Lung-on-Chip-Modelle übertreffen herkömmliche 2D-Kulturen, indem sie die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Perfusion der Endothelzellen nachahmen und den Blutfluss und den Nährstoffaustausch simulieren, die für lungenphysiologische Studien entscheidend sind. Dies erhöht die Relevanz der Lungenforschung und bietet eine dynamische, physiologisch genaue Umgebung, um das Verständnis und die Behandlung von Atemwegsinfektionen zu verbessern.
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Methodenartikel
Immunkompetentes Alveolen-on-Chip-Modell zur Untersuchung der Immunantworten der Alveolarschleimhaut
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir stellen ein fortschrittliches immunkompetentes Lung-on-Chip-Modell vor, das die Struktur und Funktion der menschlichen Alveolen replizieren soll. Dieses innovative Modell verwendet einen mikrofluidisch durchbluteten Biochip, der eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche unterstützt, die die Umgebung in den menschlichen Lungenbläschen nachahmt. Tissue Engineering wird verwendet, um wichtige zelluläre Komponenten wie Endothelzellen, Makrophagen und Epithelzellen zu integrieren, um ein repräsentatives Gewebemodell der Alveole zu erstellen. Das Modell ermöglicht es, die Immunantworten der Schleimhäute auf verschiedene Krankheitserreger, darunter Viren, Bakterien und Pilze, eingehend zu untersuchen und so unser Verständnis der Lungenimmunität zu verbessern. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Details für die Etablierung dieses Alveolen-on-Chip-Modells als robuste In-vitro-Plattform für Infektionsstudien bereitzustellen, die es den Forschern ermöglicht, die komplexen Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und dem Immunsystem des Wirts in der pulmonalen Umgebung genau zu beobachten und zu analysieren. Dies wird durch die Anwendung mikrofluidischer Techniken erreicht, um wichtige physiologische Bedingungen der menschlichen Alveolen zu simulieren, einschließlich des Blutflusses und der biomechanischen Stimulation von Endothelzellen, sowie durch die Aufrechterhaltung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die für die realistische Exposition von Epithelzellen gegenüber Luft entscheidend ist. Das Modellsystem ist mit einer Reihe von standardisierten Assays kompatibel, wie z. B. Immunfluoreszenzfärbung, Zytokinprofilierung und Koloniebildungseinheit (KBE)/Plaque-Analyse, was einen umfassenden Einblick in die Immundynamik während der Infektion ermöglicht. Der Alveolus-on-Chip besteht aus essentiellen Zelltypen, einschließlich humaner distaler Lungenepithelzellen (H441) und humaner Nabelvenendothelzellen (HUVECs), die durch poröse Polyethylenterephthalat-Membranen (PET) getrennt sind, wobei primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen strategisch zwischen der Epithel- und der Endothelschicht positioniert sind. Das Gewebemodell verbessert die Fähigkeit, die nuancierten Faktoren, die an der pulmonalen Immunantwort beteiligt sind, in vitro zu analysieren und zu analysieren. Als wertvolles Instrument soll es zur Weiterentwicklung der Lungenforschung beitragen, indem es ein genaueres und dynamischeres In-vitro-Modell für die Untersuchung der Pathogenese von Atemwegsinfektionen und die Erprobung potenzieller therapeutischer Interventionen bereitstellt.
Einleitung
Die menschliche Lunge spielt eine bemerkenswerte Rolle bei der Atmung und Immunabwehr, mit komplexen Wechselwirkungen zwischen den Immunantworten der Alveolarschleimhaut1. Die Fähigkeit der Lungenbläschen, eine effiziente Immunantwort zu erzeugen, ist entscheidend für die Vorbeugung von Lungeninfektionen und die Sicherung der Lungengesundheit. Da die Lunge ständig einer Vielzahl potenzieller Risiken ausgesetzt ist, darunter Bakterien, Viren, Pilze, Allergien und Feinstaub, ist das Verständnis der Komplexität der Immunreaktionen der Alveolarschleimhaut entscheidend, um die Mechanismen hinter Atemwegsinfektionen, entzündlichen Erkrankungen und der Behandlung von Lungenerkrankungen zu entdecken1.
Um infektions- und entzündungsbedingte Prozesse der Atemwege in vitro zu untersuchen, werden Modelle benötigt, die das alveoläre Milieu und die Immunantworten originalgetreu nachahmen können. 2D-Zellkulturen und tierische Module werden seit Jahrzehnten als unverzichtbare Werkzeuge für die biomedizinische Forschung zur Immunantwort der Lunge eingesetzt. Sie haben jedoch oft Grenzen in ihrem translationalen Potenzial für menschliche Situationen. Lung-on-Chip-Modelle können dazu beitragen, die Lücke zwischen traditionellen In-vitro- und In-vivo-Modellen zu schließen und einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung humanspezifischer Immunantworten zu bieten 2,3. Lung-on-Chip-Modelle können die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche nachahmen, die für Lungenzellen erforderlich ist, um physiologische Zustände der Atemwege zu rekapitulieren und ein genaueres und robusteres Gewebemodell zu entwickeln. Diese Kulturtechnik ermöglicht eine präzise Untersuchung der Zelldifferenzierung, -funktion und -reaktion auf Medikamente oder krankheitsbezogene Reize in vitro2.
In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidikbasiertes Modell der menschlichen Alveole als effektives Werkzeug zur Rekapitulation des menschlichen Alveolenmilieus vor, indem wir Perfusion anwenden, um den Blutfluss und die biomechanische Stimulation von Endothelzellen nachzuahmen und eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche mit Epithelzellen zu integrieren, die einer Luftphaseausgesetzt sind Phase 4. Wir haben eine mikrofluidisch perfundierte Alveole auf Chip entwickelt, die die physikalische Struktur und die biologischen Wechselwirkungen der menschlichen Alveolen nachahmt, mit besonderem Fokus auf die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Diese Schnittstelle spielt eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung von respiratorischen Epithelzellen, die für die genaue Modellierung des Lungenmilieus unerlässlich ist. Das Modell verwendet humane distale Lungenepithelzellen (H441) und humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs), die durch poröse Polyethylenterephthalat (PET)-Membranen getrennt sind, wobei primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen zwischen den Zellschichten positioniert sind. Dieser Aufbau repliziert die komplizierte zelluläre Anordnung der Alveolen und ist entscheidend für die genaue Simulation der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die ein wesentlicher Faktor für die physiologische Funktion des Lungengewebes ist.
Die Logik hinter der Modellentwicklung erstreckt sich auf die Integration sowohl zirkulierender als auch geweberesidenter Immunzellen. Dieser Ansatz ist so konzipiert, dass er die entzündliche Wirtsreaktion auf Atemwegsinfektionen beim Menschen genau nachahmt und eine dynamische Umgebung für die Untersuchung von Erreger-Wirt-Interaktionen bietet. Das Vorhandensein von Makrophagen ermöglicht die Untersuchung der unmittelbaren Immunreaktionen und ihrer Interaktion mit Krankheitserregern, was die erste Verteidigungslinie gegen Atemwegsinfektionen darstellt. Darüber hinaus ermöglicht das Design der Biochip-Plattform eine bequeme und präzise Manipulation sowohl biophysikalischer als auch biochemischer Hinweise, was für die Replikation der Alveolenfunktion in vitro von entscheidender Bedeutung ist. Diese Flexibilität ist entscheidend für die Analyse der Faktoren, die zu menschlichen Infektionen beitragen, und ermöglicht es den Forschern, die Bedingungen an verschiedene Krankheitszustände anzupassen oder potenzielle therapeutische Interventionen zu testen. Die Kompatibilität der Plattform mit mehreren Auslesetechnologien, einschließlich fortschrittlicher Mikroskopie, mikrobiologischer Analysen und biochemischer Abwasseranalyse, erhöht ihren Nutzen. Diese Fähigkeiten ermöglichen eine umfassende Bewertung der Gewebereaktion auf Infektionen, einschließlich der Bewertung des zellulären Verhaltens, der Proliferation von Krankheitserregern und der Wirksamkeit von Immunantworten.
Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll und Techniken zur Erstellung und Nutzung eines humanen Alveolen-on-Chip-Modells, das sich auf die Replikation der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Integration von Immunzellen zur Untersuchung menschlicher Infektionen in vitro konzentriert.
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Protokoll
HUVEC-Zellen werden aus Nabelschnüren isoliert und bis zur Passage 4 verwendet. Primäre Monozyten werden von gesunden Spendern aus Vollblut isoliert. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Jena, Jena, Deutschland genehmigt (3939-12/13). Laut der Erklärung von Helsinki gaben alle Personen, die Zellen für die Studie spendeten, ihre Einverständniserklärung.
1. Tag 1: Vorbereitung des Biochips
- Die Biochips sind in verschiedenen Größen und Modellen erhältlich. Verwenden Sie für Experimente hier das Modell BC002. Legen Sie den Biochip in eine Petrischale aus Glas, füllen Sie die Schale und spülen Sie alle Hohlräume mit sterilem 70%igem Ethanol (EthOH). 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie anschließend die Kavitäten 2x mit sterilem ddH2O. Entfernen Sie das ddH2O.
- Beschichten Sie die Biochip-Membran beider Kavitäten mit steriler Kollagen-IV-Lösung (0,5 mg/ml in 0,5 mM Essigsäure; verwenden Sie eine Konzentration von 1:100 in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die Magnesium und Calcium PBS (+/+) enthält), indem Sie die Kollagen-IV-Lösung mit einer 1.000-μl-Pipette mit blauen Spitzen vorsichtig durch beide Hohlräume spülen. 15 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
HINWEIS: Die Verwendung einer 1.000-μl-Pipette mit Blaufilterspitzen (P1000) wird während des gesamten Protokolls empfohlen. Der Durchmesser der Öffnung der Filterspitze bedeckt die Öffnung der Anschlüsse, die die Kanäle verbinden, vollständig, wodurch das Eindringen von Luftblasen in den Chip vermieden wird. - Nach 30 min Inkubation spülen Sie die untere und obere Kammer 2x mit sterilem PBS (+/+), um das restliche Kollagen und die Essigsäure auszuspülen.
- Bereiten Sie das EC-Medium vor, indem Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) hinzufügen. Füllen Sie die obere Kammer jeder Kavität mit 250 μl EC-Medium und die untere Kammer mit 150 μl EC-Medium.
- Ernte HUVEC aus einem konfluenten T25-Kolben: Mit 5 mL Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Magnesium und Calcium PBS (-/-) waschen, 1 mL 0,25% Trypsin + 1 mM EDTA in PBS (-/-) zugeben und 3 min bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die Trypsinaktivität, indem Sie 5 mL PBS (+/+) + 5 % FCS hinzufügen und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 350 x g in einem konischen 50-ml-Röhrchen zentrifugieren. Den Überstand entfernen und das Küvettenpellet in 1 ml EC-Medium resuspendieren.
- Verwenden Sie eine serielle Verdünnung von 1:10, wenn Sie die Zellzählung durchführen. Geben Sie 10 μl des resuspendierten Zellpellets zu 90 μl Zellmedium. Kombinieren Sie die Proben sorgfältig. Verwenden Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 μl Trypanblau-Fleck. Verdünnen Sie die Zelllösung mit Trypanblau (1:1) unter Verwendung von Objektträgern der Zellzählkammern. Zählen Sie die Zellen entweder manuell mit einer Neubauer-Kammer oder mit einem automatisierten Zellzähler. Bestimmen Sie die Zellzahl und stellen Sie die Konzentration auf 0,4 x 106 Zellen pro 200 μl ein.
- Ersetzen Sie das Endothelzellmedium in der oberen Kammer des Biochips durch 200 μl EC-Medium, das suspendierte HUVECs enthält. Vorsichtig pipettieren, um die Bildung von Luftblasen in den Kanälen oder Kammern zu vermeiden. Stellen Sie die Petrischale aus Glas mit den Biochips bei 37 °C und 5 % CO2 auf.
2. Tag 2: Überprüfung der Zellschicht
- Überprüfen Sie an Tag 2 visuell die Konfluenz der HUVEC-Zellschicht in der oberen Kammer. In der oberen Kammer wird das Medium mit 300 μl EC-Medium gewechselt. Vorsichtig pipettieren, um eine Ablösung der Zellen von der Membran zu vermeiden. Führen Sie den Medienaustausch täglich nach 24 Uhr durch. Stellen Sie die Petrischale aus Glas mit den Biochips wieder auf 37 °C und 5 % CO2 ein.
3. Tag 3: Vorbereitung der unteren Kammer
- Überprüfen Sie visuell die Konfluenz der Endothelzellschicht. Bestimmen Sie an dieser Stelle das Vorhandensein einer konfluenten Schicht und einer kopfsteinpflasterartigen Morphologie (Abbildung 1). In der oberen Kammer wird das Medium mit 300 μl EC-Medium gewechselt.
- Bereiten Sie dann die untere Kammer für die Aussaat der Zellen vor, die die Epithelschicht bilden. Spülen Sie die untere Kammer vorsichtig mit 150 μl des RPMI-Mediums (fügen Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 5 % fötales Kuhserum, 1 μM Dexamethason hinzu).
- Für die untere Kammer werden 0,5 x 106 H441-Zellen in 200 μl RPMI-Medium (RPMI) pro Kavität ausgeimpft.
- Ernte von H441-Zellen
- Waschen Sie die Zellen einmal mit 5 mL PBS (-/-). Fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin + 1 mM EDTA in PBS (-/-) hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2. Die Inkubationszeit variiert je nach Konfluenz der Schicht. Innerhalb von 5-7 Minuten sollten sich die Zellen vollständig ablösen.
- Stoppen Sie die Trypsinaktivität mit 10 mL PBS (+/+) + 5% FBS, sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie 4 Minuten lang bei 200 x g .
- Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml RPMI und zählen Sie.
- 0,5 x 106 Zellen pro Kammer aussäen, indem die Zelllösung vorsichtig in die untere Kammer pipettiert wird. Schließen Sie alle Anschlüsse und drehen Sie den Biochip auf den Kopf, damit sich die Zellen an der PET-Membran anheften können. Bewahren Sie den Biochip auf dem Kopf auf und inkubieren Sie ihn über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
4. Tag 4 - Tag 7: Erhaltung der Zellen und Ernte von Monozyten
- Führen Sie täglich einen Medienwechsel in der oberen und unteren Kammer durch. Für die obere Kammer wird der Medienaustausch mit 300 μL EC-Medium durchgeführt.
- Verwenden Sie 200 μl RPMI+ (RPMI-Medium plus 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 10 ng/mL GM-CSF, 10 % autologes humanes Serum, 1 μM Dexamethason) für die untere Kammer. Spülen Sie an Tag 7 die untere Kammer mit RPMI+, um den Hohlraum für die Aussaat von Monozyten vorzubereiten.
- Saatgut 0,1 x 106 Monozyten in 200 μl RPMI+ in der unteren Kammer.
- Gewinnung von Monozyten
- Waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS (-/-) und inkubieren Sie sie 7 Minuten lang bei 37 °C in vorgewärmtem PBS (-/-) mit 4 mg/ml Lidocain + 5 mM EDTA bei 37 °C und 5 % CO2.
- Sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie 7 Minuten lang bei 350 x g , resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI+ und zählen Sie. Platzieren Sie die Biochip-Ports nach unten, so dass die Zellen an der Membran anhaften.
5. Tag 8: Biochip-Perfusion
- Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt sicher, dass die Biochips bereit sind, an den Durchfluss angeschlossen und durchblutet zu werden. Bevor Sie mit der Perfusion beginnen, bereiten Sie einen leeren Inkubator vor und setzen Sie die Peristaltikpumpe hinein.
- Perfusion der Biochips
- Bevor Sie den sterilisierten Schlauch an den Biochip anschließen, spülen Sie den Schlauch mit 200 μl PBS (+/+), gefolgt von 200 μl EC-Medium. Der Schlauch hat einen Innendurchmesser von 0,5 mm, bestehend aus längeren (20 cm) und kürzeren (12 cm) Seiten, die durch zwei peristaltische Pumpenstopfen geteilt sind. Legen Sie die Schläuche beiseite und bereiten Sie die Behälter für das Medium vor.
- Führen Sie einen Medienaustausch in der oberen und unteren Kammer durch, indem Sie diese mit dem jeweils frisch zubereiteten Zellkulturmedium spülen.
- Setzen Sie das Reservoir auf der Auslassseite des Biochips ein und verbinden Sie das Reservoir mit dem Schlauch mit dem Einlass des Biochips (Abbildung 2). Verbinden Sie den Schlauch mit dem Reservoir und dem Biochip so, dass zwischen dem Reservoir und dem Biochip eine kreisförmige Mediumperfusion entsteht.
- Sobald alles an die Anschlüsse angeschlossen ist, füllen Sie den Behälter mit einem 500 μl EC-Medium auf. Verbinden Sie den Biochip mit dem Schlauch an einer Perfusionsrate mit einer Durchflussrate von 21 μL/min (Abbildung 2). Beobachten Sie während der ersten 15 Minuten der Perfusion genau, ob sich Blasen einfügen. Führen Sie täglich einen Mediumwechsel in beiden Kammern durch.
6. Tag 9 - Tag 11: Etablierung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche
- Stoppen Sie die Perfusion, leeren Sie die Reservoire und füllen Sie sie unter einem sterilen Sicherheitsschrank mit frisch zubereitetem Medium auf. Pipettieren Sie 500 μl EC-Medium in die Reservoire und spülen Sie die untere Kammer vorsichtig mit 200 μl RPMI+. Beginnen Sie die Perfusion wieder mit einer Perfusionsrate von 21 μL/min.
- Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI)
- Legen Sie ALI von Tag 12 bis zum Ende des Experiments (Tag 14) fest. Während der ALI-Kultur die Epithelzellen der Luft aussetzen.
- Um die ALI-Kultur zu etablieren, bereiten Sie ein neues Gefäßmedium EC vor (fügen Sie 1:100 (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml), 10 ng/ml GM-CSF, 20 % autologes humanes Serum, 1 μM Dexamethason hinzu), um alle Zelltypen im Chip zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt enthält das Medium eine höhere Konzentration an AS (20%).
- Öffnen Sie die Stopfen an der unteren Kammer unter einem sterilen Sicherheitsschrank und saugen Sie das Medium vorsichtig auf, bis eine Luftblase sichtbar ist, wie in Abbildung 3 gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Flüssigkeit aus dem Kanal und der Kammer entfernt wird, und schließen Sie die Öffnungen vorsichtig.
- Füllen Sie die Reservoire mit EC-Medium (-/-) und setzen Sie die Perfusionskultur mit einer Flussrate von 21 μL/min fort. Wechseln Sie das Medium bis zum 14. Tag nur in der oberen Kammer und halten Sie die Epithelzellen in der unteren Kammer nur mit Luft.
7. Tag 14: Gewebeentnahme und -analyse
- Trennen Sie den Biochip von der Strömung. Stecken Sie den Schlauch aus und prüfen Sie am Mikroskop die Zellkonfluenz. Aufgrund der Luft in der unteren Kammer können die Zellschichten verschwommen und schwer sichtbar erscheinen. Zu diesem Zeitpunkt ist das Modell bereit für weitere Experimente.
- Fixierung und Färbung von Gewebe im Biochip
- Waschen Sie die Kavitäten mit PBS (+/+), um das Zellkulturmedium zu entfernen. Pipettieren Sie 300 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA), gelöst in PBS (-/-), in die obere Kammer und 200 μl in die untere Kammer und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
HINWEIS: Wenn Sie mit Fixierchemikalien wie PFA arbeiten, verwenden Sie einen Abzug. Sammeln und entsorgen Sie den Abfall entsprechend. - Waschen Sie die Kammern 3x mit PBS (+/+). Lagern Sie die Biochips nach der Fixierung bei 4 °C oder verwenden Sie sie direkt für die Immunfluoreszenzfärbung von Zellen.
- Für die Permeabilisierung pipettieren Sie 300 μl 0,25 % Triton X-100 in PBS (+/+). 30 Minuten bei RT inkubieren.
- Nach der Inkubation werden beide Kammern mit PBS (+/+) gewaschen und in beiden Kammern 300 μl 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (+/+) pipettiert. 1 h bei RT inkubieren.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit das Antikörperpanel für die Immunfluoreszenzfärbung vor. Um das Antikörperpanel für die Immunfluoreszenzfärbung vorzubereiten, wurde ein Röhrchen mit einer ausreichenden Menge von 3% BSA aufgestellt, um die Antikörper zu verdünnen. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnungen für jede Membran. Verwenden Sie ein Verdünnungsverhältnis von 1:100 für primäre Antikörper-Panels und 1:200 für sekundäre Antikörper-Panels. Bereiten Sie zusätzlich für das sekundäre Antikörperpanel DAPI in einem Verdünnungsverhältnis von 1:2.000 vor. Entsprechende Antikörper finden Sie unter (Tabelle 1).
- Um direkt an die Zellen innerhalb des Biochips zu gelangen, muss die Klebefolie entfernt werden. Um die mikrofluidischen Kammern zu öffnen, machen Sie einen exakten Schnitt quer über die Außenseite des Hohlraums und entfernen Sie die Klebefolie. Schneiden Sie die Membran heraus, indem Sie die mit dem Biochip versiegelten Ränder mit dem Skalpell entfernen.
HINWEIS: Arbeiten Sie während dieses Schritts präzise und genau, um Membranschäden und Verletzungen durch die Schärfe des Skalpells zu vermeiden. - Nachdem Sie die Membran vom Biochip gelöst haben, teilen Sie die Membran in zwei Teile. Sammeln Sie die Membranstücke mit einer Pinzette und legen Sie sie zum Färben auf einen mikroskopisch kleinen Objektträger.
- 50 μl Antikörperlösung pro Membranstück pipettieren. Über Nacht bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Legen Sie die Membran nach der Inkubation in 500 μl PBS (-/-) in eine 24-Well-Platte und waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min in PBS (+/+). Nach dem Waschen 50 μl Sekundärantikörperlösung pipettieren und 1 h bei RT lichtgeschützt inkubieren.
- Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit PBS (+/+). Bereiten Sie in der Zwischenzeit die mikroskopischen Objektträger für das Experiment vor und beschriften Sie sie. Geben Sie einen Tropfen Einbettmedium auf die Schiene und platzieren Sie die entsprechende Membran. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Membranen. Geben Sie zum Schluss noch einen Tropfen des Eindeckmediums auf die Oberseite der Membran und verwenden Sie ein Deckglas. Bei 4 °C lagern.
- Waschen Sie die Kavitäten mit PBS (+/+), um das Zellkulturmedium zu entfernen. Pipettieren Sie 300 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA), gelöst in PBS (-/-), in die obere Kammer und 200 μl in die untere Kammer und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
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Ergebnisse
Eine Untersuchung morphologischer Veränderungen und der Expression von Markerproteinen könnte mittels Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt werden. Nach 14-tägiger Co-Kultivierung werden die Gefäß- und Epithelseite auf die Expression der jeweiligen Zellmarker analysiert. Diese Methode ist nützlich für die Untersuchung der Wechselwirkungen und der Integrität von vaskulären und epithelialen Komponenten, was für die Krankheitsmodellierung als funktionelle biologische Auslesung im Zusammenhang mit Infektionen unerlässlich ist...
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Diskussion
Das Alveolus-on-Chip-Modell stellt ein mehrschichtiges Gewebemodell der menschlichen Alveole dar, das essentielle Zelltypen der unteren Atemwege integriert, einschließlich Lungenepithelzellen, Endothelzellen und Makrophagen, die in einer organotypischen Anordnung an einem ALI mit mittlerer Perfusion der Endothelschleimhaut kultiviert werden. Zellen verschiedener Schichten exprimieren spezifische Zellmarkerproteine wie E-Cadherin, ein kalziumabhängiges Adhäsionsmolekül von Lungenepithelzellen, das für die Etablierung inte...
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Offenlegungen
K.R. ist Geschäftsführer der Dynamic42 GmbH und hält Anteile an dem Unternehmen. A.S.M. ist wissenschaftlicher Berater der Dynamic 42 GmbH und hält Anteile an dem Unternehmen. Alle anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
H.K. und A.S.M. danken für die Förderung durch den Leibniz-Wissenschafts-Campus InfectoOptics Jena, finanziert durch die Förderlinie Strategische Vernetzung der Leibniz-Gemeinschaft. M.A. und A.S.M. wurden gefördert durch das vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie auf der Grundlage eines Beschlusses des Deutschen Bundestages geförderte IGF-Projekt IMPROVE. A.S.M bedankt sich ferner für die finanzielle Unterstützung durch den Exzellenzcluster Balance of the Microverse im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Consumables | |||
| Cellcounting chamber slides (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Zellkultur-Multiwell-Platten, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Zellkultur-Multiwell-Platten, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Deckgläser (24x40mm; #1,5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | |
| Eco Tücher | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Mulltupfer | Noba | PZN 2417767 | |
| Handschuhe Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Objektträger | Menzel-Glä ser | AAAA000001##12E | |
| Multiwell Platten 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Pasteur Pipetten (Glas) 150mm | Assistent | 40567001 | |
| Pasteur Pipetten (Glas) 230mm | Assistent | 40567002 | |
| Rundbodenröhrchen (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Skalpelle | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Serologische Pipetten 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Serologische Pipetten 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Serologische Pipetten 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Serologische Pipetten 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| Serologische Pipetten 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 Flasche | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| Spitzen steril 10µ L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Spitzen steril 1250µ L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Tips steril 300& micro; L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Spitzen unsteril 10µ L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| Spitzen unsteril 1000µ L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Spitzen unsteril 200& micro; L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| Pinzette (Prä Zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Ethanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Fluoreszierendes Eindeckmedium | Dako | S3023 | |
| Methanol | VWR | 20847.295 | |
| Saponin | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| Zellkultur | |||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| EDTA-Lösung | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Endothelzellwachstumsmedium | Promocell | C-22020 | |
| Endothelzellwachstumsmedium Ergänzungsmischung | Promocell | C-39225 | |
| Fötales Rinderserum | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| Humane rekombinante GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Trypanblau-Färbung 0,4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Primäre Antikörper | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (Ziege) | BD | 610252 | |
| CD68 (Kaninchen) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (Ziege) | Forschung & Forschung D | AF748 | |
| SP-A (Maus) | Abcam | ab51891 | |
| Sekundäre Antikörper | |||
| AF488 (Esel gegen Maus) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (Esel gegen Maus) | Invitrogen | A31571 | |
| AF647 (Esel gegen Kaninchen) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (Donkey Anti Goat) | jackson research | 705-165-147 | |
| Microfluidic | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| Männlicher Luer-Lock (klein) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Männliche Mini-Luer-Stecker, Viererreihe, PP, grün | Microfluidic Chipshop | 09-0558-0336-11 | |
| Mini-Luer-Stecker, Vierer-Stecker, PP, undurchsichtig | Mikrofluidik Chipshop | 09-0556-0336-09 | |
| Mini-Luer-Stecker, Viererreihe, PP, rot | Microfluidic Chipshop | 09-0557-0336-10 | |
| Stecker | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
| Reservoir 4,5 mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| Schlauch | Dynamic 42 | ST001 | |
| Equipment | |||
| Autoklav | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| CO2 Inkubator | Heracell | 150i | |
| Countess automatisierter Zellzähler | Invitrogen | C10227 | |
| Durchflusszytometer | BD | FACS Canto II | |
| Gefrierschrank (-20 &Grad; C) | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Gefrierschrank (-80 &Grad; C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Kühlschrank | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| Mikroskop | Leica | DM IL LED | |
| Orbitalschüttler | Heidolph | Reax2000 | |
| Schlauchpumpe | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| Pipetten 10µ L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| Pipetten 100µ L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| Pipetten 1000µ L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| Pipetten 2,5µ L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| Pipetten 20µ L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| Pipetten 200µ L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Waage | Sartorius | 6101 | |
| Waage | Sartorius | TE1245 | |
| Sterilbank | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Wasserbad | Julabo | SW-20C | |
| Fluoreszenzmikroskop Setup | |||
| Apotome.2 | Zeiss | ||
| Beleuchtungsgerät | Zeiss | HXP 120 C | |
| Mikroskop | Zeiss | Axio Observer 5 | |
| Optisches Schneiden | Zeiss | ApoTome | |
| Netzteil Mikroskop | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN Blaue Edition | Zeiss |
Referenzen
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- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
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- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
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Nachdrucke und Genehmigungen
