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Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

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DOI:

10.3791/66566

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19. April 2024

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1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Komplikationen nach einer Lungentransplantation hängen weitgehend damit zusammen, dass das Immunsystem des Wirts auf das Transplantat reagiert. Solche Immunantworten werden durch die Wechselwirkung zwischen Spender- und Empfängerzellen reguliert. Ein besseres Verständnis dieser Prozesse beruht auf der Verwendung präklinischer Tiermodelle und wird durch die Möglichkeit unterstützt, den Transport von Immunzellen innerhalb der Transplantate in Echtzeit zu untersuchen. Mit der Intravital-Zwei-Photonen-Mikroskopie können Gewebe und Organe für Tiefen von bis zu mehreren hundert Mikrometern mit minimaler Lichtschädigung abgebildet werden, was einen großen Vorteil gegenüber der konfokalen Einzelphotonenmikroskopie darstellt. Die selektive Verwendung transgener Mäuse mit Promotor-spezifischer Fluoreszenzproteinexpression und/oder adoptiver Transfer von fluoreszierenden Farbstoff-markierten Zellen während der intravitalen Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht die dynamische Untersuchung einzelner Zellen in ihrer physiologischen Umgebung. Unsere Gruppe hat eine Technik zur Stabilisierung der Lungen von Mäusen entwickelt, die es uns ermöglicht hat, die zelluläre Dynamik in naiven Lungen und orthotopisch transplantierten Lungentransplantaten abzubilden. Diese Technik ermöglicht eine detaillierte Beurteilung des zellulären Verhaltens innerhalb des Gefäßsystems und im Interstitium sowie die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellpopulationen. Dieses Verfahren kann leicht erlernt und angepasst werden, um Immunmechanismen zu untersuchen, die entzündliche und tolerogene Reaktionen nach einer Lungentransplantation regulieren. Es kann auch auf die Untersuchung anderer pathogener Lungenerkrankungen ausgeweitet werden.

Einleitung

Die Lungentransplantation ist die letzte Option für viele Patienten, die an einer Lungenerkrankung im Endstadium leiden. Das Langzeitüberleben nach einer Lungentransplantation ist jedoch im Vergleich zu anderen soliden Organtransplantationen schlecht. Die Überlebensrate nach 5 Jahren beträgt nur ~60%-70%1, verglichen mit 80%-90% bei Herzen2 und 85%-90% bei Nieren3. Viele Komplikationen nach einer Lungentransplantation, wie z. B. eine Dysfunktion des primären Transplantats, eine Antikörper-vermittelte Abstoßung und eine chronische Dysfunktion des Lungentransplantats, sind auf die Immunantwort des Wirts auf das Allotransplantat zurückzuführen. Zum Beispiel hat unsere Gruppe gezeigt, dass Neutrophile nach einer transplantatinduzierten Ischämie-Reperfusionsverletzung schnell in das Lungenallotransplantat rekrutiert werden und dynamische Cluster bilden, die Blutmonozyten umgeben4. Die Wechselwirkung zwischen Spender- und Empfängerzellen ist für schädliche Alloimmunreaktionen verantwortlich 5,6,7, und die Fähigkeit, diese dynamischen Zellinteraktionen in einem lebenden Tiermodell zu untersuchen, ist von unschätzbarem Wert.

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht eine hochauflösende intravitale Bildgebung für Tiefen von bis zu mehreren hundert Mikrometern mit minimalem Photobleaching des Gewebes 8,9. Es wird in einer Vielzahl von Geweben und anatomischen Stellen verwendet, einschließlich des Neokortex10,11, der Haut12,13 und der Niere14,15. In jüngerer Zeit wurde es an nicht-statische Organe wie Lunge und Herz angepasst 4,16,17. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zur bildstabilisierten, beatmeten und perfundierten Lungentransplantate nach einer orthotopen linken Lungentransplantation von Mäusen. Ein wesentlicher Vorteil des Transplantationsmodells ist die Möglichkeit, Spender und Empfänger getrennt voneinander genetisch zu manipulieren. Einzelne Zellpopulationen können mit transgenen Mausstämmen mit Knock-in-Expression fluoreszierender Proteine, adoptivem Transfer von fluoreszenzmarkierten Zellen5 oder intravenöser Injektion von fluoreszenzmarkierten Antikörpern zur Bindung zellspezifischer Marker 4,16,17,18 visualisiert werden.

Um die Lunge während der Bildgebung zu stabilisieren, beinhaltet dieses Protokoll das Verkleben der Lunge mit einem Deckglas, während andere Gruppen die Saugstabilisierung mit einem speziell angefertigten reversiblen Vakuumgerät beschrieben haben19. Unser Protokoll hat mehrere Vorteile, darunter einen größeren Bereich für die Bildgebung und eine relativ einfache Einrichtung mit allgemein verfügbaren Materialien in einem Mikroskopielabor (einschließlich Deckglas und Kleber). Da diese Klebetechnik die Lunge an der oberen Oberfläche einschränkt, wird erwartet, dass sie die Beatmungsbewegung verringert und eine tiefere Bildgebung ermöglicht. Diese intravitale Bildgebungstechnik ermöglicht eine detaillierte Beobachtung des Verhaltens und der Wechselwirkungen von Immunzellen in Echtzeit, was zur Untersuchung von Immunmechanismen beiträgt, die entzündliche und tolerogene Reaktionen nach Lungentransplantationen regulieren.

Protokoll

Alle Verfahren zum Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University School of Medicine genehmigt.

1. Anästhesie und Intubation

HINWEIS: Eine orthotope Maus-Transplantation der linken Lunge wird durchgeführt, wie zuvor beschrieben20,21. Lungen von 20-25 g C57BL/6 (B6) Mäusen werden in geschlechtlich und altersgleiche B6-Empfänger transplantiert. B6. LysM-GFP-Reportermäuse werden als Empfänger für ausgewählte Experimente verwendet, um die Infiltration von Neutrophilen in Lungentransplantate sichtbar zu machen. Empfängermäuse können unmittelbar nach einer Lungentransplantation abgebildet werden.

  1. Reanästhesieren Sie Mäuse mit intraperitonealer Verabreichung von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (8-10 mg/kg). Verabreichen Sie Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (0,5-1,0 mg/kg) subkutan zur zusätzlichen Schmerzkontrolle. Bestätigen Sie die ausreichende Anästhesietiefe mit einer Pfotenkneife.
    HINWEIS: Wenn die Zeit zwischen der Lungentransplantation und der geplanten intravitalen Bildgebung weniger als zwei Stunden beträgt, kann das Anästhetikum mit 50 % der Anfangsdosis Ketamin erneut dosiert werden.
  2. Entfernen Sie die Haare von der gesamten linken Brust mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und wischen Sie die Brust ab, um die überschüssigen abgeschnittenen Haare zu entfernen.
  3. Tragen Sie eine nicht medikamentöse Augensalbe auf die Augen der Maus auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
  4. Re-intubieren Sie die Maus orotracheal mit einem 20-G-Angiokatheter, wie zuvor beschrieben21.
  5. Beatmen Sie mit Raumluft mit einer Frequenz von 120 Atemzügen/min und einem Atemzugvolumen von 0,5 cm³.
  6. Geben Sie während des gesamten Eingriffs 1 % Isofluoran endotracheal ab.
  7. Um Blutgefäße während der Bildgebung sichtbar zu machen, injizieren Sie mindestens 5 Minuten vor der Bildgebung 20 μl 655 nm nicht-zielgerichtete Quantenpunkte (Q-Punkte) in 50 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung intravenös.

2. Chirurgische Vorbereitung der linken Lunge für die Bildgebung

  1. Platzieren Sie die Maus in einer rechten seitlichen Dekubitusposition (siehe Abbildung 1A).
  2. Desinfizieren Sie die Brusthaut dreimal mit einer Mischung aus 0,75 % Jod und 70 % Ethanol.
  3. Öffnen Sie die linke Thorakotomie (aus einer Mauslungentransplantation) durch den dritten Interkostalraum wieder (siehe Abbildung 1A).
  4. Entfernen Sie einen Teil der Haut und des Weichgewebes über der linken Thorakotomiestelle mit den Maßen 1,5 cm x 1,5 cm (siehe Abbildung 1B).
  5. Vor der Rippenresektion klemmen Sie zunächst die Rippen für ~10 s ein, um die Mikrogefäße zu thrombosieren und eine Blutstillung zu erreichen (siehe Abbildung 1C, D).
  6. Sezieren Sie Teile der 3. bis 5. Rippe, um ein Bildgebungsfenster zu schaffen, das groß genug ist, um die Lunge zu befreien (~0,8 cm kraniokaudal und ~1,0 cm anteroposterior, Abbildung 1D, E).
  7. Stoppen Sie zusätzliche Blutungen aus den Rippenkanten mit Elektrokauter.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine Blutstillung an der Schnittkante der Rippen zu erreichen, um einen übermäßigen Blutverlust während der Bildgebung zu vermeiden.
  8. Legen Sie eine kleine Beule (4 cm x 4 cm Gaze 3-fach längs gefaltet) unter die rechte Brust (siehe Abbildung 1E).
  9. Heben Sie das Lungentransplantat mit Wattestäbchen aus der Brust und legen Sie den unteren Teil der Lunge auf einen 1 cm x 3 cm großen Streifen mit Kochsalzlösung getränkter Gaze (siehe Abbildung 1F).
    HINWEIS: Dieser Streifen aus mit Kochsalzlösung getränkter Gaze verhindert das Verrutschen der Lunge, sorgt für ein feuchtes Milieu der Lunge, schützt die Lunge vor den scharfen Kanten der resezierten Rippen und trennt die Lunge von der Herzbewegung. Sobald die umlaufende Bildgebungskammer über der Lunge angelegt wird (Abbildung 1G, H, beschrieben in Abschnitt 3), sollte es während der Bildgebung zu minimalen Wärme- und Flüssigkeitsverlusten aus der offenen Brusthöhle kommen.

3. Vorbereitung der Bildgebungskammer

HINWEIS: Eine Bildgebungskammer wird speziell angefertigt (siehe Abbildung 2A). Diese Bildgebungskammer besteht aus einer Grundplatte und einer Deckplatte, zwischen denen die Maus platziert und mit federbelasteten Schrauben auf beiden Seiten befestigt wird (Abbildung 2B). Die obere Platte enthält einen kreisförmigen Ausschnitt mit einem Durchmesser von ~2 cm. In diese Öffnung an der Vorderseite der Deckplatte wird ein entsprechend großer schwarzer O-Ring eingesetzt, der die Objektivlinse schützt (Abbildung 2C). Auf der Rückseite der Deckplatte wird ein 24 mm x 50 mm großes Deckglas mit Hochvakuumfett aufgeklebt, das eine wasserdichte Abdichtung erzeugt. Dieses Deckglas dient als Bildgebungsfenster, indem es an der Lunge unten haftet und das Bildgebungsmedium (d. h. Wasser) oben hält. Stellen Sie sicher, dass kein Vakuumfett in das kreisförmige Bildfenster gelangt. Das Deckglas wird bei jedem neuen bildgebenden Experiment ausgetauscht. Die Grundplatte wird mit einem Thermoelement-Temperaturfühler auf 35-37 °C erhitzt (Abbildung 2A).

  1. Platzieren Sie die intubierte Maus mit der offenen linken Brust nach oben auf der Grundplatte der Bildgebungskammer (siehe Abbildung 1G, H). Befestigen Sie die Maus mit Seidenband über Gesicht, Vorderpfoten und Schwanz (siehe Abbildung 1H und Abbildung 2A).
  2. Tragen Sie Kleber auf die Unterseite des Deckglases auf, das an der oberen Platte befestigt ist (grauer Kreis in Abbildung 2C, unten), und lassen Sie in der Mitte einen 0,8-1,0 cm großen klebstofffreien Kreis.
    HINWEIS: Es gibt einen Kompromiss zwischen der Größe des klebstofffreien Kreises und der Menge des Bewegungsartefakts. Es wird daher empfohlen, dass der Kreis einen Durchmesser von 1,0 cm nicht überschreitet.
  3. Senken Sie die obere Platte ab, bis das Deckglas die Lunge berührt, wobei der Kleber die Lungenoberfläche berührt (siehe Abbildung 1G).
    HINWEIS: Die linke Lunge wird mit einem sauberen, klebstofffreien Kreis in der Mitte auf das Deckglas geklebt, der der Bereich ist, der abgebildet wird.
  4. Halten Sie das Deckglas gegen die Lunge und blasen Sie die Lunge 1-2 s lang auf, so dass die Klebefläche am umgebenden Gewebe haftet. Erreichen Sie das Aufblasen der Lunge, indem Sie den Abflussschlauch vom Endotrachealtubus der Maus zum Beatmungsgerät verschließen.
    HINWEIS: Blasen Sie die Lunge nicht länger als 1-2 Sekunden auf, da dies zu einem übermäßigen Barotrauma führen kann.
  5. Ziehen Sie sich von der oberen Platte leicht zurück, um den Druck auf das Lungengewebe zu verringern. Stellen Sie sicher, dass sich der Bereich der Lunge innerhalb des Bildgebungsfensters bei der Beatmung nicht bewegt.
  6. Befestigen Sie beide Enden der oberen Platte, indem Sie die Rändelmutter über jeder Schraube befestigen (siehe Abbildung 2B).

4. Zwei-Photonen-Bildgebung

HINWEIS: Für die Intravitalmikroskopie sollte ein aufrechtes Mikroskop mit festem Tisch und einem Wasserimmersionsobjektiv mit 20x oder 25x >1,0 numerischer Apertur (NA) verwendet werden. Nachfolgend finden Sie das Setup, das in dieser Studie für einen B6 bis B6 verwendet wurde. LysM-GFP-Transplantat der linken Lunge mit 655-nm-Q-Punkt-Blutgefäßmarkierung. Bei der Anwendung dieses Protokolls kann der Aufbau des Mikroskops, der Laser und der dichroitischen Filter an die Anforderungen des jeweiligen Experiments und die verwendeten Fluoreszenzreporter angepasst werden.

  1. Platzieren Sie die gesamte Bildgebungskammer mit der intubierten Empfängermaus (B6, linke Lunge transplantiert in B6. LysM-GFP mit 655 nm q-dots) auf den Mikroskoptisch (siehe Abbildung 2A).
  2. Verwenden Sie dichroitische Filter mit den Wellenlängen 480 nm, 560 nm und 635 nm, die die Signale angemessen vom GFP-Reporter, den Q-Dots und dem SHG-Signal (Second Harmonic Generation) (445 nm) trennen, das vom Kollagen erzeugt wird. Diese Filter können je nach Experiment angepasst werden.
    HINWEIS: Das von Kollagen erzeugte SHG-Signal grenzt dunkle kraterartige Strukturen ab, die alveoläre Lufträume darstellen (siehe weiße Pfeile in Abbildung 3).
  3. Stellen Sie den gepulsten Titan-Saphir-Femtosekundenlaser für die Anregung auf 890 nm (im Nahinfrarotbereich) ein. Verwenden Sie die geringstmögliche Laserleistung, um ein ausreichendes Signal zu erzielen.
    HINWEIS: Die Lasereinstellungen sollten für das jeweilige Experiment angepasst werden, um die Signaltrennung zu maximieren.
  4. Tragen Sie ~1 ml Wasser auf, um das Deckglas auf der Deckplatte vollständig abzudecken, das durch den O-Ring und die Vakuumfettdichtung des Deckglases auf der Deckplatte an Ort und Stelle gehalten wird (siehe Abbildung 1G und Abbildung 2C).
  5. Verwenden Sie am Mikroskop das Wasserimmersionsobjektiv 20x >1,0 NA. Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse auf der Grundlage des spezifischen Experiments angepasst wird.
    HINWEIS: Eine größere NA ermöglicht eine bessere Lichterfassung, einen höheren Kontrast und detailliertere Bilder. Wasserimmersionsobjektive werden bevorzugt, da Wasser oder Puffer besser mit biologischem Gewebe kompatibel sind.
  6. Senken Sie das Objektiv des Mikroskops ins Wasser und fokussieren Sie auf die Oberfläche der Lunge.
  7. Aktivieren Sie die Fußplattenheizung und halten Sie die Temperatur auf 35-37 °C.
    HINWEIS: Wenn Bedenken hinsichtlich der Unfähigkeit bestehen, die Gewebetemperatur oder eine ausreichende Durchblutung der Lunge aufrechtzuerhalten, können zusätzlich zur Basisplatte zwei zusätzliche Widerstände angebracht werden, um die obere Platte zu erwärmen (siehe ergänzende Abbildung 1).
  8. Erfassen Sie Bildstapel mit der Erfassungssoftware Ihrer Wahl.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Raum während der Aufnahme vollständig dunkel ist, was die Verwendung von Verdunkelungsvorhängen/Jalousien und eine strategische Abdeckung aller Lichtquellen beinhalten kann.

5. Videoaufnahme

HINWEIS: Die folgenden Parameter können je nach Experiment angepasst werden. In den Schritten 5.1-5.3 werden die spezifischen Parameter beschrieben, die für B6 bis B6 verwendet werden. Lysm-GFP Maus-Transplantation der linken Lunge, die als Referenzhilfe verwendet werden kann.

  1. Legen Sie mit einem bidirektionalen Scanner mit Videorate die Abmessungen des XY-Scans auf 512 x 512 Pixel fest.
  2. Mit einer xyz-Stepper-Einheit können Sie Zeitrafferaufnahmen eines 21-stufigen Z-Stacks mit einer Mittelung von 10 Frames pro Schritt aufnehmen. Die Erfassung jedes Stacks dauert etwa 20 s, einschließlich der Zeit, die für die Frame-Mittelwertbildung erforderlich ist, des Schrittmotors, um sich zu bewegen und seine Position zu überprüfen, und einer Verzögerung von 100 ms.
    HINWEIS: Der bidirektionale Scanner am Mikroskop, der in dieser Studie verwendet wurde, arbeitet mit einer Videorate von 30 Bildern/s. Dies kann je nach Mikroskopkonfiguration unterschiedlich sein.
  3. Erfassen Sie 80 aufeinanderfolgende Z-Stacks, um eine Zeitraffer-Bildgebung der Leukozytenmigration innerhalb des Gewebeparenchyms zu erhalten. Dies dauert ca. ~27 min bei 20 s/Stack.
    HINWEIS: Die Stapelgröße, die Frame-Mittelwertbildung, die Laserleistung und die Gesamtlänge der Zeitrafferaufnahme sollten minimiert werden, um eine übermäßige Laserbelastung des Gewebes zu vermeiden. Wenn die verwendeten Fluoreszenzreporter hell sind (d. h. GFP) und die Laserleistung gering ist, wird die Wiederholung eines 21-stufigen Z-Stacks mit einem durchschnittlichen Scan von 10 Bildern und 512 x 512 Pixeln in 20-s-Intervallen für ~27 Minuten von der Maus gut toleriert. Wenn längere Bildgebungszeiträume gewünscht werden, sollte die Erfassungszeit pro Stapel erhöht werden, um die Gesamtlaserbelichtung gleich zu halten (d. h. 1 min pro Stapel über ~1,5 h). Diese Einstellungen müssen auf der Grundlage der verwendeten Fluoreszenzreporter optimiert werden.
  4. Euthanasieren Sie die Maus am Ende der Bildaufnahme. Zur Euthanasie wird die Maus mit Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (8-10 mg/kg) betäubt, gefolgt von einer anschließenden Zervixluxation. Typische Bildgebungsvorbereitungen können die Lebensfähigkeit der Maus problemlos bis zu 2 Stunden lang aufrechterhalten.
    HINWEIS: Um diesen Zeitraum zu verlängern, können eine zusätzliche Flüssigkeitsergänzung, eine Anästhesie mit Isofluran und die Beachtung der Temperaturregulierung erforderlich sein.
  5. Vollständiges Video-Rendering mit Imaris. Andere Imaging-Software (z. B. ImageJ) kann ebenfalls verwendet werden.
    HINWEIS: Bilder können nach der Aufnahme mithilfe von Kontrastverbesserung, Glättung und Kanalarithmetik verarbeitet werden, um Kanalübersprechen zu entfernen.

Ergebnisse

Nach 1 h kalter ischämischer Lagerung bei 4 °C transplantierten wir orthotopisch die linke Lunge von einer B6-Maus in eine B6-Maus. LysM-GFP-Maus4 und dann wurde eine intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt, wie oben beschrieben. Wir führten die Bildgebung zu zwei Zeitpunkten nach der Transplantation durch - 2 h (Abbildung 3A) und 24 h (Abbildung 3B). Die Blutgefäße werden durch die Q-Punkte, die unmittelbar vor der Bildgebung injiziert werden, rot markiert. Zusätzlich können wir Monozyten sichtbar machen, die bei 24 h4 Q-Punkte aufgenommen haben. Im entsprechenden Video ist zu sehen, wie grün markierte Neutrophile des Empfängers 24 Stunden nach der Transplantation in das Lungentransplantat infiltrieren (Ergänzendes Video 1). Alveolen können aufgrund von SHG aus Kollagen als dunkle Krater dargestellt werden (weiße Pfeile in Abbildung 3). Wir beobachten, dass 24 Stunden nach der Transplantation mehr Neutrophile in der Lunge vorhanden sind als 2 Stunden nach der Transplantation (Abbildung 3).

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Abbildung 1: Vorbereitung der Maus für die Zwei-Photonen-Bildgebung. (A) Wiedereröffnung der Haut über der linken Thorakotomie. (B) Haut und Weichgewebe über der linken Brust exzidiert. (C,D) Die Rippen werden vor dem Teilen 10 s lang geklemmt. (E) Die linken 3rd-5 Rippen wurden reseziert, um ein Fenster mit den Maßen ~0,8 cm kraniokaudal x 1,0 cm anteroposterior zu schaffen. (F) Linke Lunge aus der linken Brust herausgehoben und auf einen Gazestreifen gelegt. (G) Eine Bildgebungskammer mit einem Bildgebungsfenster liegt über der linken Lunge. (H) Die Bildgebungskammer wird auf den Mikroskoptisch gestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Aufbau der Bildgebungskammer. (A) Die Bildgebungskammer wird auf den Mikroskoptisch gestellt. (B) Vergrößerte Ansicht des federbelasteten Bolzenmechanismus zur Sicherung der oberen Platte über der linken Lunge. (C) Vorder- und Rückseite der Deckplatte mit aufgebrachtem O-Ring und Deckglas. Weiße Linien stellen den Bereich dar, auf den Vakuumfett aufgetragen wird, um das Deckglas auf der Deckplatte zu haften. Der graue Kreis stellt einen Ring aus Klebstoff dar, der auf das Deckglas aufgetragen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung eines Maus-Transplantats der linken Lunge von B6 auf B6. LysM-GFP Maus mit 1 h kalter ischämischer Lagerung. Die Bildgebung erfolgt bei (A) 2 h und (B) 24 h nach der Transplantation. Rot steht für q-Punkte. Grün steht für Neutrophile von B6. LysM-GFP-Empfänger. Blau steht für SHG aus kollagenreichen Lungenbläschen. Weiße Pfeile zeigen alveoläre Lufträume. Der Maßstabsbalken stellt 20 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Obere Platte mit zwei angebrachten Widerständen zur zusätzlichen Erwärmung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Zwei-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung der transplantierten linken Lunge einer Maus von B6 auf B6. LysM-GFP-Maus mit 1 h kalter ischämischer Lagerung, durchgeführt 24 h nach der Transplantation. Rot steht für q-Punkte. Grün stellt die Neutrophilen des LysM-GFP-Empfängers dar. Blau repräsentiert die zweite harmonische Generation aus kollagenreichen Lungenbläschen. Der Maßstabsbalken steht für 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Zwei-Photonen-Anregung wurde erstmals 1931 in ihrer Doktorarbeit von Maria Göppert-Mayer beschrieben, die später den Nobelpreis für Physik für die Beschreibung der Kernschalenstruktur erhielt22,23. Die traditionelle Fluoreszenzmikroskopie beruht auf Einzelphotonenanregung mit Anregungswellenlängen, die kürzer und energiereicher als die Emissionswellenlängen sind. Im Gegensatz zur Einzelphotonenmikroskopie wird bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie die gleichzeitige Anregung durch zwei Photonen mit jeweils längeren Wellenlängen als die des emittierten Fluoreszenzsignals 24,25,26 durchgeführt. Da zwei einzelne Photonen kolokalisieren müssen, um einen einzelnen Brennpunkt im Gewebe anzuregen, erfolgt die Zwei-Photonen-Anregung räumlich auf ein kleines Probenvolumen, was einen optischen Schnitt 24,25,26 ermöglicht und es findet weniger Photobleichung oberhalb und unterhalb der Ebene statt, die den Brennpunkt27 enthält. Die Wahrscheinlichkeit einer gleichzeitigen Anregung durch zwei Photonen ist sehr gering, so dass ein gepulster Femtosekundenlaser erforderlich ist, um die für ein Fluoreszenzemissionssignal erforderliche Anregungsintensität zu erreichen 25,26,27. Der Anregungslaser befindet sich im nahen Infrarotbereich (700-1100 nm), was durch eine geringere Streuung begünstigt wird, wodurch das Licht tiefer in das Gewebe eindringen kann28. Die Abbildungstiefe ist abhängig von der Schwingungsgeschwindigkeit und der Leistung des Lasers24. In der Lunge können Bildtiefen von ~500-600 μm erreicht werden17. Die Kombination aus Abbildungstiefe und geringem Photobleaching macht die Zwei-Photonen-Mikroskopie daher sehr gut geeignet für die intravitale Bildgebung von Organen.

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde in mehreren verschiedenen Geweben und anatomischen Stellen eingesetzt, wie z. B. in der Haut12,13, den Lymphknoten29, dem venösen Endothel30, der Hirnrinde 10,11, der Niere 14,15 und der Leber31,32. In der Dermis von Mäusen wurde beispielsweise die intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet, um das Schwärmen von Neutrophilen nach sterilen körperlichen Verletzungen zu beschreiben12. In einem Modell der Venenthrombose wurden Blutmonozyten und Neutrophile sichtbar gemacht, die entlang des Endothels der Vena cava inferior krochen30. Menschliche Mikroglia wurden erfolgreich in vivo abgebildet, nachdem sie in ein menschliches Gehirn-Organoid-Modell33 xenotransplantiert worden waren. Mit kontinuierlichen Fortschritten in der Zwei-Photonen-Mikroskopie ist die intravitale Bildgebung in größeren Tiefen und sogar in nicht-statischen Organen möglich. Zum Beispiel wurden Tiefen von bis zu 1000 μm im Neokortex bei Mäusen mit einem regenerativen Ti:Al2O3-Verstärker 34 abgebildet.

Eine der Herausforderungen der intravitalen Bildgebung in Thoraxorganen ist die Bildstabilisierung. Aufgrund der Bewegung des schlagenden Herzens und der Lungenatmung können Bewegungsartefakte die Bildqualität erheblich beeinträchtigen. Es wurden mehrere Stabilisierungsmethoden für die Bildgebung von Herz und Lunge entwickelt, darunter das Verkleben des Organs 4,7, die Saugstabilisierung 19,35,36,37 und die nachträgliche Bewegungskorrektur38. Unsere Technik zur Bildgebung der Lunge beruht auf dem Verkleben der Lungenoberfläche mit einem stabilisierten Deckglas. Wir halten die Lunge durchblutet, beatmet und normotherm, was die Bedingungen in vivo simuliert. Gegenüber der von Looney et al.19 beschriebenen Saug-Stabilisierungsmethode hat dieses Protokoll mehrere Vorteile. Erstens benötigen wir keine spezielle Absaugvorrichtung. Stattdessen können unsere Bildgebungskammer und die obere Platte mit Materialien konstruiert werden, die in einem Mikroskopielabor leicht verfügbar sind. Darüber hinaus ermöglicht die in dieser Studie verwendete Klebetechnik im Vergleich zur Absaugvorrichtung (die einen Innendurchmesser von 4 mm hat) eine größere Oberfläche der Abbildung (bis zu 10 mm). Bei der umlaufenden Verklebung wird der Bereich der Lunge innerhalb des Leimkreises ausreichend eingeengt und die Beatmungsbewegung minimiert. Im Vergleich zur Absaugtechnik verhindert der Deckglasansatz eine konvexe Verformung der Lungenoberfläche, die den subpleuralen Kapillarblutfluss beeinträchtigen könnte. Zu den Nachteilen unseres Systems gehört die Unfähigkeit, das Deckglas zu entfernen, ohne den pleurokrenchymalen Übergang zu beeinträchtigen. So ist es mit der hier verwendeten Klebetechnik nicht möglich, die Lunge ein zweites Mal abzubilden, während die Saugtechnik eine serielle Bildgebung ermöglicht. Darüber hinaus erfordert die Anwendung einer Thorakotomie den Verlust des normalen intrathorakalen Unterdrucks, der in Kombination mit der Überdruckbeatmung nicht physiologisch ist. Weitere Einschränkungen und Einschränkungen der Zwei-Photonen-Bildgebung werden im Folgenden erläutert.

Während die Brust während der intravitalen Bildgebung offen ist, ist es wichtig, so nah wie möglich an einer physiologischen Umgebung zu bleiben. Die Grundplatte, auf der die Maus liegt, wird auf einer Temperatur von 35-37 °C gehalten. Da nur die Grundplatte erhitzt wird, haben wir festgestellt, dass die Kerntemperatur der Maus (gemessen über eine rektale Sonde) über mehrere Stunden gut reguliert wird. Unserer Erfahrung nach werden die Beweglichkeit und das Verhalten der Zellen erst dann sichtbar beeinflusst, wenn die Temperatur unter 32 °C fällt, was bei diesem Aufbau unwahrscheinlich ist. Wenn es während der Ersteinrichtung dieser Bildgebungskammer Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Gewebenormothermie oder der Lungenperfusion gibt, können zusätzlich zur Basisplatte zwei zusätzliche Widerstände angebracht werden, um die obere Platte zu erwärmen (ergänzende Abbildung 1). Sobald die Bildgebungskammer optimiert ist, ist es nicht mehr notwendig, die Innentemperatur der Maus während jedes Bildgebungsexperiments routinemäßig zu überwachen. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die Kombination aus kochsalzgetränkter Gaze, die über die offene Brusthöhle gelegt wird, und dem okklusiven Ring aus Klebstoff um den abzubildenden Bereich der Lunge wirksam ist, um Flüssigkeitsverluste während der Bildgebung zu minimieren.

Ein wichtiger technischer Aspekt ist das Erreichen einer guten Blutstillung während der Rippenresektion bei der Erstellung des Thorax-Bildgebungsfensters. Teile der linken 3. bis 5. Rippe werden reseziert, und anhaltende Blutungen aus diesen abgeschnittenen Rippen beeinträchtigen das Überleben der Maus während der Bildgebung. Um dem entgegenzuwirken, empfehlen wir, die Rippen zunächst für 10 s proximal an der Stelle, an der sie reseziert werden sollen, zu klemmen, um die Mikrogefäße zu thrombosieren (siehe Abbildung 1C,D). Nach der Resektion der Rippen sollten die Schnittkanten der Rippen großzügig mit Elektrokauter geronnen werden. Schließlich ist es wichtig, die linke Lunge während der Bildgebung auf den Streifen aus mit Kochsalzlösung getränkter Gaze zu legen (siehe Abbildung 1F), um zu verhindern, dass die scharfen Rippenkanten die Lunge durchstechen. Mit dieser Kombination technischer Überlegungen können wir klare Videos des Immunzelltransports innerhalb des Lungenparenchyms mit minimalem Bewegungsartefakt über mehrere Stunden hinweg aufnehmen, ohne dass es zu Lungenverletzungen oder Verlusten normaler Perfusionsmuster kommt.

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde in der Lunge eingesetzt, um Modelle von Infektionskrankheiten und sterilen Entzündungen zu untersuchen. Eine Gruppe verwendete Zwei-Photonen-Bildgebung, um die Beweglichkeit und Migration von B-Zellen des Gedächtnisses zu untersuchen, nachdem die Lungen von Mäusen wiederholt mit dem Influenzavirus infiziert worden waren39. Darüber hinaus wurde die Zwei-Photonen-Mikroskopie bei der Transplantation von Haut-, Nieren- und Pankreasinseln eingesetzt 40,41,42,43. Mit einem Transplantationsmodell können Spender und Empfänger genetisch verändert werden, um ihre jeweiligen Zellpopulationen zu untersuchen. Unseres Wissens war unsere Gruppe die erste, die intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung bei murinen Lungentransplantaten durchgeführthat 4. Wir beobachteten eine schnelle Rekrutierung und Clusterbildung von Neutrophilen nach transplantatvermittelter Ischämie-Reperfusions-Schädigung, die durch pharmakologische Depletion von Blutmonozyten reduziert wurde4. In nachfolgenden Arbeiten haben wir gezeigt, dass aus der Milz stammende Monozyten des Empfängers die Extravasation von Neutrophilen durch die Produktion von IL-1B44 erleichtern. Die intravitale Bildgebung in diesen Studien ermöglichte es uns, vorgelagerte Regulatoren der Neutrophilenextravasation als mögliche therapeutische Ziele zur Verringerung der Entzündungsreaktion nach der Transplantation aufzudecken45. Darüber hinaus haben wir auch intravitale Bildgebung bei schlagenden Mausherzen nach heterotoper Transplantation durchgeführt16. Wir haben die Rekrutierung von Neutrophilen in das Myokard sichtbar gemacht und festgestellt, dass der ferroptotische Zelltod von Herztransplantatzellen eine Entzündung nach einer Herztransplantation auslöst46. Wir wandten eine ähnliche Stabilisierungstechnik auf transplantierte Aortenbögen an, um den monozytären Transport in atherosklerotische Plaques sichtbar zu machen47. Diese Studien zeigten die Machbarkeit und den Nutzen der intravitalen Bildgebung von nicht-statisch transplantierten Thoraxorganen.

Schließlich lohnt es sich, Methoden zur Visualisierung verschiedener Zelltypen und des Lungenparenchyms zu diskutieren. Zur Markierung von Zellen werden zwei Hauptmethoden verwendet - 1) transgene Mausstämme mit Knock-in-Mutationen fluoreszierender Proteine und 2) fluoreszenzmarkierte Antikörper zur Färbung von Zellen. Zu den häufig verwendeten transgenen Mausstämmen zur Identifizierung von Immunzellen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie gehören LysM-GFP für Neutrophile48, CX3Cr1-GFP für verschiedene interstitielle Makrophagenpopulationen49,50, CCR2-GFP für klassische Monozyten51, CD19-tdTomate für B-Zellen52 und Foxp3-GFP für regulatorische T-Zellen5. Bemerkenswert ist, dass CX3Cr1 allein nicht ausreicht, um Zellen eindeutig zu identifizieren, aber dies kann durch die Zellmorphologie und -lokalisation unterstützt werden, die mit der von interstitiellen Makrophagen übereinstimmt. Alveolarmakrophagen können aufgrund ihrer Autofluoreszenz53,54, ihrer charakteristischen Morphologie und ihres Verhaltens (d.h. mangelnde Motilität bei der Zeitauflösung von Zeitrafferaufnahmen) ohne Markierung abgebildet werden. Im Vergleich zu Eosinophilen, die ebenfalls autofluoreszierend sind, sind Alveolarmakrophagen größer und mit einer Anregung von 890 nm deutlich heller54. Alternativ können Alveolarmakrophagen auch anhand ihrer phagozytären Funktion über die intrapulmonale Verabreichung von Farbstoffaggregaten markiert werden54.

Die Visualisierung von Immunzellen bei Transplantatempfängern kann auch durch intravaskulären adoptiven Transfer von fluoreszenzmarkierten Zellen oder durch Injektion von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen zellspezifische Oberflächenmarker erreicht werden18,55. Ein weiterer inhärenter Vorteil der Zwei-Photonen-Mikroskopie ist die SHG durch bestimmte doppelbrechende Strukturen im Gewebe, wie z. B. Kollagen56. Dieses Phänomen ist besonders nützlich für die Lungenbildgebung aufgrund des hohen Kollagengehalts in den Alveolarsäcken, der ohne zusätzliche Fluoreszenzfarbstoffe als intrinsischer Indikator für die Alveolarstruktur fungiert. Darüber hinaus sind die Alveolen auch von Alveolarkapillaren umgeben, die mit 655 nm q-Punkten markiert sind. Schließlich können Blutgefäße durch intravenöse Injektion von Q-Dots (wie in diesem Protokoll beschrieben) oder Rhodamin B-Dextran markiert werden. Bei der Konzeption eines intravitalen Zwei-Photonen-Mikroskopie-Experiments empfehlen wir die Verwendung von nicht mehr als vier verschiedenen Emissionskanälen, um das Risiko eines Durchschlagens und einer schlechten Unterscheidung zwischen den Kanälen zu minimieren.

Eine der Haupteinschränkungen unserer beschriebenen Leimstabilisierungstechnik ist die Unfähigkeit, das Deckglas von der Lunge zu entfernen, ohne dass das Gewebe beschädigt wird und sich Klebstoffreste auf der Lungenoberfläche bilden. Daher kann die Lunge nur einmal und nicht zu mehreren Zeitpunkten über einen Zeitraum von mehreren Tagen abgebildet werden. Um diese Einschränkung zu beheben, hat eine Gruppe ein semi-permanentes Thorax-Bildgebungsfenster beschrieben, das eine serielle Bildgebung der Lunge ermöglicht57. Nach unserer Erfahrung ermöglicht dieser Ansatz jedoch keine adäquate Lungenstabilisierung über längere Zeiträume der Bildgebung. Diese Technik ermöglicht es, die Lunge über mehrere Stunden hinweg abzubilden, was wichtige Einblicke in die angeborene und adaptive Immunantwort nach einer Transplantation liefert.

Zu den weiteren Einschränkungen der Zwei-Photonen-Bildgebung gehören die teuren Anschaffungskosten für die Einrichtung und das Fachwissen, das für die Wartung des Systems erforderlich ist. Die Scanfelder sind im Vergleich zur Immunfluoreszenzbildgebung relativ klein. Thermische Schäden und Photoschäden können ohne sorgfältige Optimierung der Erfassungsparameter erheblich sein. Die Zwei-Photonen-Anregungspunkt-Spread-Funktion ist breit, was die Auflösung etwas einschränkt, insbesondere in der z-Dimension. Darüber hinaus erfordert die Zwei-Photonen-Bildgebung, dass die interessierenden Zellen fluoreszenzmarkiert werden, und einige Zellen können nicht eindeutig mit einem einzelnen Zellmarker markiert werden. Die Anzahl der Signale, die gleichzeitig abgebildet werden können, ist oft auf vier oder weniger begrenzt. Schließlich können Anästhesie, Operation und Bildgebung zusätzliche Entzündungen und physiologische Veränderungen zusätzlich zur Lungentransplantation hervorrufen, die experimentelle Ergebnisse und Interpretationen trotz aller Bemühungen, ein physiologisches Umfeld aufrechtzuerhalten, verwirren können. Zu den zukünftigen Richtungen gehört die Entwicklung minimal-invasiver Methoden der intravitalen Bildgebung (z. B. durch eine kleinere Thorakotomie oder einen bronchoskopischen Zugang).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie ein unschätzbares Werkzeug bei der Untersuchung mehrerer Krankheitsprozesse ist. In dieser Arbeit beschreiben wir eine zuverlässige Technik der Lungenimmobilisierung und Zwei-Photonen-Bildgebung, die eine intravitale Beobachtung des Zelltransports und der dynamischen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellpopulationen nach einer murinen Lungentransplantation ermöglicht. Diese Technik hat unser Verständnis der Immunlandschaft nach der Transplantation erweitert und wird auch weiterhin ein unverzichtbares Werkzeug bei der Erforschung von Lungentransplantationen und anderen Prozessen bei Lungenerkrankungen sein.

Offenlegungen

Die Autoren berichten über keine relevanten Angaben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des NIH 1P01AI11650 und der Foundation for Barnes-Jewish Hospital unterstützt. Wir danken dem In Vivo Imaging Core an der Washington University School of Medicine.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,75 % Povidon-JodAplicareNDC 52380-0126-2Für Desinfektionsmittel
1-Zoll 20G IV-KatheterTerumoSROX2025CAFür Endotrachealtubus (ETT)
1-Zoll-SeidenbandDurapore3M ID 7100057168Zur Fixierung der Maus in Position
20x Wasserimmersion lange ObjektivlinseOlympusN20X-PFH
3M Vetbond-KleberMedi-Vet.com10872Zum Aufkleben von Deckglas auf die Lunge
655 nm nicht zielgerichtete QuantenpunkteThermoFisherQ21021MPZur Markierung von Blutgefäßen
70% EthanolSigma AldrichEX0281Zum Desinfektionsmittel
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Schwarzer O-Ring (2 cm)BaumarktN/AFür maßgeschneiderte Bildgebung
Kammer Bolzen (2)BaumarktN/AFür maßgefertigte Bildgebungskammer
Messing Rändelmutter (2)BaumarktN/AFür maßgefertigte Bildgebungskammer
Buprenorphin 1,3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Zur Schmerzkontrolle
Chamäleon Titan-Saphir Femtosekunden-gepulster LaserCoherentN/A
Deckglas (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63Für speziell angefertigte Bildgebungskammer
Gebogene Moskitoklemme (1)Fine Science Tools13009-12
Zweikanal-HeizungssteuerungWarner InstrumentsTC-344B
Feine Schere (1)Fine Science Tools15040-11
FesttischmikroskopOlympusBX51WI
Gaze (geschnitten auf 1 cm x 3 cm)McKesson476709Zum Platzieren unter der linken Lunge
HochvakuumfettDow Corning N/AZum Aufkleben von Deckglas auf die Deckplatte
Isofluran 1%Sigma Aldrich26675-46-7Für die Anästhesie
Ketaminhydrochlorid 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Für die Anästhesie
Metallblech (3 cm x 7 cm)BaumarktN/AFür maßgefertigte Bildgebungskammer
Spitze Applikatoren mit WattespitzeSolon56225Zur Manipulation der Lunge und zum stumpfen Sezieren
Power Pro Ultra ClipperOster078400-020-001
Puralube Vet AugensalbeMedi-Vet.com11897Zur Vorbeugung von Augenaustrocknung
Beatmungsgerät für KleintiereHarvard Apparatur55-0000
Gerade Pinzette (1)Fine Science Tools91113-10
Dreikanal-Shutter-TreiberUniblitzVMM-D3Resonanzscanner
x.y.z Optischer SchrittmotorPrior ScientificOptiScan II
Xylazin 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Zur Schmerzkontrolle

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