml umfüllen.
    4. Fügen Sie 40 μl DNaseI (10 U/μl) hinzu. Für 1 h 37°C in den Inkubator stellen.
      HINWEIS: Optional nach Inkubation von DNase: Entnehmen Sie 50 μl Probe für die Q-PCR.
    5. Reinigen Sie Rührstäbe, die für die PEG-Fällung verwendet wurden, gut mit Chloridlösung, gefolgt von 70% Ethanol. Lassen Sie die Rührstäbchen in 70% Ethanol für das nächste Experiment.
    6. Füllen Sie ein 25 mm x 89 mm großes Polyallomerröhrchen mit einer Glaspasteurpipette mit 15,5 ml konzentriertem Zelllysat in jedem Röhrchen. Tauschen Sie nach der Zugabe von Zelllysat die Glaspipette Pasteur gegen eine neue aus.
    7. Fügen Sie Iodixanollösungen von 15%-60% hinzu: Ziehen Sie 9 ml der 15%igen Iodixanollösung vorsichtig unter das Zelllysat. Als nächstes fügen Sie 5 ml der 25% und 40% igen Iodixanollösungen und zuletzt 5 ml der 60% igen Iodixanollösung hinzu.
    8. Verschließen Sie das Röhrchen mit einer Spritze mit DPBS +/+, um die meisten Luftblasen zu entfernen, und achten Sie darauf, die Iodixanolschichten nicht zu stören. Verschließen Sie das Rohr mit einem elektrischen Schlauchaufsatz.
    9. 1 h 10 min bei 490.000 x g bei 16 °C in einer Ultrazentrifuge in einem Ausschwingrotor zentrifugieren. Aus der Ultrazentrifuge nehmen, die Röhrchen in einem Metallverschluss zusammensetzen und Sammelröhrchen vorbereiten. Öffnen Sie den Rotor in der Haube, falls während des Schleuderns etwas verschüttet wird.
    10. Bereiten Sie ein 50-ml-Röhrchen (zum Entsorgen des Rotorröhrchens), ein 15-ml-Röhrchen (zum Auffangen von Viren), eine 5-ml-Spritze und eine 30-g- und 19-g-Nadel pro Gradient vor.
    11. Stechen Sie mit einer 30G-Nadel ein Loch in die Oberseite des Röhrchens. Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle. Legen Sie eine 19G-Nadel auf die Spritze.
    12. Durchstechen Sie das Röhrchen vorsichtig knapp unter der 40%/60%-Grenzfläche, die an der Phenolrotanzeige zu erkennen ist. Stellen Sie sicher, dass die Nadelfase zur 40%-Schicht zeigt.
    13. Entfernen Sie die 30G-Nadel mit der nicht dominanten Hand von der Oberseite des Röhrchens. Extrahieren Sie mit abgeschrägter Nadel langsam das Virus/Iodixanol. Ziel ist es, zwischen 3 ml und 4,5 ml zu extrahieren. Drehen Sie die Nadel etwa auf halbem Weg und weit in die 40%/klare Schicht hinein, damit die Fase nach unten zeigt, und extrahieren Sie weiter, um eine Ansammlung aus der Proteinschicht zu vermeiden.
    14. Bereiten Sie das 50-ml-Röhrchen mit der nicht dominanten Hand vor, ziehen Sie die Nadel vorsichtig heraus, während Sie das Röhrchen in das 50-ml-Röhrchen legen und entsorgen. Verdünnen Sie die AAV/Iodixanol-Suspension 5x in DPBS, indem Sie bis zu 15 ml füllen.
    15. In ein Zentrifugalfilterrohr umfüllen und bei 3428 x g, 4 °C 10 min zentrifugieren. Durchfluss verwerfen; Entfernen Sie vorsichtig den Halter des Filters und kippen Sie den unteren Behälter in eine Abfallflasche. Fügen Sie 15 ml PBS-5% Saccharose hinzu, um zu filtrieren und zu resuspendieren.
    16. Zentrifugieren Sie bei 3428 x g bei 4 °C für 20 min. Wiederholen Sie den Pufferaustausch mindestens 3x. Viren (~150-250 μl) bei 4 °C (PHP. B-Varianten (maximal 3 Monate) oder in 50 μl Aliquote aliquotieren und langfristig bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: PHP. B-Kapsidvarianten reagieren empfindlich auf Einfrieren/Auftauen, daher sollte dies vermieden werden.
    17. Führen Sie die Titration wie in einem früheren Protokollbeschrieben durch 10.

Ergebnisse

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Die meisten akademischen Labore verwenden adhärente HEK293T Zellen für die AAV-Produktion 8,9. Während dies relativ gut funktioniert, wenn kleine Mengen AAV für die Direktinjektion benötigt werden, ist ein 100-fach höherer Titer (mindestens 1 x 1011 GC/Maus) erforderlich, um eine ähnliche Transduktion mit systemischen Kapsiden wie AAV zu erreichen. PHP.eB.

In diesem Protokoll wurde die Herstellung von AAV unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen etabliert, die in konischen Röhrchen kultiviert wurden. Kleinkulturen können in 50-ml-Röhrchen und großflächige in 600-ml-Röhrchen durchgeführt werden. Für spezifische Schüttler (siehe Materialtabelle) kann ein Rack verwendet werden, in dem bis zu 16 große Röhrchen gleichzeitig kultiviert werden können. Dieses Rack wird in Kombination mit speziellen Einsätzen für 50-ml-Röhrchen verwendet (Abbildung 2A). Dieses System bietet einen erheblichen Zeitgewinn für das Kultivierungs- und Transfektionssegment dieses Protokolls. Der anfängliche Aufbau der Produktion erfolgte mit Reporterkonstrukten für Luciferase und grün fluoreszierendes Protein (GFP)10,11. Parallel dazu wurde das GFP-Konstrukt in 12, 15 cm2 Platten hergestellt, wie in einem zuvor veröffentlichten Protokoll12 beschrieben. Im Durchschnitt wurde eine Ausbeute von 7,7 x 1012 GC insgesamt mit Polyethylenimin (PEI) und 2,4 x 1013 GC mit TransIt erzielt (Abbildung 2B). Für PEI ist dies eine fast 3-fache Verbesserung; für TransIt ist es eine 9,2-fache Verbesserung gegenüber den Titern, die mit adhärenter Kultur (2,6 x 1012) erzielt wurden. Bei Verwendung zur Transfektion von Suspensionszellen führt TransIt zu einer etwa 3-fachen Verbesserung der Ausbeute im Vergleich zu PEI (Abbildung 2B).

Anschließend wurde die Leistung der AAV-Vektoren in vivo getestet. GFP-Vektoren wurden mit PEI und TransIt hergestellt und mit GFP-Vektoren verglichen, die mit dem klassischen adhärenten System hergestellt wurden. 4 Wochen nach der Injektion wurden Mäuse (6 Wochen C57BL/6 weibliche Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g) getötet, und die GFP-Expression im Gehirn der Maus wurde histologisch untersucht (Abbildung 3A). Eine vergleichende Analyse wurde an sagittalen Hirnschnitten durchgeführt. Es wurde kein Unterschied im Transduktionsmuster des mit diesen Produktionsmethoden hergestellten Virus beobachtet (Abbildung 3B). Die Luciferase-Aktivität der mit beiden Methoden hergestellten Vektoren wurde ebenfalls bewertet. Die Transduktion wurde 3 Wochen lang in vivo gemessen; das Expressionsmuster im Laufe der Zeit ist ähnlich, unabhängig davon, welches Transfektionsreagenz verwendet wird (Abbildung 4).

Als nächstes wurde das Protokoll von anderen Mitgliedern des Teams getestet und implementiert (Tabelle 2). Die Herstellung anderer Kapside mit PEI war erfolgreich und ergab eine durchschnittliche Ausbeute von 3,5 x 1012 GC-Vektoren. Für die Produktion von Kapsid B10 kann eine 3-fache Verbesserung durch die Verwendung von TransIt im Vergleich zu PEI erreicht werden. Für ein anderes Projekt ergaben mehrere in AAv.PHP.eB verpackte Konstrukte eine durchschnittliche Ausbeute von 3,7 x 1012, was ausreicht, um 7 Mäuse intravenös in einer Dosis von 5 x 1011 GC pro Maus zu injizieren. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass das Protokoll von mehreren Forschern erfolgreich für verschiedene Kapside und Konstruktkombinationen eingesetzt werden kann.

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Abbildung 1: Schematische Übersicht der Produktion. An Tag 1 (D1) werden die Zellen in 300-ml-Röhrchen kultiviert. Am Tag 2 (D2) werden die Zellen mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert. Am Tag 5 (D5) werden die Zellen geerntet und mit einem 10-fachen Tween-Lysepuffer lysiert. Nach der Lyse werden Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt. Anschließend wird das Zelllysat filtriert, um große Proteine zu entfernen, und das AAV-Virus wird mit Polyethylenglykol (PEG) 8000 ausgefällt. An Tag 6 (D6) werden die Iodixanolreinigung und -konzentration durchgeführt. Das PEG-Konzentrat vom Vortag wird mit DNase behandelt und anschließend durch einen Iodixanol-Gradienten gegeben. Die gereinigten Vektoren werden anschließend mit einem Zentrifugalfilter entsalzt und konzentriert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Aufbau des Inkubators und AAV-Erträge. (A) Virale Produktionszellen werden in einem Schüttelinkubator mit einem Schütteldurchmesser von 50 cm kultiviert. Dieser Inkubator ist mit einer Adapterplatte für 600-ml-Röhrchen und speziellen Einsätzen für 50-ml-Röhrchen ausgestattet, die von der Mechatronikabteilung hergestellt werden. (B) Nach dem initialen Aufbau werden Reporterkonstrukte entweder mit Polyethylenimin (PEI; 7,7 x 1012 GC gesamt, n=5) oder TransIt (2,4 x 1013 GC insgesamt, n=5) als Transfektionsmethode verwendet und mit den Ausbeuten verglichen, die mit der klassischen adhärenten Methode (2,6 x 1012 GC insgesamt, n=5) erzielt wurden, wie in Verhaagen et al.12 beschrieben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: GFP-Expressionsmuster nach In-vivo-Bewertung . (A) Schematische Darstellung eines typischen AAV-Vektorkonstrukts, das den ubiquitären Promotor CMV immediate-early enhancer, den Huhn-β-Aktin-Promotor und die Kaninchen-β-Globin-Spleißakzeptorstelle (CAG) enthält, gefolgt von grün fluoreszierendem Protein (GFP), dem Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) und einem Polyadenylierungsschwanz (pA)13. Hier erhielten 6 Wochen alte weibliche Mäuse (n=3) eine Schwanzveneninjektion, die 5 x 1011 Gesamtgenomkopien (gc)/Maus enthielt. 4 Wochen nach der Injektion wurden Mäuse getötet und die Gehirne histologisch analysiert. (B) Repräsentative Darstellung des Transduktionsmusters in sagittalen Schnitten unter Verwendung von adhärenten HEK293T Zellen und Suspensionszellen mit Polyethylenimin (PEI) oder TransIt-Transfektionsreagenz, ein ähnliches Transduktionsmuster wird unabhängig vom verwendeten Herstellungsverfahren beobachtet. Maßstabsbalken = 1000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Ähnliche Luciferase-Aktivität unabhängig von der Transfektionsmethode. (A) Schematische Darstellung des verwendeten Konstrukts, das den ubiquitären Promotor CMV Immediate-Early Enhancer, den Hühner-β-Aktin-Promotor und die Kaninchen-β-Globin-Spleißakzeptorstelle (CAG) Luciferase (LUC) mit einem V5-Tag und einem bovinen Wachstumshormon-Polyadenylierungsschwanz (BGHpA) enthält, 5 x 1011 GC insgesamt/Maus (n=3) wurde über die Schwanzvene injiziert, Luziferaseaktivität im Schädelbereich (rot eingekreist, (Beispielbild) als biolumineszierendes Bild wurde wöchentlich gemessen. (B) Die Biolumineszenzaktivität wurde als relative Lumineszenzeinheiten (RLU) gemessen, dargestellt als blauer Balken für die PEI-Produktion und als brauner Balken für TransIt. Zwischen den Gruppen wurde kein signifikanter Unterschied in der Luziferase-Aktivität im ausgewählten Gehirnbereich beobachtet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Transfektionsparameter. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Erträge des implementierten Protokolls. Suspensionsprotokoll, das von anderen Forschern zur Herstellung von AAV verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die systemische Verabreichung von AAV ist ein wirksames Werkzeug für den Gentransfer in das ZNS; Die Herstellung von AAV ist jedoch ein teurer und mühsamer Prozess. Durch die Verwendung von Suspensionszellen werden Arbeitsaufwand und Kunststoffe im Vergleich zur adhärenten Kultur von HEK293T auf 15 cm2 Platten reduziert. Darüber hinaus sind die hier implementierten konischen Röhrchen einfach zu handhaben und maximieren die Nutzung des Laborraums. Das Protokoll wurde von zwei Forschern erstellt und anschließend von anderen im Labor angewendet. Eine Reihe von Produktionen von drei unabhängigen Forschern ergab im Durchschnitt genug Vektoren pro Charge, um 6-7 Mäuse zu injizieren.

Die Verwendung von HEK293-Suspensionszellen wurde bereits beschrieben 13,14. Die beschriebene Suspensionszelllinie ist jedoch für Forschungszwecke nicht frei verfügbar. Dies ist ein Engpass für akademische Forscher bei der Anwendung der beschriebenen Methoden. Die in diesem Protokoll beschriebene Suspensionszelllinie ist für Forschungszwecke frei verfügbar. Die Kultivierung der Suspensionszellen erfolgte in konischen Röhrchen anstelle von Erlenmeyer, um Platz und Zeit zu sparen. Mit Erlenmeyer's können bis zu 4 Produktionen gleichzeitig kultiviert werden, im Gegensatz zu 12 Produktionen mit konischen Röhrchen. Konische Röhrchen können zur Ernte direkt in die Zentrifuge überführt werden.

Eine alternative Möglichkeit für ein Suspensionszellkultursystem ist das bakulovirale System. Ein Vorteil des baculo-Systems ist, dass diese Zellen und Medien öffentlich zugänglich sind und einfach angewendet werden können. Für Akademiker stehen Repositorien wie Addgene zur Verfügung, die eine große Bibliothek gebrauchsfertiger AAV-Transferplasmideenthalten 12. Diese können zwar auch Vorbehalte haben, wie z. B. fehlerhafte ITRs, dienen aber als gute Quelle für Plug-and-Play-Experimente. Es wurde entschieden, ein HEK293-basiertes Produktionssystem beizubehalten, da verfügbare Plasmide direkt für die Produktion verwendet werden können, ohne dass das Konstrukt auf Baculovirus übertragen werden muss.

Für die Transfektion ist Polyethylenimin relativ günstig und daher das Transfektionsreagenz der Wahl. Als Alternative wurde eine neuartige Transfektionsmethode (TransIt) evaluiert, um die Ausbeute an Vektoren zu erhöhen. Eine dreifache Verbesserung wurde mit der Hälfte der Plasmidmenge beobachtet. Dies macht TransIt zu einem interessanten alternativen Transfektionsreagenz, wenn größere Bestände benötigt werden. Eine Einschränkung davon sind die Kosten, die es für kleine Chargen weniger interessant machen.

Zusammenfassend wird hier ein Protokoll vorgestellt, mit dem AAV mit hoher Ausbeute in Suspensionszellen in einer akademischen Laborumgebung hergestellt werden kann. Es werden Werkzeuge beschrieben, die in einer akademischen Laborumgebung verwendet werden können, um AAV mit hoher Ausbeute herzustellen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine kostenlose Probe von TransIT wurde von Mirus für erste Tests zur Verfügung gestellt, woraufhin das Reagenz zur weiteren Verwendung gekauft wurde. Die Autoren haben keine anderen konkurrierenden finanziellen Interessen zu berichten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Forschungsfonds der Königlich Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (KNAW) und einen Zuschuss von Start2Cure (0-TI-01) unterstützt. Wir danken Leisha Kopp für ihren Input und ihre Beratung bei der Erstellung des Protokolls. Die Figuren wurden mit Biorender erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
39 mL, Quick-Seal Röhrchen aus Polypropylen, 25 x 89 mm - 50PkBeckman Coulter342414
Adapter 600 mL konische Röhrchen, für Rotor S-4x1000, eppendorf5920701002
Adapter Plate passend für 16 Bioreaktoren à 600 mlInfors HT/ TPP587633
Aerosoldichte Verschlüsse, für 750 mL Rundbechereppendorf5820747005
Zentrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, inkl. Rotor S-4x1000, Rundbecher und Adapter 15 mL/50 mL konische Röhrcheneppendorf5948000315
Distilled WaterGibco
DNase I rekombinant, RNasefreiRoche4716728001
DNase I rekombinant, RNase-freiRoche4716728001
DPBS, Calcium, MagnesiumGibco14040091
DPBS, kein Calcium, kein MagnesiumGibco14190144
Fisherbrand Einweg-PES-Filtereinheiten 0,2Fisher
Fisherbrand Einweg PES Filtereinheiten 0,45FisherFB12566505
Halter für 50 ml Kulturröhrchen passt auch für Falcon RöhrchenInfors HT/ TPP31362
Halter für 600 ml ZellkulturröhrchenInfors HT/ TPP66129
Inkubator Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX ProduktionsmediumGibco
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimin Hydrochlorid (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
Phenolrote Lösung Sigma-Aldrich72420100
Poly(ethylenglykol) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Trypanblau-Lösung, 0,4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreaktoren-50mlTTP87050
TubeSpin Bioreaktoren-600mlTTP87600
Zellen zur viralen ProduktionGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363
15230147FB12566504A3583401

Referenzen

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  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).
  2. Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).
  3. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
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Schlagwörter

AAV Produktionadeno assoziierte Vektorenhochertragiges AAVTripel TransfektionIodixanol GradientPolyethylenimin TransfektionZentrifugationsfiltrationzentrales NervensystemReinigung viraler Vektoren

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