Direkte mikrobielle Identifizierung mit einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem zur Erleichterung der EUCAST RAST-Methode ohne Massenspektrometrie

Summary

EUCAST hat ein Protokoll für direkte antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST) für automatisierte Blutkulturen entwickelt. Die Abhängigkeit von der massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierung kann jedoch durch die Verwendung eines direkten Inokulumvorbereitungsprotokolls in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem vermieden werden. Mit diesem Ansatz können AST-Berichte innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme bereitgestellt werden.

Abstract

Die gramnegative (GN) Sepsis ist ein medizinischer Notfall, bei dem sich die Behandlung in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen auf konventionelle mikrobiologische Kulturtechniken stützt, die innerhalb von 3-4 Tagen Ergebnisse liefern. In Anbetracht dieser Verzögerung in der Durchlaufzeit (TAT) haben sowohl EUCAST als auch CLSI Protokolle zur Bestimmung von AST-Ergebnissen direkt aus positiv gekennzeichneten automatisierten Blutkulturflaschen ("aBCs") entwickelt. Das EUCAST-Schnelltestprotokoll (RAST) wurde erstmals 2018 eingeführt, wobei Zonendurchmesser-Breakpoints für vier häufige ätiologische Erreger der GN-Sepsis, d. h. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii-Komplex , berichtet werden können. Diejenigen klinischen Laboratorien, die diese Methode in ihren routinemäßigen Arbeitsablauf implementiert haben, verlassen sich jedoch auf eine massenspektrometrische mikrobielle Identifizierung, die nicht ohne weiteres verfügbar ist, was ihre Implementierung in ressourcenbegrenzten Umgebungen ausschließt. Um dies zu umgehen, evaluierten wir ein direktes Inokulumprotokoll (DIP) unter Verwendung eines kommerziellen automatisierten mikrobiellen Identifizierungs- und antimikrobiellen Empfindlichkeitstestsystems (aMIAST), um eine frühzeitige mikrobielle Identifizierung innerhalb von 8 Stunden nach positiver Markierung von aBC zu ermöglichen. Wir haben dieses Protokoll von Januar bis Oktober 2023 ausgewertet, um die vier RAST-meldepflichtigen GN (RR-GN) im positiv gekennzeichneten aBC zu identifizieren. Die Ergebnisse der mikrobiellen Identifizierung in DIP wurden mit dem Standard-Inokulumvorbereitungsprotokoll (SIP) in aMIAST verglichen. Von 204 +aBCs mit monomorphem GN (+naBC) wurde eines der 4 RR-GN in 105 +naBCs mittels SIP identifiziert (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 und A. baumannii-Komplex : 26). Davon wurden 94 % (98/105) korrekt durch DIP identifiziert, während die Quoten für schwerwiegende Fehler und sehr große Fehler bei 6 % (7/105) bzw. 1,7 % (4/240) lagen. Wenn DIP zur mikrobiellen Identifizierung mit der EUCAST RAST-Methode durchgeführt wird, können innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der Probe vorläufige klinische Berichte erstellt werden. Dieser Ansatz hat das Potenzial, die TAT signifikant zu reduzieren und so eine frühzeitige Einleitung einer geeigneten antimikrobiellen Therapie zu ermöglichen.

Introduction

Sepsis, ein wichtiges globales Gesundheitsproblem, wird als lebensbedrohliche Organdysfunktion definiert, die auf eine fehlregulierte Wirtsreaktion auf eine Infektion zurückzuführen ist. Die Global Burden of Diseases Study schätzt, dass es im Jahr 2017 weltweit 48,9 Millionen Fälle von Sepsis und 11 Millionen sepsisbedingte Todesfälle gab, was fast 20 % aller weltweiten Todesfälle ausmachte¹. Etwa 2/^{3 der} Blutbahninfektionen (BSI), die zum Tod führen, sind auf gramnegative bakterielle Erreger zurückzuführen². Die Haupttodesursachen bei gramnegativen (GN) sind Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii, die bei 33 bakteriellen Erregern rund 40 % der Fälle ausmachen².

Blutkulturen sind nach wie vor der Goldstandard für die Diagnose von BSI, und eine schnelle mikrobielle Identifizierung zusammen mit den Ergebnissen von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests (AST) ist der Schlüssel zum Management. Es wurde geschätzt, dass die Mortalitätswahrscheinlichkeit um 9 % steigt, wenn die Verabreichung geeigneter antimikrobieller Mittel bei Sepsis³ stündlich verzögert wird. Die Durchlaufzeit (TAT) von mikrobiologisch positiven Blutkulturberichten mit AST-Ergebnissen beträgt mit den verfügbaren mikrobiologischen Werkzeugen in ressourcenbegrenzten Umgebungen, auch mit automatisierten Systemen, etwa 48-72 Stunden. Infolge dieser unterdurchschnittlichen TAT werden antimikrobielle Breitbandmittel empirisch eingesetzt, was zu dem aufkeimenden Problem der Antibiotikaresistenz (AMR) beiträgt. In Anbetracht dieser dringenden Notwendigkeit, die TAT für mikrobiologische Kulturtechniken für Sepsis zu reduzieren, gehen EUCAST und CLSI dazu über, AST direkt aus positiv gekennzeichneten Blutkulturflaschen (+aBC)^4,5 durchzuführen.

Im Jahr 2018 führte EUCAST erstmals die Rapid-AST-Methode (RAST) zur Bestimmung der AST nach der Kirby-Bauer-Scheibendiffusionsmethode bei kurzen Inkubationszeiten ein, d. h. 4 h, 6 h und 8 h, direkt ab +aBC ^6,7. Die Methode ist derzeit für die Bestimmung der AST für +aBCs validiert, die eine der 8 häufigsten Ursachen von BSI enthalten, nämlich E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii-Komplex bei gramnegativen und Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium und Streptococcus pneumoniae bei grampositiven Werten⁸. Die Breakpoints für die AST-Bestimmung in verschiedenen Zeitintervallen werden für die oben aufgeführten mikrobiellen Spezies angegeben. Daher ist vor der kategorischen Interpretation der AST-Ergebnisse eine mikrobielle Identifizierung erforderlich. Der RAST-Standard legt jedoch nicht fest, mit welcher Methode die mikrobielle Identifizierung innerhalb dieses Zeitrahmens möglich ist.

Die Mehrzahl der Studien, in denen die EUCAST-RAST-Methode in ihrem Umfeld evaluiert wurde, haben die massenspektrometrische mikrobielle Identifizierung nach kurzer Inkubation auf plattierten Medien verwendet, um Mikroorganismen zu identifizieren ^{9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Massenspektrometrische Instrumente sind jedoch nicht weit verbreitet, insbesondere in Ländern mit niedrigem bis mittlerem Einkommen (LMICs), was den potenziellen Nutzen dieser Methode stark einschränkt. Nur wenige Studien haben über die Implementierung dieser Methode in ihren Zentren ohne Massenspektrometrie berichtet 18,19,20. Tayşi et ^al.18 berichteten über eine breite Kategorisierung der GN unter Enterobacterales, Pseudomonas und Acinetobacter spp. basierend auf der Morphologie der Gramfärbung und dem Oxidase-Test, bevor die AST-Ergebnisse interpretiert wurden. In anderen Studien dieses Zentrums, von Gupta et ^al.19 und Siddiqui et ^al.20, wurde die mikrobielle Identifizierung auf Speziesebene durchgeführt, indem ein Bakterienpellet aus dem positiv markierten Blut-Brühe-Gemisch hergestellt und mit den herkömmlichen biochemischen Tests geimpft wurde. Während Tayşi et ^al.18 sich nicht zur Genauigkeit der mikrobiellen Identifizierung mit ihrem Ansatz äußerten, berichteten Gupta et ^al.19, dass mit ihrem Ansatz in 165/176 (94%) Fällen ein RAST-meldepflichtiger gramnegativer (RR-GN), d.h. entweder von E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii Komplex. Bei letzterem Ansatz erfolgte die Ablesung der RAST-Ergebnisse jedoch retrospektiv unter Verwendung von Grenzwerten mit einem Zonendurchmesser von 8 Stunden erst nach der vollständigen Inkubation der konventionellen biochemischen Ergebnisse, d. h. 18-24 Stunden nach der Inokulation, und die durchschnittliche Zeit für die Berichterstattung betrug etwa 2 Tage.

Um die TAT klinischer Berichte weiter zu reduzieren, schlagen wir eine alternative Methodik vor, die eine frühzeitige Identifizierung von GN in +aBCs mit aMIAST ermöglicht. Vor der Einführung von massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierungssystemen galten diese automatisierten Identifizierungssysteme als Standard für die mikrobielle Identifizierung, bei denen die Identifizierung durch kolorimetrische und/oder fluorometrische Veränderungen ermöglicht wurde, die durch Testbakterien induziert wurden, wenn sie in miniaturisierten biochemischen Tests in einer Kassette befunden und die Ergebnisse mit ihrer Isolatdatenbank abgeglichen wurden. Die durchschnittliche Zeit bis zur Identifizierung in diesen Systemen beträgt etwa 4 bis 8 Stunden, ist jedoch durch die Tatsache begrenzt, dass die Hersteller empfehlen, Mikroben über Nacht zu vermehren, bevor ihre jeweiligen Ausweise geimpft werden können. Diese Anforderung schränkt ihren Nutzen bei der Verkürzung der Zeit bis zur Berichterstellung stark ein.

Nur wenige Studien haben Methoden zur direkten Identifizierung von Mikroben aus +aBCs unter Verwendung dieser automatisierten Systeme^evaluiert 21,22,23,24,25,26,27. Im Fall von +aBCs, die monomorphe GN enthielten, zeigte die Mehrzahl der Studien eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen der direkten Inokulation mit Bakterienpellets aus positivem Blut-Brühe-Gemisch und der Standard-Kolonieinkubation. Bei den Grampositiven waren die Konkordanzraten jedoch suboptimal. Da die durchschnittliche Zeit bis zur Positivität von +aBCs zwischen 8 h und 16 h liegt und die Identifizierung von GN in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem ~4 h bis 8 h dauert, stellen wir die Hypothese auf, dass wir durch die Verwendung des direkten Inokulationsprotokolls bei der automatisierten mikrobiellen Identifizierung die klinische Befundung von +aBCs mit GN mit einem RR-GN innerhalb von 24 Stunden nach Probeneingang abschließen können.

Schauplatz für die Studie
Die vorliegende Studie wurde von Januar bis Oktober 2023 im klinischen Bakteriologielabor eines akademischen Instituts für tertiäre Versorgung von nationaler Bedeutung (INI) mit 950 Betten in Zentralindien durchgeführt. Das Labor ist mit einem kontinuierlichen Blutkulturüberwachungssystem (CBCMS) und aMIAST ausgestattet. Das bakteriologische Labor ist rund um die Uhr in Betrieb und steht Technikern und Mikrobiologen für die Bearbeitung und Meldung von positiv gekennzeichneten Blutkulturflaschen (+aBCs) zur Verfügung.

Hier eingesetzte mikrobielle Methoden
Der Arbeitsablauf der Studie ist in Abbildung 1 dargestellt. Die +aBCs, die monomorphe GNs (+naBC) zeigten, wurden durch direkte Inokulation der entsprechenden Identifikationskarten verarbeitet, um die Identifizierung und AST unter Verwendung des EUCAST-RAST-Protokolls zu ermöglichen. Diese Ergebnisse wurden mit der Standard-of-Care (SoC)-Methode für +aBCs verglichen, d.h. der Subkultivierung auf konventionellen plattierten Medien durch Schafblut-Agar (SBA), Schokoladen-Agar (CA) und MacConkey-Agar (MA), aerobe Inkubation für 16 bis 24 Stunden, gefolgt von Identifizierungs- und AST-Karten, die von aMIAST gegeben wurden, wenn isolierte Kolonien auftreten. Blutkulturen, die grampositive Kokken, grampositive Bazillen, knospende Hefezellen und ≥2 verschiedene Mikroorganismen auf der anfänglichen Grammfärbung oder plattierten Medien zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen.

Protocol

Die Studie, die durch das intramurale Forschungsstipendium finanziert wurde, das Dr. Ayush Gupta von AIIMS Bhopal gewährt wurde, wurde von der Institutionellen Ethikkommission für Menschen (IHEC) mit dem Schreiben Nr.: IHEC-LOP/2022/IL072 genehmigt.

HINWEIS: Es wurde ein Probenvolumen von 5 ml verwendet, basierend auf Studien von Quesada et ^al.25 und Munoz-Davila et ^al.27.

1. Standard-Inokulumprotokoll (SIP) für die Identifizierung von Bakterien mit aMIAST

1. Tragen Sie saubere Handschuhe und desinfizieren Sie das Septum von +naBC in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse IIa (BSC) mit einem Tupfer mit 70% Isopropylalkohol.
2. Entnehmen Sie ca. 1 ml Blut-Brühe-Gemisch mit einer sterilen Spritze und einer 21-G-Nadel.
3. Geben Sie 1 großen Tropfen des Blut-Brühe-Gemisches von der Nadel auf die Oberfläche des plattierten Mediums, nämlich SBA, CA und MA. Die Platten durchstreichen und die Kulturplatten in einem Inkubator bei 37 °C ± 2 °C unter aeroben Bedingungen 18-24 h inkubieren.
4. Nach der Inkubation untersuchen Sie die Platten auf das Auftreten isolierter Kolonien in einem BSC und fahren Sie mit der Identifizierung und AST durch aMIAST fort.
5. Legen Sie für jedes Isolat ein aMIAST-Polystyrolröhrchen in den aMIAST-Röhrchenständer und fügen Sie 3 ml sterile Kochsalzlösung mit einem an der Kochsalzflasche befestigten Spender hinzu.
6. Berühren Sie drei bis fünf morphologisch ähnliche Kolonien mit einem sterilen geraden Impfdraht und geben Sie das bakterielle Inokulum in das erste Röhrchen.
7. Stellen Sie die Trübung mit steriler Kochsalzlösung im inokulierten Röhrchen zwischen 0,47 und 0,63 McFarland mit einem Densitometer ein.
8. Legen Sie den Kapillaraufsatz des gramnegativen aMIAST-Ausweises in das erste Röhrchen.
9. Legen Sie die ausgewählten Karten an einer geeigneten Position auf der Kassette ab. Das Inokulum in der Kassette ist fertig und kommt in die aMIAST in der Füllsektion.
   ACHTUNG: Das Alter der Suspendierung darf 30 Minuten vor der Impfung der Karten nicht überschreiten.
10. Legen Sie die Kassette mit dem Proben-Barcode nach innen in ihre Position in der Füllkammer ein.
11. Schließen Sie die Tür, und drücken Sie auf dem Bildschirm der Benutzeroberfläche auf Füllen . Die Befüllung erfolgt in einem 70-s-Zyklus. Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, blinkt die blaue Kontrollleuchte am System. Durch das Einlegen der Karten in das aMIAST-System wird das Inokulum in den kleinen Kammern der Karten durch die Maschine verteilt.
12. Nehmen Sie die Kassette aus der Füllkammer, schließen Sie die Tür und legen Sie sie in die Ladekammer. Barcodes werden automatisch gescannt und mit der elektronischen Arbeitsliste der virtuellen Kassette abgeglichen. Die Strohhalme werden automatisch versiegelt und die Karten automatisch in das Karussell geladen. Ein blinkender blauer Pfeil auf dem aMIAST zeigt an, dass der Ladevorgang abgeschlossen ist.
13. Entfernen Sie den Kassettenabfall, wenn Sie fertig sind. Weitere Informationen finden Sie unter Abfallentsorgungsverfahren in der Produktliteratur oder befolgen Sie andere Standardverfahren. Verwenden Sie den Rest der Suspension in den Röhrchen zur Subkultur auf CLED-Agar zur Reinheitsprüfung der Isolate.
14. Lesen Sie die Ergebnisse ab, nachdem das Gerät die Analyse abgeschlossen hat.

2. Direktes Inokulumprotokoll (DIP) zur Identifizierung von Bakterien mit aMIAST

1. Tragen Sie sterile Handschuhe und reinigen Sie in einer Biosicherheitswerkbank das Septum von +naBC mit einem Tupfer mit 70% Isopropylalkohol.
2. Entnehmen Sie mit einer sterilen Spritze mit einer 21-G-Nadel 5 ml Aliquot aus dem Blut-Brühe-Gemisch von +naBC und überführen Sie es in ein Serum-Separatorröhrchen (SST), nachdem Sie das Gummiseptum mit 70%igem Isopropylalkohol desinfiziert haben (Abbildung 2A).
3. Zentrifugieren Sie dieses Aliquot für 10 min bei 160 x g , um die Blutzellen in der Blut-Brühe-Mischung abzusetzen. Beobachten Sie nach der ersten Zentrifugation den Überstand, in dem sich die Blutzellen ansiedeln.
4. Öffnen Sie die Kappe des Fläschchens in einer Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie mit einer sterilen Spitze und Pipette vorsichtig den Überstand und übertragen Sie ihn in ein neues reines Blutentnahmefläschchen (roter Oberteil), indem Sie dessen Deckel entfernen.
5. Setzen Sie die Kappe auf das Fläschchen und zentrifugieren Sie sie erneut 10 min lang bei 2000 x g. Nach der zweiten Zentrifugation bildet sich am Boden ein Bakterienpellet.
6. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn mit einer sterilen Pipette und Spitze. Das Bakterienpellet verbleibt am Boden des Röhrchens und wird zur Impfung des aMIAST-Ausweises verwendet.
   HINWEIS: Bei der ersten Zentrifugation wurde ein Serumseparatorröhrchen mit 160 x g verwendet. Dies basierte auf Studien von Quesada et ^al.25 und Munoz-Davila et ^al.27_, bei denen der erste Zentrifugationsschritt bei etwa 30 x g bzw. 60 x g durchgeführt wurde. Das Blut-Brühe-Gemisch aus einem +aBC wurde zunächst bei niedriger Geschwindigkeit in einem SST zentrifugiert, um die Blutzellen herauszupelletieren.
7. Legen Sie ein aMIAST-Polystyrolröhrchen in den aMIAST-Röhrchenständer und geben Sie 3 ml sterile Kochsalzlösung mit einem Spender, der an der Kochsalzflasche befestigt ist, hinein.
8. Entnehmen Sie mit einer sterilen Impfschlaufe das Bakterienpellet vom Boden des Fläschchens und impfen Sie es in das aMIAST-Röhrchen
9. Wiederholen Sie die Schritte 1.7-1.14.

3. AST durch EUCAST RAST-Protokoll⁴

1. Halten Sie unbeimpfte 90 mm kreisförmige Mueller-Hinton-Agar (MHA)-Platten in der Biosicherheitswerkbank bereit.
2. Tragen Sie sterile Handschuhe und reinigen Sie in einer Biosicherheitswerkbank das Septum von +naBC mit einem Tupfer mit 70% Isopropylalkohol.
3. Mit einer sterilen Spritze 125 μl ± 25 μl unverdünntes Blut-Brühe-Gemisch aus +naBC aspirieren und zu jeder MHA-Platte in der Mitte hinzufügen.
4. Verteilen Sie die Brühe mit einem sterilen Wattepad in drei Richtungen vorsichtig auf den Platten und tragen Sie ≤ 6 antimikrobielle Scheiben auf jede Platte auf.
5. Inkubieren Sie die Platten in einem aeroben Inkubator bei 35 °C± 1 °C für 8 h. Beobachten Sie nach Abschluss der Inkubation die Reinheit des Isolats.
6. Lesen Sie die Hemmzonen bei 8 h ± 5 min ab. Interpretieren Sie die Ergebnisse mit der RAST-Breakpoint-Tabelle für die kurze Inkubation, nachdem Sie die Ergebnisse der bakteriellen Identifizierung im aMIAST überprüft haben.
7. AST-Ergebnisse werden nur dann gemeldet, wenn das Isolat als eines der RR-GN identifiziert wurde und die MHA- und CLED-Platten einen einzelnen Morphotyp aufweisen.

4. Qualitätskontrolle

1. Führen Sie eine interne Qualitätskontrolle für das SIP-Protokoll von aMIAST gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der empfohlenen Referenzstämme durch.
2. Führen Sie wöchentlich eine interne Qualitätskontrolle der RAST-Methode mit dem empfohlenen Referenzstamm von E. coli durch, wie unten beschrieben.
   1. Ordnen Sie 4 sterile Glasröhrchen in einem Röhrchenständer an. Geben Sie 3 ml sterile Kochsalzlösung in das erste Röhrchen und 990 μl sterile Kochsalzlösung in jedes der zweiten, dritten und vierten Röhrchen ab.
   2. Machen Sie eine 0,5 McFarland-Suspension des QC-Stammes aus den isolierten Kolonien einer Übernachtkultur auf plattierten Medien.
   3. Übertragen Sie mit einer sterilen Pipette und Spitze 10 μl Suspension aus dem ersten Röhrchen in das zweite Röhrchen.
   4. Nach dem Mischen werden 10 μl Suspension vom zweiten in das dritte Röhrchen und anschließend in das letzte Röhrchen überführt.
   5. Entnehmen Sie aus dem letzten Röhrchen 1 ml des Inokulums mit einer sterilen Spritze mit einer Nadel und geben Sie es in ein nicht beimpftes aBC.
   6. Geben Sie gleichzeitig 5 ml steriles Schafsblut mit einer sterilen Spritze mit einer Nadel in das BC und inkubieren Sie es im CBCMS, bis es aufgrund einer Farbänderung des Flüssigkeitsemulsionssensors an der Basis des aBC positiv ist.
   7. Wiederholen Sie die Schritte wie in den Schritten 1-3 für die Identifizierung durch SIP, DIP bzw. RAST. Die erwarteten Ergebnisse sind, dass der QC-Stamm durch beide Identifizierungsprotokolle des aMIAST korrekt identifiziert werden sollte und die Zonendurchmesser in den RAST-Platten innerhalb des spezifizierten Bereichs²⁸ liegen sollten.

5. Statistische Analyse

1. Betrachten Sie die mikrobielle Identifizierung mit SIP als Goldstandard, und wenn die gleiche Identifizierung durch DIP erreicht wird, betrachten Sie sie als konkordant.
2. Wenn ein RR-GN, d. h. einer der E. coli-, K . pneumoniae-, P . aeruginosa- und A. baumannii-Komplexe , die mittels SIP identifiziert wurden, im DIP diskordant ist, betrachten Sie dies als schwerwiegenden Fehler (ME), während Sie das Gegenteil als sehr schwerwiegenden Fehler (VME) betrachten, da dies das Potenzial hat, einen Bericht mit falscher Identifizierung auszustellen.
3. Berechnen Sie die Konkordanzrate für RR-GN als das Verhältnis der Gesamtzahl der konkordanten RR-GN zur Gesamtzahl der durch SIP identifizierten RR-GN multipliziert mit 100.
4. Berechnen Sie die ME-Rate als das Verhältnis der Anzahl der +naBCs, die als Nicht-RR-GN identifiziert wurden, zur Gesamtzahl der +naBCs mit RR-GN, die durch SIP identifiziert wurden, multipliziert mit 100.
5. Berechnen Sie die VME-Rate als das Verhältnis der Anzahl der +naBCs, die fälschlicherweise als RR-GN in DIP identifiziert wurden, zur Gesamtanzahl. von +naBCs, die mit DIP getestet wurden, multipliziert mit 100.
6. Berechnen Sie die Zeit bis zur Isolatidentifikation (TTI) als die Zeit, die benötigt wird, um das Isolat nach beiden Protokollen ab dem Zeitpunkt der Blutkulturkennzeichnung durch das CBCMS zu identifizieren.
7. Berechnen Sie die Differenzen zwischen DIP und SIP als Reduktion des TTI. Berechnen Sie dies nur für die konkordanten +naBCs mit einem RR-GN. Notieren Sie sich die jeweiligen Zeitpunkte aus den Uhren von CBCMS und aMIAST.
8. Verwalten Sie Daten und analysieren Sie sie mithilfe einer Tabelle. Verwenden Sie den Mann-Whitney-U-Test für stetige Variablen, wobei ein beidseitiger p-Wert von ≤ 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird.

Results

Allgemeine Ergebnisse
Während des Studienzeitraums wurden 240 +naBCs mittels aMIAST sowohl mit DIP als auch mit SIP identifiziert. Davon erwiesen sich 15% (36/240) +naBCs nach nächtlicher Inkubation auf den plattierten Medien als polymikrobiell. Von den 204 +naBCs betrug der Anteil der mittels SIP identifizierten RR-GN 51,5 % (105/204). Davon entfielen 47,6 % (50/105) auf E. coli, 19 % (20/105) auf K. pneumoniae, 8,6 % (9/105) auf P. aeruginosa und 24,8 % (26/105) auf den A. baumannii-Komplex . Eine detaillierte Beschreibung aller Identifikationsergebnisse per SIP finden Sie in Tabelle 1.

Diagnostische Genauigkeit bei der mikrobiellen Identifizierung
Von 105 RR-GN stimmten 98 (93,3%) bzw. 99 (94,2%) mit dem DIP überein, bis zur Identifizierung auf Art- bzw. Gattungsebene. Die organismusbezogenen Konkordanzraten betrugen 94 % (47/50) für E. coli, 90 % (18/20) für K. pneumoniae, 100 % (9/9) für P. aeruginosa und 92,3 % (24/26) für den A. baumannii-Komplex , wie in Tabelle 1 gezeigt. Bei 7 +naBCs waren die Ergebnisse bis zur Identifizierung auf Speziesebene mittels DIP uneinheitlich, wobei aMIAST entweder eine nicht identifizierte (3) ergab oder eine Non-RR-GN (4) identifizierte, wie in Tabelle 2 gezeigt. Da diese Ergebnisse den klinischen Mikrobiologen nicht zu einem Bericht zwingen, wurden sie als schwerwiegende Fehler (ME) angesehen. Die ME-Rate in unserer Studie betrug 6,7% (7/105) bis zur Identifizierung auf Artebene. Der Anteil der Nicht-RR-GN in der aMIAST per SIP betrug 48,5 % (99/204). Von ihnen waren 60 (60,6 %) durch DIP-Tire-Identifizierung auf Artebene übereinstimmend. Unter 99 Nicht-RR-GNs wurde eine RR-GN mittels DIP in 4 +naBCs identifiziert, wie in Tabelle 2 gezeigt. Eine solche Diskordanz hätte zu einem Meldefehler führen können und wurde als Very Major Error (VME) angesehen. Die Gesamt-VME-Rate mit DIP betrug 1,7 % (4/240). Eine vollständige Beschreibung der Identifizierungsergebnisse und Fehler aller Grammnegative ist in der Ergänzenden Tabelle 1 enthalten.

Verkürzung der Zeit bis zur Isolierung der Identifizierung (TTI)
Der TTI von konkordanten +naBCs in DIP war signifikant niedriger als der TTI in SIP (Median (IQR): 507,5 min (685-404) vs 2171 min (2532-1855), P2 vs P1, p<0,00001 (Mann-Whitney-Test)). Die mediane Differenz in der TTI zwischen beiden Protokollen betrug 1635 min (IQR: 1964-1299).

Abbildung 1: Arbeitsablauf der Studie: Darstellung des Arbeitsablaufs in der Studie für positiv markierte Blutkulturflaschen mit monomorphen Grammnegativen, die sowohl nach dem Standard- als auch nach dem direkten Inokulumprotokoll verarbeitet werden. Abkürzungen: +aBC = positiv markierte Blutkulturflasche, +naBC = positiv markierte Blutkulturflasche mit monomorphen gramnegativen Werten, DIP = Direktes Inokulum-Protokoll, SIP = Standard-Inokulum-Protokoll, SBA = Schafblut-Agar, CA = Schokoladen-Agar, MA = MacConkey-Agar, RR-GN = RAST meldepflichtig gram-negativ, TAT = Bearbeitungszeit Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Direktes Inokulumprotokoll zur bakteriellen Identifizierung: Darstellung von Bildern der Fläschchen während der Durchführung des direkten Inokulumprotokolls. Abkürzungen: +naBC = positiv markierte Blutkulturflasche mit gramnegativen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

RAST Meldepflichtige Gramnegative	Getestete Isolate (n)	Übereinstimmend	Falsche Identifizierung	Keine Identifizierung
		n (%)	n (%)	n (%)
Gesamt	105	98 (93.3%)	4 (3.8%)	3 (2.8%)
Escherichia Coli	50	47 (94%)	1	2
Klebsiella pneumoniae	20	18 (90%)	1	1
Acinetobacter baumannii-Komplex	26	24 (92.3%)	2#	0
Pseudomonas aeruginosa	9	9 (100%)	0	0
# Ein Isolat wurde korrekt auf Gattungsebene, aber nicht auf Artebene identifiziert (Acinetobacter baumannii-Komplex , identifiziert als A. haemolyticus)

Tabelle 1: Ergebnisse der bakteriellen Identifizierung im direkten Inokulumprotokoll. Die Ergebnisse beziehen sich nur auf RAST-meldepflichtige Gramnegative. Abkürzungen: n = Zähler, % = Prozent.

Gram-Negative	Gesamtzahl der getesteten Isolate	Schwerwiegender Fehler			Sehr schwerwiegender Fehler, n (%)
		Zahl	Falsche Identifizierung	Kein Ausweis	(identifiziert als)
		n (%)	n	n
Escherichia Coli	50	3 (6%)	1 (A. haemolyticus)	2	0
Klebsiella pneumoniae	20	2 (10%)	1 (Ralstonia pickettii)	1	0
Acinetobacter baumannii-Komplex	26	2 (7.7%)	2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)	-	0
Salmonella spp.	10	NA			1 (10%)
					(E. coli)
Enterobacter-Cloacae-Komplex	8	NA			1 (12.5%)
					(E. coli)
Acinetobacter lwoffi	14	NA			1 (7.1%)
					(A. baumannii-Komplex)
Sphingomonas paucimobilis	9	NA			1 (11.1%)
					(K. pneumoniae)
Abkürzungen - n: Zähler, %: Prozent, ID: Identifikation, NA: nicht zutreffend,
A: Acinetobacter, E: Escherichia, K: Klebsiella

Tabelle 2: Einzelheiten zu den wichtigsten und sehr großen Fehlern durch das direkte Inokulumprotokoll. Abkürzungen: n = Zähler, % = Prozent, ID = Identifikation, NA = nicht zutreffend, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.

Ergänzende Tabelle 1: Detaillierte Ergebnisse der Organismenidentifikation in beiden Protokollen sowie Ergebnisse von Fehlern im direkten Inokulumprotokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Mittels DIP ist es uns gelungen, die RR-GNs mit hoher diagnostischer Genauigkeit zu identifizieren. Der mittlere TTI nach positiver Markierung des aBC betrug nur 507 min (~ 8,5 h). In Verbindung mit der EUCAST-RAST-Methode zur AST-Bestimmung kann es eine Isolatidentifizierung bei einer AST-Lesezeit von 8 h ermöglichen. Dieser Ansatz hat das Potenzial, die EUCAST-RAST-Methode zu implementieren, wodurch eine massenspektrometrische Identifizierung überflüssig wird. Dies ist ein Segen für ressourcenarme Einrichtungen, die die EUCAST RAST-Methode in ihren routinemäßigen Arbeitsablauf implementieren möchten, um die Zeit für die klinische Befundung zu verkürzen und die größten Hindernisse für die Implementierung zu umgehen.

Vor der Einführung der EUCAST-RAST-Methode haben mehrere Autoren die Genauigkeit der direkten Tests von +aBC für verschiedene aMIAST-Systeme 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31 bewertet. In diesen Studien unterschieden sich die direkten Testprotokolle dahingehend, dass sie entweder einer Einzelzentrifugenstufe 29,30,31,32 oder einer Doppelzentrifuge der Stufe 21,22,24,25,26,27 folgten zur Herstellung des Bakterienpellets. Bei der einstufigen Methode wurde das Blut-Brühe-Gemisch aus einem +aBC bei hoher Geschwindigkeit in einem Serum-Separatorröhrchen (SST) zentrifugiert, um die Bakterien über der Silikongelschicht zu pelletieren. Das Pellet wurde verwendet, um das Inokulum für die Inokulation von Ausweisen vorzubereiten. Bei der Doppelzentrifugationsmethode wurde das Blut-Brühe-Gemisch aus einem +aBC zunächst bei niedriger Geschwindigkeit in einem SST zentrifugiert, um die Blutzellen herauszupelletieren. Aus diesem Röhrchen wurde der bakterienhaltige Überstand entfernt und in ein neues Röhrchen überführt und mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Aus diesem Röhrchen wurde der Überstand verworfen und das Kügelchen zur Impfung der entsprechenden Ausweise verwendet. In diesen Studien schwankte die Konkordanzrate zwischen 62 % und 100 %, aber im Allgemeinen war die Genauigkeit bei der Doppelzentrifugationsmethode höher.

Wir stellten fest, dass die Methode einfach durchzuführen war und in einem Routinediagnostiklabor mit einer Belegschaft von >10 Labortechnikern im Rotationsmodus durchgeführt wurde, was die Robustheit der Methode beweist. In ~94% (98/105) +naBCs, die eine der RR-GN enthielten, identifizierte der DIP den Mikroorganismus korrekt. Die Konkordanzrate für die verschiedenen Organismenkategorien war ebenfalls vergleichbar, da sie 94 %, 90 %, 100 % bzw. 92,3 % für E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii-Komplex betrug. Wir fanden auch heraus, dass die Gesamtkonkordanzrate für alle gramnegativen Werte suboptimal war, ~77% (157/204). Die meisten dieser Fehlidentifikationen betrafen jedoch nicht-fermentative gramnegative Substanzen wie Acinetobacter spp. mit Ausnahme des Baumannii-Komplexes, Pseudomonas spp. mit Ausnahme von aeruginosa, Moraxella spp. und Sphingomonas paucimobilis, die normalerweise als häufige Verunreinigungen der Haut angesehen werden. Fehlidentifikationen mit nicht-fermentativen Gramnegativen wurden auch von anderen Autoren festgestellt^21,23, was wahrscheinlich auf die geringe Reaktivität dieser Bakterien in den aMIAST-Identifikationskarten zurückzuführen ist.

Wir fanden eine signifikante Reduktion der TTI von Bakterien innerhalb der +naBCs unter Verwendung von DIP. Die mediane TTI der DIP war etwa 4-mal niedriger als die mediane TTI der SIP (507 min vs. 2171 min), wenn sie in einem routinemäßigen klinischen Diagnoselabor durchgeführt wurde. Dieser TTI von ~8,5 h beinhaltete auch das Intervall zwischen der positiven Markierung des aBC und der Durchführung der Inokulation der aMIAST-Karte, da die mittlere Zeit für die Isolierung der Analyse durch aMIAST nur 5,45 h ± 1,6 h betrug. Addiert man die mittlere Zeit zur Positivität von 728 min ± 301 min (~12 h) für konkordante +naBCs in unserer Studie, hat dieser Ansatz der bakteriellen Identifizierung das Potenzial, nach Erhalt des aBC in einem routinemäßigen diagnostischen Labor noch am selben Tag zu berichten.

Es gibt auch gewisse Einschränkungen beim DIP. Erstens, da es sich um eine Off-Label-Anwendung der Inokulumaufbereitung handelt, sollten die Ergebnisse als vorläufig angesehen werden, ebenso wie die AST-Ergebnisse von EUCAST RAST. Nichtsdestotrotz dient es dem Hauptzweck, nur die RR-GNs mit erheblicher diagnostischer Genauigkeit rechtzeitig zu identifizieren. Zweitens besteht die praktische Möglichkeit der Verschwendung von Testressourcen, wie bei etwa 60 % +naBCs; wir hätten weder aufgrund polymikrobieller Infektionen noch aufgrund der Identifizierung einer Nicht-RRGN berichten können. Diese Verschwendung von Ressourcen gilt für alle neueren automatisierten direkten AST-Methoden für Blutkulturen. Drittens war die Rate polymikrobieller Infektionen und die Identifizierung häufiger Hautverunreinigungen in dieser Studie aufgrund schlechter Probenentnahmepraktiken höher. Viertens haben wir die Identität der getesteten Isolate nicht mit der Massenspektrometrie bestätigt, die derzeit der Goldstandard für die Identifizierung von Bakterien ist.

Diese Studie zeigt erfolgreich, dass es auch mit phänotypischen Tests möglich ist, positive Blutkulturen, insbesondere bei gramnegativer Bakteriämie, noch am selben Tag zu melden. Dies hat das Potenzial, die Dauer bis zum Beginn einer geeigneten antimikrobiellen Therapie in den LMICs, in denen die mikrobiologische Diagnostik zur bakteriellen Identifizierung und AST stark auf konventionelle phänotypische Tests angewiesen ist, erheblich zu verkürzen. Dieser Ansatz sollte durch die Durchführung einer multizentrischen Studie validiert werden, und seine potenziellen Auswirkungen auf die Patientenergebnisse sollten als antimikrobielles Stewardship-Instrument im Mittelpunkt zukünftiger klinischer Studien in LMICs stehen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass DIP für aMIAST die EUCAST-RAST-Methode ergänzt, um eine frühzeitige Identifizierung von RR-GNs zu ermöglichen. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, sich auf fortschrittliche mikrobielle Identifizierungs- und AST-Techniken zu verlassen, da die Zeit für die Berichterstattung mit diesen Ansätzen mit diesem Ansatz vergleichbar ist. Bei gramnegativen Bakterien ist eine Meldung am selben Tag mit herkömmlichen phänotypischen Methoden möglich, wenn diese maximal optimiert werden. Dies hat das Potenzial, die Dauer der antimikrobiellen Breitbandbehandlung zu verkürzen und den verantwortungsvollen Umgang mit antimikrobiellen Wirkstoffen in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen zu erleichtern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMIKROBIELLE SCHEIBEN
Amikacin Scheibe 30 & Mikro; g	Himedia, Mumbai, Indien	SD035-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Amoxyclav-Scheibe (20/10 & Mikro; g)	Himedia, Mumbai, Indien	SD063-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Cefotaxim-Scheibe 5 & Mikro; g	Himedia, Mumbai, Indien	SD295E-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Ceftazidim Scheibe 10 &Mikro; g	Himedia, Mumbai, Indien	SD062A-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Ciprofloxacin-Scheibe (5 & Mikro; g)	Himedia, Mumbai, Indien	SD060-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Co-Trimoxazol-Scheibe (23,75/1,25 &Mikro; g)	Himedia, Mumbai, Indien	SD010-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Gentamicin disk 10 µ g	Himedia, Mumbai, Indien	SD016-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Imipenem Scheibe 10 µ g	Himedia, Mumbai, Indien	SD073-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Levofloxacin Disk 5 & Mikro; g	Himedia, Mumbai, Indien	SD216-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Meropenem disk 10 µ g	Himedia, Mumbai, Indien	SD727-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Piperacillin-Tazobactam-Scheibe (30/6 &Mikro; g)	Himedia, Mumbai, Indien	SD292E-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Tobramycin Scheibe 10 &Mikro; g	Himedia, Mumbai, Indien	SD044-1VL	Antimikrobielle Empfindlichkeitstests
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Empfohlener gramnegativer Bakterienstamm für die Qualitätskontrolle in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Frankreich	412CM8423	Kontinuierliches automatisiertes Blutkultursystem
Biosicherheitswerkbank II Typ A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, Indien	DFP-2/21-22/149	Zum Schutz vor gefährlichen und infektiösen Erregern und zur Aufrechterhaltung der Qualitätskontrolle
Blut-Agar-Basis Nr. 2	Himedia, Mumbai, Indien	M834-500G	Zubereitung von Blutagar und Schokoladenagar
Klinisches Zentrifugenmodell SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, Indien	HLL/2021-22/021	Zentrifugation bei niedriger und hoher Geschwindigkeit zur Trennung des Überstands
Dispensette S Analog einstellbarer Flaschenaufsatz-Dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Genaue Dosierung von Kochsalzlösung
MacConkey Agar	Himedia, Mumbai, Indien	M008-500G	Differenzialmedien für Laktose-Fermenter/Nicht-Fermenter Gramnegative Bazillen-Mikropipette
(100-1000 & Mikro; L)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, Indien	NJ478162	Übertragen des Überstands nach der ersten Zentrifugation, Verwerfen des Überstands nach der zweiten Zentrifugation
Mikropipettenspitzen (200-1000 µ L)	‎ Tarsons Products Pvt. Ltd., Kalkutta, Indien	521020	Übertragen des Überstands nach der ersten Zentrifugation, Verwerfen des Überstands nach der zweiten Zentrifugation
Mueller-Hinton-Agar;	Himedia, Mumbai, Indien	M173-500G	Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung durch Kirby-Bauer-Methode der Scheibendiffusion
Nichrome-Schleife D-4	Himedia, Mumbai, Indien	LA019	Zum Streifen auf Nährmedien
Nichrome-gerader Draht	Himedia, Mumbai, Indien	LA022	Für die Stichimpfung
Nulife sterile Handschuhe	MRK Healthcare Pvt Limited, Mumbai, Indien		Für die Sicherheit Vorsichtsmaßnahmen
Einfaches Fläschchen (Fläschchen mit rotem Deckel), Advance BD Vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Gewinnung von Pellets nach zweiter Zentrifugation
Schafsblut	Labline Trading Co., Hyderabad, Indien	70014	Zubereitung von Blutagar und Schokoladenagar
SST II Röhrchen, Advance BD Vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Überstandstrennung in der ersten Zentrifugation
Steriles Wattestäbchen (mit Holzstäbchen)	Himedia, Mumbai, Indien	PW005-1X500NO	Rasenkultur mit Blutkulturbrühe für antimikrobielle Empfindlichkeitstests
Sterile Injektionsspritze zum Einmalgebrauch 5 ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, Indien	2213805NB2	Vorbereitung von Aliquoten aus +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland Referenzkit	bioMérieux, Marcy d' Etoille, Frankreich	422219	Densitometer zur Überprüfung der Trübung der
(0,45 % NaCl)	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Frankreich	V1204	Einstellung des McFarland Standard
	bioMérieux, Marcy d' Etoille, Frankreich	533306-4 REV	Ständer für die korrekte Platzierung der Röhrchen vor der Impfung mit dem Ausweis
VITEK Röhrchen	bioMérieux, Marcy d' Etoille, Frankreich		Röhrchen für die Inokulumvorbereitung
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Frankreich	VKC15144	Automatisiertes Identifikations- und AST-System
VITEK-2 GN-Karte	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Frankreich	21341	Identifizierung von gramnegativen Bazillen