Echtzeit-Auswertung der absoluten, zytosolischen, freien ca2+ und der entsprechenden Kontraktilität in isolierten, druckbeaufschlagten Lymphgefäßen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur gleichzeitigen Messung von zytosolischem, freiem Calcium [Ca²⁺]_i und Gefäßdurchmesser in kontrahierenden Lymphgefäßen in Echtzeit und zur Berechnung der absoluten Ca2⁺ -Konzentrationen sowie der Kontraktilitäts-/Rhythmizitätsparameter. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Ca2⁺ und kontraktile Dynamik unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das lymphatische Gefäßsystem, das heute oft als "dritter Kreislauf" bezeichnet wird, befindet sich in vielen lebenswichtigen Organsystemen. Eine der wichtigsten mechanischen Funktionen des Lymphgefäßsystems besteht darin, Flüssigkeit aus den extrazellulären Räumen in die zentralen Venengänge zurückzuführen. Der Lymphtransport wird durch spontane rhythmische Kontraktionen der Lymphgefäße (LVs) vermittelt. LV-Kontraktionen werden weitgehend durch den zyklischen Anstieg und Abfall von zytosolischem, freiem Calcium ([Ca²⁺]_i) reguliert.

In dieser Arbeit wird eine Methode zur gleichzeitigen Berechnung von Änderungen der absoluten Konzentrationen von [Ca²⁺]_i und der Kontraktilität/Rhythmizität der Gefäße in Echtzeit in isolierten, unter Druck stehenden LVs vorgestellt. Unter Verwendung isolierter mesenterialer LVs der Ratte untersuchten wir Veränderungen von [Ca²⁺]_i und der Kontraktilität/Rhythmizität als Reaktion auf die Wirkstoffzugabe. Isolierte LVs wurden mit dem ratiometrischen Ca²⁺-Sensorindikator Fura-2AM geladen, und die Videomikroskopie in Verbindung mit einer Kantenerkennungssoftware wurde verwendet, um [Ca²⁺]_i - und Durchmessermessungen kontinuierlich in Echtzeit zu erfassen.

Das Fura-2AM-Signal von jedem LV wurde auf das Minimal- und Maximalsignal für jedes Gefäß kalibriert und zur Berechnung des absoluten [Ca²⁺]_i verwendet. Durchmessermessungen wurden verwendet, um kontraktile Parameter (Amplitude, enddiastolischer Durchmesser, endsystolischer Durchmesser, berechnete Strömung) und Rhythmizität (Frequenz, Kontraktionszeit, Relaxationszeit) zu berechnen und mit absoluten [Ca²⁺]_i-Messungen zu korrelieren.

Einleitung

Das lymphatische Gefäßsystem befindet sich in vielen Organsystemen, einschließlich Gehirn, Herz, Lunge, Niere und Mesenterium 1,2,3,4,5,6, und funktioniert, indem es Flüssigkeit (Lymphe) aus den interstitiellen Räumen zu den zentralen Venengängen befördert, um die Flüssigkeitshomöostase aufrechtzuerhalten 7,8,9,10 . Es beginnt mit verstopften lymphatischen Kapillaren innerhalb der Gefäßkapillarbetten, die in die sammelnden Lymphgefäße (LVs) abfließen. Sammelnde LVs bestehen aus zwei Zellschichten: einer Schicht aus Endothelzellen, die von einer Schicht aus lymphatischen Muskelzellen (LMCs) umgeben ^sind10,11. Der Lymphflüssigkeitstransport wird sowohl durch extrinsische Kräfte (z. B. Lymphneubildung, arterielle Pulsationen, zentralvenöse Druckschwankungen) als auch durch intrinsische Kräfte erreicht¹².

Die intrinsische Kraft für den Lymphtransport ist die spontane rhythmische Kontraktion der sich sammelnden LVs, die im Mittelpunkt der meisten Studien zur Untersuchung der Lymphfunktion steht. Diese intrinsische Lymphpumpe wird hauptsächlich durch das zyklische Auf und Ab von zytosolischem, freiem Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) reguliert. Die spontane Depolarisation der Plasmamembran in LMCs aktiviert spannungsgesteuerte "L-Typ" Ca²⁺ (Ca_v1.x) Kanäle, die den Ca2⁺-Einstrom und die anschließende rhythmische LV-Kontraktion auslösen ^8,9,10. Diese Rolle wurde durch die Blockade von Ca_v1.x mit spezifischen Wirkstoffen wie Nifedipin nachgewiesen, das die LV-Kontraktionen hemmte und eine Gefäßerweiterung verursachte^13,14. Der vorübergehende Anstieg von [Ca²⁺]_i oder "Ca²⁺ Spike" in den LMCs, der durch Ca_v1.x-Kanäle vermittelt wird, kann auch intrazelluläre Ca2⁺-Speicher mobilisieren, indem Inositoltriphosphat (IP₃)-Rezeptoren und Ryanodinrezeptoren (RyRs) auf dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) aktiviert werden15,16,17,18. Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass_{IP-3-Rezeptoren} im Vergleich zu RyRs 15,16,19,20,21 mehr Ca2⁺ beitragen, das für normale LV-Kontraktionen erforderlich ist; RyR können jedoch während der Pathologie oder als Reaktion auf pharmazeutische Interventionen eine Rolle spielen^17,18. Darüber hinaus kann die Aktivierung der Ca2⁺-aktivierten K^+-Kanäle²² und der ATP-sensitiven Kaliumkanäle (K_ATP) ^23,24 die LMC-Membran hyperpolarisieren und die spontane kontraktile Aktivität hemmen.

Es gibt viele andere Ionenkanäle und Proteine, die die^Ca2+ -Dynamik beim Sammeln von LVs regulieren können. Der Einsatz von Methoden zur Untersuchung von Veränderungen von Ca2⁺ und der Kontraktilität der Gefäße als Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe in Echtzeit ist wichtig, um diese potenziellen Regulatoren zu verstehen. Eine frühere Methode, bei der Fura-2 zur Messung relativer Änderungen von LV [Ca²⁺]_i verwendet wurde, wurde beschrieben²⁵. Da die Dissoziationskonstante für Fura-2 und Ca²⁺ bekannt ist²⁶, ist es möglich, die tatsächlichen Konzentrationen von Ca²⁺ zu berechnen, was die Anwendung dieser Methode erweitert und zusätzliche Einblicke in die Ca2⁺ -Signalgebung, die Membranerregbarkeit und die Kontraktilitätsmechanismen²⁷ bietet und Vergleiche zwischen den Versuchsgruppen ermöglicht. Dieser letztere Ansatz wurde bei Kardiomyozyten²⁸ angewendet und kann daher an LVs angepasst werden. In diesem Artikel wird eine verbesserte Methode vorgestellt, die diese beiden Ansätze kombiniert, um Änderungen des absoluten [Ca²⁺]_i sowie der Kontraktilität/Rhythmizität des Gefäßes kontinuierlich in Echtzeit in isolierten, unter Druck stehenden LVs zu messen und zu berechnen. Wir liefern auch repräsentative Ergebnisse für LVs, die mit Nifedipin behandelt wurden.

Protokoll

Neun bis 13 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden von einem kommerziellen Verkäufer gekauft. Nach ihrer Ankunft wurden alle Ratten in der Einrichtung der University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Division of Lab Animal Medicine (DLAM) untergebracht und unter einer Standard-Labordiät gehalten und 12 Stunden lang einem Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 ^°C ausgesetzt. Alle Verfahren wurden gemäß dem genehmigten Tierverwendungsprotokoll #4127 vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der UAMS durchgeführt.

1. Dissektion und Kanülierung mesenterialer LVs

HINWEIS: Es ist wichtig, die Perfusionskammer vor der Isolierung der mesenterialen LVs einzurichten, um sicherzustellen, dass es keine Unterbrechung des Flusses oder ein Leck gibt, das das Experiment stören würde.

1. Vorbereitung des Perfusionsbades
   1. Kaufen Sie Mikropipetten aus Borosilikatglas (1,2 mm Außendurchmesser, 0,68 mm Innendurchmesser und mit einem Außendurchmesser von 75-100 μm) von einem kommerziellen Händler. Schneiden und polieren Sie Mikropipetten (auch Kanülen genannt) auf eine Länge von ca. 1-2 cm für den Einbau in die isolierte Gefäßperfusionskammer.
   2. Verbinden Sie jede montierte Glaskanüle in der Perfusionskammer des Gefäßes mit unabhängigen Druckmessumformern, die in einer Linie mit unabhängigen Schwerkraft-Druckreglern mit Polyethylenschläuchen angeordnet sind.
      HINWEIS: Dies ermöglicht eine unabhängige Manipulation des Zu- und Abflussdrucks je nach Studiendesign. Abbildung 1 zeigt dieses Setup im Detail.
   3. Füllen Sie die Perfusionskammer (5 mL), die Glasmikropipetten und den unabhängigen Schwerkraft-Druckregler zusammen mit dem Polyethylenschlauch mit physiologischer Salzlösung (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO₃; 1,17 mM NaH₂PO₄; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO₄; 5,5 mM C₆H₁₂O₆ (Glukose); 0,026 mM_{C 10}H₁₆N₂O₈ (EDTA) und 1,6 mM CaCl₂) ohne Luftblasen. Klemmen Sie dann den Druck so ein, dass die Kanülen nicht unter Druck stehen.
      HINWEIS: Der pH-Wert dieser Lösung beträgt ~7,5. Im Perfusionsbad wird ein pH-Wert von 7,4 aufrechterhalten, wobei die CO₂ -Blase verwendet wird, um auf das Bikarbonat-Puffersystem innerhalb des PSS zu wirken, wie in Schritt 1.3.7 beschrieben. EDTA wird hier verwendet, um überschüssige^Ca2+ -Ionen zu chelatisieren.
2. Vorbereitung der Knoten
   1. Binden Sie doppelte Überhandknoten unter dem Mikroskop mit geflochtenem Seidennahtfaden (Größe 8-0). Die wichtigsten Schritte sind in Abbildung 2 dargestellt.
      1. Trennen Sie ein einzelnes Filament.
      2. Verwenden Sie zwei Dumont #5 Pinzetten mit mikrostumpfen Spitzen und machen Sie mit einer Pinzette eine doppelte Schlaufe um die Spitze der anderen Pinzette.
      3. Fassen Sie mit der Schlaufenzange das lose Ende der Naht und ziehen Sie sie durch beide Schlaufen, wobei Sie darauf achten, dass der Knoten nicht vollständig zugezogen wird und eine kleine Öffnung bleibt.
      4. Verwenden Sie eine Vanna-Federschere, um überschüssiges Nahtmaterial von beiden Seiten zu schneiden. Verwenden Sie diese Knoten später, um den LV auf den Kanülen zu befestigen.
         HINWEIS: Verwenden Sie nicht die gleiche Pinzette, mit der Sie präparieren oder kanülieren werden, da die Gefahr besteht, dass die Pinzettenspitzen beim Knotenbinden beschädigt werden.
3. Isolierung und Kanülierung mesenterialer LVs
   1. Tiere durch Verabreichung eines 5%igen Isoflurans mit einer Überdosierung von 1,5 l/min O₂ tief betäuben und durch Enthauptung exsanguinieren.
   2. Isolieren Sie ganze Mesenterien für die Dissektion mesenterialer LVs, indem Sie zuerst einen Längsschnitt entlang der Mittellinie der Bauchwand machen, das Mesenterium nach außen stellen und dann die Verbindung knapp unter dem Pylorusschließmuskel und ~2-3 cm über dem Blinddarm sowie die Verbindung zum Rektum abschneiden.
   3. Waschen Sie die präparierten ganzen Mesenterien in 200 ml eiskaltem PSS und geben Sie sie dann in eine mit Silikon ausgekleidete (8-10 mm) Petrischale (100 mm), die eiskaltes PSS enthält.
   4. Präparieren Sie mesenteriale LVs zweiter Ordnung aus dem umgebenden Fett und Bindegewebe mit einem Stereomikroskop, dissektionieren Sie eine Dumont #5 Inox-Feinzange und eine Vanna-Federschere. Um die Enden der LVs nach der Entfernung aus dem Gewebe zu identifizieren, lassen Sie ein kleines Stück Fett am proximalen Ende der LV.
   5. Übertragen Sie die präparierten LVs in die Perfusionskammer des Gefäßes, um sie mit Glaskanülen zu kanülieren.
   6. Verwenden Sie zwei vorgeschärfte Dumont #5 Inox-Feinpinzetten mit gerader Spitze (0,05 x 0,01 mm), um LVs mit dem distalen Ende der LV auf der P1-Kanüle (Zufluss) und dem proximalen Ende des Gefäßes auf der P2-Kanüle (Ausfluss) zu kanülieren, um die Richtung des Lymphflusses nachzuahmen.
      HINWEIS: Die Kanülen P1 und P2 sind identisch und unterscheiden sich nur darin, an welchem Ende des LV angeschlossen wird. Es ist wichtig, eine Pinzette zu verwenden, die perfekt an der Spitze und ohne Beschädigung trifft, um das Greifen der dünnen Gefäßwand zu erleichtern.
      1. Schieben Sie einen einzelnen vorgebundenen Knoten auf jede Glaskanüle, um das Gefäß später auf den Kanülen zu befestigen.
      2. Verwenden Sie das kleine Stück Fett, um die LV-Richtung zu orientieren, und kanülieren Sie zuerst das distale Ende auf P1.
      3. Schieben Sie den Knoten an der Kanüle hinunter und ziehen Sie ihn fest, um die LV zu sichern. Achten Sie darauf, dass Sie die Kanülenspitze nicht zu fest anziehen und brechen.
      4. Beaufschlagen Sie die LV in der Perfusionskammer auf 4-5 mm Hg.
         HINWEIS: Für unsere Zwecke stellen wir den Druck von P1 und P2 auf gleich ein. Abhängig von den Versuchsbedingungen kann der Druck jedoch an jeder Kanüle angepasst werden, um eine Scherspannung oder einen Rückfluss zu induzieren.
      5. Die Schritte 1.3.6.1 bis 1.3.6.4 sind zu wiederholen, um das proximale Ende des LV auf P2 zu kanülieren.
   7. Legen Sie den sprudelnden Stein mit 7 % Kohlendioxid (CO₂)/93 % Sauerstoff (_O2) in die Badekammer, um den physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten.
   8. Schließen Sie die Kammer an den Temperaturregler an und stellen Sie sie auf 37 ^°C ein, damit sich die LVs ausgleichen und stabile, spontane Kontraktionen entwickeln können (ca. 30 Minuten).
      HINWEIS: Abbildung 1 zeigt dieses Setup im Detail.

2. Messung der absoluten Konzentrationen von [Ca²⁺]_i in LV

1. Fura-2AM-Färbung von kanülierten LVs
   1. Nachdem sich spontane Kontraktionen entwickelt haben (aus Schritt 1.3.8), inkubieren Sie LVs mit Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2AM; 2 μM oder 10 μL/5 mL) und Pluronsäure (PA; 0,02 % W/V oder 5 μl/5 mL 20 % PA) für 30 min im Dunkeln.
      HINWEIS: Nach der Zugabe von Fura-2AM müssen alle verbleibenden Schritte im Dunkeln durchgeführt werden.
   2. Nach 30 min wird die Lösung in der Perfusionskammer 3x ausgetauscht, indem das gesamte Badvolumen mit einem Unterdruckvakuum entleert und durch temperaturangepasstes (37 ^°C) reagenzienfreies PSS ersetzt wird.
      HINWEIS: Dies sollte schnell erfolgen, um die Zeit, in der das LV in der Luft schwebt, zu minimieren. Verwenden Sie beide Hände, z. B. die rechte Hand zum Vakuumieren und die linke Hand zum Ersetzen des neuen reagenzienfreien PSS.
   3. Nach dem Waschen die LVs 15 Minuten lang im Dunkeln inkubieren, um den überschüssigen Indikator zu entfernen und eine Entesterung zu ermöglichen.
2. Erfassen von Ca²⁺ Fluoreszenz und Gefäßdurchmesser
   1. Übertragen Sie die Kammer auf den inversen Fluoreszenzmikroskoptisch, der mit einer LED-Lichtquelle, einem 20x S Fluor-Objektiv, einem Cell-Framing-Adapter und einem schnellen CMOS-Videokamerasystem ausgestattet ist, das eine Bild-für-Bild-Fluoreszenzerfassung bei 15 Hz ermöglicht.
      HINWEIS: Ein Schema dieser Workflow-Einrichtung ist in Abbildung 3 dargestellt. Das Ca²⁺ -Signal kann mit einer CCD-Kamera mit mindestens 15 fps erfasst werden.
   2. Schließen Sie das Mikroskop an den Computer an, der mit einer Bildgebungssoftware ausgestattet ist, um Fluoreszenz und Kantenerkennung aufzuzeichnen.
      HINWEIS: Die referenzierte Software ermöglicht auch die gleichzeitige Druckaufzeichnung; Das ist hier jedoch nicht enthalten.
   3. Schalten Sie die LED-Lichtquelle und die Schnittstelle des Leuchtstoffsystems ein.
      HINWEIS: Die hier beschriebenen Softwareanweisungen gelten für die referenzierte Software, aber es kann auch andere Software verwendet werden, um diese Daten zu erhalten.
   4. Offene Software (IonWizard).
   5. Wählen Sie auf der Registerkarte Datei die Option Neu aus.
   6. Wählen Sie auf der Registerkarte "Sammeln " die Option "Experimentieren" aus.
   7. Laden Sie die gewünschte experimentelle Vorlage, und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Sie müssen eine experimentelle Vorlage mit den zu messenden Parametern einrichten. Eine Anleitung zur Einrichtung von Vorlagen finden Sie im Software-Handbuch²⁹.
   8. Passen Sie die Kurven auf dem Bildschirm so an , dass Gefäßdurchmesser, Zähler (340-Signal), Nenner (380-Signal) und Verhältnis in absteigender Reihenfolge angezeigt werden.
   9. Passen Sie die Skalierung der Y-Achse nach Bedarf an, um die Kurven besser visualisieren zu können.
      1. Wählen Sie unter Ablaufverfolgungen die Option Benutzerlimits bearbeiten aus. Stellen Sie sicher, dass die Option Automatische Grenzwerte deaktiviert ist.
      2. Wählen Sie den Parameter aus, den Sie anpassen möchten, geben Sie die Minimal- und Maximalwerte für die Achse ein, und wählen Sie dann OK aus.
   10. Um das Experiment zu starten, klicken Sie auf START (unten auf dem Bildschirm).
   11. Um den LV-Durchmesser gleichzeitig zu messen, verwenden Sie die in das Bildgebungssystem integrierte Kantenerkennungssoftware, die kontraktile Spuren von LVs bei 3 Hz erzeugt. Verwenden Sie diese Messungen, um die in Abschnitt 3 beschriebenen und in Abbildung 4 gezeigten Kontraktions- und Rhythmizitätsparameter zu analysieren.
       1. Achten Sie darauf, die Beleuchtung so anzupassen, dass die LV-Wand als dunkle Linien erscheint.
       2. Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) aus, die frei von Fett und Ablagerungen ist. Nachdem der Test gestartet wurde, verschieben Sie diesen ROI nicht.
       3. Stellen Sie sicher, dass der Schwellenwert so eingestellt ist, dass die Behälterwandkante während des gesamten Kontraktionszyklus erkannt wird.
   12. Schalten Sie für Fluoreszenzmessungen die Photomultiplier-Röhre (PMT) ein.
   13. Stimulieren Sie Fura-2, einen ratiometrischen Indikator, durch Abwechseln von 340 und 380 nm Wellenlängen in 50 ms Belichtung mit LED-Beleuchtungen und erfassen Sie die Emissionsspektren bei 510 nm bei 15 Hz über das gesamte Bildgebungsfeld.
       HINWEIS: Es ist wichtig, alle optischen Parameter (Anregungseinstellungen, Emissionsfilter, Objektiv und dichroitische Spiegel) für eine ganze Reihe von Experimenten gleich zu halten, um reproduzierbare Ca²⁺ -Messungen zu erhalten.
   14. Messen Sie das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, indem Sie zuerst die Fluoreszenz 340 und 380 mit dem LV in der Mitte des Sichtfeldes (Signal) erhalten und dann mit den Tischmanipulatoren das Sichtfeld ohne Gefäß an den Rand des Bades verschieben (wobei darauf zu achten ist, dass der mit Silikon ausgekleidete Rand vermieden wird und/oder indem Sie Schmutz aus dem Bad entfernen), um den Hintergrund einzufangen.
       HINWEIS: Es ist wichtig, jedes Mal zum ursprünglichen Abschnitt des Schiffes zurückzukehren, um Ca²⁺ Messungen durchzuführen.
   15. Tauschen Sie die Badlösung durch temperaturangepasstes, reagenzienfreies PSS aus, um den Überschussindikator im Bad zu entfernen. Es können mehrere Badwechsel erforderlich sein, um überschüssiges Fura-2 zu entfernen, also wiederholen Sie diesen Austausch, bis das Signal-Hintergrund-Verhältnis etwa 10:1 beträgt.
   16. Aufzeichnung des Fura-2-Fluoreszenzsignals und spontaner Kontraktionen zu Studienbeginn für etwa 30 Minuten, gefolgt von einer kumulativen Konzentrationsreaktion von Nifedipin (NIF; 0,1-100 nM), einem spannungsabhängigen Ca-v-1.x-Antagonisten. Erhalten Sie Hintergrundmessungen für jede Arzneimittelkonzentration.
   17. Am Ende jedes Experiments werden LVs mit temperaturangepasstem Ca2⁺-freiem PSS gewaschen, um das minimale Fura-2-Fluoreszenzsignal (R_min) und den maximalen Durchmesser der LVs in Abwesenheit von Ca²⁺ zu erhalten. Achten Sie darauf, den Hintergrund zu messen.
       HINWEIS: Das Ca²⁺-freie PSS hat die gleiche Zusammensetzung wie PSS, jedoch ohne CaCl₂, und EDTA wird durch 1 mM EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~7,5) ersetzt.
   18. Tauschen Sie die Badlösung durch temperaturangepasstes PSS aus, das 10 mM^Ca2+ und Ionomycin (10 μM IONO), ein Ca2⁺ -Ionophor, enthält, um das maximale Fura-2-Fluoreszenzsignal (R_max) und den minimalen Durchmesser der LVs unter Bedingungen der Sättigung von Ca2⁺ zu erhalten. Achten Sie darauf, den Hintergrund zu messen.
3. Die Formel zur Messung des absoluten [Ca²⁺]_i
   1. Verwenden Sie R_min und R_max , um das Verhältnis von 340 und 380 nm Wellenlängen zu kalibrieren und die absolute zytosolische freie Ca2⁺ -Konzentration ([Ca²⁺]_i) zu berechnen.
   2. Berechnen Sie die absolute zytosolische freie Ca2⁺ -Konzentration ([Ca²⁺]_i) mit Hilfe von Gleichung (1)²⁶:
      (1)
      Dabei ist K_d = 225 nM (Dissoziationskonstante für Fura-2)²⁶, R = 340/380 Verhältnis, R_min = 340/380 Verhältnis in Abwesenheit von Ca²⁺, R_max = 340/380 Verhältnis bei Sättigung Ca²⁺ Bedingungen, S_frei = 380 Signal in Abwesenheit von Ca²⁺, S_gebunden = 380 Signal bei Sättigung Ca²⁺ Bedingungen
      HINWEIS: Alle Fluoreszenzsignale wurden um Hintergrundfluoreszenz korrigiert.
   3. Abbildung 5 ist ein Beispiel für eine Ca²⁺ -Ablaufverfolgung, in der detailliert beschrieben wird, welche Parameter aufgezeichnet werden. Definieren Sie den Ausgangswert von Ca²⁺ als den niedrigsten ruhenden^Ca-2+ -Anstieg vor dem^Ca-2+ -Spike und den Ca² +-Spitzenwert als den höchsten^Ca-2+ -Peak, der während des^Ca-2+ -Spikes erreicht wurde. Die Amplitude ist die Differenz zwischen Peak und Baseline Ca²⁺. Exportieren Sie alle Parameter direkt aus der Imaging-Software, mit Ausnahme der Häufigkeit von Ca²⁺ Spikes, die offline als Anzahl der Ca²⁺ Spikes/s berechnet werden soll. Im Folgenden finden Sie die wichtigsten Schritte innerhalb der referenzierten Software, um diese Parameter zu erhalten.
      HINWEIS: Ganze Traces können in eine .txt Datei exportiert werden und alle Parameter können in der Software Ihrer Wahl analysiert oder berechnet werden.
   4. Markieren Sie für_{R min} den Abschnitt der Zähler-Ablaufverfolgung, der dem Hintergrund während der Ca²⁺-freien PSS entspricht. Es öffnet sich ein Dialogfeld, in dem die Werte für diesen Teil der Ablaufverfolgung angegeben werden.
   5. Wählen Sie unter Vorgänge die Option Konstanten aus.
   6. Wählen Sie Calcium-Numerischer Hintergrund und geben Sie die Hintergrundnummern für den Zähler und Nenner aus dem vorherigen Schritt ein. Klicken Sie auf OK.
   7. Markieren Sie den Abschnitt der Verhältnis-Verfolgung, der dem niedrigsten Verhältnis während der Ca²⁺-freien PSS entspricht. Das ist R_min. Notieren Sie sich auch den Nennerwert für diesen Abschnitt. das ist_{S frei}.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.4 bis 2.3.7 für R_max und S_gebunden an den Abschnitt der Ablaufverfolgung, der dem hohen Ca²⁺ -freien PSS und dem höchsten Verhältnis entspricht.
   9. Wählen Sie unter Vorgänge die Option Konstanten aus.
   10. Wählen Sie Calcium-Calcium-Kalibrierung und geben Sie die in Gleichung 1 aufgeführten Werte ein. Klicken Sie auf OK.
   11. Passen Sie eine der Ablaufverfolgungen auf dem Bildschirm an, wie in Schritt 2.2.8 beschrieben, so dass Sie Calcium-Numeric subtrahiertes Calcium sehen können.
   12. Führen Sie eine monotone transiente Analyse durch, um die verbleibenden Parameter zu ermitteln. Eine Anleitung dazu finden Sie im Software-Handbuch³⁰.
   13. Alternativ können Sie unter Exportieren die Option Aktuelle Ablaufverfolgung auswählen.
   14. Wählen Sie den Speicherort aus, an den Sie die .txt Datei exportieren möchten, und klicken Sie auf OK.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie auf den einzelnen Trace klicken, den Sie exportieren möchten. Sie können die gesamte Ablaufverfolgung oder ausgewählte Abschnitte der Ablaufverfolgung exportieren.

3. Messung der LV-Kontraktilität und Rhythmizität

1. Die in das Bildgebungssystem integrierte Kantenerkennungssoftware generiert kontraktile Kurven für LV-Durchmessermessungen, wie oben beschrieben. Verwenden Sie diese Messungen, um kontraktile und rhythmische Parameter zu analysieren. Abbildung 4 ist ein Beispiel für eine kontraktile Spur, die detailliert beschreibt, welche kontraktilen Parameter aufgezeichnet werden sollen. Exportieren Sie alle Parameter direkt aus der Bildgebungssoftware mit der Funktion Monotone Transient Analysis auf der Durchmesserkurve³⁰, mit Ausnahme der Häufigkeit der Kontraktionen, der berechneten Strömung und des Intervalls, die offline berechnet werden sollen.
   HINWEIS: Ganze Kurven können in eine .txt Datei exportiert werden, und alle Parameter können in der Software Ihrer Wahl mit den folgenden Gleichungen analysiert oder berechnet werden.
2. EDD-, ESD-, Amplituden-, Frequenz- und berechnete Durchflussmessungen
   1. Messen Sie den maximalen und minimalen Durchmesser (enddiastolischer Durchmesser [EDD] bzw. endsystolischer Durchmesser [ESD]), den die LVs während ihrer rhythmischen und spontanen Kontraktionen erreichen können.
   2. Berechnen Sie die Amplitude der Kontraktionen (AMP) als Differenz zwischen EDD und ESD.
   3. Berechnen Sie die Häufigkeit als Anzahl der Kontraktionen pro Messperiode (in s).
   4. Berechnen Sie den berechneten Durchfluss pro μm mit Hilfe von Gleichung (2):
      Berechneter Durchfluss = π/4(EDD²- ESD²)F (2)
      Dabei ist EDD² = Querschnittsfläche des Gefäßes im entspannten Zustand, ESD² = Maß für die Querschnittsfläche des Schiffes während der Verengung, F = Häufigkeit der Kontraktionen/n
3. Rhythmizität: Kontraktions- und Entspannungszeit:
   1. Andere Maße für die LV-Rhythmizität sind die Kontraktionszeit und die Entspannungszeit.
   2. Definieren Sie die Kontraktionszeit als die Zeit, die das LV benötigt, um bei jeder Kontraktion ESD zu erreichen.
   3. Definieren Sie die Relaxationszeit als die Zeit, die der LV benötigt, um den EDD für jede Relaxation zu erreichen, was einen Gesamthinweis auf die Rhythmizität gibt, die mit absolutem [Ca²⁺]_i innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens korreliert.
   4. Berechnen Sie die Intervallzeit (ΔT) aus Gleichung (3).
      Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Ergebnisse

Die Kontraktilität der LVs und die entsprechenden Veränderungen des zytosolischen, freien Ca2⁺ ([Ca²⁺]_i) wurden in isolierten mesenterialen LVs der Ratte nach Exposition gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen von Nifedipin (NIF; 0,1-100 nM) untersucht (Abbildung 6). Die Parameter, einschließlich der^Ca-2+-Spike-Amplitude, des Ca²⁺ zu Studienbeginn und des Peaks Ca²⁺, zeigten eine konzentrationsabhängige Reduktion durch die inkrementelle Zugabe von NIF in die Perfusionskammer (Abbildung 7A). Gleichzeitig zeigten kontraktile Parameter wie die Kontraktionsamplitude und die berechnete Strömung ebenfalls eine schrittweise Abnahme (Abbildung 7B). Es gab eine geringfügige Zunahme des EDD-Durchmessers mit NIF (Abbildung 7B). Die Ca2⁺-Spike-Frequenz und die Kontraktionsfrequenz scheinen eine Alles-oder-Nichts-Reaktion zu sein. Dieser Effekt trat jedoch bei 10 nM für ein LV auf, während alle LVs die Kontraktionen um 100 nM gestoppt hatten. Auf diese Weise erzeugen die kombinierten Daten Diagramme, die einer abgestuften Konzentrationsreaktion ähneln. Dieser Effekt stimmt mit früheren Veröffentlichungen überein, in denen NIF auf LVs in anderen Präparaten verwendet wurde (Draht- und Druckmyographie^13,14). Manhattan-Diagramme zeigen die individuellen LV-Reaktionen für Messungen der Rhythmizität, einschließlich Intervall, Kontraktionszeit und Relaxationszeit (Abbildung 7C). Diese Art der Datendarstellung ermöglicht es dem Forscher, diese Alles-oder-Nichts-Reaktionen oder die Variabilität der Kontraktionsrhythmen herauszukitzeln, um zusätzliche Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen zu erhalten. Letztendlich führten die Abnahmen der Kontraktionsamplitude und -frequenz zu einer Verringerung des berechneten Flusses durch diese isolierten LVs, der als Surrogatindikator für die In-vivo-Funktion dient. Insgesamt korrelierte der Rückgang der LV-Kontraktilität mit der Verringerung von [Ca²⁺]_i. Unsere Ergebnisse liefern einen direkten Beweis dafür, dass NIF innerhalb des 100 nM-Bereichs Kontraktionen und [Ca²⁺]i-Oszillationen in LVs effektiv stoppte, indem es die in Lymphmuskelzellen (LMCs) vorhandenen Ca-v-1.x-Kanäle antagonisierte.

Abbildung 1: Bild des Aufbaus der isolierten Gefäßkammer. Bei der Untersuchung der Gefäßperfusion wurde eine isolierte Gefäßkammer verwendet, die mit einem Thermoregler ausgestattet war. Die Schwerkraft wurde genutzt, um den Druck über ein PSS-Reservoir zu steuern. Der Druck wurde durch Schallköpfe überwacht, die sowohl an Zufluss- (P1) als auch an Ausflusskanülen (P2) angeschlossen waren. Abkürzung: PSS = physiologische Salzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Vorbereitung des Knotens auf einen Blick. (A) Doppelschleifenpräparation unter dem Präpariermikroskop mit einem einzelnen Filament aus 3-lagigem Seidennahtfaden, (B) das lose Ende greifen und durch beide Schlaufen ziehen, (C) den Knoten an beiden Enden ziehen, um eine kleine Öffnung zu behalten, und (D) das überschüssige Filament von beiden Seiten abschneiden und die blaue Box zeigt einen gebrauchsfertigen vollständigen Doppeloberhandknoten. Maßstabsleiste = 1,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs für die Datenerfassung. Eine gesunde Ratte wurde mit 5% Isofluran-Induktion anästhesiert und eine Enthauptung durchgeführt, um das Rumpfblut zu entfernen. Es wurde ein Mittellinienschnitt durchgeführt, um das Mesenterium freizulegen und zu isolieren. Das isolierte Mesenterium wurde in eiskalter PSS-Lösung ausgebreitet und ein LV fettfrei für die Kanülierung in einer isolierten Gefäßperfusionskammer präpariert. Das Bad wurde mit einer 20-fachen Objektivlinse auf den Tisch des inversen Mikroskops gestellt. Das Gefäß wurde abwechselnd mit Licht mit einer Wellenlänge von 340 und 380 nm angeregt und die Emissionsfluoreszenzspektren wurden mit einer CCD-Kamera bei 510 nm erfasst. Der an das Mikroskop angeschlossene Computer erzeugte die kontraktilen und Ca²⁺ -Spuren mit Hilfe von Fluoreszenzerfassungs- und Kantendetektions-Bildgebungssoftware. Maßstabsleiste = 1 mm. Abkürzungen: PSS = physiologische Salzlösung; LV = Lymphgefäß; CCD = ladungsgekoppeltes Gerät. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative kontraktile LV-Spur. (A) Beispielaufzeichnung von Durchmesseränderungen kanülierter LVs, die mit dem Ca²⁺ Bildindikator Fura 2 AM in PSS beladen sind, und (B) eine vergrößerte Spur, um alle Parameter im Zusammenhang mit der Kontraktilität des Gefäßes zu zeigen: EDD, ESD, AMP und Frequenz. Diese Werte wurden zur Berechnung der Rhythmik und des Flusses verwendet. Abkürzungen: PSS = physiologische Salzlösung; LV = Lymphgefäß; EDD = enddiastolischer Durchmesser; ESD = endsystolischer Durchmesser; AMP = Amplitude. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Repräsentative LV Ca²⁺ -Bildgebungsspur. (A) Beispielaufzeichnung von Änderungen des absoluten [Ca²⁺]_i in kanülierten LVs, die mit Fura-2 in PSS beladen sind, und (B) eine vergrößerte Spur, um alle Parameter (Peak, Amplitude und Baseline) in Bezug auf [Ca²⁺]_i anzuzeigen (nicht hintergrundkorrigiert). Abkürzung: PSS = physiologische Salzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: LV-Kontraktilität und Ca2⁺ -Bildgebung auf einen Blick. Repräsentative Spuren, die (A) Durchmesser, (B) 340/380-Verhältnis und (C) absolutem [Ca²⁺]_i der PSS-Basislinie, Nifedipin, einem Ca_v1.x (Ca²⁺)-Kanalantagonisten, Konzentrationsreaktion, einschließlich R_min und_{R max}. Abkürzungen: PSS = physiologische Salzlösung; LV = Lymphgefäß; NIF = Nifedipin; R_min = minimales Fura-2-Fluoreszenzsignal; R_max = maximales Fura-2-Fluoreszenzsignal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Die Ca2⁺ -Oszillation und die entsprechende Kontraktilität, die durch Nifedipin in LVs blockiert wurde. (A) Ca²⁺ (n = 3) und (B) kontraktile (n = 3) Parameter verringerten sich konzentrationsabhängig durch die Zugabe von Nifedipin, einem spannungsabhängigen Ca_v1.x (Ca²⁺)-Kanalantagonisten. (C) Repräsentative Manhattan-Diagramme zeigen das mittlere Zeitintervall (Δt) zwischen Kontraktionen und Kontraktions- und Relaxationszeiten. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Abkürzungen: PSS = physiologische Salzlösung; LV = Lymphgefäß; NIF = Nifedipin; EDD = enddiastolischer Durchmesser; AMP = Amplitude. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Aufgrund der Zerbrechlichkeit und Winzigkeit von LVs ist sowohl bei der Dissektion als auch bei der Kanülierung äußerste Sorgfalt geboten. Schon geringfügige Beschädigungen des Gefäßes könnten zur Entwicklung eines nicht lebensfähigen LV führen oder zu Anomalien bei [Ca²⁺]_i transienten Stoffen führen. Die Konsistenz der Anregungseinstellungen ist über die gesamte Versuchsreihe hinweg gleichermaßen entscheidend, um die Vergleichbarkeit der [Ca²⁺]_i-Messungen zwischen Kontroll- und behandelter Gruppe zu gewährleisten. Das Versäumnis, einheitliche Einstellungen beizubehalten, birgt ein erhebliches Risiko, dass [Ca²⁺]_i auf allen Schiffen innerhalb einer Versuchsreihe über- oder unterschätzt wird. Ebenso wichtig ist es, dieselbe Gefäßregion während jedes Experiments genau zu identifizieren und zu überwachen.

Die Verwendung des ratiometrischen Indikators Fura-2AM normalisiert Fluoreszenzschwankungen, die durch ungleichmäßige Gewebedicke, Fluorophorverteilung/-leckage oder Photobleichung verursacht werden, Probleme, die bei Farbstoffen mit einer einzigen Wellenlänge häufig auftreten. ³¹ Dies ermöglicht die in diesem Protokoll beschriebene kontinuierliche Überwachung. Da Fura-2 jedoch durch Chelatisierung von Ca2⁺ wirkt, ist es möglich, die LVs zu überlasten und das für die Kontraktion oder das Ansprechen auf das Medikament verfügbare [Ca²⁺]_i zu reduzieren. In diesen Fällen können immer noch Ca2⁺ -Spitzen beobachtet werden, wenn rhythmische Kontraktionen fehlen. Unterschiedliche LV-Längen können ebenfalls zu diesem Phänomen beitragen. Obwohl diese Ca2⁺ -Messungen wahrscheinlich immer noch gültig sind, kann es notwendig sein, die Konzentration von Fura-2AM in replizierten Setups zu reduzieren, um sowohl Ca2⁺ - als auch Durchmessermessungen erfolgreich durchzuführen. Unsere Ergebnisse umfassen nur LVs, bei denen zu Studienbeginn sowohl Ca2⁺ -Spikes als auch rhythmische Kontraktionen vorhanden waren.

Die Messung von R_min und_{R max} sind wichtige Schritte bei der Berechnung des absoluten [Ca²⁺]_i. Da R_min in Abwesenheit von Ca²⁺ das Fura-2-Verhältnis sein sollte, wurde dem Ca²⁺-freien PSS eine hohe Konzentration an EGTA zugesetzt, um die Chelatbildung von Rest-Ca²⁺ zu gewährleisten. Erste Studien wurden mit EDTA im Ca2⁺-freien PSS durchgeführt, was zu sporadischen Gefäßkontraktionen mit entsprechenden Ca2⁺-Spikes führte. Für R_max wurde dem PSS eine hohe Konzentration von Ca²⁺ zusammen mit einem Ionophor, Ionomycin, zugesetzt, um das [Ca²⁺]_i-Signal zu maximieren. Die Lösung mit hohem Ca2⁺-Gehalt kann ausfällen, was die Entfernung des EDTA aus dem PSS erforderlich machen kann. Wichtig ist, dass diese zusätzlichen Messungen von R_min und R_max die Möglichkeit bieten, physiologisch relevante Veränderungen in [Ca²⁺]_i zu bewerten, was Informationen über die Erregbarkeit und Kontraktilitätsmechanismen der Membran^{liefern kann 27} sowie Vergleiche zwischen Versuchsgruppen im Vergleich zu Protokollen ermöglicht, die nur ein 340/380-Verhältnis für Fura-2 berichten. Wenn keine ausreichenden_{Rmin- und} Rmax-Werte erreicht werden, ist es nicht möglich, absolute [Ca²⁺]i zu berechnen_.

Aufgrund der kontraktilen Natur der LVs kann diese Methode nur ein Maß für globale Ca2⁺-Spiegel liefern und nicht für lokale Ca2⁺-Freisetzungsereignisse, die in gelähmten Gefäßen gemessen werden können³². Diese Methode ist jedoch vorteilhaft, um Veränderungen der absoluten [Ca²⁺]_i-Dynamik mit der Kontraktilität zu korrelieren, verglichen mit Methoden, die gelähmte Gefäße oder einzelne Zellen verwenden^28,32. Für diesen Ansatz wird davon ausgegangen, dass der Großteil des gemessenen Ca2⁺ aus den Lymphmuskelzellen stammt. Endothelzellen, die auch in diesen isolierten LVs vorhanden sind, könnten jedoch zu dem beobachteten^Gesamt-Ca2+-Signal beitragen³³. Dieser Beitrag könnte anhand von LVs geschätzt werden, bei denen das Endothel³⁴ entblößt wurde. LV-Kontraktionen können auch dazu führen, dass sich die Gefäßwand während des Kontraktionszyklus leicht in den Fokus und aus dem Fokus verschiebt. Daher ist es wichtig, kurze Gefäßsegmente zu verwenden, die straff gezogen werden können, ohne das Gefäß zu dehnen.

Über ihre Anwendung in LVs hinaus könnte diese Methode zur Untersuchung isolierter Gefäße aus anderen Gefäßbetten, einschließlich Arteriolen und Venen, verwendet werden, und ist vielversprechend für einen potenziellen Einsatz in der Neurobiologie und anderen Zweigen der Gefäßbiologie. Die Erforschung der Wirkungen verschiedener Agonisten oder Antagonisten, die auf verschiedene Signaltransduktionswege abzielen, ist ein weiterer Weg zur Untersuchung der zugrunde liegenden Ca2⁺ -Dynamik. Darüber hinaus kann diese Technik auch für vergleichende Untersuchungen mit Kontroll- und behandelten Proben der jeweiligen Tiere verwendet werden. Darüber hinaus ist dieser Ansatz für die Implementierung auf zellulärer Ebene, wie z. B. in isolierten lymphatischen Muskelzellen, anpassbar, wobei nur minimale Anpassungen an der Perfusionskammer und den Mikroskopobjektiven erforderlich sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode einen physiologisch relevanten Einblick in die globale Ca2⁺ -Dynamik bietet, da sie mit der Kontraktilität und Rhythmizität in LVs korreliert und eine robuste Bewertung potenzieller Regulatoren der Ca2⁺ -Dynamik bei der Sammlung von LVs ermöglicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
20x S Fluor Objektiv	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, USA)	UPlanSApo
Mikropipetten aus Borosilikatglas	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, USA)	GCP-75-100
Calciumchlorid (CaCl2)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, USA)	BP510-500
Kohlendioxid (CO2)	nexAir (Memphis, TN, Vereinigte Staaten)	UN3156
Dissektionszange	Fine Science Tools (Foster City, CA, Vereinigte Staaten)	11254-20
EDTA (C10H16N2O8)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Vereinigte Staaten)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Vereinigte Staaten)	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen (Waltham, MA, Vereinigte Staaten)	F1221
Glukose (C6H12O6)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Vereinigte Staaten)	D16-500
Schwerkraft-Druckregler	maßgeschneidert im Labor
Heizgerät	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Vereinigte Staaten)	TC-09S Bildgebungssoftware
	IonOptix (Westwood, MA, Vereinigte Staaten)
Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Vereinigte Staaten)	IX73
Ionomycin	Invitrogen (Waltham, MA, Vereinigte Staaten)	I24222
IonOptix Cell Framing Adapter	IonOptix (Westwood, MA, Vereinigte Staaten)	665 DXR
Isofluran	Piramal Intensivmedizin (Telangana, Indien)	NDC 66794-017-10
Perfusionskammer für isolierte Gefäße	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Vereinigte Staaten)	CH-1
Zange zur Knotenvorbereitung	Fine Science Tools (Foster City, CA, Vereinigte Staaten)	11253-20
LED-Lichtquelle	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Vereinigte Staaten)	TL4
Magnesiumsulfat (MgSO4)	Acros Organics (New Jersey, NJ, Vereinigte Staaten)	213115000
MyoCam-S3 Schnelles CMOS-Videosystem	IonOptix (Westwood, MA, Vereinigte Staaten)	MCS300
Nifedipin	Sigma (St. Louis, MO, Vereinigte Staaten)	N7634
Ophthalmische Nähte
Sauerstoff (O2)	nexAir (Memphis, TN, Vereinigte Staaten)	UN1072
Pluronsäure	Sigma (St. Louis, MO, Vereinigte Staaten)	P2443
Kaliumchlorid (KCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Vereinigte Staaten	BP366-500
Drucküberwachungssystem	Instrumentation (Burlington, VT, Vereinigte Staaten)	PM-4
Druckmessumformer	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Vereinigte Staaten)	PT-F
Silikon ausgekleidete Petrischale	maßgefertigt im Labor
Natriumbicarbonat (NaHCO3)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Vereinigte Staaten	BP328-500
Natriumchlorid (NaCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Vereinigte Staaten	BP358-212
Natriumphosphat (NaH2PO4)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Vereinigte Staaten	BP329-500
Sprague-Dawley Ratten	Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)	Männlich	9-13 Wochen alt
Stereomikroskop	Leica Microsystems (Wetzlar, Deutschland)	S9D
Vannas Federschere	Fine Science Tools (Foster City, CA, Vereinigte Staaten)	15000-03