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Methodenartikel

Bewertung der Konnektivitätsergebnisse von Ratten-Zwerchfell-Motoreinheiten als quantitative Biomarker für die Degeneration und Kompensation von phrenischen Motoneuronen

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DOI:

10.3791/66568

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19. April 2024

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1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir eine in vivo Methode zur Schätzung der Anzahl und Größe der motorischen Einheiten vor, um die Konnektivität der Motoreinheiten der Rattenmembran zu quantifizieren. Es wird eine Schritt-für-Schritt-Herangehensweise an diese Techniken beschrieben.

Zusammenfassung

Der Verlust der Funktion der Beatmungsmuskulatur ist eine Folge von Motoneuronenverletzungen und Neurodegeneration (z. B. zervikale Rückenmarksverletzung bzw. amyotrophe Lateralsklerose). Phrenische Motoneuronen sind das letzte Bindeglied zwischen dem Zentralnervensystem und den Muskeln, und ihre jeweiligen motorischen Einheiten (Gruppen von Muskelfasern, die von einem einzigen Motoneuron innerviert werden) stellen die kleinste funktionelle Einheit des neuromuskulären Beatmungssystems dar. Das Compound Muscle Action Potential (CMAP), das Single Motor Unit Potential (SMUP) und die Schätzung der motorischen Einheitenzahl (MUNE) sind etablierte elektrophysiologische Ansätze, die die longitudinale Beurteilung der Integrität motorischer Einheiten in Tiermodellen im Laufe der Zeit ermöglichen, aber hauptsächlich auf die Gliedmaßenmuskulatur angewendet wurden. Daher besteht das Ziel dieser Studie darin, einen Ansatz in präklinischen Nagetierstudien zu beschreiben, der longitudinal verwendet werden kann, um die phrenische MUNE, die motorische Einheitengröße (dargestellt als SMUP) und CMAP zu quantifizieren, und dann den Nutzen dieser Ansätze in einem Motoneuronenverlustmodell zu demonstrieren. Sensitive, objektive und translational relevante Biomarker für neuronale Verletzungen, Degeneration und Regeneration bei Verletzungen und Erkrankungen von Motoneuronen können experimentelle Forschungsentdeckungen bis hin zu klinischen Tests erheblich unterstützen und beschleunigen.

Einleitung

Phrenische Motoneuronen (MNs), die sich von den Myotomspiegeln C3 bis C6 erstrecken, bilden das letzte Bindeglied vom Zentralnervensystem (ZNS) zum Zwerchfellmuskel1. Phrenische motorische Einheiten (MUs) bestehen aus einer einzigen spinalen MN und ihren innervierten Zwerchfellmuskelfasern, die die kleinste funktionelle Einheit des respiratorischen neuromuskulären Systems bilden. Die Beatmungsfunktion erfordert eine adäquate Kontraktion des Zwerchfellmuskels, die durch eine koordinierte Aktivierung des phrenischen MU-Pools erreicht wird 2,3. Viele neurologische Erkrankungen, einschließlich der amyotrophen Lateralsklerose (ALS), führen zu schweren Beeinträchtigungen der Beatmung und tragen letztlich zur Todesursache bei4.

Es können verschiedene elektrophysiologische Ansätze eingesetzt werden, um die Integrität des Pools der motorischen Einheit (MU) in vivo zu bewerten und zu überwachen. Das Compound Muscle Action Potential (CMAP) spiegelt die summierte Depolarisation aller Muskelfasern in einem bestimmten Muskel oder einer bestimmten Muskelgruppe nach peripherer Nervenstimulation wider und reagiert empfindlich auf eine Reihe von neuromuskulären Erkrankungen, einschließlich ALS 5,6 und spinaler Muskelatrophie (SMA)7,8,9. Eine Einschränkung der CMAP-Bewertung besteht darin, dass das Keimen von Sicherheiten dazu führen kann, dass die CMAP-Amplitude und -Fläche auch bei MU-Verlust10 erhalten bleibt. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden Änderungen an der CMAP-Technik vorgenommen, um sowohl die Anzahl der Motoreinheiten als auch die Größe11 zu bewerten. Darüber hinaus deutete eine In-vivo-Studie, in der die funktionelle Bewertung von Membran-CMAP durch ein elektrophysiologisches System untersucht wurde, darauf hin, dass es auch machbar sein könnte, die beschriebene Membran-CMAP-Aufzeichnungstechnik für die Schätzung der motorischen Einheitenzahlzu verwenden 12.

Die MUNE-Technik (Incremental Motor Unit Number Estimation) wurde ursprünglich in den frühen 1970er Jahren von McComas et al. für den Musculus extensor digitorum brevis beim Menschen eingeführt13. Der inkrementelle MUNE-Ansatz war eine Modifikation der traditionellen CMAP-Aufzeichnungstechnik, bei der eine allmählich zunehmende Stimulation durchgeführt wurde, um quantenhafte, alles-oder-nichts-submaximale Inkremente als Indizes der Reaktionen einzelner motorischer Einheiten aufzuzeichnen. Die summierten und gemittelten Inkremente wurden verwendet, um eine Schätzung für die Größe eines Potentials für eine einzelne motorische Einheit (SMUP) zu berechnen. Diese berechnete Größe wurde dann in die CMAP-Amplitude dividiert, um die Anzahl der MUs zu schätzen, die den zu untersuchenden Muskel innervieren11. MUNE zeigt eine hohe Sensitivität bei der Erkennung und Überwachung von Verlusten motorischer Einheiten, was die Identifizierung von Funktionsstörungen motorischer Einheiten vor beobachtbaren Änderungen von Messungen wie CMAP-Amplitude oder Fläche14,15 ermöglicht. Bei ALS-Patienten hat sich MUNE als außergewöhnlich sensitiv erwiesen und dient als wichtiger Biomarker für den Beginn, das Fortschreiten und die Prognose der Erkrankung16,17.

Zahlreiche Anpassungen von MUNE wurden entwickelt und häufig verwendet, um die MU-Funktion bei Erkrankungen wie Neurodegeneration, neuronalen Verletzungen und dem natürlichen Alterungsprozess zu beurteilen 18,19,20,21. Seit der Erstbeschreibung wurden verschiedene Anpassungen, die sowohl elektrophysiologische Reaktionen als auch Messungen der inkrementellen Kraft (mechanisch) nutzen, sowohl in Humanstudien als auch in Tiermodellen eingesetzt22. MUNE bietet eine nicht-invasive funktionelle Bewertung der Konnektivität von Motoneuronen mit dem Muskel. Die longitudinale Anwendung von MUNE ermöglicht das Verständnis des Fortschreitens von Krankheiten oder induzierten Phänotypen und die Bewertung von protektiven oder regenerativen Effekten therapeutischer Interventionen, sowohl im klinischen als auch im präklinischen Umfeld. Unabhängig von der Wirksamkeit der MUNE-Messungen der Reproduzierbarkeit und der klinischen Relevanz der Technik für MU-Pools im größten Teil des menschlichen Körpers haben sich die Bemühungen weitgehend auf die Gliedmaßenmuskulatur in Nagetiermuskeln konzentriert 10,23,24,25.

Daher bestand das Ziel dieser Studie darin, einen Ansatz zur Gewinnung des zusammengesetzten Muskelaktionspotentials (CMAP), des SMUP und der phrenischen motorischen Einheitenzahl (MUNE) als In-vivo-Bewertungen zu beschreiben, die in präklinischen Nagetierstudien longitudinal verwendet werden können, um die MUNE, die Größe der motorischen Einheit (dargestellt als SMUP) und CMAP zu quantifizieren. Darüber hinaus präsentieren wir repräsentative Daten, die den Verlust der Zwerchfell-MU-Nummer nach intrapleuraler Verabreichung eines phrenischen MN-Degeneratikums, des an Saporin konjugierten B-Fragments des Choleratoxins (CTB-SAP), hervorheben.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Missouri durchgeführt. Die Experimente wurden an erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 11 bis 15 Wochen durchgeführt. Diese Ratten wurden paarweise untergebracht und in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 gehalten, wobei jederzeit Zugang zu handelsüblichem pelletiertem Futter und HCl-behandeltem Wasser zur Verfügung stand.

1. Vorbereitung der Tiere und Anästhesieverabreichung

  1. Tragen Sie beim Umgang mit Ratten geeignete persönliche Schutzausrüstung.
  2. Verabreichen Sie ein Inhalationsanästhetikum mit 3-5% Isofluran, um eine ordnungsgemäße Induktion zu gewährleisten. Sobald die Ratte ausreichend betäubt ist, legen Sie sie in Rückenlage und halten Sie die Narkose mit 1-3% inhaliertem Isofluran aufrecht. Überprüfen Sie die ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie mit einer Pinzette sanft Druck auf das Fußpolster der Hintergliedmaßen ausüben, um sicherzustellen, dass es zu keiner Entzugsreaktion kommt.
    HINWEIS: Überwachen Sie basierend auf der Größe und dem Gewicht der Ratte die Anästhesietiefe und passen Sie die Isoflurankonzentration entsprechend an.
  3. Halten Sie die Temperatur mit einer thermostatischen Warmhalteplatte von 37 °C aufrecht, um Temperaturschwankungen zu vermeiden, die sich auf die CMAP-Amplitude und -Latenz auswirken können.
  4. Tragen Sie eine Salbe auf Erdölbasis auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Überwachen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Atemfrequenz beobachten und nach Entzugsreaktionen suchen, wenn Sie mit einer Pinzette Druck auf das Fußpolster ausüben.
  5. Entfernen Sie Haare aus dem unteren Drittel der Brust und des Halses, die mit einer Haarschneidemaschine untersucht werden sollen. Überwachen Sie die Atmung der Ratte während des gesamten Experiments.
    HINWEIS: Lassen Sie die Ratte nach den CMAP- und MUNE-Aufzeichnungen und dem Absetzen der Anästhesie nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat. Bringen Sie das Tier nicht in den Heimkäfig zurück, bis es vollständig genesen ist.

2. Platzierung und Einrichtung der Elektrode

  1. Platzieren Sie ein Paar monopolare 28-G-Nadelelektroden, um CMAP, SMUP und MUNE aufzuzeichnen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
    1. Die aktive (E1) Nadelelektrode wird subkutan über der mittleren Schlüsselbeinlinie unterhalb des letzten Rippenrandes und die Referenznadelelektrode (E2) subkutan im Winkel zwischen dem Xyphoideusfortsatz und dem letzten sternokostalen Knorpel platziert.
      HINWEIS: Die Nadelelektroden sollten nicht in den Zwerchfellmuskel eingeführt werden. Stattdessen sollten sie im subkutanen Bereich positioniert werden.
  2. Zur Stimulation des Nervus phrenicus an der Halsschlagader wird ein Paar monopolare Nadelelektroden mit einem Durchmesser von 28 G als Kathode und Anode für die Nervenstimulation verwendet und subkutan über dem lateralen Hals zwischen dem vorderen und dem mittleren Skalenmuskel platziert, im Abstand von etwa 1 cm. Achten Sie darauf, dass sich die Stimulationsnadeln auf Höhe unterhalb des vierten Halswirbels (C4) befinden.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Stimulationselektroden zu tief einzuführen, um Verletzungen des Nervus phrenicus oder anderer Strukturen zu vermeiden. Abbildung 1 veranschaulicht die Platzierung der Elektroden.
  3. Platzieren Sie für die Masseelektrode eine Einweg-Oberflächenelektrode am Heck.

3. Datenerfassung

  1. Phrenic CMAP
    1. Zeichnen Sie phrenische CMAP-Reaktionen auf, indem monophasische kathodische Rechteckimpulse mit einer Dauer von 0,1 ms und einer Intensität von 60 bis 100 mA angewendet werden, um den Nervus phrenicus zu stimulieren.
    2. Erhalten Sie CMAP-Reaktionen, während Sie die Stimulusintensität schrittweise erhöhen, bis die Amplitude der Reaktion keinen weiteren Anstieg mehr zeigt. Um eine supramaximale Stimulation zu gewährleisten, erhöhen Sie die Reizintensität auf etwa 120 % des Niveaus, das zur Auslösung einer maximalen Reaktion verwendet wird, und zeichnen Sie eine zusätzliche Reaktion auf. Wenn die CMAP-Größe nicht mehr zunimmt, betrachten Sie diese Antwort als maximalen CMAP.
      HINWEIS: Die Stimulation während der Ausatmung ist vorzuziehen, um das Geräusch der gleichzeitigen Muskelaktivität während der CMAP-Aufzeichnung zu minimieren.
    3. Messen und dokumentieren Sie die Spitze-Spitze-Amplituden des CMAP in Millivolt (mV) (Abbildung 2).
      HINWEIS: Die CMAP-Amplitude kann von Basis zu Spitze und von Spitze zu Spitze bewertet werden. Klinische Elektrodiagnostiksysteme werden häufig standardmäßig verwendet, um den Base-to-Peak zu bewerten, der von der isoelektrischen Baseline bis zum anfänglichen negativen Peak berechnet wird.
  2. Durchschnittliche SMUP-Größe (Single Motor Unit Potential) und MUNE-Berechnung
    1. Berechnen Sie die durchschnittliche SMUP-Größe mit einer inkrementellen Stimulationstechnik.
      1. Um inkrementelle Reaktionen hervorzurufen, verabreichen Sie eine submaximale Stimulation mit einer Dauer von 0,1 ms bei einer Frequenz von 1 Hz und erhöhen Sie die Intensität allmählich in Schritten von 0,03 mA, bis eine minimale Alles-oder-Nichts-Reaktion erreicht ist. Erfassen Sie die erste Reaktion mit einer Reizintensität zwischen 2 mA und 10 mA.
      2. Wenn die erste Reaktion bei einer Reizintensität zwischen 2 mA und 10 mA nicht auftritt, modifizieren Sie die Position der stimulierenden Kathode, indem Sie sie entweder näher an den Nervus phrenicus im Nacken bringen oder weiter davon entfernen, um die erforderliche Reizintensität zu verringern bzw. zu erhöhen.
      3. Wenn die erste inkrementelle Reaktion mit einer Reizintensität von 2 mA bis 10 mA erreicht wird, speichern Sie die erste Reaktion und erfassen Sie zusätzliche Inkremente mit progressiv höheren Reizintensitäten, indem Sie sie in Schritten von 0,03 mA anpassen, um insgesamt 9 zusätzliche Inkremente zu erreichen, die die folgenden Kriterien in Schritt 3.2.2 erfüllen.
        HINWEIS: Jedes SMUP wird quantifiziert, indem jedes Inkrement vom vorherigen Inkrement subtrahiert wird.
    2. Achten Sie beim Messen der inkrementellen Antworten darauf, dass jedes Inkrement die folgenden Kriterien erfüllt:
      1. Stellen Sie sicher, dass der anfängliche negative Peak der inkrementellen Reaktionen zeitlich mit dem negativen Peak der maximalen CMAP-Antwort übereinstimmt.
        HINWEIS: Die leichten Bewegungen, die aufgrund von Hintergrundgeräuschen durch Atemzyklen beobachtet werden, sind Teil der Art des Versuchs. Das konsistente Vorhandensein von SMUPs während der Live-Beobachtung bestätigt jedoch ihre Identität für den jeweiligen CMAP.
      2. Da das Zwerchfell ein dynamischer Muskel ist, der an der Atmung beteiligt ist, kann jeder Atemzyklus eine Grundbewegung induzieren. Überprüfen Sie daher die Stabilität und das Fehlen von Fraktionierung in jeder inkrementellen Antwort, indem Sie die Konsistenz über drei doppelte Antworten hinweg bestätigen.
        HINWEIS: Um evozierte Potentiale mit geringer Amplitude, insbesondere das erste SMUP, von Hintergrundgeräuschen aufgrund der Atmungsaktivität zu unterscheiden, ist es wichtig, wachsam zu bleiben und 3-4 Atemzyklen lang zu beobachten. Stellen Sie auch sicher, dass die Peaks mit denen des CMAP übereinstimmen, um die Genauigkeit zu gewährleisten.
      3. Stellen Sie sicher, dass jedes Inkrement eindeutig und größer als das vorherige ist. Unterscheiden Sie daher visuell zwischen inkrementellen Antworten in Echtzeit und beobachten Sie, wie sie sich mit den zuvor aufgezeichneten Inkrementen überlagern.
        HINWEIS: Es können mehrere Wiederholungen des Stimulus bei jeder Amplitude durchgeführt werden, um die Konsistenz der Inkremente und die Einhaltung der vordefinierten Kriterien zu gewährleisten.
      4. Nachdem Sie jedes Inkrement anhand der oben genannten Kriterien visuell überprüft haben, bestätigen Sie, dass die Inkrementamplitude mindestens 25 μV beträgt. Wenn das Inkrement unter 25 μV liegt, verwerfen Sie die Messung und bewerten Sie die Reaktion neu.
      5. Stellen Sie nach der Aufzeichnung von 10 inkrementellen Antworten sicher, dass die Amplitude jeder inkrementellen Antwort nicht größer als ein Drittel der kombinierten Amplitude aller 10 Inkremente ist, was der Gesamtamplitude der endgültigen Antwort entspricht. Wenn dieses Kriterium nicht erfüllt ist, wiederholen Sie die Messung der 10 inkrementellen Antworten.
        HINWEIS: Der Schwellenwert von einem Drittel basiert auf der Annahme, dass jede inkrementelle Reaktion die Aktivierung einer einzelnen motorischen Einheit darstellt. Wenn die Amplitude einer inkrementellen Reaktion ein Drittel der kombinierten Amplitude aller zehn Inkremente überschreitet, deutet dies darauf hin, dass die Reaktion möglicherweise nicht ausschließlich auf die Aktivierung einer einzelnen motorischen Einheit zurückzuführen ist. Stattdessen könnte sie durch die Rekrutierung zusätzlicher motorischer Einheiten oder das Vorhandensein unspezifischer Aktivität, wie z. B. elektrisches Rauschen oder Artefakte, beeinflusst werden22,26.
      6. Um die durchschnittliche Amplitude der SMUPs zu schätzen, mitteln Sie die Werte der 10 Inkremente. Eine andere Methode zur Messung der durchschnittlichen SMUP-Amplitude besteht darin, die gesamte Amplitude der endgültigen inkrementellen Reaktion durch die Gesamtzahl der Inkremente11 zu dividieren.
    3. Bestimmen Sie MUNE, indem Sie die maximale CMAP-Amplitude (Spitze-Spitze) durch die durchschnittliche SMUP-Amplitude (Spitze-Spitze) dividieren. In bestimmten elektrophysiologischen Systemen werden SMUPs in Mikrovolt (μV) aufgezeichnet, während CMAP normalerweise in Millivolt (mV) ausgedrückt wird. Konvertieren Sie bei Bedarf CMAP- und SMUP-Messungen in dieselben Einheiten, bevor Sie MUNE berechnen.
      HINWEIS: Peak-to-Peak-CMAP, durchschnittlicher SMUP und MUNE werden in der Regel automatisch von klinischen Elektromyographiesystemen berechnet):
      figure-protocol-1
      CMAP = Zusammengesetztes Muskelaktionspotenzial
      SMUP = Potential für eine einzelne Motoreinheit
      MUNE = Schätzung der Anzahl der Motoreinheiten

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Ergebnisse

Die in diesem Bericht beschriebenen CMAP-, SMUP- und MUNE-Techniken ermöglichen die Aufzeichnung der neuromuskulären Funktion im Zwerchfellmuskel durch minimalinvasive Elektrodenplatzierung (Abbildung 1). Die Parameter Amplitude und Fläche können zur Charakterisierung der supramaximalen CMAP-Größe verwendet werden, um ein Gesamtmaß für die Muskelgruppenleistung zu liefern (Abbildung 2). In unseren aktuellen Methoden verlassen wir uns jedoch auf die Amplitude, um...

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Diskussion

Bei MN-degenerativen Erkrankungen wie ALS ist es entscheidend, die an der Beatmung beteiligten MUs zu beurteilen28. Trotz des Auftretens von respiratorischer MN-Degeneration bei ALS-Patienten sind der spezifische Beginn und das Fortschreiten des MN-Todes nach wie vor unvollständig verstanden 29,30,31. In Anerkennung der Bedeutung dieses Aspekts wurden verschiedene Modelle...

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Offenlegungen

WDA erhielt Forschungsgelder von NMD Pharma, Avidity Biosciences und Beratungshonorare von NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals und Novartis.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Forschungsprogramms für Rückenmarksverletzungen und -krankheiten des Missouri Spinal Cord Injury/Disease Research Program (NLN und WDA) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 mL GlasspritzeKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 mL, Modell 705 RNSpritze Hamilton Company7637-01Zur Durchführung einer intrapleuralen
Injektion 5008 - Formulab DietLabDiet0001325
Autoklavierbare 26 G Nadeln (26S RN 9,52 mm 40°)Hamilton Company7804-04Wird zur intrapleuralen Injektion verwendet
Choleratoxin B-Untereinheit (CTB)MilliporeSigmaC9903Wird für die intrapleurale Injektion verwendet, um überlebende Motoneuronen zu markieren
Choleratoxin B-Untereinheit, die an Saporin konjugiert ist (CTB-SAP)Advanced Targeting SystemsIT-14Wird für die intrapleurale Injektion verwendet, um den Tod von Motoneuronen zu verursachen
Abnehmbares KabelTechnomed202845-0000zum Anschluss der Rekorderelektrode an das Elektrodiagnosegerät
Einweg-Scheibenelektrode 2" x 2" mitElektroden Cadwell302290-000Erdungselektrode
monopolare Einwegnadeln 28 GTechnomed202270-000Kathoden- und Anodenstimulationselektroden - Aufzeichnungselektroden
EMG-Nadelkabel (Amp/Stim-Schaltkasten)Cadwell190266-200zum Anschluss monopolarer Elektroden an den elektrodiagnostischen Stimulator
Helping Hands Krokodilklemme mit EisensockelRadio Shack64-079Beibehaltung der Platzierung der Aufnahmeelektrode 
Isofluran (250 mL Flasche)Piramal Healthcare
monoject Bewässerungsspritze mit gebogener SpitzeCovidien81412012für die Anwendung von Elektrodengel verwendet
PhysioSuite Physiologisches Überwachungssystem mit RightTemp Homöotherme ErwärmungKent Scientific CorporationPS-RTEnthält Infrarot-Wärmekissen, Rektalsonde und Pad-Temperatursonde
Pro Trimmer Haustier PflegesetOster078577-010-003Haarschneidemaschine zur Haarentfernung
Saporin (SAP)Advanced Targeting SystemsPR-01Wird für die intrapleurale Injektion verwendet (Kontrollmittel, wenn es selbst injiziert wird)
Sierra Summit EMG-SystemCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAtragbares Elektrodiagnosesystem
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSOMNOEnthält einen Anti-Auslauf- und Anti-Dampf-Flaschenaufsatzadapter; Y-Adapter-Schlauch; Aktivkohle-Aasfresserfilter
Sprague-Dawley-RatteEnvigo-Kolonie 208a, Indianapolis, IN
Tierarzt auf Erdölbasis Augensalbe Puralube26870wird während der Anästhesie angewendet, um Hornhautverletzungen zu vermeiden

Referenzen

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