Aufreinigung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe

Summary

Dieses Protokoll beschreibt alle Verfahren, von der Kultivierung humaner mesenchymaler Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe über die Entnahme von Überständen bis hin zur Extraktion extrazellulärer Vesikel (EVs) mittels Ultrazentrifugation.

Abstract

Aus humanem Fett gewonnene mesenchymale Stammzellen (ADSCs) können die Regeneration und den Wiederaufbau verschiedener Gewebe und Organe fördern. Neuere Forschungen deuten darauf hin, dass ihre regenerative Funktion auf Zell-Zell-Kontakt und zellparakrine Effekte zurückzuführen ist. Der parakrine Effekt ist eine wichtige Möglichkeit für Zellen, über kurze Strecken zu interagieren und Informationen zu übertragen, wobei extrazelluläre Vesikel (EVs) eine funktionelle Rolle als Träger spielen. In der regenerativen Medizin besteht ein erhebliches Potenzial für ADSC-Elektrofahrzeuge. Mehrere Studien haben über die Wirksamkeit dieser Methoden berichtet. Derzeit werden verschiedene Methoden zur Extraktion und Isolierung von EVs beschrieben, die auf Prinzipien wie Zentrifugation, Fällung, Molekülgröße, Affinität und Mikrofluidik basieren. Die Ultrazentrifugation gilt als Goldstandard für die Isolierung von Elektrofahrzeugen. Dennoch fehlt nach wie vor ein akribisches Protokoll, um Vorsichtsmaßnahmen während der Ultrazentrifugation hervorzuheben. Diese Studie stellt die Methodik und die entscheidenden Schritte der ADSC-Kultur, der Überstandssammlung und der EV-Ultrazentrifugation vor. Doch auch wenn die Ultrazentrifugation kostengünstig ist und keine weitere Behandlung erfordert, gibt es immer noch einige unvermeidliche Nachteile, wie z. B. eine niedrige Wiederfindungsrate und EV-Aggregation.

Introduction

Die meisten ADSCs werden aus Fettgewebe gewonnen und fördern nachweislich die Regeneration und den Wiederaufbau verschiedener Gewebe und Organe, einschließlich des Myokards, des Knochens und der Haut¹. Neuere Forschungen deuten darauf hin, dass die regenerative Funktion von ADSCs auf den interzellulären Kontakt und die parakrine Wirkung der Zellen zurückzuführen sein könnte². Die parakrine Wirkung ist ein wichtiges Mittel für Zellen, um zu interagieren und Informationen über kurze Distanzen zu übertragen, und diese Funktion wird durch extrazelluläre Vesikel (EVs) erreicht.

EVs sind von Zellen hergestellte doppelschichtige Membranstrukturen mit einem Durchmesser von 40 nm bis 160 nm (mit einem Durchschnitt von etwa 100 nm). Sie beeinflussen verschiedene zelluläre Funktionen, wie z. B. die Zytokinproduktion, die Zellproliferation, die Apoptose und den Stoffwechsel ^3,4. Es wurden zahlreiche Studien zu den Funktionen von ADSC-EVs durchgeführt, einschließlich der Förderung der Knochenregeneration, der Regeneration des Mundschleimhautgewebes, des Überlebens des Fettgewebes nach einer Gewebetransplantation und der Reparatur von Hautwunden 5,6,7,8. Das enorme Potenzial von ADSC EVs in der regenerativen Medizin ist offensichtlich. Es gibt verschiedene Methoden zur Extraktion und Trennung von EVs aus dem Überstand, wie z. B. Techniken, die auf Zentrifugation, Fällung, Molekülgröße, Affinität und Mikrofluidik basieren. Die Ultrazentrifugationsmethode gilt weithin als Goldstandard für die Isolierung von EVs⁹. Das Grundprinzip der Ultrazentrifugation für die EV-Trennung beruht auf der Tatsache, dass die Partikel in der Probe unterschiedliche Sedimentationskoeffizienten aufweisen, was zu ihrer Sedimentation und Aggregation in unterschiedlichen Trennschichten führt. Dennoch wurde noch kein detailliertes Protokoll erstellt, das die Vorsichtsmaßnahmen während der Ultrazentrifugation hervorhebt.

Daher skizziert diese Studie objektiv die ADSC-Kultur, die Überstandssammlung und die Ultrazentrifugationsverfahren und Schlüsselpunkte von EVs mit einem logischen Informationsfluss und einer klaren, formalen Sprache. Dies bietet eine wertvolle Referenz für zukünftige Experimente.

Protocol

Die Übersicht über die Protokollschritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Medien

1. Bereiten Sie ein Nährmedium für ADSC ohne Exosomen vor, indem Sie 450 ml Basalkulturmedium, 50 ml fötales Rinderserum ohne Exosomen und 5 ml Dreifachantibiotika verwenden.

2. Wiederbelebung und Kultivierung von ADSCs

HINWEIS: Reanimieren Sie ADSCs.

1. Schalten Sie vorher die UV-Strahlung des ultra-clean Tisches ein und desinfizieren Sie diese für 30 min.
2. Erhitzen Sie das Medium zuvor in einem 37 °C warmen Wasserbad.
3. Entnehmen Sie 2 Röhrchen mit gefrorenen ADSCs (P3) aus flüssigem Stickstoff und rühren Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad bei konstanter Temperatur, bis sie vollständig aufgetaut sind.
   HINWEIS: Die Öffnung des Gefrierrohrs sollte nicht mit Wasser in Berührung kommen, um eine Kontamination zu vermeiden.
4. Desinfizieren Sie das Kryokonservierungsröhrchen mit 75% Alkohol und stellen Sie es dann auf den ultrareinen Tisch. Aspirieren Sie die Zellsuspension mit einer Pipette und geben Sie sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
5. Legen Sie das Zentrifugenröhrchen in eine Zentrifugenmaschine mit niedriger Drehzahl und zentrifugieren Sie es bei 250 x g für 5 min bei 4 °C.
6. Bereiten Sie vier 10-cm-Kulturschalen vor und geben Sie 9 ml Medium in jede Schale. Markieren Sie den Namen, den Zelltyp, die Generation und das Versuchsdatum und heizen Sie sie dann in einem thermostatischen Inkubator bei 37 °C vor.
7. Desinfizieren Sie das Zentrifugenröhrchen und stellen Sie es auf den ultrareinen Tisch. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
8. Fügen Sie 4 ml Medium hinzu und rühren Sie die Lösung vorsichtig (1 x 10⁵ Zellen/ml), bis sie gleichmäßig verteilt ist.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass das Zellpellet beim Extrahieren des Überstands nicht entfernt wird.
9. Geben Sie 1 ml Zellsuspension in jede Schale. Schütteln Sie die Schalen mit einer Kreuzmethode.
   HINWEIS: Positionieren Sie die Platte auf einer ebenen Fläche und bewegen Sie sie in einem Kreuzmuster (nach oben, unten, links und rechts) für 5-6 Wiederholungen. Vermeiden Sie kreisende Bewegungen, da diese zu einer Zellansammlung in der Mitte führen können.
10. Beobachten Sie die Zellen bei 40-facher Vergrößerung mit dem Lichtmikroskop und legen Sie dann die Schalen in den Inkubator.
    HINWEIS: Der Hauptzweck der Beobachtung der Zellen besteht darin, festzustellen, ob sie gleichmäßig verteilt sind, da eine ungleichmäßige Verteilung das spätere Wachstum beeinflusst.
11. Bereiten Sie das Austauschmedium für die Zellen vor.
    1. Schalten Sie vorher die UV-Strahlung des ultra-clean Tisches ein und desinfizieren Sie diese für 30 min.
    2. Erhitzen Sie das Medium zuvor in einem 37 °C warmen Wasserbad.
    3. Beobachten Sie den Zellzustand unter dem Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Der Konfluenzpegel beträgt ca. 50 %.
       HINWEIS: Das Konfluenzniveau wird berechnet als das Verhältnis der von den Zellen eingenommenen Fläche zur Oberfläche der Petrischale, nachdem die Zellen an der Wand haften und sich vollständig gedehnt haben.
    4. Übertragen Sie die Kulturschale nach der Desinfektion auf den ultrareinen Tisch (Biosicherheitsstufe 2) und entfernen Sie das Medium.
    5. Spülen Sie jede Kulturschale zweimal vorsichtig mit 2 ml PBS-Lösung aus.
    6. Geben Sie 10 ml Medium in jede Schale. Schieben Sie die Schalen in den Inkubator.

3. Sammeln des ADSC-Überstands und Extrahieren der EVs

1. Schalten Sie vorher die UV-Strahlung des ultra-clean Tisches ein und desinfizieren Sie diese für 30 min.
2. Beobachten Sie den Zellzustand unter dem Mikroskop. Der Konfluenzpegel beträgt ca. 80 %.
3. Übertragen Sie das Gericht nach der Desinfektion auf den ultrasauberen Tisch. Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette auffangen und in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben.
   HINWEIS: Zellen können entweder eingefroren oder verworfen werden. Wenn keine Sterilität erforderlich ist, können die folgenden Schritte auf dem Operationstisch durchgeführt werden. An dieser Stelle kann das Experiment pausiert und später neu gestartet werden. Wenn der Versuch unterbrochen wird, ist der Überstand nicht länger als eine Woche in einem Kühlschrank bei 4 °C zu lagern. Eine langfristige Lagerung wird nicht empfohlen, da sie die Aktivität von Elektrofahrzeugen beeinträchtigen kann. Der optimale Ansatz besteht darin, Elektrofahrzeuge sofort zu extrahieren.
4. Zentrifugieren (300 x g, 10 min, bei Raumtemperatur), um suspendierte Zellen zu entfernen. Den Überstand mit einer Pipette auffangen.
   HINWEIS: Nicht gießen. Lassen Sie ein wenig Überstand, damit das Pellet nicht aufgesaugt wird.
5. Zentrifugieren Sie, um Zelltrümmer zu entfernen (2000 x g, 10 min, 4 °C), dann fahren Sie fort, um den Überstand mit einer Pipette aufzufangen.
   HINWEIS: Die wichtigsten Punkte sind die gleichen wie in Schritt 3.4.
6. Filtern Sie den Überstand mit einer 0,22-μm-Membran, um große Partikel und Zelltrümmer zu entfernen.
   HINWEIS: Filtrieren Sie den Überstand mit 2 mL sterilem PBS, um die Filtermembran vor der Filtration zu befeuchten.
7. Zentrifugieren Sie in der Ultrazentrifugenmaschine (10.000 x g, 30 min, 4 °C).
8. Anschließend wird bei 1.00.000 x g für 70 min bei 4 °C zentrifugiert, um das Pellet zu entfernen und den Überstand aufzufangen.
   HINWEIS: Die erhaltenen EVs wurden mehrfach durch Zentrifugation gereinigt, um ihre Reinheit zu erhöhen. Das Pellet ist möglicherweise mit bloßem Auge nicht sichtbar. Daher ist es wichtig, die Pipette vorsichtig zu bedienen und ein wenig Überstand am Boden zu lassen, um eine Ansammlung von Pellets zu vermeiden.
9. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Das Pellet mit PBS resuspendieren und zentrifugieren (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C).
   HINWEIS: Das Pellet ist möglicherweise mit bloßem Auge nicht sichtbar. Daher ist es beim Ansaugen des Überstands mit einer Pipette wichtig, den Überstand vorsichtig und gründlich zu entfernen, um die Reinheit von Elektrofahrzeugen zu maximieren.
10. Entfernen Sie den Überstand und erhalten Sie das Pellet des Elektrofahrzeugs. Resuspendieren Sie es mit 1 mL PBS, geben Sie es in ein 1-ml-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie es in einem 4 °C-Kühlschrank für den anschließenden Nachweis.
    HINWEIS: Das Pellet ist möglicherweise mit bloßem Auge nicht sichtbar. Folglich ist es beim Ansaugen des Überstands mit einer Pipette entscheidend, den Überstand vorsichtig und gründlich zu entfernen, um die Reinheit der Elektrofahrzeuge zu maximieren. Wenn die Proben über einen längeren Zeitraum nicht benötigt werden, lagern Sie sie in einem -80 °C Kühlschrank.

Results

Zunächst wurden ADSCs charakterisiert und identifiziert, einschließlich ihrer Morphologie¹⁰ und Oberflächenantikörper. Anhand von Abbildung 2A ist ersichtlich, dass ADSCs spindelförmig angeordnet sind und nach dichtem Wachstum einen Wirbel bilden. Die kultivierten Zellen wurden in adiogene, osteogene und chondrogene Zellen differenziert und mit Oil Red O, Alizarin Red und Alcian Blue¹¹ gefärbt. Das induzierte Differenzierungsexperiment und die Durchflusszytometrie bestätigten, dass es sich tatsächlich um ADSCs mit dem Potenzial für multidirektionale Differenzierung handelt. Allerdings sind 22% der Zellen in den Ergebnissen CD45-positiv, was die Schlussfolgerung nicht beeinflusst, da ausreichend positive und negative Antikörper sie unterstützen (Abbildung 2A,B).

Als nächstes ist die Identifizierung der extrahierten EVs unerlässlich. Es umfasst hauptsächlich drei Aspekte: Morphologie, Partikelgröße und Markerproteine. Die TEM-Ergebnisse zeigen deutlich die becherförmige EV-Struktur mit einer Doppelschichtmembran¹² (Abbildung 3A). NTA zeigt an, dass EVs eine Partikelgrößenverteilung von etwa 50-150 nm mit einer Konzentration von etwa 1,6 x 10¹⁰ Partikeln/ml aufweisen (Abbildung 3B). Die Western-Blot-Analyse zeigt auch, dass die Markerproteine von EVs, einschließlich CD9, CD63 und TSG101¹³, reibungslos exprimiert werden (Abbildung 3C).

Abbildung 1: Übersicht über die Protokollschritte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Charakterisierung von ADSCs. (A) Die Morphologie der ADSCs ist fusiform. ADSCs wurden im Medium zur adiogenen, osteogenen bzw. chondrogenen Differenzierung kultiviert. Die adipogene Differenzierung wurde durch Ölrot-O-Färbung identifiziert. Die osteogene und chondrogene Differenzierung wurde durch Alizarinrot-Färbung bzw. Alcianblau-Färbung bestätigt. Maßstabsbalken: 100 μm. (B) Durchflusszytometrische Analyse von ADSCs auf MSC-Oberflächenmarker (CD90, CD105, CD29 und CD73) und hämatopoetische zellspezifische Marker (CD31, CD34, CD45 und HLA-DR). Die Gating-Strategie: Kreisen Sie zuerst die leere Gruppe ein. Basierend darauf werden CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 und HLA-DR nacheinander entsprechend den markierten Antikörpern jeder Gruppe einkreisen. Diese Abbildung ist eine Adaption von Han, Y. D. et ^al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Charakterisierung von EVs. (A) Die TEM-Ergebnisse zeigen deutlich die becherförmige EV-Struktur der Doppelschichtmembran. Maßstab: 200 nm. (B) NTA gibt an, dass EVs eine Partikelgrößenverteilung von etwa 50-150 nm mit einer Konzentration von etwa 1,6 x 10¹⁰ Partikeln/ml aufweisen. (C) Nachweis von TSG101-, CD9- und CD63-Expressionen in Exosomen mittels Western Blot. Diese Abbildung ist eine Adaption von Han, Y. D. et ^al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Während des formalen Versuchsprozesses sind mehrere Punkte entscheidend, um die besten experimentellen Ergebnisse zu erzielen. Aufgrund unserer bisherigen Erfahrungen wird empfohlen, sich für die Passage 3-6 ADSCs zu entscheiden, da diese den bestmöglichen Zellzustand gewährleisten. Vor P3 wurden rote Blutkörperchen, Endothelzellen und andere verschiedene Zellen möglicherweise nicht ausgesiebt. Nach P6 können die Zellen allmählich altern, was den Zustand der sezernierten EVs beeinflussen kann. Zweitens muss der Überstand entnommen werden, wenn der Zellkonfluenzgrad zwischen 80 % und 90 % liegt, um eine ausreichende Sekretion von so vielen EVs wie möglich zu gewährleisten. Um die maximale Reinheit von Elektrofahrzeugen zu erhalten, müssen die Forscher während der ersten drei Zentrifugationen vorsichtig sein und sicherstellen, dass keine Flüssigkeitsrückstände zurückbleiben, um das Ansaugen von Verunreinigungen und Pellets zu verhindern. Während der letzten beiden Zentrifugationen ist darauf zu achten, dass der Überstand vollständig entfernt wird, während das Pellet geschützt wird.

Die Ultrazentrifugation ist kostengünstig und erfordert keine weitere Behandlung. Diese Technik wurde häufig in EV-Studien eingesetzt und hat eine zufriedenstellende Effizienz bei der Gewinnung von EVs gezeigt, wie durch Charakterisierungsexperimente bestätigt wurde. Nichtsdestotrotz gibt es einige unvermeidliche Nachteile. Erstens ist die Rückgewinnungsrate der Elektrofahrzeuge gering. Zweitens neigen Elektrofahrzeuge dazu, sich manchmal zu aggregieren. Darüber hinaus können nicht-zelluläre Komponenten isoliert werden, und einige EVs können während des Prozesses platzen, was zu einer Ansammlung von Schmutz führt 14,15,16. Um diese Defekte zu beheben, konzentriert sich die Forschung hauptsächlich auf die Reinigung von Elektrofahrzeugen^12,13. Dieses Protokoll deckt jedoch den gesamten Prozess von der Zellkultur bis zur Exosomenreinigung ab, da wir glauben, dass der gesamte Prozess den Status und die Reinheit der endextrahierten EVs beeinflusst. Es ist entscheidend, die oben genannten Richtlinien während des Betriebs einzuhalten. Darüber hinaus kann die Entnahme von mehr Überständen und die Implementierung von 3D-Zellkulturen von Vorteil sein, da zahlreiche Studien gezeigt haben, dass die 3D-Kultur die Sekretion von EVs im Vergleich zur 2D-Kultur wirksamer stimuliert^17,18.

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Extraktion von EVs aus ADSCs mittels Ultrazentrifugation. Es bietet eine praktische Anleitung und ermöglicht es den Experimentatoren, Details während des Betriebs so weit wie möglich zu vermeiden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protokoll den Experimentatoren hilft, die Qualität der Proben zu verbessern, und uns daran erinnert, dass wir uns nicht nur auf die Details jedes Schritts konzentrieren sollten, sondern auch das Experiment als Ganzes betrachten sollten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Nadelfilter aus Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μ m
Basalmedium für die Zellkultur	OriCell	BHDM-03011
Fötales Rinderserum ohne EXO + Kulturzusatz (für humane mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe)	OriCell	HUXMD-05002
Inverses Mikroskop	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tisch-Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin-Lösung (100x)	Solarbio	P1410