Strategien zur Verbesserung der Kultivierung anaerober Bakterien aus dem Magen-Darm-Trakt von Hühnern

Summary

Das Protokoll stellt zwei Methoden vor, um die Isolierung von anaeroben Darmbakterien zu verbessern. Die erste konzentriert sich auf die Isolierung einer Vielzahl von Bakterien mit unterschiedlichen Nährmedien. Die zweite konzentriert sich auf die Kultivierungsschritte einer bestimmten mikrobiellen Gruppe, die möglicherweise Myo-Inositol assimiliert, um ihre ökologische Bedeutung vollständig zu verstehen.

Abstract

Der Magen-Darm-Trakt (GIT) von Hühnern ist ein komplexes Ökosystem, das Billionen von Mikroben beherbergt, die eine entscheidende Rolle für die Physiologie des Wirts, die Verdauung, die Nährstoffaufnahme, die Reifung des Immunsystems und die Verhinderung des Eindringens von Krankheitserregern spielen. Für eine optimale Tiergesundheit und Produktivität ist es unerlässlich, diese Mikroorganismen zu charakterisieren und ihre Rolle zu verstehen. Während der GIT von Geflügel ein Reservoir an Mikroorganismen mit potenziellen probiotischen Anwendungen enthält, ist der größte Teil der Vielfalt noch unerforscht. Um unser Verständnis der unkultivierten mikrobiellen Vielfalt zu verbessern, sind konzertierte Anstrengungen erforderlich, um diese Mikroorganismen in Kultur zu bringen. Die Isolierung und Kultivierung von GIT-besiedelnden Mikroorganismen liefert reproduzierbares Material, einschließlich Zellen, DNA und Metaboliten, das neue Einblicke in Stoffwechselprozesse in der Umwelt bietet. Ohne Kultivierung bleibt die Rolle dieser Organismen in ihrer natürlichen Umgebung unklar und auf eine deskriptive Ebene beschränkt. Unser Ziel ist es, Kultivierungsstrategien zu implementieren, die darauf abzielen, die Isolierung einer Vielzahl von anaeroben Mikroben aus dem GIT des Huhns zu verbessern, indem wir multidisziplinäres Wissen aus der Tierphysiologie, Tierernährung, Metagenomik, Futtermittelbiochemie und modernen Kultivierungsstrategien nutzen. Darüber hinaus sind wir bestrebt, die Anwendung geeigneter Praktiken für die Probenahme, den Transport und die Medienvorbereitung zu implementieren, von denen bekannt ist, dass sie den Erfolg der Isolierung beeinflussen. Geeignete Methoden sollten eine gleichbleibend sauerstofffreie Umgebung, optimale atmosphärische Bedingungen, eine angemessene Inkubationstemperatur des Wirts und Vorkehrungen für spezifische Ernährungsbedürfnisse in Übereinstimmung mit ihren besonderen Bedürfnissen gewährleisten. Durch die Befolgung dieser Methoden wird die Kultivierung nicht nur reproduzierbare Ergebnisse für die Isolierung liefern, sondern auch die Isolierungsverfahren erleichtern und so ein umfassendes Verständnis des komplizierten mikrobiellen Ökosystems innerhalb des GIT des Huhns fördern.

Introduction

Das Wiederaufleben der Kultivierung bei der Untersuchung von Mikroorganismen hat Erkenntnisse aus metagenomischen Studien ergänzt, indem es Material zum Testen von metabolischen Hypothesen lieferte, die zuvor nur teilweise beschrieben und quantifiziert wurden. Die Kultivierung von Darmbakterien liefert Material, um die zukünftige Forschung zu mikrobiellen Wirt-Interaktionen zu unterstützen, gezielte Besiedlungsstudien zu erleichtern und molekulare Interaktionsstudien zu verbessern ^1,2,3. Die gewonnenen Erkenntnisse über gastrointestinale Mikroorganismen haben die Ernährung und das Wohlergehen der Tiere verbessert, indem sie die Futterformulierungen beeinflusst und die Nährstoffverfügbarkeit erhöht^{haben 4}. Dieses Verständnis hat zu Leistungsverbesserungen bei der Nutzung präbiotischer und probiotischer Wechselwirkungen beigetragen. Es bedarf jedoch eingehender Forschung, um ein vollständiges Verständnis dafür zu erlangen, wie biochemische und physikalisch-chemische Bedingungen zusammenwirken und sich auf das mikrobielle Profil und seine Struktur auswirken. Um dieses Ziel zu erreichen, ist der Anbau nach wie vor unerlässlich und dient als entscheidendes Instrument, um die komplizierte Dynamik der mikrobiellen Gemeinschaften im Magen-Darm-Milieu zu erforschen.

Im Gegensatz zu den umfangreichen Forschungen über Mikroben, die mit dem menschlichen Darm in Verbindung gebracht werden, und klinischen Kultivierungsstudien⁵ wurde bei Berichten über Mikroorganismen aus Nutztieren überwiegend eine begrenzte Anzahl von Medien zur Isolierung verwendet, was die Vielfalt der Isolate möglicherweise einschränkt ^2,3. Darüber hinaus wurden Verbesserungen in der Formulierung von Medien und Studien zur Wechselwirkung von Phosphat und Salzen mit Agar, wie sie von Tanaka et al. und Kawasaki et al. erläutert wurden, noch nicht für Darm-Mikrobiom-Studien implementiert 6,7,8,9.

Es wurde berichtet, dass Myo-Inositol (MI) als semi-essentielle Substanz eine zentrale Rolle bei verschiedenen metabolischen, physiologischen und regulatorischen Prozessen spielt^10,11. Dazu gehören die Beteiligung an der Knochenmineralisierung, der Entwicklung der Brustmuskulatur, der zellulären Signalgebung, der Förderung des Eisprungs und der Fertilität, der Modulation der neuronalen Signalübertragung und der Rolle als Regulator der Glukosehomöostase und der Insulinregulation bei Geflügel^10,11. MI spielt eine Rolle als Vorläufer durch seine Umwandlung innerhalb zentraler biochemischer Prozesse, einschließlich des Glykolyse-/Glukoneogeneseprozesses, des Zitronensäurezyklus und des Pentosephosphatwegs. Darüber hinaus dient es auch als Vorläufer von Phosphatidylinositol (PI), das weiter am Glycerophospholipidstoffwechsel beteiligt ist¹². Nur wenige Untersuchungen haben berichtet, dass die Metabolisierung von MI zu Veränderungen der Knochenstabilität und der Leistung der Tiere führt. Dazu gehören Verbesserungen der Futterverwertungsrate und der Körpergewichtszunahme, was die Auswirkungen nach der Aufnahme und Verwertung im Tier zeigt^13,14. Der Weg der MI-Metabolisierung und ihre Auswirkungen auf den Geflügelstoffwechsel sind jedoch nach wie vor schwer fassbar¹⁵. Darüber hinaus deuten nur wenige Studien auf eine mögliche Rolle von Bakterien bei der MI-Nutzung hin, insbesondere in Regionen mit hoher metabolischer Aktivität wie dem Ileum 16,17,18,19.

Die Bemühungen zur Kultivierung von Bakterien aus dem GIT von Tieren zielen darauf ab, genomische Datenbanken zu verbessern und die Forschung auszuweiten, genombasierte Hypothesen zu verifizieren und die ökologische Bedeutung dieser Ressourcen zu verstehen²⁰. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Strategien für die bakterielle Kultivierung aus dem GIT von Hühnern zu verbessern, um die Isolationsvielfalt und die gezielte Isolierung einer ökologischen Interessengruppe, die Myo-Inositol assimiliert und metabolisiert, zu verbessern.

Protocol

Das Protokoll gliedert sich in vier Teile: Probenahme, Isolierung der Bakterien, Identifizierung und Konservierung der gewonnenen Mikroorganismen. Die genehmigten Erlaubnisse für die Verwendung von Tieren wurden von der Ethikkommission des Regierungspräsidiums Tübingen mit den Zulassungsnummern HOH50/17 TE und HOH67-21TE erteilt.

1. Gewinnung von Proben für die Kultivierung von anaeroben Bakterien

1. Haltung von Tieren
   1. Haltung der Tiere auf ad libitum kommerziellem Maisfutter (Legehennen/ Junghennenfutter; siehe Materialtabelle) und Unterbringung in der Versuchsstation der Universität Hohenheim.
2. Vorbereitung der Transportlösung
   1. 1-2 Tage vor der Probenentnahme ist die Transportlösung vorzubereiten, die 1,00 g/l Natriumthioglykolat, 0,10 g/l Calciumchloriddihydrat (CaCl_{2,2H 2}O) und 0,5 % Cystein²¹ und 0,1 % Natriumresazurinlösung enthält.
   2. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums auf 6,0 ± 0,2 bei 25 °C ein und autoklavieren Sie es 15 Minuten lang bei 121 °C bei 15 psi Druck.
   3. Nachdem das Medium auf ca. 50 °C abgekühlt ist, ersetzen Sie den Verschluss der Mediumflasche durch einen sterilen Schraubverschluss mit einer Bohrung und einem Gummistopfen. Führen Sie zwei sterile Spritzennadeln an unterschiedlichen Positionen in den Gummistopfen ein und befestigen Sie einen hydrophoben Spritzenvorsatzfilter (0,22 μm) auf einer der Nadeln.
      HINWEIS: Der Austausch der Kappen und das Einsetzen von Nadeln und Filter sollte innerhalb einer laminaren Luftströmung (LAF) erfolgen.
   4. Befestigen Sie den Schlauch mit 100 % Stickstoff (N₂) an den Spritzenvorsatzfilter und gießen Sie N₂ -Gas 10 Minuten lang bei 1 psi in die Flasche.
   5. Anschließend werden die Mediumflasche und die sterilen Hungate-Röhrchen in die anaerobe Station überführt und das Transportmedium aseptisch in die Hungate-Röhrchen überführt. Füllen Sie die Hungate-Rohre vollständig bis zum Rand und stellen Sie sicher, dass sich keine Luft im Inneren befindet.
3. Schlachtung und Probenentnahme
   1. Halten Sie während des Schlachtprozesses axenische Bedingungen aufrecht, um eine Kontamination zu vermeiden, indem Sie während des gesamten Verfahrens Handschuhe, Maske, Laborschürze aus Kunststoff und sterile chirurgische Instrumente verwenden. Desinfizieren Sie außerdem die Arbeitsbank ordnungsgemäß mit Ethanol und Taschentüchern, um eine sterile Umgebung zu gewährleisten.
   2. In der Versuchsstation werden 10 50 Wochen alte Lohmann-Legehennen mit einem Flaschengasgemisch aus 35 % N₂, 35 % CO₂ und 30 % O₂ betäubt und sofort enthauptet.
      HINWEIS: Die Betäubung und Opferung sollte von einem Versuchstiertechniker durchgeführt werden, der sich mit Tierschutz und wissenschaftlichen Verfahren auskennt. Dadurch wird sichergestellt, dass das Opferverfahren den ethischen Standards, gesetzlichen Vorschriften und Sicherheitsrichtlinien entspricht.
   3. Bevor Sie mit der Dissektion des GIT-Schnitts fortfahren, sichern Sie das erforderliche Darmsegment, nämlich den Kropf, das Ileum und das Jejunum, mit einem sterilen Kelly-Hämostat (auch bekannt als Kelly-Klemme; Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Sektion des Tieres sollte entweder von einem Tierarzt oder einer gut ausgebildeten Person durchgeführt werden, die mit der Anatomie von Hühnern vertraut ist.
   4. Füllen Sie jeden einzelnen Abschnitt in ein separates, mit Transportmedium gefülltes Hungate-Röhrchen und schließen Sie den Deckel ordnungsgemäß. Geben Sie bei Bedarf zusätzliches Transportmedium in das Rohr, um die verbleibende Luft zu verdrängen.
      HINWEIS: Die Übertragung des Abschnitts ist ein entscheidender Schritt, und es ist wichtig, eine Verzögerung oder Öffnung des Abschnitts zu minimieren, um eine längere Exposition gegenüber Sauerstoff zu vermeiden
4. Transport der Probe
   1. Gehen Sie vorsichtig mit dem Transport der Hungate-Rohre vor und legen Sie sie in eine Styroporbox, um jegliche Bruchgefahr zu vermeiden. Falls die Außentemperatur unter 15 °C liegt, halten Sie die Temperatur der Probe mit Warmpackungen aufrecht. Stellen Sie sicher, dass die Transportzeit 4 Stunden nicht überschreitet.
   2. Übertragen Sie die Schläuche vorsichtig in die anaerobe Station für die weitere Verarbeitung.

2. Isolierung von anaeroben Bakterien

1. Vorbereitung von Nährmedien
   HINWEIS: Die beschriebene Methode stellt verschiedene Überlegungen zur Vorbereitung von Nährmedien dar. Tabelle 1 zeigt beispielhaft die Aufteilung von Lösungen für die vielfältige Isolierung von Mikroorganismen.
   1. Unterteilen Sie die Bestandteile der zu verwendenden Medienformulierung in vier Lösungsgruppen: Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Agar und Mineralquelle. Bei Rich Media wie der Gehirn-Herz-Infusion (BHI) ist eine Trennung nicht immer möglich (siehe Beispiel für Medium 2 in Tabelle 1). Stellen Sie in solchen Fällen sicher, dass Agar oder zusätzliche Lösungen separat vorbereitet und autoklaviert werden.
   2. Bereiten Sie die Kohlenhydratlösung in 1/^{4 des erforderlichen} Endvolumens des Mediums vor, z. B. in 250 mL für ein Gesamtvolumen von 1 l des Mediums. Nach dem Beispiel von Medium 1 in Tabelle 1 werden 2 g Dextrose und 0,5 g Stärke in 250 ml destilliertem Wasser gelöst.
   3. Bereiten Sie die Proteinlösung in 1/^{4 des erforderlichen} Endvolumens des Mediums vor, z. B. in 250 mL für ein Gesamtvolumen von 1 l Medium. Nach dem Beispiel von Medium 1 in Tabelle 1 werden 10 g Pepton in 250 ml destilliertem Wasser gelöst.
   4. Bereiten Sie die Agarlösung in 45 % bis 48 % des Endvolumens des Mediums vor, z. B. in 450 bis 480 mL für ein Gesamtvolumen von 1 l des Mediums. Nach dem Beispiel von mediu 1 in Tabelle 1 werden 15 g Agar in 450 bis 480 ml destilliertem Wasser gelöst.
   5. Bereiten Sie die mineralische Lösung im linken Volumen von 20 bis 50 ml des Mediums vor, wenn das endgültige Volumen des Mediums 1 l beträgt. Nach dem Beispiel von Medium 1 in Tabelle 1 werden 0,5 g K₂HPO₄ in 20 bis 50 mL destilliertem Wasser gelöst.
   6. Die Proteinlösung, die Agarlösung und die mineralischen Lösungen 15 Minuten lang bei 121 °C und 21 psi Druck autoklavieren. Autoklavieren Sie die Kohlenhydratlösung bei 110 °C für 30 min bei 5 psi.
   7. Sobald alle Lösungen steril sind, kühlen Sie sie auf 50 °C ab und mischen Sie sie unter sterilen Bedingungen in eine geeignete autoklavierte Glasflasche mit einem Verschluss mit Bohrung und einem Gummistopfen. Führen Sie anschließend die Schritte 1.2.3 und 1.2.4 aus.
      HINWEIS: Das Mischen der Lösungen sollte in einem LAF erfolgen.
   8. Nachdem das Medium gemischt und entgast wurde, gießen Sie es in sterile Petrischalen oder Röhrchen in der anaeroben Station.
2. Isolierung von anaeroben Bakterien
   HINWEIS: Die folgende Methodik erläutert eine Isolationsstrategie für die Kultivierung eines breiten Spektrums anaerober Bakterien, die den Verdauungstrakt von Hühnern bewohnen.
   1. Die Proben werden in eine anaerobe Station überführt, die ein Flaschengasgemisch enthält, das aus 80 % N₂ (Qualitätsstufe 5.0), 15 % CO₂ (Qualitätsstufe 3.0) und 5 % H₂ (Qualitätsstufe 5.0) besteht und von einem kommerziellen Lieferanten bereitgestellt wird (siehe Materialtabelle).
   2. Übertragen Sie in der anaeroben Station den Schnitt aus dem Zündrohr mit einer autoklavierten Pinzette in die sterile Petrischale.
   3. Schneiden Sie den Abschnitt vorsichtig mit einer sterilen Schere auf und extrahieren Sie mit einem sterilen Spatel ca. 1 g Digesta-Inhalt aus dem Darmsegment.
      HINWEIS: Nach der Entnahme von 1 g Digesta-Inhalt den restlichen Digesta verschrotten und zur gezielten Isolierung in das entsprechende Transportmediumröhrchen überführen.
   4. Führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung mit einer sterilen physiologischen Lösung (0,85 % NaCl) durch.
   5. 0,1 mL der Probe aus den Verdünnungen 10-4 bis 10-7 in sterile und ordnungsgemäß beschriftete Petrischalen geben und mit einem sterilen Drigalski-Spatel bestreuen.
   6. Inkubieren Sie die Platten in der anaeroben Station für 24–48 Stunden bei 39 °C.
      HINWEIS: Wenn Sie in einem Inkubator inkubieren, geben Sie die Petrischalen in eine luftdichte Box, bevor Sie die Petrischalen aus der anaeroben Station nehmen.
3. Gezielte Isolierung einer bestimmten Bakteriengruppe.
   HINWEIS: Die folgende Methodik erläutert eine Isolationsstrategie für anaerobe Bakterien, die möglicherweise MI assimilieren können.
   1. Für die Herstellung von Anreicherungsmedium, Minimal-Agar-Medium und Minimal-Bouillon-Medium ist die in Tabelle 2 und Tabelle 3 angegebene Zusammensetzung unter Einhaltung der in Schritt 2.1 dargelegten Richtlinien zu befolgen. Geben Sie nach dem Autoklaviervorgang 0,2 ml/l filtersterile Vitaminmischung (wie in der Zusammensetzung beschrieben) in Minimal-Agar-Medien und Minimal-Brühe-Medien.
   2. Homogenisieren Sie die Ausgangsprobe mit einem Vortex-Mischer für 10-15 s. Anschließend wird die homogenisierte Probe mit einer Pipette mit einer Geschwindigkeit von 5 % in das Röhrchen mit dem Anreicherungsmedium überführt (z. B. wenn das Volumen des Anreicherungsmediums 10 ml beträgt, 0,5 ml homogenisierte Probe inokulieren). Die frisch beimpfte Probe wird 24 Stunden lang bei 39 °C in der anaeroben Station inkubiert.
   3. Mischen Sie das angereicherte Röhrchen nach der Inkubation gründlich, indem Sie entweder einen Vortex-Mischer für 10-15 s verwenden oder pipettieren. Anschließend wird die gemischte Probe mit einer Geschwindigkeit von 5 % in ein steriles Minimalbouillonmedium überführt und anschließend 24 Stunden lang bei 39 °C inkubiert.
   4. Verdünnen Sie die Proben seriell in steriler Kochsalzlösung (d. h. 0,85 % NaCl), beginnend mit einer Verdünnung von 1:10 und bis zur Verdünnung von 1:1000. Nach jeder Verdünnung wird die Probe mit einem Vortex-Mischer 10-15 s lang oder durch Pipettieren gründlich bei Raumtemperatur homogenisiert.
   5. Unter sterilen und anaeroben Bedingungen 1 ml der verdünnten Probe in eine Petrischale geben. Gießen Sie ca. 15-20 ml geschmolzenes minimales Agarmedium in die Petrischale und schwenken Sie es vorsichtig horizontal, um eine gleichmäßige Mischung zu erzielen.
      HINWEIS: Die Temperatur des Agars sollte etwa 45 °C betragen, damit keine Klumpen vorhanden sind und die Probe nicht durch Hitze abgetötet wird. Das mittlere Gießen sollte unter anaeroben Bedingungen erfolgen.
   6. Nach der Erstarrung des Agars werden die Petrischalen 24 Stunden lang bei 39 °C in umgekehrter Position in einer anaeroben Station oder im Inkubator inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation erscheinen Bakterienkolonien als deutliche, kleine Punkte, die in das Medium eingebettet sind.
      HINWEIS: Wenn Sie die Petrischale in einem Inkubator inkubieren, bringen Sie die Platten in eine luftdichte Box, bevor Sie sie aus der anaeroben Station nehmen.
   7. Nehmen Sie mit einer sterilen Impfschlaufe vorsichtig die einzelnen Bakterienkolonien heraus und geben Sie sie in separate Röhrchen mit minimalem Brühemedium.
   8. Nachdem die Kolonien in einzelne Röhrchen überführt wurden, werden die beimpften Röhrchen 24 h lang bei 39 °C anaerob inkubiert. Nach der Inkubation deutet eine erhöhte Trübungen im Medium auf Bakterienwachstum hin.
      HINWEIS: Jedes Mal, bevor Sie die Medienflaschen in die anaerobe Station befördern, sollten sie entgast werden, wie bereits in Schritt 2.1.7 erwähnt. Die Schritte 2-8 sollten innerhalb der anaeroben Station durchgeführt werden.

3. Identifizierung von anaeroben Bakterien

1. Extraktion von DNA aus Kulturen mit einer Inkubationszeit von 24 bis 48 Stunden nach einem enzymatischen Lyseprotokoll²².
2. Die Kultur wird bei 3000 x g 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette verworfen.
3. Waschen Sie das Pellet 2x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), indem Sie es in 2 mL PBS suspendieren. Homogenisieren Sie die Probe mit einem Vortex-Mischer für 10-15 s. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
4. Das Zellpellet wird in 0,2 mL PBS pH 7,4 suspendiert und 30 Minuten lang bei 50 ΰC mit 1 μl Lysozym und 1 μμ rekombinantem Mutanolysin inkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 56 μC mit 5 μl Proteinase K.
5. Geben Sie 4 μl RNAseA in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugenröhrchen bei 21168 x g für 1 min. Den Überstand zurückgewinnen und mit magnetischen Kügelchen reinigen.
6. Durchführung der DNA-Quantifizierung mit einer fluorometrischen Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers für das dsDNA-Quantifizierungskit (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Extrahierte DNA kann bei -20 °C gelagert werden.
7. DNA-Proben als Templates für die PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer 27f und 1492r²³ gemäß den in Tabelle 4 gezeigten Bedingungen verwenden. Um sicherzustellen, dass die PCR-Reaktion erfolgreich war, führen Sie die Agarose-Gelelektrophorese gemäß der Standard-Agarose-Gelelektrophoresemethode mit 1X TAE-Puffer und 1% Agarose durch.
8. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem kommerziellen PCR-Aufreinigungskit, um Primer, Nukleotide und andere Verunreinigungen zu entfernen.
9. Senden Sie das PCR-Produkt für die Sanger-Sequenzierung an den geeigneten Sequenzierdienstleister.
   HINWEIS: Neben der Sequenzierung können Dienstleister auch Dienstleistungen wie die Aufreinigung des PCR-Produkts gegen zusätzliche Gebühren anbieten. PCR-Produkte können bei 4 °C oder -20 °C gelagert werden.
10. Nachdem Sie die Sequenzierungsergebnisse im FASTA-Format zusammen mit der Chromatogrammdatei (üblicherweise im ABI- oder SCF-Format) erhalten haben, analysieren Sie die Sequenzen mit bioinformatischen Tools. Verwenden Sie eine Sequenzanalysesoftware, um die Chromatogrammdatei zu öffnen und zu visualisieren.
    HINWEIS: Die Gesamtqualität des Chromatogramms wurde auf der Grundlage klarer und deutlicher Peaks ohne übermäßiges Rauschen überprüft
11. Vergleichen Sie Amplikons und richten Sie sie mit den eng verwandten Spezies in der nicht redundanten ribosomalen RNA-Datenbank GenBank 16S des National Center for Biotechnology Information (NCBI) aus, indem Sie das Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Tool²⁴ und die Refseq-Genomdatenbank verwenden.
    HINWEIS: Wenn Sie NCBI BLAST verwenden, kopieren Sie die gesamte FASTA-Sequenz in die Suchleiste.

4. Konservierung von reinen Bakterienkulturen

1. Ernten Sie Bakterienzellen aus einer gut gewachsenen Kultur von 24 h bis 48 h entweder durch Zentrifugation (3000 x g für 10 min) oder Biomassesammlung aus einer axenischen Kultur auf einer Platte.
2. Die Bakterienkultur wird in einer geeigneten isotonischen sterilen Lösung (NaCl 0,85 %) suspendiert und durch Zentrifugieren der Bakterienlösung bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C gewaschen.
3. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in einem kleinen Volumen steriler isotonischer Lösung (0,5 ml). Um die Entfernung von Rückständen des Wachstumsmediums sicherzustellen, wiederholen Sie dies 1x.
4. Resuspendieren Sie das Pellet in 0,8 mL bis 1 mL sterilem Nährmediumkonzentrat und homogenisieren Sie es entweder mit einem Vortex-Mischer für 5-10 s oder durch vorsichtiges Pipettieren.
5. Übertragen Sie 0,5 ml Zellsuspension in ein steriles und ordnungsgemäß markiertes 1 ml-Kryoröhrchen und fügen Sie 0,5 ml autoklavierte 50%ige Glycerinlösung hinzu. Homogenisieren Sie das Kryofläschchen mit einem Vortex-Mischer und lagern Sie es in einem Gefrierschrank bei -80 °C (Abbildung 3).
   HINWEIS: Alle Schritte vor dem Transfer der Kryoröhrchen auf -80 °C sollten in der anaeroben Station durchgeführt werden.

Results

Überwachung der anaeroben Bedingungen während des Transports
Aufgrund der Zugabe von Natriumresazurin deutet die Änderung der Farbe der Transportlösung zu rosa vor dem Transfer der Probe in das Röhrchen auf eine Störung oder ein Versagen bei der Aufrechterhaltung der anaeroben Bedingungen hin. Daher wurde auf die Verwendung der Röhre mit Farbänderung während des Transports verzichtet und es wurden nur die Röhren verwendet, die keine Farbänderung zeigten, wie in Abbildung 2 zu sehen ist.

Analyse der Sequenzierungsergebnisse
Die DNA-Extraktion von Isolaten mit Chromatogrammdaten mit übermäßigem Hintergrundrauschen oder Störung der Basislinie, Peaks mit geringer Signalintensität, dem Vorhandensein mehrerer oder überlappender Peaks an einer einzigen Position und inkonsistenten Peakhöhen wurden mit frischer und reiner Kultur wiederholt, da sie auf eine Kontamination der Probe, eine ungleichmäßige Amplifikation oder Probleme während des Sequenzierungsprozesses hinweisen. Bei der Durchführung der BLAST-Suche in NCBI war der Stamm mit der höchsten prozentualen Identität und der hohen Abfrageabdeckung der verwandte Stamm zu unserem Isolat, der zur Identifizierung des Isolats führte.

Kultivierung eines breiten Spektrums anaerober Bakterien
Die Isolierung von anaeroben Bakterien führte zu mehr als 600 Isolaten, die in fünf verschiedenen Medien gewonnen und in separaten Flaschen aufbereitet und sterilisiert wurden. Die Identifizierung anhand des 16S rRNA-Gens ergab 15 verschiedene Bakteriengattungen (Abbildung 4). Von der Gesamtzahl der Isolate handelt es sich bei mehr als der Hälfte um streng anaerobe Bakterien und der Rest um fakultativ anaerobe Bakterien.

Die Diversität der Isolate umfasst acht Stämme, die neue taxonomische Arten aufweisen, die mit Mitgliedern der Familien Clostridiaceae, Lactobacillaceae und Oscillospiraceae verwandt sind (Tabelle 5)²⁵. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Einhaltung bewährter Verfahren bei der Vorbereitung von Nährmedien und der Verwendung einer Vielzahl von Medien für den Erfolg von Anbaustudien.

Gezielte Isolierung
Die Beobachtung von Kolonien auf minimalem Agarmedium deutet auf das potenzielle Vorhandensein anaerober Bakterien hin, die in der Lage sind, MI als Kohlenstoffquelle zu nutzen (Abbildung 5). Um diese Befunde auf genetischer Ebene abschließend zu bestätigen, kann eine umfassende Analyse durch Ganzgenomsequenzierung durchgeführt werden. Dieser Sequenzierungsansatz ermöglicht die Identifizierung spezifischer Gene, die mit dem MI-Metabolismus assoziiert sind oder dazu beitragen, einschließlich iolA, iolB, iolC, iolD, iolE, iolF, iolG, iolH, iolI, iolJ, iolT und iolW.

Abbildung 1: Prozess der Probenahme und des Transports von GIT-Schnitten für die Kultivierung anaerober Bakterien. 1) Die Schnitte werden vor dem Schneiden zugeklemmt. Die gestrichelten Linien zeigen die empfohlene Schnittposition an. 2) Überführung des beprobten Abschnitts in ein mit Transportlösung gefülltes Hungate-Röhrchen. 3) Ersatz der Luftatmosphäre durch Injektion von Transportlösung, um anaerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Abbildung von Hungate-Röhrchen mit Proben, die aus dem Ileumschnitt von Hühnchen entnommen wurden. Das Bild zeigt die korrekte Befüllung der Hungate-Röhrchen mit Transportlösung, wobei das Fehlen von Luftraum und die Beibehaltung einer konsistenten Farbe im Vergleich zur Kontrolle ohne Probe sichergestellt werden. Eine auffällige Trübungen in den Probenröhrchen wird auf die Auflösung der Digesta zurückgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Aufeinanderfolgende Schritte bei der Konservierung anaerober Bakterien. 1) Biomasseernte von 24 h bis 48 h axenischer Kultur in einer isotonischen Lösung. 2) Waschen von Bakterienzellen durch Zentrifugation und Entfernung des Überstands, um Medienreste zu entfernen. 3) Wiederholung des Waschvorgangs. 4) Pelletauflösung in Nährmedien und 50%iger Glycerinlösung, gefolgt von Lagerung bei -80 °C in sterilen Kryoröhrchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Taxonomische Verteilung isolierter Bakterien auf Gattungsebene. Das gestapelte Balkendiagramm zeigt die Vielfalt der Bakterien, die aus fünf verschiedenen Medienformulierungen isoliert wurden, und unterstreicht die positiven Auswirkungen der Verwendung verschiedener Medienformulierungen in dieser Studie. Die Formulierung des Mediums ist in Tabelle 1 aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Anaerobe Bakterienkolonien auf minimalem Agarmedium. Anaerobe Bakterienkolonien, die nach 24 Stunden Inkubation bei 39 °C auf minimalem Agarmedium gedeihen. Die Entwicklung von Kolonien deutet auf eine mögliche Assimilation von Myo-Inositol als primäre Kohlenstoffquelle neben anderen Kohlenstoffquellen hin. Es werden zwei Verdünnungen vorgestellt, (A) ^10-1, die eine Koloniezahl zeigen, die aufgrund ihrer Häufigkeit eine praktische Zählung übertrifft; und (B) ^10-2, das unterscheidbare, zählbare Kolonien anzeigt und die selektive Analyse erleichtert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Medien	1	2	3	4	5
	Peptone-Medien	Polysaccharide Medien	Medien für kurze Fettsäuren	Kohlenhydrate Medien	Medien für sulphatoreduzierende Bakterien (SRB)
Quelle von C	Traubenzucker 0,2 %	Geflügelfutter (2 %)	Essigsäure 0,17%, Isovaleriansäure 0,01%, Propionsäure 0,2%, Buttersäure 0,2%	Traubenzucker 5%	Na-DL-Lactat, Ascorbinsäure
	Stärke 0,05 %
Quelle von N	Aminosäuren aus Sojabohnen (1%)	-	Aminosäuren aus Trypton und Fleischextrakt (0,1%)	Aminosäuren aus Sojapeptonen (0,1%), (NH4)3 Citrat (0,1%)	NH4Cl (0,1 %)
Quelle der Mineralien	K2HPO4 (0,05 %)	-	K2HPO4 (0,05 %)	K2HPO4 (0,05 %)	K2HPO4 (0,05 %)
Agar	1.50%	1.50%	1.50%	1.50%	1.50%
Cofaktor (wird nach der Sterilisation hinzugefügt)	Hefe-Extrakt (0,1%)	-	Vitaminmischung (0,01%)	Vitaminmischung (0,01%)	Hefe-Extrakt (0,01%)
Hemmer	nichts	nichts	Tween 80 (1%)	Menadion (0,05 %)	-

Tabelle 1: Zusammensetzung des Nährmediums für ein breites Spektrum der bakteriellen Isolierung. Zusammensetzung aus fünf Agarmedien, die jeweils einzigartig formuliert sind und auf Variationen der Kohlenstoffquelle, der Stickstoffquelle, der Mineralquelle und der Einbeziehung von Co-Faktoren und Inhibitoren basieren.

Zusammensetzung	Menge (g/L)
Kasein-Pepton	17
Soja-Pepton	3
Natriumchlorid	5
Dikaliumhydrogenphosphat	2.5
Myo-Inositol	2.5

Tabelle 2: Zusammensetzung des Anreicherungsmediums. Formulierung eines Mediums, das mit einer Mischung komplexer Inhaltsstoffe entwickelt wurde, um das Wachstum eines breiten Spektrums von Bakterien zu unterstützen. Die Menge der einzelnen Zutaten wird in g/L angegeben.

Zusammensetzung	Minimaler Agar-Gehalt (g/mL)/ L	Minimales Bouilland-Medium (g/mL)/ L
L-Cystin	0.5	0.5
Natriumchlorid	0.3	0.3
Natriumthioglykolat	0.5	0.5
Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat	0.53	0.53
Kaliumdihydrogenphosphat	0.41	0.41
Ammoniumchlorid	0.3	0.3
Calciumchlorid	0.11	0.11
Magnesiumchlorid	0.1	0.1
Trypton	10	10
EDTA	0.00773	0.00773
Spurenelement-Lösung SL7	1	1
Vitamin-Mix	0.2	0.2
Myo-Inositol (20 mM)	3.6	3.6
Agar	15	--
pH-Wert (bei Verwendung von 1 mM HCl)	6 ± 0,2	6 ± 0,2

Tabelle 3: Minimale mittlere Zusammensetzung. Das Medium ist mit Myo-Inositol als primärer Kohlenstoffquelle formuliert.

Anfängliche Denaturierung	95 °C	4 Minuten	1x
Denaturierung	95 °C	30 Sek.
Glühen	52 °C	30 Sek.	30-fach
Erweiterung	68 °C	90 Sek.
Letzte Verlängerung	68 °C	ca. 10 Minuten	1x
	4 °C	∞

Tabelle 4: Optimale Bedingungen für die Amplifikation von 16S rRNA-Genen. Die idealen Temperatur-, Dauer- und Zyklusparameter, die im Thermocycler für eine effiziente Amplifikation des Zielgens verwendet werden sollen.

Neuartige Taxonomie-Zuweisung	Größe des Genoms	GC-Inhalte	Darmregion	16S Beitritt
Limosilactobacillus galli	1861581	50.43	Ernte	OM760982
Limosilactobacillus avium	2158112	48.49	Krummdarm	OM760983
Limosilactobacillus pulli	1924125	45.87	Krummdarm	OQ831033
Clostridium butanoliproduce	3507657	28.34	Ernte	OQ831034
Faecalispora anaeroviscerum	2921858	50.36	Krummdarm	OM760984
Limosilactobacillus viscerum	1993658	44.9	Krummdarm	OM760986
Ligilactobacillus hohenheimensis	1381484	50.47	Jejunum	OM760988
Limosilactobacillus difficilis	1998683	47.38	Krummdarm	OQ832131

Tabelle 5. Taxonomische Identifizierung neuer Bakterienarten. Die in dieser Studie aus dem Magen-Darm-Trakt von Hühnern isolierten und identifizierten neuen Bakterienarten werden zusammen mit ihrer Genomgröße, ihrem GC-Gehalt, ihrem Schnitt und ihrer 16S-rRNA-Genakzession detailliert beschrieben. Diese Tabelle wurde von²⁵ geändert.

Discussion

Der Zweck dieser Methodik besteht darin, die Kultivierung anaerober Darmbakterien zu verbessern, indem die Qualität der Probenahmebedingungen, der Probenverarbeitung sowie der Medienformulierung und -vorbereitung verbessert wird. Bei der Formulierung der Nährmedien müssen die physikalisch-chemischen Bedingungen der Proben (pH-Wert, Verfügbarkeit von Kohlenstoff, Stickstoff und Cofaktoren) berücksichtigt werden. Im Vergleich zu Bakterienkultursammlungen von Schweinen, Menschen oder Mäusen ^1,26,27 ist der Bericht über die Auswahl der Medien für Hühner eher eng gefasst und möglicherweise sogar für Bereiche von hohem Interesse wie Kot und Blinddarm^{unterschätzt 2,28}. In diesem Sinne bot die Formulierung und Vorbereitung der in dieser Arbeit verwendeten Medien 80 verschiedene Bedingungen, die den metabolischen Bedarf von Mikroorganismen decken sollen, der durch Sequenzierungsansätze in anderen Arbeiten berichtet wurde 29,30,31.

Neben der Auswahl des Mediums und der Supplementierung wird auch die Formulierung des Nährmediums und das Zusammenspiel der Inhaltsstoffe während der Aufbereitung und Sterilisation beobachtet. Die Kombination von Phosphaten und Agar, von der berichtet wurde, dass sie H₂O₂ erzeugt, wurde vermieden, indem Phosphat und Agarlösung getrennt hergestellt wurden. Diese Modifikation verbesserte das Spektrum der Isolatenvielfalt, indem sie die Lebensfähigkeit von Katalase-negativen Bakterien erhöhte. Um die Bildung von Maillard-Reaktionsprodukten (MRP) während der Sterilisation zu vermeiden, wurden die Kohlenhydrate in einer separaten Lösung aufbereitet und unter verschiedenen Bedingungen sterilisiert. Diese beiden Modifikationen erhöhen den Material- und Arbeitszeitbedarf, bieten aber den Vorteil, dass eine exponentielle Anzahl verschiedener Medienkombinationen gemischt und formuliert werden kann.

Die Herstellung separater Lösungen in kleineren Volumina kann eine Herausforderung bei der Auflösung der Inhaltsstoffe und der Suche nach angemessenen Sterilisationsbedingungen zur Vermeidung von Ausfällungen darstellen. Aber die Formulierungen von Nährmedien erreichen in der Regel keine Sättigung. Wir bevorzugen filtriert-sterilisierte mineralische Lösungen, die bei 60 °C gelöst werden, um Ausfällungen zu vermeiden. Bei Lösungen, die durch Hitze und Druck im Autoklaven sterilisiert wurden, wurde besonderes Augenmerk auf die Oxidation der Kohlenhydratlösungen bei hohen Temperaturen und hohem Druck gelegt. Um jegliche chemische Modifikation zu vermeiden, müssen alle Kohlenhydratlösungen 30 Minuten lang bei 110 °C bei 5 psi sterilisiert werden. Diese Vorsichtsmaßnahmen verbessern die Verfügbarkeit von Nährstoffen wie essentiellen Aminosäuren, Cofaktoren wie Kupfer, Zink oder Eisen sowie die Verringerung der hydrolytischen Aktivität einiger Proteine, die durch die erzeugten Carbonylverbindungen modifiziert wurden³².

In allen Studien gibt es nur sehr wenige Autoren, die den direkten Einfluss von Nährmedien auf die Kultivierungsergebnisse diskutieren. Gängige Behandlungen, die in Kultivierungsstudien am Menschen angewendet wurden (Vorinkubation in Blutkultur, Pansenflüssigkeit oder Mucin), wurden undeutlich in Darmkulturstudien an anderen Spezies mit unterschiedlichen Darmbedingungen wiederholt ^2,28,33. In dieser Arbeit unterstützte die pflanzliche Ernährung, die Hühnern verabreicht wurde, die Modifikation der Formulierung von Medien, indem Hauptkomponenten pflanzlicher Nährstoffe (Peptide und Kohlenhydrate) verwendet wurden, die die GIT-Umgebung von Hühnerfleisch nachahmen und die Nährstoffverfügbarkeit berücksichtigten.

Die meisten Studien verfolgen einen Kultivierungsansatz in den unteren Verdauungsregionen von Hühnern (Blinddarm und Kot)2,3,28,34. Nur wenige Kultivierungsansätze haben Mitglieder der Familie Lactobacillaceae, Clostridiaceae und Enterobacteriaceae^35,36 aus dem oberen Verdauungstrakt isoliert. Keiner von ihnen verwendete jedoch die modernen Protokolle für die Kultur. Im Jahr 2021 berichteten Zenner et al. über die alleinige Isolierung von Ligilactobacillus aviarius, die aus dem Ileum von Hühnern gewonnen wurde, während der Rest der Kulturen von Caeca stammte. Im Gegensatz dazu berichtete die in dieser Arbeit gefundene Diversität über eine redundante Isolierung von L. aviarius, zusammen mit anderen Arten aus den Gattungen Lactobacillus, Ligilactobacillus und Limosilactobacillus²⁵. Dieser Unterschied verdeutlicht den Vorteil der Verwendung von separat aufbereiteten Medien gegenüber kommerziell erhältlichen gebrauchsfertigen Formulierungen.

Die Aufrechterhaltung anaerober Bedingungen während des gesamten Isolations- und Kultivierungsprozesses ist ein sehr wichtiger Schritt, da selbst eine kleine Menge Sauerstoff das Wachstum von Anaerobiern negativ beeinflussen kann. Um die anaeroben Bedingungen während des Probentransports zu überwachen und aufrechtzuerhalten, wird der Transportlösung Natriumresazurin zugesetzt. Diese chemische Verbindung wird reduziert, wenn sie Sauerstoff ausgesetzt wird, was zu einem Farbübergang von Blau zu Rosa führt. In niedriger Konzentration hat es keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Bakterien. Es ist jedoch wichtig, zu hohe Konzentrationen zu vermeiden, da sie zu unbeabsichtigten Auswirkungen auf Bakterien führen können. Die sorgfältige Kontrolle des Natriumresazurinspiegels gewährleistet eine genaue Überwachung der anaeroben Bedingungen, ohne die Integrität der Bakterienproben zu beeinträchtigen. Für die gezielte Isolierung wurde das Pour-Plate-Verfahren mit dem Spread-Plate-Verfahren eingesetzt, da es eine homogene Verteilung der Bakterienkolonien ermöglicht und so eine präzise Selektion der einzelnen Bakterien ermöglicht. Darüber hinaus weist diese Methode eine verminderte Anfälligkeit für Kontaminationen in der Luft oder von außen auf. Darüber hinaus bietet es eine konsistente Wachstumsumgebung für verschiedene Bakterienarten, sowohl für schnell als auch für langsam wachsende Arten, so dass sich jeder Bakterienstamm in seinem eigenen individuellen Tempo vermehren kann, ohne von anderen mikrobiellen Spezies gestört zu werden.

Für die Konservierung wurde Glycerinbrühe auf Pelletbasis gegenüber Glycerinbrühe gewählt, da sie eine höhere Bakterienkonzentration und eine geringere Anfälligkeit für Verunreinigungen ermöglicht. Diese Methode erweist sich als effiziente Methode, um die Bakterienkultur bei -80 °C zu konservieren und so eine langfristige Lagerstabilität zu gewährleisten.

Der erste Teil dieser Methodik skizziert einen Ansatz zur Isolierung neuartiger anaerober Kulturen, mit dem primären Ziel, die Vielfalt zuvor unkultivierter Stämme im Hühnerdarm zu erforschen. Die Kultivierung und Identifizierung anaerober Bakterien dient als wertvolles Instrument für ein besseres Verständnis der Geflügelgesundheit, des Tierschutzes, der Mikroben-Wirt-Interaktion und der potenziellen Isolierung probiotischer Stämme. Darüber hinaus kann es auch ein tieferes Verständnis der genetischen Ausstattung und der Metabolitenfähigkeiten vermitteln und den Weg für Fortschritte bei der Manipulation der Darmmikrobiota ebnen, um die gewünschten Ergebnisse in der Geflügelproduktion zu erzielen. Der anschließende Teil der Methodik konzentriert sich auf die potentielle Isolierung von MI-metabolisierenden Anaerobiern. Dieses Unterfangen ist vielversprechend für die Aufklärung des MI-Metabolisierungswegs, ein Prozess, der bisher unklar geblieben ist. Bemerkenswert ist, dass die Vielseitigkeit dieser Methoden über Hühner hinausgeht und eine Isolationstechnik bietet, die auf verschiedene Probentypen anwendbar ist. Daher ist die in dieser Studie vorgestellte Methode einer der effizienten Ansätze zur Isolierung von aneroben Kulturen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essigsäure	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammoniumchlorid	Carl Roth	P726.1
Anaerobe Station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Buttersäure	Merck	8.0045.1000
Calciumchlorid-Dihydrat	VWR	97061-904
Zentrifuge	Eppendorf	5424R
Hühnerlysozym (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cystein	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Dikaliumhydrogenphosphat	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Dü Düsseldorf,	Deutschland-MagAttract
HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesiumchlorid	Carl Roth	2189.1
Mischgas (80% N2 (Qualitätsstufe 5.0), 15% CO2 (Qualitätsstufe 3.0) und 5% H2 (Qualitätsstufe 5.0))Westfalen	Gase GmbH,
, rekombinant (Lyophilisat)	A& A Biotechnologie	1017-10L
Myo-Inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Kaliumdihydrogenphosphat	Carl Roth	3904.2
Propionsäure	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuklease A (RNase A)	19101
Natriumchlorid	VWR	27800.291
Natriumresazurin	VWR	85019-296
Natriumthioglykolat	Sigma-Aldrich	102933
Soja Pepton, gentechnikfrei, tierversuchsfrei	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Trypton	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitaminmischung (Nahrungsergänzungsmittel)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Hefeextrakt	Carl Roth	9257.05
β-D-Fruktose	VWR	53188-23-1