Methodenartikel

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

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DOI:

10.3791/66589

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24. Mai 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Vorbereitung von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie, wobei der Schwerpunkt auf den strukturellen Merkmalen retinaler Photorezeptorterminalien liegt.

Zusammenfassung

Die Volumenelektronenmikroskopie (Volume EM) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um die 3D-Struktur von Zellen und Geweben mit Präzision im Nanometerbereich zu visualisieren. Innerhalb der Netzhaut bauen verschiedene Arten von Neuronen synaptische Verbindungen in den inneren und äußeren plexiformen Schichten auf. Während herkömmliche EM-Techniken wertvolle Einblicke in subzelluläre Organellen der Netzhaut geliefert haben, liegt ihre Einschränkung in der Bereitstellung von 2D-Bilddaten, die genaue Messungen behindern können. Zum Beispiel ist die Quantifizierung der Größe von drei verschiedenen synaptischen Vesikelpools, die für die synaptische Übertragung entscheidend sind, in 2D eine Herausforderung. Volume EM bietet eine Lösung, indem es großflächige, hochauflösende 3D-Daten bereitstellt. Es ist erwähnenswert, dass die Probenvorbereitung ein kritischer Schritt bei der Volumen-EM ist, der sich erheblich auf die Bildschärfe und den Kontrast auswirkt. In diesem Zusammenhang skizzieren wir ein Probenvorbereitungsprotokoll für die 3D-Rekonstruktion von Photorezeptor-Axonendigungen in der Netzhaut. Dieses Protokoll umfasst drei wichtige Schritte: Netzhautdissektion und -fixierung, Probeneinbettungsprozesse und Auswahl des interessierenden Bereichs.

Einleitung

Die Netzhaut ist dicht gepackt mit ineinander verschlungenen neuronalen Axonen und Dendriten, die Synapsen zwischen ihnen bilden1. Die Mikroskopie ist ein unverzichtbares Werkzeug für die Untersuchung der Netzhautanatomie, da sie feine, komplizierte und kleine Strukturen aufweist. Obwohl die Elektronenmikroskopie (EM) eine beispiellose Leistung bietet, um die Ultrastruktur subzellulärer Organellen und die genaue Lokalisierung spezifischer Proteine auf Nanometerebene2 zu untersuchen, erzeugt sie Bilder, die auf die zweidimensionale (2D) Ebene beschränkt sind, was zu einem potenziellen Verlust wichtiger Informationen führt.

Die Entwicklung neuer hochauflösender Techniken der Volumenelektronenmikroskopie (Volume EM) unterstützt die Bereitstellung umfassenderer und größerer dreidimensionaler (3D) Strukturinformationen. Einige 3D-EM-Methoden wurden kürzlich von anderen überprüft 3,4,5. 3D-EM ermöglicht die Rekonstruktion von neuronalen Form- und Konnektivitätsdetails und ermöglicht so eine präzise quantitative Analyse von Strukturen, die von Interesse sind. Dies zeigt, dass die von Volume EM erhaltenen Daten systematischer, vollständiger und genauer sind.

Retinale Photorezeptoren, die die ersten Neuronen der visuellen Signalübertragung bilden 6,7, etablieren Synapsen mit Dendriten von bipolaren und horizontalen Zellen zweiter Ordnung im Terminal des Photorezeptors, um exzitatorische Signale zu erleichtern 8,9. Diese Terminals, die als Kegelstiele und Stäbchenkügelchen bezeichnet werden, umfassen drei entscheidende Komponenten: Mitochondrien, synaptische Bänder und synaptische Vesikel. Während sich frühere Studien überwiegend auf die allgemeine Struktur von Bandsynapsen konzentriert haben, gab es einen bemerkenswerten Mangel an Untersuchungen über die Feinstruktur der Hauptkomponenten, einschließlich Mitochondrien, Bänder, Vesikelpools und ihrer räumlichen Organisation in den Terminals 10,11,12,13. Eine präzise und systematische Analyse jeder Komponente, zusammen mit einem Verständnis ihrer Assoziation innerhalb der Photorezeptor-Terminals, ist von entscheidender Bedeutung, um die räumliche Organisation zu entschlüsseln und die visuellen Verarbeitungsfunktionen umfassend zu erfassen. Bei Photorezeptoren sind Mitochondrien hauptsächlich im inneren Segment, im Zellkörper und im Terminal vorhanden. Wir konzentrierten uns hier auf die Mitochondrien in den terminalen Photorezeptoren. Die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM), eine Art von Volumen-EM mit hoher Auflösung (x-, y- und z-Auflösung < 5 nm) und einem relativ großen Volumenfluss 4,14, ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genauen Visualisierung der 3D-Struktur von Photorezeptor-Terminals.

Sowohl das FIB-SEM als auch das Serial Block Face Scanning Electron Microscope (SBF-SEM) sind Volumen-EM auf Basis von REM zur Gewinnung von Bildern von Geweben durch Abtasten der Oberfläche der Probe. Die ultrastrukturellen Merkmale der Oberfläche einer Probe werden durch den Kontrast sichtbar, der durch die Intensität der sekundären oder rückgestreuten Elektronen (BSE) erzeugt wird, wenn der Elektronenstrahl die Probeabtastet 15. Im Wesentlichen ermöglicht der Nachweis von BSE oder Sekundärelektronen aus der Querschnittsoberfläche einer in Harz eingebetteten Gewebeprobe im REM die Gewinnung von Bildern der eingebetteten Probe16,17. Wenn BSE oder Sekundärelektronen weniger erzeugt werden, können nur Informationen über die Probenoberfläche gewonnen werden. Um einen konsistenten Kontrast und qualitativ hochwertige Serienbilder zu erzielen, ist eine ausreichende Ablagerung von Schwermetallen in der Probe erforderlich. Daher sind spezifische Probenvorbereitungsprotokolle für die anschließende Segmentierung, 3D-Rekonstruktion und Analyse bei der Verwendung von REM für die serielle Bildgebung von entscheidender Bedeutung. Die Osmium-Thiocarbohydrazid-Osmium (OTO)-Methode ist ein typisches Probenvorbereitungsschema für die 3D-Elektronenmikroskopie biologischer Proben, bei dem die Struktur lipidhaltiger Membranen erhalten bleibt und ein guter Kontrast erhaltenbleibt 18,19.

Hier haben wir die OTO-Methode zur Aufbereitung von Netzhautproben für den Einsatz von Volume EM entwickelt. Dieser Prozess konzentriert sich insbesondere auf die Präparierung der Netzhaut, die Bestimmung der optimalen Fixierungszeit für Netzhautgewebe und die detaillierten Details der spezifischen Verfahren und Vorsichtsmaßnahmen bei der 3D-Probenvorbereitung. Darüber hinaus sind die Segmentierung und 3D-Rekonstruktion der Zielstruktur integrale Schritte in dieser erweiterten Anwendung. Da die Netzhaut eine kleine und schwierige Struktur ist, aus der Materialien gewonnen werden können, erfordert sie schnelle und präzise Operationen für die EM, mit festen Zeiten und frischen Reagenzien, die für den sofortigen Einsatz vorbereitet sind.

Protokoll

Die Pflege- und Verwendungsprotokolle der Tiere wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Wenzhou genehmigt und folgten den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO). Alle Mäuse wurden in einem 12-stündigen Licht- und 12-stündigen Dunkelzyklus gehalten und mit einer Standard-Chow-Diät versorgt.

1. Netzhautdissektion und -fixation

  1. Die Mäuse (C57BL/6J, männlich, 8 Wochen alt, 20-25 g) werden durch intraperitoneale Injektion von 2,2,2-Tribromethanol (0,25 mg/g Körpergewicht) anästhesiert. Bestätigen Sie die Narkosetiefe durch kein Zurückziehen der hinteren Pfote nach dem Einklemmen der Zehe oder durch keinen Blinzelreflex. Gabeln Sie dann den Halswirbel aus, während Sie noch unter Narkose stehen, um das Tier einzuschläfern.
    HINWEIS: Tribromethanol wurde aufgrund seiner gut dokumentierten Wirksamkeit bei der Induktion einer schnellen und zuverlässigen Anästhesie in Kleintiermodellen ausgewählt, insbesondere bei kurzfristigen Eingriffen. Während Anästhetika in pharmazeutischer Qualität bevorzugt werden, bietet Tribromethanol in bestimmten Protokollen spezifische Vorteile, was es bei richtiger Zubereitung und Verabreichung zu einer geeigneten Alternative macht. Es wurden alle Vorkehrungen getroffen, um eine sichere und effektive Anwendung zu gewährleisten. Diese Studie hält sich an ethische Überlegungen, indem sie eine ordnungsgemäße Vorbereitung, Verabreichung und Überwachung gewährleistet, um potenzielle Risiken im Zusammenhang mit ihrer Verwendung zu mindern.
  2. Entfernen Sie die Augen mit einer gebogenen Schere und tauchen Sie die Augen in eine gemischte Lösung, die 2 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PB, 0,1 M, pH 7,4) enthält.
  3. Entfernen Sie den vorderen Augenabschnitt und den Glaskörper mit einer Pinzette unter dem Präpariermikroskop.
  4. Schälen Sie die Sklera mit den beiden Pinzetten, bis die Netzhaut vollständig von der Augenmuschel isoliert ist.
  5. Schneiden Sie die Netzhaut mit einem Rasiermesser schnell in 100 - 200 μm dicke Streifen und handhaben Sie die Netzhautstreifen mit einer Pasteurpipette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen (EP), das 2 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PB, 0,1 M, pH 7,4) enthält, für 2 h bei Raumtemperatur (RT) auf dem Rotator. Nach Fertigstellung die zu fixierenden Schläuche 24 h lang bei 4 °C fixieren.

2. Beispiel für den Einbettungsprozess

  1. Nach dem 5-maligen Waschen in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,4) für jeweils 15 min die Netzhautstreifen mit einer Lösung, die 1,5 % Kaliumferrocyanid und 1 % OsO4 (in PB, pH7,4) enthält, in 0,1 M Natriumcacodylat mit 4 mM CaCl2 für 1,5 h im Dunkeln auf Eis inkubieren.
    HINWEIS: Dunkle Inkubation und Phosphatmangel können Ausfällungen und Artefakte in der Probe verhindern.
  2. Waschen Sie die Netzhautstreifen 3 Mal in ddH2O für je 10 min, und behandeln Sie anschließend mit 1% Thiocarbohydrazid in ddH2O für 30 min im Dunkeln bei RT.
  3. Nach dem Spülen in ddH2O 3 mal für je 15 min die Netzhautstreifen in 2% OsO4 (in PB, PH 7,4) für 45 min im Dunkeln bei RT inkubieren.
  4. Nach dem Waschen in ddH2O 3 mal für je 15 min die Netzhautstreifen im Dunkeln bei 4 °C über Nacht in 1% wässriges Uranylacetat tauchen.
  5. Am nächsten Tag nach dem Waschen in ddH2O 3 x für je 15 min die Netzhautstreifen mit 0,66% Bleinitrat in L-Asparaginsäure (0,03 M, pH 5,5) für 40 min bei 65 °C behandeln.
  6. Nach dem Waschen in ddH2O 3 mal für jeweils 15 min die Netzhautstreifen mit aufsteigender Ethanolkonzentration von 30 %, 50 %, 70 %, 90 % und 100 % für 20 min in jeder Lösung dehydrieren.
  7. Behandeln Sie die Netzhautstreifen 20 Minuten lang mit einer gemischten Lösung, die zu gleichen Teilen Ethanol und Aceton enthält, gefolgt von einer Acetonwäsche 2 Mal für jeweils 20 Minuten.
  8. Infiltrieren Sie die Netzhautstreifen in Aceton/Harz gemischt in einem Verhältnis von 7:3 im Dunkeln bei RT über Nacht und dann Aceton/Harz im Dunkeln bei 3:7 für 24 Stunden bei RT.
    HINWEIS: Die genaue Zusammensetzung des Harzes ist wie folgt: Epon812 10,06 mL, DDSA 4 mL, MNA 5,94 mL und DMP-30 0,2 mL.
  9. Wechseln Sie die Schläuche am nächsten Tag und infiltrieren Sie die Netzhautstreifen für 24 h bei 45 °C mit reinem Harz. Wechseln Sie das Harz am nächsten Tag erneut und betten Sie die Netzhautstreifen für 48 h bei 60 °C ein.
    HINWEIS: Der Zweck der Temperaturerhöhung besteht darin, die Durchdringung zu verbessern.

3. Auswahl des Interessengebiets

  1. Schneiden Sie die Harzblöcke in 1 μm dicke Abschnitte, färben Sie die Abschnitte mit 1 % Toluidinblau und beobachten Sie die allgemeine Struktur der Netzhaut unter Lichtmikroskopie, um die groben Regionen von Interesse auszuwählen.
  2. Die Harzblöcke werden mit einem Sputter-Coater mit Platin beschichtet und anschließend mit einem 70 nm dicken Querschnitt unter Verwendung eines fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskops unter einem Strom von 0,23 nA und einer Beschleunigungsspannung von 30 kV gefräst.
  3. Führen Sie eine Vorabprüfung des Schnitts mit FIB-SEM mit 2000-facher Vergrößerung durch, um die genauen Bereiche von Interesse zu identifizieren.
  4. Erfassen Sie die Daten mit FIB-SEM mit einem Strahlstrom von 0,69 nA und einer Beschleunigungsspannung von 2 kV. Die anderen Parameter sind wie folgt: Verweilzeit = 2 μs, Voxelgröße = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt das Bild von retinalen Photorezeptorenden, die mit der traditionellen chemischen Doppelfixationsmethode präpariert wurden, und Abbildung 1B zeigt das Bild von retinalen Photorezeptorterminals, die mit der OTO-Methode präpariert wurden. Beide wurden mit dem FIB-SEM beprobt. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Zellmembranstruktur mit der OTO-Methode so weit wie möglich erhalten bleiben kann, und sogar der Umriss von Vesikeln ist deutlich zu erkennen. Darüber hinaus ist auch der Kontrast von Bildern, die mit der OTO-Methode erhalten wurden, klarer.

Abbildung 2 zeigt den experimentellen Arbeitsablauf zur Rekonstruktion der ultrastrukturellen Eigenschaften von Photorezeptorterminals. Die Rekonstruktion konzentrierte sich auf vier Arten von Photorezeptor-Terminals, darunter M-Zapfen-Pedikel, S-Zapfen-Pedikel, Rod1-Kügelchen und Rod2-Kügelchen. Das Hauptaugenmerk lag auf essentiellen Komponenten wie Mitochondrien, synaptischen Bändern und synaptischen Vesikelpools innerhalb der Photorezeptorendigungen.

Abbildung 3 zeigt die rekonstruierten Mitochondrien und synaptischen Bänder in den Photorezeptor-Enden der Stäbchen. Bemerkenswert ist, dass die synaptischen Bänder der Stangen2-Kügelchen eine charakteristische Hufeisenform aufweisen, die typischerweise ein einzelnes Band pro Kügelchen aufweist. Darüber hinaus zeigt Abbildung 2 das Vorhandensein von zwei Mitochondrien in Stäbchenkügelchen, mit einer konsistenten Position im zentralen Raum der Terminals, die sich über den synaptischen Bändern befinden. Alle Strukturen wurden von Hand nachgezeichnet, Seite für Seite.

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Abbildung 1: Beispiele für Bilder, die mit FIB-SEM für die traditionelle chemische Doppelfixationsmethode und die OTO-Methode aufgenommen wurden. (A) Traditionelle chemische Doppelfixierungsmethode. (B) OTO-Methode. Maßstab: 1000 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: 3D-Rekonstruktions-Workflow für Photorezeptor-Terminals mittels FIB-SEM. Nach der Ausrichtung mit Hilfe einer 3D-Datenvisualisierungssoftware wurden die Serienbilder manuell segmentiert und für die weitere Analyse gerendert. (A) Original-Serienbilder. (B) Ausgerichtete Bilder. (C) Segmentierte Bilder. (D) Rekonstruierte Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: 3D-Rekonstruktion. Die repräsentativen 3D-Rekonstruktionsbilder zeigen die Photorezeptor-Endungen in Weiß, die Mitochondrien in Orange und die synaptischen Bänder in Blau. Maßstab: 500 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Wir implementierten das OTO-Protokoll zur Probenvorbereitung Volume EM, um die terminale Struktur der Photorezeptoren im Netzhautgewebe zu analysieren. Der Schwerpunkt lag auf der Detaillierung des gesamten Verfahrens, beginnend mit der Ablösung und Fixierung der Netzhaut bis hin zur Präsentation der Ergebnisse der 3D-Rekonstruktion der Photorezeptor-Axonendigungen.

Die Besonderheit des Netzhautgewebes liegt im Gegensatz zum Hirngewebe darin, dass es keine regionalen Unterschiede aufweist. Die Netzhaut, die aus drei Schichten neuronaler Zellkörper und zwei Schichten synaptischer Verbindungen besteht, weist trotz der Komplexität ihrer neuronalen und synaptischen Komponenten eine regelmäßige und hierarchische Struktur auf20. Bei der Präparierung der Netzhaut ist es unerlässlich, darauf zu achten, dass die dünnen Streifen minimiert werden, um in den nachfolgenden Phasen der Probenvorbereitung einen gleichmäßigen Kontrast zu gewährleisten. Die Photorezeptor-Axonendigungen, kritische Strukturen von Interesse, befinden sich in der äußeren plexiformen Schicht (OPL) der Netzhaut. Die hierarchische und organisierte Natur der Netzhaut ermöglicht eine effiziente Lokalisierung der Zielstrukturen, erleichtert eine präzise Probenahme während der EM und gewährleistet die Genauigkeit der nachfolgenden 3D-Rekonstruktionsergebnisse.

Die Volumen-EM ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung lokaler neuronaler Schaltkreise und synaptischer Verbindungen innerhalb der Netzhaut auf der Nanoskala unter Verwendung von seriellen Schnitten21, 22. Diese Technik ermöglicht die automatische Erzeugung hochauflösender 3D-Bilder, und FIB-SEM hat das Potenzial, komplizierte Details sowohl physiologischer als auch pathologischer Aktivitäten zu enthüllen. Daher ist die Aufrechterhaltung eines stabilen Bildkontrasts über den gesamten Block während des Probenvorbereitungsprozesses von entscheidender Bedeutung. Um eine gleichmäßige Leitfähigkeit zu erreichen, verwenden wir die Pre-Embedding-OTO-Methode, einen klassischen Ansatz, der für seine Wirksamkeit bei der Kontrastverbesserung in der Rasterelektronenmikroskopie (REM) weithin anerkannt ist18,23,24. Bei diesem Verfahren wird eine doppelte Osmiumbeschichtung in Kombination mit Thiocarbohydrazid verwendet, um eine optimale Leitfähigkeit für große Proben zu gewährleisten. Darüber hinaus trägt die Doppelosmiumbehandlung zur besseren Erhaltung der Lipidmembranstrukturen bei und verleiht unseren Untersuchungen eine zusätzliche Präzisionsschicht. Die Netzhautproben sind hierarchisch, die Gewebeblöcke sind klein und leicht zu durchdringen, und die OTO-Methode kann eine bessere Zellmembrankontur und einen gleichmäßigen Bildkontrast aufrechterhalten.

Mehrere kritische Faktoren tragen zum Erfolg dieses Protokolls bei. Erstens sind eine schnelle Entnahme der Netzhaut und präzise Fixierungszeiten von größter Bedeutung für die Aufrechterhaltung einer optimalen subzellulären Struktur. Zweitens ist die Sicherstellung angemessener Konzentrationen von Osmium und Thiocarbohydrazid unerlässlich, um den Kontrast in der Membranstruktur der Serienbilder zu erhalten. Insbesondere Osmium spielt eine entscheidende Rolle, indem es an Lipidmoleküle bindet und so das BSE-Signal verstärkt.

Unser Protokoll zur Probenvorbereitung für Netzhaut ist benutzerfreundlich, erfordert keine zusätzliche Ausrüstung und minimiert die Verarbeitungszeit. Diese Eigenschaft unterstreicht die potenzielle Anwendbarkeit auf andere Volumen-EM-Techniken, was auf Vielseitigkeit und einfache Anwendung in verschiedenen Versuchsaufbauten hindeutet. Die Methode des OTO verbessert den Kontrast von FIB-REM-Bildern erheblich. Allerdings können die Details über die Zellmembran, insbesondere die Doppelschichtstruktur, noch etwas verschwommen erscheinen. Unser derzeitiges Probenvorbereitungsschema beinhaltet bis zu einem gewissen Grad einen gewissen Verzicht auf kleine Details in der Zellstruktur. Unser Ziel ist es, in Zukunft optimierte Methoden zu entwickeln, um diese Einschränkung zu beheben und zu verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren machen keine Angaben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), des State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103) und der Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,2,2-TribromethanolSigma-AldrichT48402
AcetonElektronenmikroskopie Wissenschaft10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
EinbettformBeijing Zhongjingkeyi TechnologieGP10590
Epon HarzElektronenmikroskopie Wissenschaft14900
EthanolSigma64-17-5
GlutaraldehydElektronenmikroskopie Wissenschaft16020
Helios NanoLab 600i Zweistrahl-REMFEI
L-AsparaginsäureSigma56-84-8
BleinitratSigma10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650Eine Komponente des Phosphatpuffers
NaH2PO4. H2OSigma71507Ein Bestandteil des Phosphatpuffers
OsO4TED PELLA4008-160501
Paraformaldehyd-ElektronenmikroskopieWissenschaft 157-8
KaliumferrocyanidSigma14459-95-1
NatriumcacodylatSigma6131-99-3
SputterbeschichterLeicaACE200
ThiocarbohydrazidSigma2231-57-4
UranylacetatTED PELLACA96049

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Schlagwörter

Retinale ProbenvorbereitungPhotorezeptorterminals3D RekonstruktionNetzhautdissektionProbeneinbettungfokussierter IonenstrahlRasterelektronenmikroskopiesynaptische VesikelpoolsZellmembranstruktur

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