Methodenartikel

Chirurgische Knochenimplantationstechnik für Ratten-Tibia-Modelle für Diabetes und Osteoporose

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DOI:

10.3791/66591

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5. Juli 2024

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1Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Barcelona, 2Department of Oral Surgery, Davallmed Clinic. Porto, 3Biomaterials, Biomechanics and Tissue Engineering Group, Department of Materials Science and Engineering, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Barcelona Research Centre in Multiscale Science and Engineering, Universitat Politècnica de Catalunya, 5Department of Periodontology, Davallmed Clinic. Porto, 6Department of Odontostomatology, University of Barcelona, 7Oral Health and Masticatory System Research Group at the Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 8Preclinical imaging platform, Vall d'Hebron Research Institute, Barcelona, 9Preclinical Therapeutics Core, Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 10Animal facility, Vall d'Hebron Research Institute, Barcelona, 11UCSF Gnotobiotics Core Facility, University of California, San Francisco, 12Human Anatomy and Embryology Unit, Experimental Pathology and Therapeutics Department, Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Barcelona

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Einsetzen von Implantaten in ein Rattenmodell ist ein wesentliches experimentelles Verfahren für die klinische Forschung. Diese Studie stellt ein umfassendes chirurgisches Protokoll für die Implantation von Titanimplantaten in die Tibia von Rattenmodellen mit Diabetes und Osteoporose vor.

Zusammenfassung

Die Ratte dient seit langem als wertvolles Tiermodell in der Implantologie und Orthopädie, insbesondere bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Biomaterialien und Knochengewebe. Das Schienbein der Ratte wird häufig gewählt, da sie einen einfachen chirurgischen Zugang durch dünne Gewebeschichten (Haut und Muskeln) und eine abgeflachte Form ihres medialen Gesichts aufweist und das chirurgische Einsetzen von intraossären Geräten erleichtert. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell die Induktion spezifischer Krankheiten, indem es verschiedene klinische Zustände nachahmt, um biologische Reaktionen auf verschiedene Implantatbedingungen wie Geometrie, Oberflächenbeschaffenheit oder biologische Signale zu bewerten. Trotz ihrer robusten kortikalen Struktur können bestimmte intraossäre Geräte jedoch Anpassungen in Design und Größe erfordern, um eine erfolgreiche Implantation zu gewährleisten. Daher ist die Etablierung standardisierter chirurgischer Methoden zur Manipulation von Weich- und Hartgewebe im Implantationsbereich unerlässlich, um eine korrekte Platzierung von Implantaten oder Schrauben zu gewährleisten, insbesondere in Bereichen wie der Implantologie und Orthopädie. Diese Studie umfasste achtzig Sprague-Dawley-Ratten, die auf der Grundlage ihrer jeweiligen Krankheiten in zwei Gruppen eingeteilt wurden: Gruppe 1 mit Osteoporose und Gruppe 2 mit Typ-2-Diabetes. Die Implantationen wurden nach 4 Wochen und 12 Wochen durchgeführt, wobei derselbe Chirurg eine konsistente Operationstechnik anwandte. Es wurde eine positive biologische Reaktion beobachtet, die auf eine vollständige Osseointegration aller gesetzten Implantate hinweist. Diese Ergebnisse bestätigen den Erfolg des chirurgischen Protokolls, das für andere Studien repliziert werden kann und als Benchmark für die Biomaterial-Community dient. Bemerkenswert ist, dass die Osseointegrationswerte sowohl nach 4 Wochen als auch nach 12 Wochen für beide Krankheitsmodelle stabil blieben, was eine dauerhafte Integration des Implantats über die Zeit zeigt und die Etablierung einer intimen Knochenverbindung bereits nach 4 Wochen unterstreicht.

Einleitung

Die häufige Wahl von Ratten als Versuchsobjekte ist der Tatsache geschuldet, dass sie einfach zu züchten und im Vergleich zu größeren Tiermodellen relativ kostengünstig sind. Das Aufkommen neuer Verfahren, wie z.B. die zuverlässige Reproduktion einer Störung, z.B. Osteoporose oder Diabetes, macht dieses Modell besonders geeignet, um den potentiellen Nutzen von Behandlungen und/oder den Einfluss der Krankheit auf das biologische Ansprechen auf Medikamente und chirurgische Geräte oder Verfahren zu analysieren 1,2.

Der Zuwachs an Knochenmasse bei der Ratte tritt hauptsächlich in den ersten 6 Lebensmonaten auf, obwohl einige Forscher glauben, dass der lange Knochen mindestens ein Jahr lang konstant wächst und die Länge schrittweise zunimmt1. Mit zunehmendem Alter kommt es zu einem Übergang von der Modellierung zum Umbau, der nicht in allen Fällen in allen Knochen gleichermaßen auftritt2. Weibliche Sprague Dawley-Ratten wachsen langsamer als männliche Ratten und erreichen ein niedrigeres Spitzengewicht als männliche Ratten1. Kontinuierliche Knochendehnung und unterschiedliche Knochenumbaudynamik bei Ratten sind Faktoren, die bei der Behandlung von Problemen der menschlichen Gesundheit berücksichtigt werden müssen. Es war jedoch bisher nicht möglich, experimentelle Untersuchungen zu finden, die entweder eine lebenslange Entwicklung von Rattenknochen oder die Unfähigkeit der Spezies zum Wiederaufbau von Knochen1 belegen. Wenn der Versuch im Alter von etwa 10 Monaten beginnt, sollte aufgrund dieses longitudinalen Knochenwachstums ein Rand von mindestens 1 mm von der Wachstumsfuge der Tibia intakt bleiben, ein Problem, das in Zahnimplantatstudien berücksichtigt werdenmuss 2. Hormone sind auch ein wichtiger Parameter in der Knochenforschung, da im Alter von 8 Monaten festgestellt wurde, dass männliche Ratten eine um 22 % größere Knochenbreite und eine um 33 % höhere Bruchfestigkeit aufweisen als weibliche Ratten in der Tibia3.

Die zuverlässige Reproduktion einer Störung ist daher in der Orthopädie und Implantologie von großer Bedeutung, da die Osseointegration einer orthopädischen Schraube oder eines Zahnimplantats ein komplexer Prozess ist, der von zahlreichen Faktoren abhängt, die die systemische Reaktion auf die Implantatimplantation in den Knochen beeinflussen. Es ist bekannt, dass systemische Erkrankungen wie Osteoporose und Diabetes die Erfolgsrate in der Orthopädie und Implantologie beeinflussen, so dass die zuverlässige Reproduktion dieser Erkrankungen in Rattenmodellen genutzt werden kann, um Wege zur Überwindung dieser Einschränkungen zu erforschen.

Die Tibia der Ratte eignet sich aufgrund des einfachen chirurgischen Zugangs, des moderaten Knochenvolumens und der flachen Form auf der medialen Platte für chirurgische Knochenimplantationsexperimente 4,5 und wurde in zahlreichen Forschungsstudien verwendet, in denen die Auswirkungen der Implantatoberfläche auf die Osseointegration untersuchtwurden 4,5,6. Eine wachsende Zahl von Studien untersucht die Auswirkungen von Beschichtungen und Substanzen, die der Implantatoberfläche zugesetzt werden, auf die Osseointegration sowohl bei gesunden Tieren7 als auch bei kompromittierten Tieren, die von Diabetes oder Osteoporose betroffen sind 8,9,10,11,12,13,14.

Die Anzahl der Implantate, die in das Schienbein einer Ratte eingesetzt werden, ist begrenzt und kann je nach Art der Studie variieren. Abhängig von der Anzahl der Implantate oder den Studienbedingungen müssen die Abmessungen der Geräte angepasst werden, um ein chirurgisches Trauma zu minimieren. In Studien mit einem Implantat kann ein Implantat in nahezu menschlicher Größe (2,0 mm Durchmesser und 4 bis 5 mm Länge) und eine bikortikale Verankerung erreicht werden 6,7,15,16. Die Abmessungen der Implantate in Multiimplantatprotokollen sollten eine geeignete Implantatgröße annehmen (1,5 mm Durchmesser und 2,5 mm Länge)4,17.

Ziel der vorliegenden Studie ist es, ein standardisiertes Operationsprotokoll für die Platzierung von Titanimplantaten auf der Tibia von zwei Rattenmodellen zu beschreiben: dem Osteoporose- und dem Diabetes-Rattenmodell. Darüber hinaus ermöglicht diese Studie die Überprüfung des chirurgischen Protokolls, um verschiedene Arten der Biofunktionalisierung der Implantatoberfläche und deren Auswirkungen auf die Osseointegration zu bewerten.

Eine Stichprobe von 80 Ratten wurde in zwei Gruppen eingeteilt. In Gruppe 1 wurden 40 ovariektomierte Sprague Dawley-Weibchen und 5 Scheintiere mit einem Durchschnittsgewicht von 484 g und einem Durchschnittsalter von 12 Wochen ausgewählt. Basierend auf den Empfehlungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) startete das Experiment drei Monate nach der Kastration. Diese Wartezeit sorgte für das Verschwinden der Sexualhormone. Die Osteoporose wurde zum Zeitpunkt der Operation auf der Grundlage einer Knochenanalyse mit Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) bestätigt, die einen durchschnittlichen Knochenverlust von 20 % im Vergleich zur Scheingruppe ergab. Gruppe 2 bestand aus 40 BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) genetisch veränderten Sprague Dawley Ratten mit Typ-II-Diabetes. Das Durchschnittsgewicht lag bei 730 g und das Durchschnittsalter bei 12 Wochen. Vor der Operation wurde der Diabetesstatus durch drei aufeinanderfolgende Tage mit Glukosemessungen mit Ergebnissen von mehr als 200 mg/dl bestätigt. Die Glukose wurde mit einem Blutzuckermessgerät in 6 Stunden Fasten gemessen, und ein Blutstropfen wurde durch Schwanzpunktion entnommen.

Es wurden Titanimplantate der Güteklasse 3 mit einer Länge von 2 mm und einem Durchmesser von 1,8 mm verwendet. Alle Implantate wurden unter Reinraumbedingungen sterilisiert, indem sie mit Ultraschall in Cyclohexan (3 mal für 2 min), Aceton (einmal für 1 min), deionisiertem Wasser (3 mal für 2 min), Ethanol (3 mal für 2 min) und Aceton (3 mal für 2 min) in einem Ultraschallbad (230 VAC, 50/60 Hz, 360 W) gereinigt wurden. Anschließend wurden die Proben mit Stickstoffgas getrocknet und ein Stickstoffstrahl mit 0,5 bar direkt auf die Proben aufgebracht. Vor der Implantation wurden die Implantate zunächst in entionisiertem Wasser eingeweicht und dann 10 Minuten lang in 70%iges Ethanol (v/v) getaucht. Danach wurden die Implantate in sterile Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bis zur Operation unter sterilen Bedingungen aufbewahrt.

Protokoll

Alle Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Leitlinien der Europäischen Gemeinschaft zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere (Richtlinie 2010/63/EU), wie sie in spanisches Recht umgesetzt wurden (Königliches Dekret 53/2013) und den Vorschriften der Generalitat de Catalunya (Dekret 214/97), durchgeführt. Die Ethikgenehmigung für alle tierischen Verfahren und den Umgang mit Tieren wurde von der Ethikkommission für Tierversuche des Vall D'Hebron Institut de Recerca (Registrierungsnummer 72/18 CEEA) eingeholt. Für das osteoporotische Modell wurden weibliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 484 g und einem Durchschnittsalter von 12 Wochen verwendet. Als Diabetikermodell wurden genetisch veränderte weibliche BBDR-Ratten (Bio Breeding Diabetes Resistant) mit einem Durchschnittsgewicht von 730 g und einem Durchschnittsalter von 12 Wochen verwendet. Alle Tiere wurden von einem kommerziellen Lieferanten bezogen. Die spezifischen Details zu den Tieren, Reagenzien und Geräten, die in der Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Anästhesie/Pharmakologie und Aufbereitung von Tieren

  1. Verabreichen Sie eine präoperative Analgesie mit Buprenorphin in einer Dosierung von 0,05 mg/kg und Meloxicam in einer Dosierung von 2 mg/kg durch subkutane Injektionen 10-15 Minuten vor Beginn des chirurgischen Eingriffs.
  2. Führen Sie eine intrachirurgische Anästhesie mit inhalativem Isofluran durch: Während der Induktion bei 5 % an der frischen Luft beginnen und bei 3 % halten. Induzieren Sie eine Anästhesie in einer Rattenkammer und halten Sie die Isofluranversorgung mit einer konischen Nasenanpassung während der Operation aufrecht.

2. Vorbereitung auf die Operation

  1. Messen Sie die Körpertemperatur des anästhesierten Tieres mit einer Rektalsonde und verwenden Sie ein elektronisch gesteuertes Heizkissen zur thermischen Unterstützung während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Vor Beginn der Operation muss eine Augensalbe aufgetragen werden, um Trockenheit der Hornhaut zu vermeiden.
    HINWEIS: Falls erforderlich, muss die Salbe nach Überprüfung der Augentrockenheit erneut aufgetragen werden.
  2. Trimmen Sie das Haar mit einem Elektrorasierer und tragen Sie Haarentfernungscreme auf, um das restliche Fell zu entfernen.
  3. Erhalten Sie ein aseptisches Operationsfeld, indem Sie die Kniehaut in einem Muster aus Jod und 70 % (v/v) Ethanol mit sterilen Tupfern reinigen, beginnend von innen und nach außen entlang der Inzisionslinie, ohne sie zurückzuverfolgen. Führen Sie mindestens drei aufeinanderfolgende Reinigungsumdrehungen (Jod-Ethanol-Jod) durch.
  4. Isolieren Sie das Operationsfeld, indem Sie ein steriles fenestriertes OP-Abdecktuch über dem Tier positionieren und das Bein durch die zentrale Öffnung freilegen (Abbildung 1).

3. Chirurgie

  1. Chirurgische Exposition
    1. Machen Sie einen Hautschnitt in voller Dicke von etwa 1 cm Länge vertikal entlang der proximalen Grenze der anteromedialen Fläche der Tibia im Metaphysenbereich, um den Knochen freizulegen (Abbildung 2).
    2. Stabilisieren Sie das Bein und ziehen Sie die Haut straff gegen den darunter liegenden Knochen, während Sie den Schnitt vornehmen, um sicherzustellen, dass ein sauberer Schnitt an der richtigen Stelle bleibt. Reinigen Sie die erwartete leichte Blutung mit einer in Kochsalzlösung getränkten Kompresse (Abbildung 2).
      HINWEIS: Die Rattenhaut ist dünn und schlaff oder locker. Die Stabilisierung der Haut ist entscheidend und erforderlich.
    3. Lösen Sie das Gewebe mit kleinen Periostliftern vollständig vom Knochen (Abbildung 3).
    4. Der Knochen wird bis zur Identifizierung des Ansatzes des Musculus tibialis cranialis, des Gracilis und des lateralen Kopfmuskels gastrocnemius am hinteren Rand des medialen Aspekts der Tibia als fibröses weißes Gewebe freigelegt, das fest mit dem Knochen haftet (Abbildung 3).
      HINWEIS: Es ist wichtig, diese Gruppe von Muskelansätzen zu identifizieren, damit das Implantat in einer Knochenregion mit ähnlichen Eigenschaften und Reizen über die gesamte Probe hinweg platziert werden kann, unabhängig von der Größe der Ratte.
  2. Bohrprozess
    1. Beginnen Sie den Bohrvorgang in der richtigen Region zwischen dem proximalen Tibiakamm und der hinteren Begrenzung der medialen Fläche des Tibiaknochens, die an den Ansatz des Musculus tibialis cranialis, des Gracilis und des lateralen Kopfmuskels gastrocnemius angrenzt, um Muskelverletzungen zu vermeiden.1
      HINWEIS: Die korrekte Position sollte 5 mm ± 2 mm vom Tibiaplateau entfernt sein.
    2. Bohren Sie mit maximal 150 U/min (Umdrehungen/min) unter Salzlösungsspülung bei einer Temperatur nahe 20 °C mit einem chirurgischen Elektromotor mit einem Winkelstück mit einer Reduzierung von 20:1.
      HINWEIS: Es waren nur zwei Bohrer erforderlich.
    3. Beginnen Sie mit einem Lanzen-Pilotbohrer (Abbildung 4) in einer Tiefe von 2,4 mm unter Salzlösungsbewässerung.
      HINWEIS: Jeder Bohrer hatte maximal 10 Anwendungen.
    4. Als zweiten Bohrer verwenden Sie (Abbildung 4) einen Spiralbohrer in einer Tiefe von 2,4 mm mit einem Durchmesser von 1,6 mm unter Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Jeder Bohrer hatte maximal 10 Anwendungen.
  3. Einsetzen von Implantaten
    1. Setzen Sie das Implantat mit einem Zwischenstück (Abbildung 5) ein, das am 20:1-Reduktionswinkelstück befestigt ist.
    2. Reinigen Sie das Implantat vor dem Einsetzen des Implantats von chemischen Sterilisationsresten, indem Sie es im Winkelstück drehen und gleichzeitig 10 s lang mit Kochsalzlösung spülen (Abbildung 5).
    3. Platzieren Sie das Titanimplantat (2 mm längs und 1,8 mm Durchmesser) mit dem Zwischenstück bei 20 U/min, während Sie den Drehmomentwert in Echtzeit überwachen und das maximale Einführdrehmoment registrieren.
      HINWEIS: Aufgrund der Differenz zwischen dem endgültigen Bohrer und dem Implantat sowie des zylindrischen Profils des Implantats ist mit anfänglichen Schwierigkeiten beim Einsetzen des Implantats zu rechnen. Diese anfängliche Schwierigkeit normalisiert sich jedoch schnell, sobald das Implantat den anfänglichen kortikalen Knochen durchdringt.
    4. Beenden Sie die Implantatinsertion, bevor es vollständig den kortikalen Knochen passiert, in dem es eingesetzt wird, d. h. die flache mediale Fläche der Tibia.
      HINWEIS: Im letzten Moment des Einsetzens des Implantats ist es wichtig, das Implantat etwas außerhalb des kortikalen Knochens oder auf Höhe des kortikalen Knochens zu belassen, in dem es eingesetzt wird, d. h. die flache mediale Fläche der Tibia, um die primäre Stabilität zu gewährleisten (Abbildung 6).
  4. Wundverschluss
    1. Die Grenzen des Muskelgewebes werden mit einfachen inneren Nähten mit einem monofilen synthetischen resorbierbaren 4/0-Naht (Glyconat) vernäht (Abbildung 7).
    2. Führen Sie den Hautverschluss mit einer intradermalen Naht unter Verwendung eines monofilen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterials (Glyconat) durch (Abbildung 7).

4. Mikro-CT-Scan

  1. Führen Sie nach Abschluss der Operation und noch unter Vollnarkose einen Mikro-CT-Scan durch, um die korrekte Implantatinsertion zu bestätigen.
  2. Nehmen Sie die Ratte vom Operationsbett und legen Sie sie auf das Scanbett. Lokalisieren Sie das operierte Bein mit dem Mikro-CT-Live-Scan-Modus und zentrieren Sie das Sichtfeld auf dem Implantat.
    HINWEIS: Empfohlene Erfassungsparameter sind ein Sichtfeld von 5 mm, eine räumliche Auflösung von 0,0001 mm3, 50 kV, 200 μA und eine Erfassungszeit von 3 min.
  3. Sobald der Scan aufgenommen wurde, bestätigen Sie den korrekten Abstand zwischen dem proximalen Aspekt des Implantats und der Oberfläche des Tibiaplateaus gemäß Schritt 5.2.1.
    HINWEIS: Dieser Wert ist hilfreich für die Standardisierung der Technik (Abbildung 8).

5. Nachsorge

  1. Nach der Aufnahme der Bildgebung die Ratte in ihren Käfig zurückbringen und bis zur vollständigen Genesung überwachen.
    HINWEIS: Dies dauert je nach Tiermodell ca. 5-10 Minuten. Es wird erwartet, dass diabetische Ratten aufgrund der mit Diabetes verbundenen metabolischen Veränderungen länger anästhesiert bleiben und eine längere Erholungszeit haben.
  2. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 6-8 h und Meloxicam (5 mg/kg) alle 24 h, subkutan, bis zu 72 h.
  3. Zeit für die Nahtentfernung
    1. Untersuchen Sie die Operationswunde täglich auf Infektionen, Nahtintegrität oder andere Probleme und entfernen Sie bei Bedarf 15 Tage nach der Operation Nahtreste.

6. Euthanasie

  1. Euthanasieren Sie die Tiere in einer CO2 -Kammer gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) mit einer CO2 -Füllrate von 30 % bis 70 % des Kammervolumens/min nach der Implantationszeit (4 Wochen oder 12 Wochen).

7. Postoperative Analyse

  1. Bei beiden Modellen (Osteoporose und Diabetes) ist die Tibia durch Disartikulation nach der Euthanasie zur weiteren Analyse zu entfernen.
    HINWEIS: In Bezug auf die Mikro-CT-Analyse ermöglichten die Daten die Berechnung des Knochen-Implantat-Kontakts (BIC). Die CT-Akquisition wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen Parameter durchgeführt, und die BIC-Analyse wurde durchgeführt, indem die Knochenfläche (mm 2) durch die in der kortikalen Region berechnete Implantatfläche (mm 2) dividiert wurde, wobei ein bereits in der Literatur beschriebenes Protokoll angepasstwurde 18. Repräsentative Bilder sind für jedes Modell zu Osteoporose (Abbildung 9) und Diabetes (Abbildung 10) zu sehen.

Ergebnisse

Chirurgische Phase
Es ist wichtig zu erwähnen, dass beide Tiermodelle, die in dieser Studie verwendet wurden, aufgrund der induzierten Krankheiten gewisse Einschränkungen aufweisen. Diese Einschränkungen bei der Manipulation von Hart- und Weichgewebe spiegeln sich während des chirurgischen Eingriffs wider.

Im Diabetikermodell ist die Ratte größer, was es schwierig macht, die Beine während chirurgischer Eingriffe zu stabilisieren. Dies verlängert die Operationszeit und damit die Anästhesiezeit, was eine längere Erholungszeit erfordert und daher eine größere Wachsamkeit in der postoperativen Phase erfordert.

Was das osteoporotische Modell betrifft, so waren die Anforderungen sehr unterschiedlich, da es zum Zeitpunkt der Knochenmanipulation konzentrierter war. In diesem Fall ist es möglich, während des Bohrvorgangs eine stärkere Blutung zu beobachten. Darüber hinaus wird der Prozess der Implantatinsertion schwieriger. Es können einige Komplikationen auftreten, wie z. B. kleine Risse im Knochen, die das Fortschreiten des Implantats während seines Eintritts verändern und es aufgrund des fehlenden Knochenwiderstands an den Seitenwänden des Implantats instabiler machen. Diese Einschränkung erfordert mehr manuellen Druck und Stabilisierung während der Platzierung, was die Kontrolle erschwert, bis die korrekte Positionierung des Implantats erreicht ist.

Hinsichtlich des maximalen Implantateinführdrehmoments wurden für die beiden Erkrankungen relativ unterschiedliche Werte beobachtet (Tabelle 1). Im Allgemeinen war das maximale durchschnittliche Einführmoment, das für das osteoporotische Modell beobachtet wurde, höher als für das diabetische Modell. Angesichts dieser Ergebnisse ist es interessant, die Auswirkungen von Diabetes auf die Knochendichte und die Knochenresistenz gegen das Einsetzen von Implantaten zu verstehen, da diese Erkrankung im Vergleich zu Osteoporose einen stärkeren Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des Knochens zu haben scheint.

Postoperative Analyse
Die adäquate Platzierung der Titanimplantate nach 4 Wochen und 12 Wochen nach der Implantation wurde mittels Mikro-CT-Bildgebung analysiert. Repräsentative Bilder werden sowohl für osteoporotische (Abbildung 9) als auch für diabetische (Abbildung 10) Ratten bereitgestellt. Insgesamt wurden die Implantate korrekt durch die kortikalen und trabekulären Tibien implantiert, wobei sie einen engen und kontinuierlichen Kontakt mit dem kortikalen Teil zeigten und keine Anzeichen von Entzündungen oder Nebenwirkungen aufwiesen, was den Erfolg des chirurgischen Protokolls für beide Pathologiemodelle beweist.

Insgesamt ermöglichte die Analyse der Bilder auch die Berechnung des Verhältnisses von Knochenfläche (mm 2) zu Implantatfläche (mm2), die als V(BIC) bezeichnet wird, in der kortikalen Region und den Vergleich der Leistung des chirurgischen Eingriffs im Laufe der Zeit und innerhalb von Modellen. Wie in Abbildung 11 gezeigt, blieben die V(BIC)-Werte für das osteoporotische Modell nach 4 Wochen und 12 Wochen konstant, was auf eine stabile Integration des Implantats über die Zeit hindeutet und unterstreicht, dass eine innige Verbindung mit dem Knochen bereits nach 4 Wochen gewährleistet ist. Bemerkenswert ist, dass für das Diabetikermodell sehr ähnliche Werte erzielt wurden, was die Angemessenheit des Studienprotokolls für beide Pathologiemodelle zeigt.

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Abbildung 1: Operationsfeld. Das Operationsfeld, das die korrekte Position der Ratte und die Freilegung des zu intervenierenden Bereichs zeigt, die Anpassung des konischen Adapters an die Atemwege zur Aufrechterhaltung der Anästhesie während des Eingriffs sowie die für den Eingriff erforderlichen Instrumente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Chirurgischer Schnitt. Korrekte Stabilisierung der Rattenpfote und gleichzeitige Fixierung der dünnen beweglichen Haut, um einen korrekten Schnitt zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Knochenfreilegung und Muskelansatz Identifizierung. Links: totale Ablösung des Gewebes mit der daraus resultierenden Knochenfreilegung. Um den Ansatz des Musculus tibialis cranialis, des Gracilis und der lateralen Kopfmuskulatur des Gastrocnemius zu erhalten und zu schädigen, ist es wichtig, das fest mit dem Knochen verbundene fibröse weiße Gewebe korrekt zu identifizieren, das in der Abbildung auf der rechten Seite zu sehen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Ablauf der Bohrung. Der Ablauf des Bohrprozesses beginnt mit dem Lanzenpilotbohrer auf der linken Seite, gefolgt vom Spiralbohrer auf der rechten Seite. Um einen stabilen und sicheren Bohrvorgang zu gewährleisten, ist es wichtig, sowohl die Bein- als auch das Weichgewebe während des Bohrens zu stabilisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Vorbereitung für die Implantatinsertion. Das Implantat wird auf ein Zwischenstück eingesetzt, um es dem Reinigungsprozess mit einer Kochsalzlösung zu unterziehen, während sich das Implantat mit 20 U/min dreht. Dieses Zwischenstück ermöglicht das Einsetzen des Implantats in den Knochen mit einem elektronischen Gerät. Dieses Gerät sorgt für die Kontrolle der Geschwindigkeit beim Einsetzen des Implantats und zeichnet das Einführdrehmoment in Echtzeit auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Einsetzen von Titanimplantaten. Das Einsetzen des Implantats in den Knochen erfordert seine Platzierung auf der flachen Fläche des medialen Knochens, weg von der proximalen Grenze der anterior-medialen Fläche des Knochens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Wundverschluss. Die Schritte zum Verschließen der Wunde werden in 2 verschiedenen Ebenen beobachtet. Links: Die erste, tiefere Ebene wird mit einfachen Stichen hergestellt, um die Ränder des Muskelgewebes zu approximieren. Rechts: Die zweite, oberflächlichere Ebene wird mit einer intradermalen Naht ausgeführt, um sich der Haut anzunähern und gleichzeitig zu verhindern, dass sich der Knoten in einer externalisierten Position befindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Mikro-CT-Scan der Implantatinsertion nach einem chirurgischen Eingriff. Die Abbildung veranschaulicht die Positionierung der Ratte im Mikro-CT-Scanner, und die Bilder der Implantatposition sind in drei Abschnitte unterteilt, die den x-, y- und z-Ansichten entsprechen. Das Implantat ist in den verschiedenen Ansichten mit einem roten Pfeil angedeutet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Mikro-CT-Scan eines Implantats, das in die Tibia einer osteoporotischen Ratte eingesetzt wurde. Repräsentative postoperative Mikro-CT-Bilder von Titanimplantaten, die in die Tibien von osteoporotischen Ratten nach (A) 4 Wochen und (B) 12 Wochen nach der Implantation eingesetzt wurden. Jedes Bild ist in drei Abschnitte unterteilt, die jeweils den x-, y- und z-Ansichten entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 10: Mikro-CT-Scan eines Implantats, das in die Tibia einer diabetischen Ratte eingesetzt wurde. Repräsentative postoperative Mikro-CT-Bilder von Titanimplantaten, die in die Tibien von osteoporotischen Ratten nach (A) 4 Wochen und (B) 12 Wochen nach der Implantation eingesetzt wurden. Jedes Bild ist in drei Abschnitte unterteilt, die jeweils den x-, y- und z-Ansichten entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 11: Analyse des Knochen-Implantat-Kontakts (BIC). V(BIC)- Werte, berechnet als Knochenfläche (mm2) *100/ Implantatfläche (mm2) aus Mikro-CT-Bildern für das osteoporotische (Osteo) und diabetische (Diab) Modell nach 4 Wochen (4 w) und 12 Wochen (12 w) nach der Implantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Maximales Drehmoment zum Einsetzen des Implantats [N·cm]
ModellRechtes BeinLinkes Bein
Osteoporose6,11 ± 0,966.49 ± 1.34
Diabetes4,79 ± 1,704,90 ± 1,76

Tabelle 1: Maximales Einsteckdrehmoment. Unterschiede in den maximalen Drehmomentwerten, die beim Einsetzen des Implantats zwischen diabetischen Ratten und osteoporotischen Ratten erzielt werden. Diabetische Ratten weisen niedrigere maximale Drehmomentwerte auf als osteoporotische Ratten.

Diskussion

Obwohl die Ratte ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der Osseointegration ist, ist es wichtig, eine reproduzierbare Operationstechnik für die adäquate Platzierung von Implantaten zu definieren und zu beschreiben. Eine solche Technik könnte der wissenschaftlichen Gemeinschaft als Leitfaden dienen. Darüber hinaus stellt die Tatsache, dass bestimmte Krankheiten wie Osteoporose und Diabetes den Knochenstoffwechsel verändern, höhere Anforderungen an die korrekte Gestaltung chirurgischer Eingriffe. Die Ratte schneidet im Vergleich zu anderen Tiermodellen gut ab, da sie die Hauptmerkmale sowohl von Osteoporose (spontane und Low-Impact-Frakturen) als auch von Diabetes und ernährungsbedingter Adipositas aufweist, ohne dass kostspielige Spezialeinrichtungen und lange, teure Experimente sowie postoperative Kontrolle und Wartung erforderlich sind19. Die geringe Größe, die hohe Fruchtbarkeit und die kurze Lebensdauer der Ratte ermöglichen groß angelegte, zeiteffiziente Experimente und erfüllen gleichzeitig die drei R-Anforderungen von Tierversuchen (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung)20.

Trotz der beträchtlichen Menge an wissenschaftlicher Literatur auf diesem Gebiet gibt es nur wenige wissenschaftliche Artikel, die detaillierte Operationstechniken beschreiben. Die überwiegende Mehrheit lässt jedoch entscheidende chirurgische Informationen aus und verhindert so die Möglichkeit, die beschriebenen Techniken zu replizieren.

In diesem chirurgischen Protokoll müssen während des gesamten chirurgischen Eingriffs mehrere kritische Schritte berücksichtigt werden, wie z. B. die Position des Schnitts, die genaue Position für die Bohrung und Implantatplatzierung, die Bohrtechnik, die genauen Abmessungen des Implantats und der endgültige Bohrer, der für die Implantatinsertion verwendet wird.

In der Literatur ist die genaue Lokalisation des Schnitts oft ungenau, da es keine wissenschaftliche Grundlage für seine Platzierung gibt. Der Schnitt sollte in einem anderen Bereich als dem der Implantatinsertion erfolgen. Es ist wichtig, den Schnitt und die anschließende Naht nicht direkt über dem implantierten Bereich zu platzieren, um die Integrität des über dem Implantat abgelösten Periosts zu erhalten. Ein Schnitt und eine erste Ablösung des Lappens in voller Dicke können die Blutversorgung stören und das Periost schädigen, was möglicherweise zu einer Störung der Aktivität der Periostzellen während der Knochenneubildung führt, wie in anderen Studien beobachtetwurde 21. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die periimplantäre Knochenbildung zu optimieren und Traumata, schlechte Heilung, Fibrose oder das Risiko einer bakteriellen Besiedlung im Nahtbereich zu minimieren. Bei dieser Methode wird der Schnitt detailliert und im proximalen Tibiakamm vorgenommen, um sicherzustellen, dass er sich nicht direkt über der Implantatplatzierungsstelle befindet.

Bei der Bestimmung des Bereichs für die Implantatinsertion ist es entscheidend, eine gleichmäßige Knochendichte in der gesamten Probe zu gewährleisten. Typischerweise beziehen sich die Messungen auf das Tibiaplateau. Angesichts der longitudinalen Größenvariation bei Ratten ist eine anatomische Referenz erforderlich, um Implantate konsistent in derselben Region zu platzieren. Bei dieser Methode dient der Bereich neben dem Ansatz der lateralen Kopfmuskulatur tibialis cranialis, gracilis und gastrocnemius als verlässliche anatomische Referenz. Es wird erwartet, dass diese Region, die durch muskuläre Ansatzpunkte gekennzeichnet ist, in der gesamten Probe eine homogene Knochendichte aufweist.

Bei der Diskussion der Bohrmethode ist es wichtig, genaue Angaben über die Art/Abmessungen des Bohrers/der Bohrer, die Bohrgeschwindigkeit (normalerweise gemessen in U/min) und die Temperatur der Kochsalzlösung zu machen. Diese Faktoren sind wesentlich für die Verhinderung einer ausgedehnten nekrotischen Fläche und der anschließenden Bildung von fibrösem Gewebe22,23, wie in mehreren Studien hervorgehoben wurde, die sich auf bohrinduzierte nekrotische Reaktionen konzentrierten. Einige Artikel überschreiten jedoch diese biologischen Grenzen24 in ihren Bohrmethoden, während andere diese entscheidenden Informationen völlig weglassen 4,25,26,27,28. Diese Studie unterstreicht die sorgfältigen Vorsichtsmaßnahmen, die während der Bohrungen getroffen werden, um chirurgische Traumata und Gewebenekrosen zu reduzieren. Wir haben uns für ein Sicherheitsbohrverfahren mit einer Drehzahl von 150 U/min entschieden, einem Niveau, das auch ohne Kochsalzlösung in Bezug auf die Knochentemperatur als sicher gilt. Dieser Ansatz ist in Bezug auf die Bohrgeschwindigkeit effektiv und ermöglicht eine gute Bohrkontrolle während des Eingriffs29,30. Darüber hinaus haben wir die Bewässerung und Kühlung mit einer Salzlösung bei ca. 20 °C aufrechterhalten, um mögliche thermische Effekte weiter zu mildern.

Eine weitere relevante Information, die häufig ausgelassen wird, ist die Größe des verwendeten Implantats. Diese Auslassung macht es unmöglich, den Zusammenhang zwischen der Größe des endgültigen Bohrers und der Größe des Implantats zu interpretieren. Diese Diskrepanz ist entscheidend für die Beurteilung der Stabilität des Implantats, die bei einem Defizit zu einer Instabilität führen kann, während sie bei einem Übermaß zu einem Überdruck und einer ischämisch-nekrotischen Reaktion führen kann.

Es ist wichtig zu beachten, dass für das Erreichen der Primärstabilität ein geringer Durchmesserunterschied zwischen dem endgültigen Bohrer und dem Implantat bestehen sollte, wobei das Implantat einen etwas größeren Durchmesser hat. Dieser kritische chirurgische Parameter für das Erreichen der Primärstabilität ist in der Literatur nicht immer konsistent, da einige Methoden einen Endbohrer mit einem größeren Durchmesser als das platzierte Implantataufweisen 4. Da diese Region durch muskuläre Ansatzpunkte gekennzeichnet ist, wird eine homogene und robuste Knochendichte in der gesamten Probe erwartet. Dieses Merkmal trägt dazu bei, die primäre Einschränkung zu vermeiden, die für tibiale Eingriffe bei Ratten berichtet wird, nämlich das longitudinale Wachstum der Tibia im Laufe der Zeit31. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode eine Temperaturkontrolle, die eine der Ursachen für Komplikationen und nachfolgende Morbidität bekämpft23. Ähnlich wie bei anderen Studien gibt es jedoch auch in dieser Studie eine Einschränkung hinsichtlich der Notwendigkeit, das Gerät aufgrund von Schwankungen in der Tibiagröße 4,17 anzupassen.

Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Anzahl der verwendeten Tiere ist die Bedeutung der Auswahl einer geeigneten Stichprobengröße. Dies ist entscheidend, um die Wirkung der Forschungsergebnisse zu maximieren und gleichzeitig den Einsatz von Tieren zu minimieren. Eine solche Strategie verbessert nicht nur die Effizienz und Zuverlässigkeit von Studien, sondern betont auch die ethischen Überlegungen in der wissenschaftlichen Forschung. Es sollten weitere Anstrengungen unternommen werden, um diese Effizienz zu optimieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Methode eine detaillierte Beschreibung aller chirurgischen Eingriffe darstellt und die Beobachtung verschiedener chirurgischer Herausforderungen bei beiden Erkrankungen ermöglicht. Darüber hinaus zeichnet sich dieses Protokoll als valide Methode aus, da alle Proben mit direktem Kontakt zum Knochen stabile V(BIC)-Werte erreichten. Sie unterscheidet sich jedoch von den meisten experimentellen Studien in der Literatur dadurch, dass sie eine detaillierte und begründete Technik präsentiert, die eine exakte Reproduktion ermöglicht. Folglich kann es verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Implantatoberflächen bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich solcher, die die Knochendichte beeinflussen, zu untersuchen.

Offenlegungen

Wir erklären hiermit, dass kein Interessenkonflikt in Bezug auf diesen wissenschaftlichen Artikel besteht.

Danksagungen

Die Autoren danken der staatlichen spanischen Forschungsagentur für die finanzielle Unterstützung durch die Projekte PID2020-114019RBI00 und PID2021-125150OB-I00.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
22 G Nadeln+A2:C30TerumoNN-2238R
4/0 monofile synthetische resorbierbare NahtBraun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL SpritzenBraun4617100V-02 4606051V
Adson-PinzetteAmeisen- und Atilde; o MedicalRef: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley RatsJanvier Labs
BetadineMylan
BuprecareAnimalcare (UK)
Castroviejo Messschieber 0-40 mm 15 cm abgewinkeltUL AMIN Industries
Castroviejo NadelhalterAmeise & Atilde; o MedizinischeRef: AM1702
Schere für Zahnchirurgie gebogen und geradeAmeise & Atilde; o MedicalAMA603 / AMA600
ElektrorasiererOster Pro 3000i34264482227
Extra feine Graefe PinzetteF.S.TRef: 11150-10
MullpolsterCOVIDIEN441001
GlukometerMenarini (Italien)
Spiralbohrer / OSTEO-PIN DRILL & Oslash; 1,6 mmsoadcoRef. OS-8001
Implantate / SCHRAUBE OSTEO-PIN & Oslash; 1,8 x 2,0 mmsoadcoRef. OS-3
IsofloLe Vet Pharma (Niederlande)
Lanze Pilotbohrer / Lanzettbohrer (DS)soadcoRef. 10 02 01 T
Latexhandschuhe - OP-Handschuhe sterilHartmannRef: 9426495
Lucas Chirurgische KüretteAmeise; o MedicalRef: AMA940-3
MetacamBoehringer Ingelheim (Deutschland)
Mikrozange geradeNopaRef: AB 542/12
Micro-CT Scan ( Quantum Fx microCT )Perkin Elmer (US)
Osteoporotische Sprague Dawley Frauen RattenJanvier Labs
Periost Aufzug -  Häutung 2-4Ameise & Atilde; o MedizinischRef: A1564
Physiologische Lösung zur SpülungHygitechRef:10238
Skalpellklinge Kohlenstoffstahl 15CRasierer MedRef: 02846
Sterile MulltupferAlledentalRef: 270712
Steriles SpülsystemHygitechRef:HY1-110001D
Sterile Handtücher (1 Stück pro Tier)Dinarex4410
Chirurgisches WinkelstückW& HRef: WS-75 LED G
Chirurgisches WinkelstückW& HSN 08877
Chirurgisches WinkelstückW& HSN 01309
Chirurgischer ElektromotorWH Implantmed Typ: SI-1023  Ref: 30288000
Griff für chirurgisches SkalpellAsaDentalRef: 0350-3
HandtuchklemmenXelpov chirurgischAF-773-11
UltraschallgerätJ.P. Selecta, Abrera, Spanien

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