Hier wird ein zellbasiertes AAV-Produktionsprotokoll für HEK293-Suspensionen vorgestellt, das zu einem reduzierten Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion mit Komponenten führt, die für Forschungszwecke von kommerziellen Anbietern erhältlich sind.
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Methodenartikel
Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) sind ein bemerkenswertes Werkzeug zur Untersuchung des zentralen Nervensystems (ZNS). Innovative Kapside, wie z. B. AAV. PHP.eB, zeigen eine ausgedehnte Transduktion des ZNS durch intravenöse Injektion bei Mäusen. Um eine vergleichbare Transduktion zu erreichen, ist ein 100-fach höherer Titer (mindestens 1 x 1011 Genomkopien/Maus) im Vergleich zur direkten Injektion in das ZNS-Parenchym erforderlich. In unserer Gruppe ist die AAV-Produktion, einschließlich AAV. PHP.eB setzt auf adhärente HEK293T Zellen und die dreifache Transfektionsmethode. Das Erreichen hoher AAV-Ausbeuten mit adhärenten Zellen erfordert einen arbeits- und materialintensiven Prozess. Diese Einschränkung veranlasste die Entwicklung eines Protokolls für suspensionsbasierte Zellkulturen in konischen Röhrchen. AAVs, die in adhärenten Zellen erzeugt wurden, wurden mit der Suspensionsherstellungsmethode verglichen. Kulturen in Suspension mit Transfektionsreagenzien Polyethylenimin oder TransIt wurden verglichen. AAV-Vektoren wurden durch Iodixanol-Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigt, gefolgt von Pufferaustausch und Konzentration mit einem Zentrifugalfilter. Mit der adhärenten Methode erreichten wir insgesamt durchschnittlich 2,6 x 1012 Genomkopien (GC), während die Suspensionsmethode und Polyethylenimin insgesamt 7,7 x 1012 GC und TransIt insgesamt 2,4 x 1013 GC ergaben. Es gibt keinen Unterschied in der In-vivo-Transduktionseffizienz zwischen Vektoren, die mit Adhärent hergestellt wurden, im Vergleich zum Suspensionszellensystem. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein auf Suspensionszellen HEK293-Zellen basierendes AAV-Produktionsprotokoll eingeführt wird, das zu einem geringeren Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion führt und gleichzeitig eine 3- bis 9-mal höhere Ausbeute mit Komponenten erzielt, die von kommerziellen Anbietern für Forschungszwecke erhältlich sind.
Einleitung
Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wurde 1965 entdeckt und seitdem in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt1. AAVs wurden in der neurowissenschaftlichen Forschung eingesetzt, um Gen- und neuronale Funktionen zu untersuchen, Neuroschaltkreise zu kartieren oder Tiermodelle für Krankheitenherzustellen 2. Traditionell geschieht dies durch Injektion direkt an der interessierenden Stelle, da die meisten natürlichen Serotypen die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden oder dafür eine hohe Dosis benötigen 1,2,3.
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Protokoll
Alle Versuchsverfahren wurden vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss der Königlich Niederländischen Akademie der Wissenschaften (KNAW) genehmigt und entsprachen dem niederländischen Tierversuchsgesetz unter der Projektnummer AVD8010020199126. In Abbildung 1 ist ein schematischer Überblick über das gesamte Protokoll gegeben. Von der Aussaat der Zellen bis zur AAV-Aufreinigung dauert das Protokoll 6 Tage.
1. Reagenzien-Vorbereitung
- Plasmid-Aufreinigung
- Führen Sie die Plasmidextraktion wie vom Hersteller beschrieben mit einigen Anpassungen durch, um die Sterilit....
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Ergebnisse
Die meisten akademischen Labore verwenden adhärente HEK293T Zellen für die AAV-Produktion 8,9. Während dies relativ gut funktioniert, wenn kleine Mengen AAV für die Direktinjektion benötigt werden, ist ein 100-fach höherer Titer (mindestens 1 x 1011 GC/Maus) erforderlich, um eine ähnliche Transduktion mit systemischen Kapsiden wie AAV zu erreichen. PHP.eB.
In diesem Protokoll wurde die Herstellung von AAV unter Verwendung vo.......
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Diskussion
Die systemische Verabreichung von AAV ist ein wirksames Werkzeug für den Gentransfer in das ZNS; Die Herstellung von AAV ist jedoch ein teurer und mühsamer Prozess. Durch die Verwendung von Suspensionszellen werden Arbeitsaufwand und Kunststoffe im Vergleich zur adhärenten Kultur von HEK293T auf 15 cm2 Platten reduziert. Darüber hinaus sind die hier implementierten konischen Röhrchen einfach zu handhaben und maximieren die Nutzung des Laborraums. Das Protokoll wurde von zwei Forschern erstellt und anschließend.......
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Offenlegungen
Eine kostenlose Probe von TransIT wurde von Mirus für erste Tests zur Verfügung gestellt, woraufhin das Reagenz zur weiteren Verwendung gekauft wurde. Die Autoren haben keine anderen konkurrierenden finanziellen Interessen zu berichten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Forschungsfonds der Königlich Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (KNAW) und einen Zuschuss von Start2Cure (0-TI-01) unterstützt. Wir danken Leisha Kopp für ihren Input und ihre Beratung bei der Erstellung des Protokolls. Die Figuren wurden mit Biorender erstellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 39 mL, Quick-Seal Röhrchen aus Polypropylen, 25 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL konische Röhrchen, für Rotor S-4x1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate passend für 16 Bioreaktoren à 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosoldichte Verschlüsse, für 750 mL Rundbecher | eppendorf | 5820747005 | |
| Zentrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, inkl. Rotor S-4x1000, Rundbecher und Adapter 15 mL/50 mL konische Röhrchen | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | ||
| DNase I rekombinant, RNasefrei | Roche | 4716728001 | |
| DNase I rekombinant, RNase-frei | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, Calcium, Magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, kein Calcium, kein Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Einweg-PES-Filtereinheiten 0,2 | Fisher | ||
| Fisherbrand Einweg PES Filtereinheiten 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Halter für 50 ml Kulturröhrchen passt auch für Falcon Röhrchen | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Halter für 600 ml Zellkulturröhrchen | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Inkubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Produktionsmedium | Gibco | ||
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep - Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimin Hydrochlorid (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenolrote Lösung | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylenglykol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypanblau-Lösung, 0,4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreaktoren-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreaktoren-600ml | TTP | 87600 | |
| Zellen zur viralen Produktion | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
Referenzen
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).
- Pietersz, K. L., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
