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Immunkompetentes Alveolen-on-Chip-Modell zur Untersuchung der Immunantworten der Alveolarschleimhaut

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DOI:

10.3791/66602

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31. Mai 2024

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1Institute of Biochemistry II, Jena University Hospital, 2Dynamic42 GmbH, 3Center for Sepsis Control and Care, Jena University Hospital, 4Jena School of Microbial Communication, Friedrich Schiller University Jena

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Lung-on-Chip-Modelle übertreffen herkömmliche 2D-Kulturen, indem sie die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Perfusion der Endothelzellen nachahmen und den Blutfluss und den Nährstoffaustausch simulieren, die für lungenphysiologische Studien entscheidend sind. Dies erhöht die Relevanz der Lungenforschung und bietet eine dynamische, physiologisch genaue Umgebung, um das Verständnis und die Behandlung von Atemwegsinfektionen zu verbessern.

Zusammenfassung

Wir stellen ein fortschrittliches immunkompetentes Lung-on-Chip-Modell vor, das die Struktur und Funktion der menschlichen Alveolen replizieren soll. Dieses innovative Modell verwendet einen mikrofluidisch durchbluteten Biochip, der eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche unterstützt, die die Umgebung in den menschlichen Lungenbläschen nachahmt. Tissue Engineering wird verwendet, um wichtige zelluläre Komponenten wie Endothelzellen, Makrophagen und Epithelzellen zu integrieren, um ein repräsentatives Gewebemodell der Alveole zu erstellen. Das Modell ermöglicht es, die Immunantworten der Schleimhäute auf verschiedene Krankheitserreger, darunter Viren, Bakterien und Pilze, eingehend zu untersuchen und so unser Verständnis der Lungenimmunität zu verbessern. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Details für die Etablierung dieses Alveolen-on-Chip-Modells als robuste In-vitro-Plattform für Infektionsstudien bereitzustellen, die es den Forschern ermöglicht, die komplexen Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und dem Immunsystem des Wirts in der pulmonalen Umgebung genau zu beobachten und zu analysieren. Dies wird durch die Anwendung mikrofluidischer Techniken erreicht, um wichtige physiologische Bedingungen der menschlichen Alveolen zu simulieren, einschließlich des Blutflusses und der biomechanischen Stimulation von Endothelzellen, sowie durch die Aufrechterhaltung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die für die realistische Exposition von Epithelzellen gegenüber Luft entscheidend ist. Das Modellsystem ist mit einer Reihe von standardisierten Assays kompatibel, wie z. B. Immunfluoreszenzfärbung, Zytokinprofilierung und Koloniebildungseinheit (KBE)/Plaque-Analyse, was einen umfassenden Einblick in die Immundynamik während der Infektion ermöglicht. Der Alveolus-on-Chip besteht aus essentiellen Zelltypen, einschließlich humaner distaler Lungenepithelzellen (H441) und humaner Nabelvenendothelzellen (HUVECs), die durch poröse Polyethylenterephthalat-Membranen (PET) getrennt sind, wobei primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen strategisch zwischen der Epithel- und der Endothelschicht positioniert sind. Das Gewebemodell verbessert die Fähigkeit, die nuancierten Faktoren, die an der pulmonalen Immunantwort beteiligt sind, in vitro zu analysieren und zu analysieren. Als wertvolles Instrument soll es zur Weiterentwicklung der Lungenforschung beitragen, indem es ein genaueres und dynamischeres In-vitro-Modell für die Untersuchung der Pathogenese von Atemwegsinfektionen und die Erprobung potenzieller therapeutischer Interventionen bereitstellt.

Einleitung

Die menschliche Lunge spielt eine bemerkenswerte Rolle bei der Atmung und Immunabwehr, mit komplexen Wechselwirkungen zwischen den Immunantworten der Alveolarschleimhaut1. Die Fähigkeit der Lungenbläschen, eine effiziente Immunantwort zu erzeugen, ist entscheidend für die Vorbeugung von Lungeninfektionen und die Sicherung der Lungengesundheit. Da die Lunge ständig einer Vielzahl potenzieller Risiken ausgesetzt ist, darunter Bakterien, Viren, Pilze, Allergien und Feinstaub, ist das Verständnis der Komplexität der Immunreaktionen der Alveolarschleimhaut entscheidend, um die Mechanismen hinter Atemwegsinfektionen, entzündlichen Erkrankungen und der Behandlung von Lungenerkrankungen zu entdecken1.

Um infektions- und entzündungsbedingte Prozesse der Atemwege in vitro zu untersuchen, werden Modelle benötigt, die das alveoläre Milieu und die Immunantworten originalgetreu nachahmen können. 2D-Zellkulturen und tierische Module werden seit Jahrzehnten als unverzichtbare Werkzeuge für die biomedizinische Forschung zur Immunantwort der Lunge eingesetzt. Sie haben jedoch oft Grenzen in ihrem translationalen Potenzial für menschliche Situationen. Lung-on-Chip-Modelle können dazu beitragen, die Lücke zwischen traditionellen In-vitro- und In-vivo-Modellen zu schließen und einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung humanspezifischer Immunantworten zu bieten 2,3. Lung-on-Chip-Modelle können die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche nachahmen, die für Lungenzellen erforderlich ist, um physiologische Zustände der Atemwege zu rekapitulieren und ein genaueres und robusteres Gewebemodell zu entwickeln. Diese Kulturtechnik ermöglicht eine präzise Untersuchung der Zelldifferenzierung, -funktion und -reaktion auf Medikamente oder krankheitsbezogene Reize in vitro2.

In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidikbasiertes Modell der menschlichen Alveole als effektives Werkzeug zur Rekapitulation des menschlichen Alveolenmilieus vor, indem wir Perfusion anwenden, um den Blutfluss und die biomechanische Stimulation von Endothelzellen nachzuahmen und eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche mit Epithelzellen zu integrieren, die einer Luftphaseausgesetzt sind Phase 4. Wir haben eine mikrofluidisch perfundierte Alveole auf Chip entwickelt, die die physikalische Struktur und die biologischen Wechselwirkungen der menschlichen Alveolen nachahmt, mit besonderem Fokus auf die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Diese Schnittstelle spielt eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung von respiratorischen Epithelzellen, die für die genaue Modellierung des Lungenmilieus unerlässlich ist. Das Modell verwendet humane distale Lungenepithelzellen (H441) und humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs), die durch poröse Polyethylenterephthalat (PET)-Membranen getrennt sind, wobei primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen zwischen den Zellschichten positioniert sind. Dieser Aufbau repliziert die komplizierte zelluläre Anordnung der Alveolen und ist entscheidend für die genaue Simulation der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die ein wesentlicher Faktor für die physiologische Funktion des Lungengewebes ist.

Die Logik hinter der Modellentwicklung erstreckt sich auf die Integration sowohl zirkulierender als auch geweberesidenter Immunzellen. Dieser Ansatz ist so konzipiert, dass er die entzündliche Wirtsreaktion auf Atemwegsinfektionen beim Menschen genau nachahmt und eine dynamische Umgebung für die Untersuchung von Erreger-Wirt-Interaktionen bietet. Das Vorhandensein von Makrophagen ermöglicht die Untersuchung der unmittelbaren Immunreaktionen und ihrer Interaktion mit Krankheitserregern, was die erste Verteidigungslinie gegen Atemwegsinfektionen darstellt. Darüber hinaus ermöglicht das Design der Biochip-Plattform eine bequeme und präzise Manipulation sowohl biophysikalischer als auch biochemischer Hinweise, was für die Replikation der Alveolenfunktion in vitro von entscheidender Bedeutung ist. Diese Flexibilität ist entscheidend für die Analyse der Faktoren, die zu menschlichen Infektionen beitragen, und ermöglicht es den Forschern, die Bedingungen an verschiedene Krankheitszustände anzupassen oder potenzielle therapeutische Interventionen zu testen. Die Kompatibilität der Plattform mit mehreren Auslesetechnologien, einschließlich fortschrittlicher Mikroskopie, mikrobiologischer Analysen und biochemischer Abwasseranalyse, erhöht ihren Nutzen. Diese Fähigkeiten ermöglichen eine umfassende Bewertung der Gewebereaktion auf Infektionen, einschließlich der Bewertung des zellulären Verhaltens, der Proliferation von Krankheitserregern und der Wirksamkeit von Immunantworten.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll und Techniken zur Erstellung und Nutzung eines humanen Alveolen-on-Chip-Modells, das sich auf die Replikation der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Integration von Immunzellen zur Untersuchung menschlicher Infektionen in vitro konzentriert.

Protokoll

HUVEC-Zellen werden aus Nabelschnüren isoliert und bis zur Passage 4 verwendet. Primäre Monozyten werden von gesunden Spendern aus Vollblut isoliert. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Jena, Jena, Deutschland genehmigt (3939-12/13). Laut der Erklärung von Helsinki gaben alle Personen, die Zellen für die Studie spendeten, ihre Einverständniserklärung.

1. Tag 1: Vorbereitung des Biochips

  1. Die Biochips sind in verschiedenen Größen und Modellen erhältlich. Verwenden Sie für Experimente hier das Modell BC002. Legen Sie den Biochip in eine Petrischale aus Glas, füllen Sie die Schale und spülen Sie alle Hohlräume mit sterilem 70%igem Ethanol (EthOH). 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie anschließend die Kavitäten 2x mit sterilem ddH2O. Entfernen Sie das ddH2O.
  2. Beschichten Sie die Biochip-Membran beider Kavitäten mit steriler Kollagen-IV-Lösung (0,5 mg/ml in 0,5 mM Essigsäure; verwenden Sie eine Konzentration von 1:100 in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die Magnesium und Calcium PBS (+/+) enthält), indem Sie die Kollagen-IV-Lösung mit einer 1.000-μl-Pipette mit blauen Spitzen vorsichtig durch beide Hohlräume spülen. 15 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
    HINWEIS: Die Verwendung einer 1.000-μl-Pipette mit Blaufilterspitzen (P1000) wird während des gesamten Protokolls empfohlen. Der Durchmesser der Öffnung der Filterspitze bedeckt die Öffnung der Anschlüsse, die die Kanäle verbinden, vollständig, wodurch das Eindringen von Luftblasen in den Chip vermieden wird.
  3. Nach 30 min Inkubation spülen Sie die untere und obere Kammer 2x mit sterilem PBS (+/+), um das restliche Kollagen und die Essigsäure auszuspülen.
  4. Bereiten Sie das EC-Medium vor, indem Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) hinzufügen. Füllen Sie die obere Kammer jeder Kavität mit 250 μl EC-Medium und die untere Kammer mit 150 μl EC-Medium.
  5. Ernte HUVEC aus einem konfluenten T25-Kolben: Mit 5 mL Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Magnesium und Calcium PBS (-/-) waschen, 1 mL 0,25% Trypsin + 1 mM EDTA in PBS (-/-) zugeben und 3 min bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die Trypsinaktivität, indem Sie 5 mL PBS (+/+) + 5 % FCS hinzufügen und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 350 x g in einem konischen 50-ml-Röhrchen zentrifugieren. Den Überstand entfernen und das Küvettenpellet in 1 ml EC-Medium resuspendieren.
  6. Verwenden Sie eine serielle Verdünnung von 1:10, wenn Sie die Zellzählung durchführen. Geben Sie 10 μl des resuspendierten Zellpellets zu 90 μl Zellmedium. Kombinieren Sie die Proben sorgfältig. Verwenden Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 μl Trypanblau-Fleck. Verdünnen Sie die Zelllösung mit Trypanblau (1:1) unter Verwendung von Objektträgern der Zellzählkammern. Zählen Sie die Zellen entweder manuell mit einer Neubauer-Kammer oder mit einem automatisierten Zellzähler. Bestimmen Sie die Zellzahl und stellen Sie die Konzentration auf 0,4 x 106 Zellen pro 200 μl ein.
  7. Ersetzen Sie das Endothelzellmedium in der oberen Kammer des Biochips durch 200 μl EC-Medium, das suspendierte HUVECs enthält. Vorsichtig pipettieren, um die Bildung von Luftblasen in den Kanälen oder Kammern zu vermeiden. Stellen Sie die Petrischale aus Glas mit den Biochips bei 37 °C und 5 % CO2 auf.

2. Tag 2: Überprüfung der Zellschicht

  1. Überprüfen Sie an Tag 2 visuell die Konfluenz der HUVEC-Zellschicht in der oberen Kammer. In der oberen Kammer wird das Medium mit 300 μl EC-Medium gewechselt. Vorsichtig pipettieren, um eine Ablösung der Zellen von der Membran zu vermeiden. Führen Sie den Medienaustausch täglich nach 24 Uhr durch. Stellen Sie die Petrischale aus Glas mit den Biochips wieder auf 37 °C und 5 % CO2 ein.

3. Tag 3: Vorbereitung der unteren Kammer

  1. Überprüfen Sie visuell die Konfluenz der Endothelzellschicht. Bestimmen Sie an dieser Stelle das Vorhandensein einer konfluenten Schicht und einer kopfsteinpflasterartigen Morphologie (Abbildung 1). In der oberen Kammer wird das Medium mit 300 μl EC-Medium gewechselt.
  2. Bereiten Sie dann die untere Kammer für die Aussaat der Zellen vor, die die Epithelschicht bilden. Spülen Sie die untere Kammer vorsichtig mit 150 μl des RPMI-Mediums (fügen Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 5 % fötales Kuhserum, 1 μM Dexamethason hinzu).
  3. Für die untere Kammer werden 0,5 x 106 H441-Zellen in 200 μl RPMI-Medium (RPMI) pro Kavität ausgeimpft.
  4. Ernte von H441-Zellen
    1. Waschen Sie die Zellen einmal mit 5 mL PBS (-/-). Fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin + 1 mM EDTA in PBS (-/-) hinzu.
    2. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2. Die Inkubationszeit variiert je nach Konfluenz der Schicht. Innerhalb von 5-7 Minuten sollten sich die Zellen vollständig ablösen.
    3. Stoppen Sie die Trypsinaktivität mit 10 mL PBS (+/+) + 5% FBS, sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie 4 Minuten lang bei 200 x g .
    4. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml RPMI und zählen Sie.
    5. 0,5 x 106 Zellen pro Kammer aussäen, indem die Zelllösung vorsichtig in die untere Kammer pipettiert wird. Schließen Sie alle Anschlüsse und drehen Sie den Biochip auf den Kopf, damit sich die Zellen an der PET-Membran anheften können. Bewahren Sie den Biochip auf dem Kopf auf und inkubieren Sie ihn über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.

4. Tag 4 - Tag 7: Erhaltung der Zellen und Ernte von Monozyten

  1. Führen Sie täglich einen Medienwechsel in der oberen und unteren Kammer durch. Für die obere Kammer wird der Medienaustausch mit 300 μL EC-Medium durchgeführt.
  2. Verwenden Sie 200 μl RPMI+ (RPMI-Medium plus 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 10 ng/mL GM-CSF, 10 % autologes humanes Serum, 1 μM Dexamethason) für die untere Kammer. Spülen Sie an Tag 7 die untere Kammer mit RPMI+, um den Hohlraum für die Aussaat von Monozyten vorzubereiten.
  3. Saatgut 0,1 x 106 Monozyten in 200 μl RPMI+ in der unteren Kammer.
  4. Gewinnung von Monozyten
    1. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS (-/-) und inkubieren Sie sie 7 Minuten lang bei 37 °C in vorgewärmtem PBS (-/-) mit 4 mg/ml Lidocain + 5 mM EDTA bei 37 °C und 5 % CO2.
    2. Sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie 7 Minuten lang bei 350 x g , resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI+ und zählen Sie. Platzieren Sie die Biochip-Ports nach unten, so dass die Zellen an der Membran anhaften.

5. Tag 8: Biochip-Perfusion

  1. Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt sicher, dass die Biochips bereit sind, an den Durchfluss angeschlossen und durchblutet zu werden. Bevor Sie mit der Perfusion beginnen, bereiten Sie einen leeren Inkubator vor und setzen Sie die Peristaltikpumpe hinein.
  2. Perfusion der Biochips
    1. Bevor Sie den sterilisierten Schlauch an den Biochip anschließen, spülen Sie den Schlauch mit 200 μl PBS (+/+), gefolgt von 200 μl EC-Medium. Der Schlauch hat einen Innendurchmesser von 0,5 mm, bestehend aus längeren (20 cm) und kürzeren (12 cm) Seiten, die durch zwei peristaltische Pumpenstopfen geteilt sind. Legen Sie die Schläuche beiseite und bereiten Sie die Behälter für das Medium vor.
    2. Führen Sie einen Medienaustausch in der oberen und unteren Kammer durch, indem Sie diese mit dem jeweils frisch zubereiteten Zellkulturmedium spülen.
    3. Setzen Sie das Reservoir auf der Auslassseite des Biochips ein und verbinden Sie das Reservoir mit dem Schlauch mit dem Einlass des Biochips (Abbildung 2). Verbinden Sie den Schlauch mit dem Reservoir und dem Biochip so, dass zwischen dem Reservoir und dem Biochip eine kreisförmige Mediumperfusion entsteht.
    4. Sobald alles an die Anschlüsse angeschlossen ist, füllen Sie den Behälter mit einem 500 μl EC-Medium auf. Verbinden Sie den Biochip mit dem Schlauch an einer Perfusionsrate mit einer Durchflussrate von 21 μL/min (Abbildung 2). Beobachten Sie während der ersten 15 Minuten der Perfusion genau, ob sich Blasen einfügen. Führen Sie täglich einen Mediumwechsel in beiden Kammern durch.

6. Tag 9 - Tag 11: Etablierung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche

  1. Stoppen Sie die Perfusion, leeren Sie die Reservoire und füllen Sie sie unter einem sterilen Sicherheitsschrank mit frisch zubereitetem Medium auf. Pipettieren Sie 500 μl EC-Medium in die Reservoire und spülen Sie die untere Kammer vorsichtig mit 200 μl RPMI+. Beginnen Sie die Perfusion wieder mit einer Perfusionsrate von 21 μL/min.
  2. Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI)
    1. Legen Sie ALI von Tag 12 bis zum Ende des Experiments (Tag 14) fest. Während der ALI-Kultur die Epithelzellen der Luft aussetzen.
    2. Um die ALI-Kultur zu etablieren, bereiten Sie ein neues Gefäßmedium EC vor (fügen Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 10 ng/ml GM-CSF, 20 % autologes humanes Serum, 1 μM Dexamethason hinzu), um alle Zelltypen im Chip zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt enthält das Medium eine höhere Konzentration an AS (20%).
    3. Öffnen Sie die Stopfen an der unteren Kammer unter einem sterilen Sicherheitsschrank und saugen Sie das Medium vorsichtig auf, bis eine Luftblase sichtbar ist, wie in Abbildung 3 gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Flüssigkeit aus dem Kanal und der Kammer entfernt wird, und schließen Sie die Öffnungen vorsichtig.
    4. Füllen Sie die Reservoire mit EC-Medium (-/-) und setzen Sie die Perfusionskultur mit einer Flussrate von 21 μL/min fort. Wechseln Sie das Medium bis zum 14. Tag nur in der oberen Kammer und halten Sie die Epithelzellen in der unteren Kammer nur mit Luft.

7. Tag 14: Gewebeentnahme und -analyse

  1. Trennen Sie den Biochip von der Strömung. Stecken Sie den Schlauch aus und prüfen Sie am Mikroskop die Zellkonfluenz. Aufgrund der Luft in der unteren Kammer können die Zellschichten verschwommen und schwer sichtbar erscheinen. Zu diesem Zeitpunkt ist das Modell bereit für weitere Experimente.
  2. Fixierung und Färbung von Gewebe im Biochip
    1. Waschen Sie die Kavitäten mit PBS (+/+), um das Zellkulturmedium zu entfernen. Pipettieren Sie 300 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA), gelöst in PBS (-/-), in die obere Kammer und 200 μl in die untere Kammer und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
      HINWEIS: Wenn Sie mit Fixierchemikalien wie PFA arbeiten, verwenden Sie einen Abzug. Sammeln und entsorgen Sie den Abfall entsprechend.
    2. Waschen Sie die Kammern 3x mit PBS (+/+). Lagern Sie die Biochips nach der Fixierung bei 4 °C oder verwenden Sie sie direkt für die Immunfluoreszenzfärbung von Zellen.
    3. Für die Permeabilisierung pipettieren Sie 300 μl 0,25 % Triton X-100 in PBS (+/+). 30 Minuten bei RT inkubieren.
    4. Nach der Inkubation werden beide Kammern mit PBS (+/+) gewaschen und in beiden Kammern 300 μl 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (+/+) pipettiert. 1 h bei RT inkubieren.
    5. Bereiten Sie in der Zwischenzeit das Antikörperpanel für die Immunfluoreszenzfärbung vor. Um das Antikörperpanel für die Immunfluoreszenzfärbung vorzubereiten, wurde ein Röhrchen mit einer ausreichenden Menge von 3% BSA aufgestellt, um die Antikörper zu verdünnen. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnungen für jede Membran. Verwenden Sie ein Verdünnungsverhältnis von 1:100 für primäre Antikörper-Panels und 1:200 für sekundäre Antikörper-Panels. Bereiten Sie zusätzlich für das sekundäre Antikörperpanel DAPI in einem Verdünnungsverhältnis von 1:2.000 vor. Entsprechende Antikörper finden Sie unter (Tabelle 1).
    6. Um direkt an die Zellen innerhalb des Biochips zu gelangen, muss die Klebefolie entfernt werden. Um die mikrofluidischen Kammern zu öffnen, machen Sie einen exakten Schnitt quer über die Außenseite des Hohlraums und entfernen Sie die Klebefolie. Schneiden Sie die Membran heraus, indem Sie die mit dem Biochip versiegelten Ränder mit dem Skalpell entfernen.
      HINWEIS: Arbeiten Sie während dieses Schritts präzise und genau, um Membranschäden und Verletzungen durch die Schärfe des Skalpells zu vermeiden.
    7. Nachdem Sie die Membran vom Biochip gelöst haben, teilen Sie die Membran in zwei Teile. Sammeln Sie die Membranstücke mit einer Pinzette und legen Sie sie zum Färben auf einen mikroskopisch kleinen Objektträger.
    8. 50 μl Antikörperlösung pro Membranstück pipettieren. Über Nacht bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
    9. Legen Sie die Membran nach der Inkubation in 500 μl PBS (-/-) in eine 24-Well-Platte und waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min in PBS (+/+). Nach dem Waschen 50 μl Sekundärantikörperlösung pipettieren und 1 h bei RT lichtgeschützt inkubieren.
    10. Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit PBS (+/+). Bereiten Sie in der Zwischenzeit die mikroskopischen Objektträger für das Experiment vor und beschriften Sie sie. Geben Sie einen Tropfen Einbettmedium auf die Schiene und platzieren Sie die entsprechende Membran. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Membranen. Geben Sie zum Schluss noch einen Tropfen des Eindeckmediums auf die Oberseite der Membran und verwenden Sie ein Deckglas. Bei 4 °C lagern.

Ergebnisse

Eine Untersuchung morphologischer Veränderungen und der Expression von Markerproteinen könnte mittels Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt werden. Nach 14-tägiger Co-Kultivierung werden die Gefäß- und Epithelseite auf die Expression der jeweiligen Zellmarker analysiert. Diese Methode ist nützlich für die Untersuchung der Wechselwirkungen und der Integrität von vaskulären und epithelialen Komponenten, was für die Krankheitsmodellierung als funktionelle biologische Auslesung im Zusammenhang mit Infektionen unerlässlich ist. Die Immunfluoreszenzfärbung könnte durch die Quantifizierung von Analysen, morphologischen Bewertungen und funktionellen Assays unterstützt werden, einschließlich der Freisetzung von Zytokinen, der Abwasseranalyse von Zelltodmarkern wie der LDH-Freisetzung und der Veränderung der Morphometrie von Zellen5. Auf der vaskulären Seite können die Integrität und Morphologie der Endothelzellübergangsproteine, wie z. B. VE-Cadherin, untersucht werden, um die Konfluenz und die Bildung der Endothelbarrierezu beurteilen 6 (Abbildung 4A). Nach der Perfusion sollte die Endothelzellschicht mit einer klar strukturierten Expression von VE-Cadherin an den Endothelzellgrenzen konfluent sein. Der untere Teil der Membran kann für Epithelmarker wie E-Cadherin und Surfactant Protein A (SP-A)7 immungefärbt werden. Die Expression von SP-A, einer Schlüsselkomponente des Lungentensids und einer komplexen Mischung aus Lipiden und Proteinen, reduziert die Oberflächenspannung an der epithelialen Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und verhindert dadurch in vivo den Kollaps der Alveolen während der Ausatmung und die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Lungenfunktion und des Gasaustauschs 6,8. In unserem Modell exprimieren die Epithelzellen nach der ALI-Behandlung SP-A und können durch Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden (Abbildung 4B). Die Konfluenz und Integrität der Epithelzellschicht kann durch Immunfluoreszenzfärbung von E-Cadherin, einem wichtigen epithelialen Junktionsmarker von Alveolarepithelzellen, bestätigt werden (Abbildung 4C). Das Vorhandensein von Makrophagen kann durch Immunfluoreszenzfärbung für das Makrophagen-Maker-Protein CD686 bestätigt werden (Abbildung 4C). Um virale, bakterielle oder Pilzinfektionen zu untersuchen, finden Sie Details zu Infektionsmodellen in Deinhardt-Emmer et al.6, Schicke et al.7 und Hoang et al.9.

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Abbildung 1: Repräsentatives Bild einer konfluenten HUVECs-Schicht im Biochip an Tag 3. Das Bild zeigt die Hellfeldmikroskopie mit 10-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Aufbau für die Alveolen-on-Chip- und ALI-Induktion. (A) Repräsentatives Bild des Perfusionsaufbaus für das Alveolus-on-Chip-Modell und (B) ein repräsentatives Bild der Induktion einer ALI in der Kammer durch Aufsaugen des Mediums und Einbringen von Luft in die Zellen. Die Bildung einer Luftblase im Inneren der Kammer deutet darauf hin, dass die Zellen Luft ausgesetzt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Schematische Übersicht des Alveolus-on-Chip. Ein detailliertes Protokoll für eine 14-tägige Kultur zeigt wichtige Schritte für die Aussaat und das Wachstum der Zellen innerhalb des Biochips an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Immunfluoreszenzfärbung von Endothel- und Epithelzellschichten. (A) HUVEC-Endothelzellen, die VE-Cadherin exprimieren (orange), (B-C) H441-Epithelzellen, die (B) SP-A (rot) exprimieren und (C) E-Cadherin (orange), SP-A (rot) und CD68 (grün) exprimieren, auf der Epithelseite. DAPI (blau) färbt die DNA und zeigt die Zellkerne an. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HohlraumZellen
Oberer HohlraumEndothel (0,4 x 106)
Unterer HohlraumEpithel (0,5x106H441+ 1x105 Monozyten)

Tabelle 1: Überblick über das Cell Seeding im Biochip.

Diskussion

Das Alveolus-on-Chip-Modell stellt ein mehrschichtiges Gewebemodell der menschlichen Alveole dar, das essentielle Zelltypen der unteren Atemwege integriert, einschließlich Lungenepithelzellen, Endothelzellen und Makrophagen, die in einer organotypischen Anordnung an einem ALI mit mittlerer Perfusion der Endothelschleimhaut kultiviert werden. Zellen verschiedener Schichten exprimieren spezifische Zellmarkerproteine wie E-Cadherin, ein kalziumabhängiges Adhäsionsmolekül von Lungenepithelzellen, das für die Etablierung interzellulärer Epithelbarrieren von zentraler Bedeutung ist 5,10. E-Cadherin bildet ein physikalisches Barriereelement und steuert die immunologische Reaktion auf schädliche Krankheitserreger und Substanzen in der Umwelt10,11. H441-Epithelzellen exprimieren außerdem das Tensidprotein A, das auch in der ersten Verteidigungslinie des Wirts gegen Infektionen von entscheidender Bedeutung ist, indem es immunmodulatorische und antibakterielle Aktivität vermittelt8. Die Integration von Immunzellen in das Alveolenmodell erhöht die zelluläre Komplexität, wodurch die Immunantwort auf Entzündungsauslöser, z.B. während einer Infektion, besser repliziert werden kann. In diesem Zusammenhang wurde das Modell verwendet, um die Koinfektion von Influenzavirus A und humanem opportunistischem Erreger Staphylococcus aureus (S. aureus) zu untersuchen5. In der Studie wurde ein Mechanismus der Koinfektion bei Lungenentzündung aufgedeckt, bei dem eine Virusinfektion von Epithelzellen eine signifikante Entzündungsreaktion auslöst, die die Endothelzellen erheblich schädigt und zu einem Verlust der Barrierefunktion führt. In einer anderen Studie wurde das Modell verwendet, um zu zeigen, dass eine S. aureus-Infektion die extrazellulären Spiegel von Surfactant Protein-A (SP-A), einer wichtigen Komponente der Immunabwehr in der Lunge, reduziert, wahrscheinlich aufgrund bakterieller Proteasen6. Während die Expression von SP-A weder von S. aureus noch von Influenzavirus A direkt beeinflusst wird, wird sie durch TNF-α, ein Zytokin, das als Reaktion auf bakterielle Infektionen, insbesondere in Gegenwart von Makrophagen, stark produziert wird, signifikant herunterreguliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bakterielle Mono- und Superinfektionen den SP-A-Spiegel in der Lunge senken können, was das Ergebnis einer bakteriellen Lungenentzündung möglicherweise verschlechtert6. Darüber hinaus wurde das Alveolenmodell verwendet, um die Pilzinfektion der Alveolen mit Aspergillus fumigatus und die Wirksamkeit von Antimykotika zu untersuchen, indem hochauflösende Mikroskopie und algorithmusbasierte Bildanalyse in Kombination mit molekularbiologischen Assays, einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und Zytokinprofilierung, genutzt wurden7. Die Modellierung der invasiven pulmonalen Aspergillose in der Alveole-on-Chip enthüllte Schlüsselfunktionen menschlicher Makrophagen, die das Wachstum des Pilzes teilweise hemmen könnten. Makrophagen spielten eine zentrale Rolle bei der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen, die mit einer erhöhten Anzahl invasiver Pilzhyphen korrelierten. Darüber hinaus bestätigte die Studie, dass das Fungistatikum Caspofungin das Pilzwachstum wirksam begrenzt und morphologische Veränderungen in der Pilzstruktur induziert, was mit den Ergebnissen anderer Studien übereinstimmt. Diese Studien bestätigen das Potenzial der Modellplattform für die Identifizierung zellulärer Infektionsziele und die Erprobung von Medikamenten in klinisch relevanten Konzentrationen.

Es gibt mehrere Aspekte, die bei der Etablierung des Alveolus-on-Chip berücksichtigt werden müssen. Eine präzise Zellaussaat ist entscheidend, um eine gleichmäßige Zellverteilung und Schichtbildung zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen in der richtigen Dichte ausgesät werden, um eine Konfluenz zu erreichen, ohne sich gegenseitig zu überwuchern, was die Integrität und Funktionalität der Zellschichten beeinträchtigen kann. Entfernen Sie während des ALI-Etablierungsprozesses vorsichtig das Medium von der apikalen Seite und schließen Sie die Anschlüsse, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Aufrechterhaltung optimaler Co-Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur, CO2 - Gehalt und Medienzusammensetzung, ist entscheidend für das Überleben und die Interaktion von Endothel- und Epithelzellen. Führen Sie den Mediumwechsel immer vorsichtig durch, um eine Störung der Zellschichten oder das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden. Pipettieren Sie vorsichtig und stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Geräte steril sind, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Um Luftblasen zu vermeiden, pipettieren Sie den Chip langsam und kippen Sie ihn während des Mediumwechsels, damit die Blasen entweichen können. Arbeiten Sie in einer sauberen, sterilen und kontrollierten Umgebung, um Kontaminationen zu minimieren. Berücksichtigen Sie die Komplexität und Präzision, die zum Erstellen und Verwalten des 3D-Modells für nachfolgende Experimente mit dem Modell erforderlich sind. Wenn sich Zellschichten nicht richtig bilden, sollten Sie die Zelldichte und die Zellchargen optimieren, da je nach Spender und Charge Unterschiede im Zellwachstum auftreten können.

Obwohl das Modell erhebliche Verbesserungen gegenüber bestehenden Methoden bietet, ist es auch wichtig anzuerkennen, dass einige Einschränkungen berücksichtigt werden müssen. Eine dieser Einschränkungen ist die Komplexität und die Kosten, die mit dem Betrieb des mikrofluidischen Geräts verbunden sind. Die Ausführung von Organ-on-Chip-Modellen erfordert spezielle Ausrüstung und Fachwissen in der Mikrofluidik, um das Alveolen-on-Chip-Modell zu übernehmen. Darüber hinaus kann dieses Modell zwar viele der Schlüsselmerkmale der alveolären Umgebung erfolgreich replizieren, aber nicht alle zellulären Wechselwirkungen und mechanischen Kräfte, die in vivo gefunden werden, vollständig replizieren. Zum Beispiel verfügt das Modell nicht über ein umfassendes Immunsystem oder die gesamte Bandbreite der Zelltypen in der menschlichen Lunge, was sich auf die Genauigkeit von Erreger-Wirt-Interaktionsstudien auswirken könnte.

Trotz dieser Einschränkungen bietet das Lung-on-Chip-Modell Fortschritte im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Zellkulturen wie Transwell-Systemen. Durch die Einbeziehung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, Endothel- und Epithelzellen sowie Immunkomponenten in ein mehrschichtiges Gewebe in einer dynamischen, durchbluteten Umgebung stellt das Modell einen physiologisch relevanteren Ansatz für die Untersuchung der Lungenphysiologie, der Krankheit und des Behandlungsansprechens in vitro dar. Dies ist entscheidend, um unser Verständnis von Atemwegsinfektionen beim Menschen zu verbessern und wirksamere Therapien zu entwickeln. Die Fähigkeit des Modells, biophysikalische und biochemische Signale präzise zu manipulieren, stellt ein wichtiges Merkmal dar, um die Mechanismen des Krankheitsverlaufs und der Wirkstoffwirkung zu entschlüsseln. Durch die Verwendung von menschlichem Zellmaterial können die im Tierversuch beobachteten Unterschiede zwischen den Spezies weiter reduziert werden. Die Integration mehrerer Biomarker-Analysen erhöht zusätzlich die Tiefe und Breite der Daten, die aus einem einzigen Experiment gewonnen werden können, was dazu beiträgt, die Kosten für In-vitro-Experimente zu senken. Das Lunge-on-Chip-Modell ist sich seiner Grenzen bewusst, stellt aber einen bedeutenden Schritt nach vorne in der Erforschung von Atemwegserkrankungen dar und bietet eine genauere, ethischere und effizientere Alternative zu herkömmlichen Methoden.

Offenlegungen

K.R. ist Geschäftsführer der Dynamic42 GmbH und hält Anteile an dem Unternehmen. A.S.M. ist wissenschaftlicher Berater der Dynamic 42 GmbH und hält Anteile an dem Unternehmen. Alle anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

H.K. und A.S.M. danken für die Förderung durch den Leibniz-Wissenschafts-Campus InfectoOptics Jena, finanziert durch die Förderlinie Strategische Vernetzung der Leibniz-Gemeinschaft. M.A. und A.S.M. wurden gefördert durch das vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie auf der Grundlage eines Beschlusses des Deutschen Bundestages geförderte IGF-Projekt IMPROVE. A.S.M bedankt sich ferner für die finanzielle Unterstützung durch den Exzellenzcluster Balance of the Microverse im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)InvitrogenC10283
Zellkultur-Multiwell-Platten, 24 Well, sterilGreiner Bio-One662 160
Zellkultur-Multiwell-Platten, 6 Well, sterilGreiner Bio-One657 160
Deckgläser (24x40mm; #1,5)Menzel-Glä ser15747592
Eco TücherDr. Schuhmacher00-915-REW10003-01
Eppies 2.0Sarstedt72.691
Eppis 0.5Sarstedt72.699
Eppis 1.5Sarstedt72.690.001
Falcons 15mLGreiner Bio-One188 271-TRI
Falcons 50mLGreiner Bio-One227 261-TRI
MulltupferNobaPZN 2417767
Handschuhe Nitril 3000Meditrade1280
ObjektträgerMenzel-Glä serAAAA000001##12E
Multiwell Platten 24 Well, sterilGreiner Bio-One662 160
Pasteur Pipetten (Glas) 150mmAssistent40567001
Pasteur Pipetten (Glas) 230mmAssistent40567002
Rundbodenröhrchen (PS, 5mL)Falcon352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mmSarstedt85.1637.235
SkalpelleDahlhausen11.000.00.715
Serologische Pipetten 10mLGreiner Bio-One607 160-TRI
Serologische Pipetten 25mLGreiner Bio-One760 160-TRI
Serologische Pipetten 2mLGreiner Bio-One710 160-TRI
Serologische Pipetten 50mLGreiner Bio-One768 160-TRI
Serologische Pipetten 5mLGreiner Bio-One606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-GelSarstedt1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3ESarstedt02.1066.001
Softasept NBraun3887138
T25 FlascheGreiner Bio-One690 960
Spitzen steril 10µ LGreiner Bio-One771 261
Spitzen steril 1250µ LGreiner Bio-One750 261
Tips steril 300& micro; LGreiner Bio-One738 261
Spitzen unsteril 10µ LGreiner Bio-One765 290
Spitzen unsteril 1000µ LGreiner Bio-One739 291
Spitzen unsteril 200& micro; LGreiner Bio-One686 290
Pinzette (Prä Zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1
Chemicals
Descosept AFDr. SchuhmacherN-20338
Ethanol 96%Nordbrand-Nordhausen410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)Sigma AldrichFD4-100MG
Fluoreszierendes EindeckmediumDakoS3023
MethanolVWR20847.295
SaponinFluka47036
TergazymeAlconox1304-1
Zellkultur
Collagen IVSigma-AldrichC5533-5MG
DexametasonSigma-AldrichD4902
DPBS (-/-)LonzaBE17-516F
DPBS (+/+)LonzaBE17-513F
EDTA-LösungSigma-AldrichE788S
EndothelzellwachstumsmediumPromocellC-22020
Endothelzellwachstumsmedium ErgänzungsmischungPromocellC-39225
Fötales RinderserumSigma-AldrichE2129-10g
H441ATCC
Humane rekombinante GM-CSFPeprotech300-30
LidocainSigma-AldrichL5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140-122 /-163
RPMIGibco
Trypanblau-Färbung 0,4%InvitrogenT10282
TrypsinGibco15090-046
Primäre Antikörper
Cadherin-5 / VE-Cadherin (Ziege)BD610252
CD68 (Kaninchen)CellSignaling76437
E-Cadherin (Ziege)Forschung & Forschung DAF748
SP-A (Maus)Abcamab51891
Sekundäre Antikörper
AF488 (Esel gegen Maus)InvitrogenR37114
AF647 (Esel gegen Maus)InvitrogenA31571
AF647 (Esel gegen Kaninchen)InvitrogenA31573
Cy3 (Donkey Anti Goat)jackson research705-165-147
Microfluidic
ChipDynamic 42BC002
Männlicher Luer-Lock (klein)ChipShop09-0503-0270-09
Männliche Mini-Luer-Stecker, Viererreihe, PP, grünMicrofluidic Chipshop09-0558-0336-11
Mini-Luer-Stecker, Vierer-Stecker, PP, undurchsichtigMikrofluidik Chipshop09-0556-0336-09
Mini-Luer-Stecker, Viererreihe, PP, rotMicrofluidic Chipshop09-0557-0336-10
SteckerCole ParmerGZ-45555-56
Reservoir 4,5 mLChipShop16-0613-0233-09
SchlauchDynamic 42ST001
Equipment
AutoklavTuttnauer5075 ELV
ZentrifugeEppendorf5424
CO2 InkubatorHeracell150i
Countess automatisierter ZellzählerInvitrogenC10227
DurchflusszytometerBDFACS Canto II
Gefrierschrank (-20 &Grad; C)LiebherrLCexv 4010
Gefrierschrank (-80 &Grad; C)HeraeusHerafreeze HFU 686
KühlschrankLiebherrLCexv 4010
Heraeus MultifugeThermo ScientificX3R
MikroskopLeicaDM IL LED
OrbitalschüttlerHeidolphReax2000
SchlauchpumpeREGLO Digital MS-4/12ISM597D
Pipetten 10µ LEppendorf Research plus3123000020
Pipetten 100µ LEppendorf Research plus3123000047
Pipetten 1000µ LEppendorf Research plus3123000063
Pipetten 2,5µ LEppendorf Research plus3123000012
Pipetten 20µ LEppendorf Research plus3123000039
Pipetten 200µ LEppendorf Research plus3123000055
WaageSartorius6101
WaageSartoriusTE1245
SterilbankKojairBiowizard SL-130
WasserbadJulaboSW-20C
Fluoreszenzmikroskop Setup
Apotome.2Zeiss
BeleuchtungsgerätZeissHXP 120 C
MikroskopZeissAxio Observer 5
Optisches SchneidenZeissApoTome
Netzteil MikroskopZeissEplax Vp232
Software
ZEN Blaue EditionZeiss
72400047

Referenzen

  1. Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
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  10. Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
  11. Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).

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