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Immunkompetentes Darm-on-Chip-Modell zur Analyse der Immunantworten der Darmschleimhaut

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DOI:

10.3791/66603

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24. Mai 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry II, Jena University Hospital, 2Cluster of Excellence Balance of the Microverse, Friedrich Schiller University, 3Jena School of Microbial Communication, Friedrich Schiller University, 4Dynamic42 GmbH, 5Jena Center for Sepsis Control and Care, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.

Zusammenfassung

Es wurde ein fortschrittliches Darm-on-Chip-Modell entwickelt, das epitheliale 3D-organotypische zottenartige und kryptenartige Strukturen nachbildet. Das immunkompetente Modell umfasst humane Nabelvenendothelzellen (HUVEC), Caco-2-Darmepithelzellen, geweberesidente Makrophagen und dendritische Zellen, die sich selbst im Gewebe organisieren und die Eigenschaften der menschlichen Darmschleimhaut widerspiegeln. Ein einzigartiger Aspekt dieser Plattform ist ihre Fähigkeit, zirkulierende menschliche primäre Immunzellen zu integrieren, was die physiologische Relevanz erhöht. Das Modell soll die Reaktion des intestinalen Immunsystems auf bakterielle und pilzliche Besiedlung und Infektion untersuchen. Aufgrund seiner vergrößerten Kavitätengröße bietet das Modell vielfältige funktionelle Messwerte wie Permeationsassays, Zytokinfreisetzung und Immunzellinfiltration und ist kompatibel mit der Immunfluoreszenzmessung von 3D-Strukturen, die von der Epithelzellschicht gebildet werden. Dabei bietet es umfassende Einblicke in die Zelldifferenzierung und -funktion. Die Darm-on-Chip-Plattform hat ihr Potenzial bei der Aufklärung komplexer Wechselwirkungen zwischen Surrogaten einer lebenden Mikrobiota und menschlichem Wirtsgewebe innerhalb einer mikrophysiologischen durchbluteten Biochip-Plattform unter Beweis gestellt.

Einleitung

Organ-on-Chip (OoC)-Systeme stellen eine aufstrebende Technik der 3D-Zellkultur dar, die in der Lage ist, die Lücke zwischen herkömmlichen 2D-Zellkulturen und Tiermodellen zu schließen. OoC-Plattformen bestehen in der Regel aus einem oder mehreren Kompartimenten, die gewebespezifische Zellen enthalten, die auf einer Vielzahl von Gerüsten wie Membranen oder Hydrogelen gezüchtetwerden 1. Die Modelle sind in der Lage, eine oder mehrere definierte organotypische Funktionen nachzuahmen. Pumpen ermöglichen die kontinuierliche mikrofluidische Perfusion von Zellkulturmedium zur Entfernung zellulärer Abfallprodukte, zur Versorgung mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren für eine verbesserte zelluläre Differenzierung und zur Wiederherstellung wesentlicher In-vivo-Bedingungen. Durch die Integration von Immunzellen können OoC-Systeme die menschliche Immunantwort in vitro nachahmen 2. Bisher wurde ein breites Spektrum an Organen und Funktionseinheiten vorgestellt1. Zu diesen Systemen gehören Modelle des Gefäßsystems3, der Lunge4, der Leber 2,5 und des Darms6, die für Arzneimitteltests 5,7 und Infektionsstudien 6,8 ermöglicht werden können.

Wir präsentieren hier ein humanes Darm-on-Chip-Modell, das humane Epithelzellen integriert, die eine organotypische 3D-Topographie von zottenartigen und kryptenartigen Strukturen bilden, kombiniert mit einer Endothelauskleidung und geweberesidenten Makrophagen. Das Modell wird in einem mikrofluidisch perfundierten Biochip in Form eines mikroskopischen Objektträgers kultiviert. Jeder Biochip besteht aus zwei separaten mikrofluidischen Kavitäten. Jeder Hohlraum ist durch eine poröse Polyethylenterephthalat (PET)-Membran in eine obere und eine untere Kammer unterteilt. Die Membran selbst dient auch als Gerüst für das Wachstum der Zellen auf jeder Seite. Die Poren der Membran ermöglichen zelluläres Übersprechen und Zellmigration zwischen den Zellschichten. Jede Kammer ist über zwei weibliche Luer-Lock-Anschlüsse zugänglich. Optional kann ein zusätzlicher Mini-Luer-Anschluss in der Größe eines Locks den Zugang zur oberen oder unteren Kammer ermöglichen (Abbildung 1).

Die OoC-Plattform bietet eine Reihe von Messwerten, die aus einem einzigen Experiment gewonnen werden können. Der Darm-on-Chip ist auf die Kombination von perfundierter 3D-Zellkultur, Abwasseranalyse und Fluoreszenzmikroskopie zugeschnitten, um die Zellmarkerexpression, die Metabolisierungsraten, die Immunantwort, die mikrobielle Besiedlung und Infektion sowie die Barrierefunktion zu beurteilen 3,6,8. Das Modell umfasst geweberesidente Immunzellen und den direkten Kontakt lebender Mikroorganismen mit dem Wirtsgewebe, was im Vergleich zu anderen veröffentlichten Modellen einen Vorteil darstellt9. Darüber hinaus organisieren sich Epithelzellen selbst zu dreidimensionalen Strukturen, die eine physiologisch relevante Schnittstelle für die Besiedlung mit einer lebenden Mikrobiota darstellen6.

Protokoll

Dieses Protokoll erfordert den Zugang zu ~20 ml frischem Blut pro Biochip von gesunden Spendern, um primäre menschliche Monozyten zu isolieren. Alle Spenderinnen und Spender gaben eine schriftliche, informierte Einwilligung zur Teilnahme an dieser Studie, die von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Jena genehmigt wurde (Zulassungsnummer 2018-1052-BO). Weitere Informationen zu den Materialien finden Sie in der Materialtabelle. Einzelheiten zur Zusammensetzung aller Lösungen und Medien finden Sie in Tabelle 1.

1. Allgemeine Bemerkungen zur Handhabung von Biochips

  1. Trennen Sie vorsichtig einen Streifen von Behältern und lösen Sie die Deckel mit einem erhitzten Messer, um einzelne Behälter und Deckel zu erhalten. Erweitern Sie das Loch des Deckels, damit der Silikonschlauch eng anliegt.
  2. Der Silikonschlauch hat einen Innendurchmesser von 0,5 mm, ist asymmetrisch und wird durch zwei peristaltische Pumpenstopfen in eine längere (20 cm) und eine kürzere (12 cm) Seite getrennt. Montieren Sie zwei Röhrchen jeder Symmetrie pro Biochip, indem Sie ein Röhrchen an einem männlichen Luer-Lock-Connecter befestigen und den Deckel auf der gegenüberliegenden Seite des Röhrchens anbringen. Bauen Sie außerdem vier Reservoirs pro Biochip zusammen.
    HINWEIS: Bereiten Sie Schläuche und Reservoirs im Voraus vor und sterilisieren Sie sie vor der Verwendung durch Autoklavieren. Da der Silikonschlauch eine begrenzte Lebensdauer hat, tauschen Sie den Schlauch nach 3-5 Versuchen aus. Für bestimmte Forschungsinteressen, wie z. B. Drogentests, wird empfohlen, für jedes Experiment neue Schläuche vorzubereiten. Viele Schritte dieses Protokolls laufen parallel ab. Siehe die Übersichtsabbildung, die die verschiedenen Schritte zeigt, die an einem Tag ausgeführt wurden, wie in Abbildung 2 gezeigt.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Darm-on-Chip-Modells. (A) Der Biochip wird in einer Querschnittsansicht dargestellt. (B) Die Abmessungen des gesamten Biochips sowie der flachen, abnehmbaren PET-Membran sind sichtbar. Das Gesamtvolumen der oberen Kammer einschließlich der weiblichen Luer-Lock-Ports beträgt 290 μl bzw. 270 μl für die untere Kammer. (C) Zu sehen ist ein schematischer Aufbau des Darm-Biochips, des dreidimensionalen Auswuchsepithels, das zottenartigen und kryptenartigen Strukturen ähnelt, einschließlich differenzierter Immunzellen und einer Schleimschicht. Die andere Seite der PET-Membran ist von einer endothelialen Monoschicht bedeckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematischer Überblick über den Zeitplan für den Modellaufbau und den Versuchsaufbau. Diese Abbildung zeigt die schematische Übersicht des vorgestellten Protokolls. Wichtige Vorgänge, wie die Aussaat von Zellen und die epitheliale Provokation mit LPS sind durch Pfeile gekennzeichnet. Abkürzungen: HUVECs = humane nabelvenöse Endothelzellen; LPS = Lipopolysaccharid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Sterilisation von Biochips

  1. Eine sterile Petrischale aus Glas mit einem Durchmesser von 15 cm wird zu 70 % mit unvergälltem Ethanol gefüllt. Platzieren Sie den Biochip so, dass alle Anschlüsse des Biochips vollständig von der Ethanollösung bedeckt sind.
  2. Ziehen Sie zweimal pro Port 1 ml 70%iges Ethanol durch alle Kammern des Chips. 45-60 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luft im Biochip eingeschlossen ist. Ab diesem Zeitpunkt sollte keine Luft mehr in das Biochip-System eindringen und die Hohlräume sollten mit Flüssigkeit gefüllt bleiben.
  3. Entfernen Sie das Ethanol aus der Petrischale und ersetzen Sie es durch steriles doppelt destilliertes Wasser (ddH2O), bis alle Anschlüsse vollständig bedeckt sind. Ziehen Sie wiederum zweimal pro Port 1 mL ddH2O durch den Biochip-Hohlraum. Frischen Sie das ddH2O in der Petrischale auf und wiederholen Sie den Vorgang.
  4. Entfernen Sie alle Flüssigkeiten aus der Petrischale. Bewahren Sie danach die vollständig sterilisierten Biochips in der geschlossenen Petrischale auf, wenn sie sich außerhalb einer sterilen Umgebung befinden. Geben Sie ein kleines Reservoir (z. B. den Deckel eines 50-ml-Röhrchens) mit 2-5 mL ddH2O in die Petrischale, um die Verdunstung von Flüssigkeit im Biochip zu reduzieren.
    HINWEIS: Biochips können bis zu 3 Tage im Voraus sterilisiert werden, wenn sie bis zur Verwendung in einer sterilen Umgebung aufbewahrt werden. Dies ermöglicht eine flexible Arbeitsbelastung an einem einzigen Tag.

3. Ernte und Aussaat der HUVECs

HINWEIS: Die humanen venösen Nabelzellenzellen (HUVECs) wurden aus Nabelschnüren isoliert, wie vor10 veröffentlicht.

  1. Vor der Aussaat der HUVECs die Membran mit humanem Kollagen IV beschichten. Bereiten Sie dazu eine 1:100-Verdünnung einer Kollagen-Stammlösung (Tabelle 1) in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung vor, die Magnesium und Calcium enthält (PBS +/+). Geben Sie 350 μl der verdünnten Stammlösung in die entsprechende Kammer. 5 min bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Wenn Sie den Biochip in der sterilen Haube handhaben, empfehlen wir, ein steriles Tuch darunter zu legen, um überschüssiges Medium aufzufangen.
  2. Spülen Sie alle Kammern zweimal mit 350 μL PBS +/+, um das restliche Kollagen und die Essigsäure auszuwaschen. Geben Sie dann 350 μl Endothelzellwachstumsmedium (EC) in jede Kammer.
    HINWEIS: Von hier aus sind die Biochips bereit für die Zellaussaat und können bis zur Verwendung bei 37 °C gelagert werden.
  3. Verwenden Sie HUVECs an den Passagen 1-3 bei 80-90% Zellkonfluenz. Kultivieren Sie HUVECs in EC-Medium, das eine vom Hersteller bereitgestellte definierte Ergänzungsmischung enthält. Ein repräsentatives Hellfeldbild einer HUVEC-Zellkultur ist in Abbildung 3A dargestellt.
    HINWEIS: Je nach Spender können HUVECs mit höheren Passagen beginnen, sich zu dedifferenzieren und können keine dichte und konfluente Monoschicht im Biochip bilden. Die Verwendung von Antibiotika, d. h. 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, ist fakultativ, wird aber als Ergänzung zum EC-Medium empfohlen, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
  4. Nehmen Sie das Zellkulturmedium aus einem T25-Zellkulturkolben und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 3-5 mL der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco ohne Magnesium und Calcium (PBS -/-). Entfernen Sie das PBS -/- und fügen Sie 1 ml Trypsin-Dissoziationsreagenz hinzu (Tabelle 1). 5 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen vom Zellkulturkolben lösen.
  5. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein Röhrchen mit 9 ml 5 % fötalem Rinderserum (FBS) in PBS -/-. Bei 350 × g für 5 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand entfernen, in 1 mL EC-Medium resuspendieren und die Anzahl der Zellen bestimmen. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 0,4 × 106 Zellen pro 150 μl (Aussaat in der unteren Kammer) oder pro 250 μl (Aussaat in der oberen Kammer) ein.
  6. Geben Sie das entsprechende Zellvolumen in die Kammer. Wenn Sie in der unteren Kammer säen, schließen Sie alle Anschlüsse und positionieren Sie den Biochip sofort auf dem Kopf, so dass die Zellen auf die PET-Membran fallen. Inkubieren Sie die Biochips in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
  7. Führen Sie nach 24 h einen Medienaustausch der HUVEC-haltigen Kammer mit 350 μL EC-Medium durch. Das Medium in der gegenüberliegenden Kammer muss nicht ausgetauscht werden.

4. Humane Serumentnahme und Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) aus Monozyten

HINWEIS: Die PBMCs wurden isoliert, wie in Mosig et al.11 beschrieben.

  1. Entnahme von humanem venösem Blut von gesunden Spendern. Beschaffen Sie pro Biochip mindestens 10 ml Vollblut in silikathaltigen Blutentnahmeröhrchen für die Serumentnahme. Nach vollständiger Koagulation zentrifugieren Sie die Blutentnahmeröhrchen bei 2.500 × g für 10 min bei RT. Entnehmen Sie das Serum, aliquot und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
  2. Beschaffen Sie mindestens 10 ml Vollblut vom selben Spender in EDTA-haltigen Blutentnahmeröhrchen für die PBMC-Isolierung. Mischen Sie das nicht koagulierte Blut vorsichtig 1:1 mit Isopuffer (Tabelle 1) durch Inversion und schichten Sie langsam 35 ml dieser Mischung auf 15 ml eines Dichtegradientenmediums mit einer Dichte von 1,077 g/ml in einem 50 ml-Röhrchen.
  3. Zentrifugieren Sie bei 800 × g für 20 min ohne Bremse bei RT. Die resultierende Immunzellschicht, die auf dem Dichtegradientenmedium erscheint, wird vorsichtig herausgezogen und in ein neues 50-ml-Röhrchen überführt. Füllen Sie bis zu 50 mL mit kaltem Iso-Puffer und waschen Sie die Zellen durch sanfte Inversion.
  4. Bei 200 × g für 8 min ohne Bremse bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird verworfen und in 10 ml Isopuffer pro Dichtegradient resuspendiert. Optional: Poolen Sie PBMCs eines Donors, wenn mehrere Gradienten parallel ausgeführt werden.
  5. Bei 150 × g 8 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 10 ml Isopuffer pro Dichtegradient resuspendiert. Der Zentrifugationsschritt 4.4 wird wiederholt. Zum Schluss wird der Überstand verworfen und die Zellen in 2 ml Monozyten-Differenzierungsmedium resuspendiert (Tabelle 1).
    HINWEIS: Die Zugabe von M-CSF und GM-CSF erzwingt die Differenzierung der isolierten Monozyten zu Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (in Kombination mit Lipopolysaccharid [LPS], das zu einem späteren Zeitpunkt dieses Protokolls hinzugefügt wird). Die Verwendung von Antibiotika, d. h. 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, ist fakultativ, wird aber als Ergänzung des Mediums empfohlen, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern.
  6. Bestimmen Sie die Zellzahl und den Seed ~10 × 106 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte in 2 ml Monozyten-Differenzierungsmedium (Tabelle 1). In einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C für 1 h inkubieren, um die Monozyten an den Kunststoff der 6-Well-Platte anheften zu können.
  7. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie ihn 2x mit vorgewärmten 2 ml hämatopoetischem Zellmedium, um die ungebundenen Zellen zu entfernen. Bei 37 °C für weitere 24 h in Monozyten-Differenzierungsmedium inkubieren.
  8. Um die Monozyten zu gewinnen, entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie ihn einmal mit 2 mL vorgewärmtem PBS -/-. In Abbildung 3B finden Sie ein Beispiel für ein Hellfeldbild der Monozytenkultur an dieser Stelle. Inkubieren Sie die Zellen dann 7 Minuten lang in 1 ml vorgewärmtem Monozytenablösungsreagenz (Tabelle 1) bei 37 °C, um die Ablösung der Monozyten vom Kunststoff der 6-Well-Platte zu erzwingen.
  9. Übertragen Sie die abgelösten Monozyten in ein niedrig bindendes Röhrchen. Optional: Um eine höhere Zellausbeute zu erzielen, waschen Sie die 6-Well-Platte mehrmals vorsichtig mit PBS -/-.
  10. Bei 300 × g für 8 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und in EC-konditioniertem Medium resuspendieren (Tabelle 1). Bestimmen Sie die Zellzahl und stellen Sie die Zellkonzentration auf 0,1 × 106 Zellen pro 150 μL (Aussaat in der unteren Kavität) oder pro 250 μL (Aussaat in der oberen Kavität) ein.
    HINWEIS: Seien Sie bei allen Schritten der Immunzellisolierung vorsichtig und reduzieren Sie die Scherkräfte, um eine Aktivierung der Immunzellen zu verhindern. Bei der Etablierung dieser Isolierung ist die Reinheit der PBMC-abgeleiteten Monozyten zu überprüfen (z. B. durch Durchflusszytometrie). Mehr als 95% aller Zellen sollten positiv für typische Monozytenmarker wie CD14 sein.

5. Aussaat von Monozyten

  1. In der HUVEC-haltigen Kammer wird ein Medienaustausch mit 350 μL vorgewärmtem EC-konditioniertem Medium durchgeführt.
  2. 150 μl (untere Kammer) oder 250 μl (obere Kammer) der vorbereiteten Monozytensuspension (siehe Schritt 4.10) in dieselbe Kammer geben. Wenn Sie in die untere Kammer säen, schließen Sie alle Anschlüsse und positionieren Sie den Biochip sofort auf dem Kopf, damit die Zellen auf die HUVEC-Schicht fallen. Inkubieren Sie den Biochip in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
  3. In der HUVEC + Monozyten-haltigen Kammer wird alle 24 h ein Mediumaustausch mit 350 μl EC-konditioniertem Medium durchgeführt.

6. C2BBe1-Ernte und Aussaat

HINWEIS: Die Caco-2-Bürstenrand, die die Zellen 1 (C2BBe1)12 exprimieren, werden bis zum Durchgang 35 verwendet und aus Kolben mit einer Konfluenz von 80-90 % entnommen. Ein repräsentatives Hellfeldbild einer C2BBe1-Kultur ist in Abbildung 3C dargestellt.

  1. C2BBe1-Zellen in C2-Medium kultivieren (Tabelle 1).
    HINWEIS: Die Verwendung von Antibiotika, d. h. 20 μg/ml Gentamicin, ist optional, wird aber als Ergänzung des C2-Mediums empfohlen, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
  2. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus einem T25-Zellkulturkolben und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 3-5 mL PBS -/-. Entfernen Sie das PBS -/- und fügen Sie 1 ml Trypsin-Dissoziationsreagenz hinzu (Tabelle 1). 5 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen vom Zellkulturkolben lösen.
  3. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein Röhrchen, indem Sie 9 ml 5% fötales Rinderserum (FBS) in PBS -/- verwenden. Bei 350 × g für 5 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand entfernen, in 1 mL C2-Medium resuspendieren und die Anzahl der Zellen bestimmen. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 0,5 × 106 Zellen pro 150 μl (Aussaat in der unteren Kammer) oder pro 250 μl (Aussaat in der oberen Kammer) ein.
  4. Waschen Sie vor der Aussaat des C2BBe1 die jeweilige Kammer vorsichtig mit 350 μL C2-Medium.
  5. 150 μL (untere Kammer) bzw. 250 μL (obere Kammer) der vorbereiteten C2BBe1-Suspension (siehe Schritt 6.3) in die jeweilige Kammer geben. Wenn Sie in die untere Kammer säen, schließen Sie alle Anschlüsse und positionieren Sie den Biochip sofort auf dem Kopf, damit die Zellen auf die PET-Membran fallen. Inkubieren Sie die Biochips in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.

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Abbildung 3: Zellmorphologie von HUVECs, Monozyten und C2BBe1 vor der Aussaat im Biochip. Diese Abbildung zeigt repräsentative Hellfeldbilder der verschiedenen Zellquellen, die im gesamten Protokoll verwendet werden. Die Bilder wurden mit einem umgekehrten Hellfeldmikroskop mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Alle Zelltypen, (A) HUVECs, (B) Monozyten und (C) C2BBe1 wurden in 2D-Monolayer-Zellkulturen kultiviert, wie in den jeweiligen Protokollabschnitten beschrieben. Maßstabsleisten = 200 μm. Abkürzungen: HUVECs = humane nabelvenöse Endothelzellen; PBMCs = mononukleäre Zellen des peripheren Blutes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Anschluss an Peristaltikpumpe und Zirkularperfusion

  1. Bereiten Sie einen leeren Inkubator mit einer Schlauchpumpe vor. Reinigen Sie alle Bereiche des Inkubators und der Pumpe gründlich mit Desinfektionsmittel, um eine quasi-sterile Umgebung zu schaffen.
    HINWEIS: Schlauchpumpen können während der Arbeit viel Wärme erzeugen. In gut isolierten Brutschränken oder schlecht klimatisierten Laboren kann die Anzahl der nutzbaren Pumpen pro Brutkasten begrenzt sein, da Brutschränke zur Überhitzung neigen. Zwei Schlauchpumpen pro Inkubator sollten ausreichend sein.
  2. Bevor Sie die sterilisierten Röhrchen an den Biochip anschließen, spülen Sie jeden Schlauch mit 700 μl PBS +/+, gefolgt von 500 μl C2-Medium oder EC-konditioniertem Medium. Bereiten Sie einen Schlauch für jede Symmetrie pro Medium vor (siehe Schritt 1.2). Verwenden Sie den Schlauch mit dem kurzen Abstand vom Luer-Lock zum peristaltischen Pumpenstopfen für die linke Kavität und den Schlauch mit der anderen Symmetrie für die rechte Kavität.
  3. Entnehmen Sie den Biochip aus dem Inkubator und führen Sie einen Medienaustausch mit 350 μL für jede Kammer durch. Entfernen Sie alle Stecker und füllen Sie alle Anschlüsse bis ganz nach oben.
  4. Beginnen Sie am linken Hohlraum und verbinden Sie den ersten Schlauch mit dem rechten Anschluss der oberen Kammer, indem Sie den Luer-Lock-Adapter in den Anschluss des Biochips einführen. Verbinden Sie dann den zweiten Schlauch mit dem linken Anschluss der unteren Kammer. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den richtigen mikrofluidischen Hohlraum.
  5. Nehmen Sie ein Reservoir und geben Sie einen kleinen Tropfen Zellkulturmedium auf den Boden des Reservoirs. Setzen Sie dann das Reservoir auf die gegenüberliegende Seite des ersten Schlauchs ein und wiederholen Sie den Vorgang für die andere Kammer. Sobald alle Anschlüsse mit einem Schlauch oder Reservoir verbunden sind, füllen Sie die Reservoirs mit 3,5 ml Zellkulturmedium.
  6. Legen Sie die lose Seite des Schlauchs, an der der Deckel befestigt ist, auf das Reservoir, um das mikrofluidische System jeder Kammer zu schließen. Transportieren Sie in diesem Zustand den Biochip zur Schlauchpumpe.
    HINWEIS: Abhängig von der Entfernung zum Inkubator und der Laborumgebung kann eine zuvor gereinigte und autoklavierte Box verwendet werden, um die Chips in den Inkubator zu überführen.
  7. Verwenden Sie die Schlauchpumpenstopfen, um den Schlauch mit der Pumpe zu verbinden. Schließen Sie jeden Schlauch so an die Schlauchpumpe an, dass das Medium aus dem Reservoir in den Hohlraum, in den Schlauch und über die Pumpe zurück in das Reservoir fließt (Abbildung 4). Das Reservoir dient als Blasenfalle in der zirkulären Perfusion und verhindert, dass Luft im System eingeschlossen wird. Jede Kammer wird mit einer Durchflussrate von 50 μL/min durchblutet, was zu einer Scherspannung von 0,013 dyn/cm2 in der oberen Kammer und 0,006 dyn/cm2 in der unteren Kammerführt 8.
    HINWEIS: Wird das Medium der unteren und oberen Höhle in entgegengesetzte Richtungen bewegt, kann ein höheres dreidimensionales Auswachsen des Darmgewebes erreicht werden13. Daher sind die Reservoire des oberen und unteren Hohlraums auf gegenüberliegenden Seiten angeordnet (Abbildung 4). Die zirkuläre Perfusion reduziert die Menge an benötigtem Zellkulturmedium, könnte aber möglicherweise zu einer Anreicherung von Zytokinen und Metaboliten führen. Auf Wunsch ist auch eine lineare Perfusion des Biochips möglich.
  8. Perfusionieren Sie den Biochip 72 h lang bei 37 °C und 5 % CO2.

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Abbildung 4: Biochip, der mit der Schlauchpumpe verbunden ist. Vorgestellt wird ein Beispiel für einen Biochip, der mit einer Schlauchpumpe verbunden ist. Epithel-C2BBe1-Zellen werden in der unteren Kammer kultiviert (rotes C2-Medium befindet sich in den Reservoiren vorne), während die HUVECs in der oberen Kammer kultiviert werden (gelbliches EC-konditioniertes Medium befindet sich in den Reservoirs auf der Rückseite). Die verschiedenen Zellkulturmedien vermischen sich aufgrund der Barrierefunktion des gezüchteten Gewebes nicht. Der Biochip wird so mit der Peristaltikpumpe verbunden, dass das Medium aus dem Reservoir in den Hohlraum fließt. Von hier fließt das Medium durch die Schläuche über die Pumpe zurück in das Reservoir. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. LPS-Konditionierung der Epithelbarriere

  1. Nach 72 Stunden Präperfusion stoppen Sie die Peristaltikpumpe und entfernen Sie den Deckel, der mit dem Schlauch jedes Reservoirs verbunden ist. Legen Sie es auf ein steriles Tuch neben der Pumpe.
  2. Entfernen Sie das gesamte Medium und füllen Sie die Behälter mit 2 mL frisch zubereitetem Medium. Für die epitheliale Seite, die die C2BBe1-Zellen enthält, geben Sie 100 ng/mL LPS in das Medium.
    HINWEIS: Das LPS erhöht die Barrierefunktion des Gewebes, stimuliert die von Monozyten abgeleiteten Makrophagen, in das Epithelgewebe zu migrieren, und ermöglicht die Differenzierung von dendritischen Zellen aus Monozyten.
  3. Schließen Sie die Schläuche und Deckel wieder an das Reservoir an und setzen Sie die zirkuläre Perfusion bei einer Flussrate von 50 μl/min für weitere 24 Stunden fort.
    HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt kann das Chip-Modell in Experimenten, Tests von Verbindungen oder Infektionsstudien verwendet werden. Wir empfehlen einen Medienaustausch von 2 mL pro Reservoir alle 24 h.

9. Zugang zum Gewebe für verschiedene Auslesemethoden

  1. Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt der Perfusion Überstände des Zellkulturmediums aus den Reservoiren. Öffnen Sie den Behälter und sammeln Sie das gewünschte Volumen (siehe Schritte 8.1-8.3). Verwenden Sie diese Überstände zum Nachweis von Metaboliten, Zytokinen oder anderen Molekülen.
  2. Um an das Gewebe zu gelangen, verwenden Sie ein Skalpell, um einen präzisen Schnitt entlang der Außenseite der oberen Kammer zu machen, und entfernen Sie die Klebefolie, um den mikrofluidischen Hohlraum zu öffnen. Das Gewebe des Darm-Biochip-Modells ist nun zugänglich. Schneiden Sie vorsichtig an der Außenseite der mikrofluidischen Kammer entlang, um die Membran vom Biochip zu lösen. Entnehmen Sie die gewebehaltige Membran mit einer Pinzette.
    ACHTUNG: Achten Sie bei diesem Schritt auf die Fingerplatzierung und arbeiten Sie vorsichtig, um Unfälle zu vermeiden. Schnittschutzhandschuhe werden empfohlen.
  3. Alternativ können die Zellen mit Enzymlösungen, d. h. Trypsin oder Zellen, die mit Triton X-100-haltigen Puffern lysiert wurden, aus separaten Schichten im Inneren des Biochips entnommen werden.

10. Permeabilitätsbewertung mittels FITC-Dextran-Diffusion

HINWEIS: Die Barrierefunktion des Gewebes kann über einen FITC-Dextran-Permeabilitätsassay nach Abschaltung der Peristaltikpumpe analysiert werden. Die Bewertung der Durchlässigkeit von FITC-Dextran wurde von Deinhardt-Emmer et al.4 adaptiert.

  1. Eine Stammlösung aus Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran (Molekulargewicht von 3-5 kDa, Tabelle 1) herstellen.
  2. Leeren Sie die Behälter und trennen Sie den Chip von der Perfusion.
  3. Führen Sie in der oberen und unteren Kammer einen Medienaustausch mit phenolrotfreiem Medium durch.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn während des Versuchs bereits phenolrotfreies Medium verwendet wurde.
  4. 350 μl 1 mg/ml FITC-Dextran-Lösung in die Kammer geben, die die C2BBe1-Zellen enthält.
  5. Schließen Sie die Öffnungen und inkubieren Sie den Chip 60 Minuten lang bei 37 °C mit der Epithelseite nach oben.
  6. Nach der Inkubationszeit wird das Nährmedium aus beiden Kammern des Chips getrennt entnommen und bis zur Messung bei 4 °C lichtgeschützt gelagert.
  7. Für die Messung ist eine Standardkurve in C2-Medium und dem EC-konditionierten Medium ohne Phenolrot im Bereich von 1.000 μg/mL bis 0 μg/mL FITC-Dextran mit 11 aufeinanderfolgenden 1:2 Serienverdünnungen zu erstellen.
  8. Übertragen Sie 200 μl jeder Probe in eine schwarze 96-Well-Platte mit klarem Boden. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Emissionswellenlänge von 517 nm.
  9. Verwenden Sie die Standardkurve, um die FITC-Dextran-Konzentration der Proben und damit den Permeabilitätskoeffizienten zu berechnen.

11. Immunfluoreszenz-Färbung

HINWEIS: Das lebende Gewebe kann mikroskopisch untersucht werden. Für eine einfachere Handhabung empfehlen wir die Abtrennung des Biochips von der Peristaltikpumpe und die Verwendung von Fernobjektiven an einem inversen Mikroskop. Als Endpunktanalyse kann das Gewebe im Biochip fixiert werden, z. B. für die Immunfluoreszenzfärbung.

  1. Stoppen Sie die Schlauchpumpe und öffnen Sie die Reservoirs aller Kavitäten. Leeren Sie die Reservoirs und trennen Sie die Schläuche sowie die Reservoirs vom Biochip.
  2. Waschen Sie die mikrofluidischen Kavitäten zweimal pro Kammer mit 500 μl kaltem PBS +/+. 500 μl eiskaltes Methanol in alle Kavitäten geben und 15 min bei -20 °C inkubieren. Waschen Sie dann die mikrofluidische Kammer zweimal pro Kavität mit 500 μl PBS +/+.
    HINWEIS: Andere Fixierungsmethoden, wie z.B. die Fixierung mit 4% Paraformaldehyd oder Carnoy's Fixiermittel, sind ebenfalls geeignet. Nach der Fixierung können die Chips bei 4 °C gelagert werden oder direkt zur Immunfluoreszenzfärbung übergehen. ACHTUNG: Fixierende Chemikalien wie Methanol oder Paraformaldehyd sind giftig. Führen Sie die jeweiligen Aufgaben unter einem Abzug durch und sammeln Sie den Müll entsprechend.
  3. Öffnen Sie den Chip wie in Schritt 9.2 beschrieben, um an das Gewebe zu gelangen. Schneiden Sie die gewebehaltige PET-Membran in bis zu drei Stücke, um sie parallel mit verschiedenen Immunopanels zu färben.
  4. Übertragen Sie jedes der Membranstücke mit einer Präzisionspinzette auf eine separate 24-Well-Platte, die eine Blockierungs- und Permeabilisierungslösung enthält (Tabelle 1). Stellen Sie sicher, dass die interessierende Zellschicht während des gesamten Färbeprozesses immer nach oben zeigt. Inkubieren Sie die Membranstücke 30 Minuten lang bei RT.
    HINWEIS: Die besten Färbeergebnisse werden erzielt, wenn das Serum auf den Sekundärantikörper abgestimmt wird. Werden z.B. Sekundärantikörper von Ziegenarten gewonnen, empfehlen wir die Verwendung von normalem Ziegenserum.
  5. Übertragen Sie die Membranstücke auf einen sauberen Objektträger in einer Feuchtkammer. Bereiten Sie das primäre Antikörperpanel in der Färbelösung vor (Tabelle 1) und fügen Sie jedem Membranstück 50 μl hinzu. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Die optimale Antikörperkonzentration und Färbewirksamkeit kann je nach Hersteller und Klon unterschiedlich sein. Wir empfehlen, die Färbeplatten vorher in einer 2D-Zellkultur zu testen.
  6. Nach der Inkubation werden die Proben auf eine 24-Well-Platte umgefüllt und die Membranen 3 x 5 min lang vorsichtig mit Waschlösung gewaschen (Tabelle 1).
  7. Übertragen Sie die Membranstücke erneut auf einen sauberen Objektträger in einer Feuchtkammer. Bereiten Sie das sekundäre Antikörperpanel in Färbelösung vor (Tabelle 1) und fügen Sie jedem Membranstück 50 μl hinzu. Falls erforderlich, fügen Sie eine nukleare Gegenfärbung wie 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder Hoechst hinzu. 30 Minuten bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Bewahren Sie bei der Arbeit mit Fluorophoren die Proben vor Licht geschützt auf, um Photobleiche zu verhindern und die Bildqualität zu verbessern.
  8. Nach der Inkubation werden die Proben auf eine 24-Well-Platte umgefüllt und die Membranen 2 x 5 min vorsichtig mit Waschlösung gewaschen (Tabelle 1). Dann einmal mit PBS +/+ für 5 min waschen.
  9. Montieren Sie die Membranstücke mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium und einem Deckglas auf einen sauberen Objektträger. Bis zur mikroskopischen Bildgebung bei 4 °C lagern.

Ergebnisse

Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen die unterschiedlichen Gewebeschichten des Darm-on-Chip-Modells. Sie sind immunfluoreszenzgefärbt, wie in Protokollabschnitt 11 beschrieben. Die Bilder wurden mit einem Epifluoreszenz- oder konfokalen Fluoreszenzmikroskop als z-Stacks aufgenommen und zu einer orthogonalen Projektion verarbeitet. In der Materialtabelle finden Sie Details zum mikroskopischen Aufbau und zur Software. Abbildung 5 zeigt die Gefäßschicht, eine barrierebildende endotheliale Monoschicht, bestehend aus HUVECs und Makrophagen. Repräsentative zelluläre Marker wie VE-Cadherin und von-Willebrand-Faktor für die Endothelzellen und CD68 für die Makrophagen sind angefärbt. Die dreidimensionale Epithelschicht, bestehend aus C2BBe1-Zellen, ist in Abbildung 6 und Abbildung 7 dargestellt. Die Integrität des Gewebes wird durch Färbung von E-Cadherin und ZO-1 bestätigt. Eine detaillierte Analyse aller zu erwartenden Gewebemarker und der Gewebepolarisation findet sich in Maurer et al.6. Abbildung 8 zeigt ein beispielhaftes Bild, in dem das dreidimensionale Auswachsen von darmzottenartigen Strukturen fehlt. Im Vergleich zu einer typischen dreidimensionalen Zellschicht (Abbildung 6) ist die Anzahl der gefärbten Zellkerne stark reduziert, und die Zellen sind nur in einer Monoschicht vorhanden. Dieser spezifische Phänotyp wurde durch die Zugabe eines Histon-Deacetylase-Inhibitors zum Zellkulturmedium erzeugt, der die Zellproliferation hemmt. Die Permeabilität der Barriere wird durch einen Permeationsassay mit FITC-Dextran bestimmt. Die Permeabilität nahm nach Infektion mit dem opportunistischen pathogenen C. albicans zu, wie in Abbildung 9A gezeigt. Die Infektion führt zu einer erhöhten Freisetzung der Zytokine IL-1β, IL-6, IL-8 und IL-10 in den vaskulären Medienüberstand (Abbildung 9B)8.

figure-results-1
Abbildung 5: Fixierte Gefäßseite des Darms auf Chip. Repräsentatives Immunfluoreszenzbild der Gefäßbarriere nach fünf Tagen Perfusion. Das Gewebe wurde mit Methanol fixiert. Mit einem Epifluoreszenzmikroskop wurde ein Z-Stapel von 1 μm-Schnitten aufgenommen, und es wird eine orthogonale Maximalprojektion dieses Z-Stapels dargestellt. (A) Die DNA innerhalb der Zellkerne wurde mit DAPI gefärbt. (B) Vollständig differenzierte Monozyten-abgeleitete Makrophagen exprimieren CD68 und sind über das gesamte Gefäßgewebe verteilt. (C) HUVECs bilden eine konfluente Schicht, die durch die Bildung von Adhärentverbindungen wie VE-Cadherin die Integrität des Gewebes zeigt. Darüber hinaus wird der (D)-von-Willebrand-Faktor in hohem Maße durch HUVECs exprimiert. Schließlich (E) werden alle Marker in einem Overlay angezeigt. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; HUVECs = humane venöse Nabelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Fixierte epitheliale Seite des Darms auf dem Chip. Repräsentatives Immunfluoreszenzbild der polarisierten Epithelzellschicht nach 5 Tagen Perfusion, die die Verbindungsproteine E-Cadherin und ZO-1 exprimiert. Das Gewebe wurde mit Methanol fixiert. Ein Z-Stack von 1 μm Schnitten wurde mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Eine orthogonale maximale Projektion dieses Z-Stapels wird angezeigt. (A) Die DNA in den Zellkernen wurde mit DAPI gefärbt. Eine dichte Epithelbarriere entsteht durch die Bildung von (B) Adhärens, gefärbt mit E-Cadherin, und (C) apikalen Tight Junctions, gefärbt mit ZO-1. Tight Junctions und Adhärens-Verbindungen kolokalisieren an der apikalen Zellmembran, wie im Überlagerungsbild (D) zu sehen ist. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzung: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Fixierte epitheliale Seite des Darms auf dem Chip mit zottenartigem Auswuchs. Repräsentatives Immunfluoreszenzbild der dreidimensionalen Epithelzellschicht nach sechstägiger Perfusion. Das Gewebe wurde mit dem Fixiermittel von Carnoy fixiert. Ein Z-Stapel von 1 μm großen Schnitten wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen, und (A) eine orthogonale maximale Projektion dieses Z-Stapels ist dargestellt. Die DNA in den Zellkernen wurde mit Hoechst angefärbt. Zusätzlich wurde das Gewebe mit Weizenkeimagglutin gefärbt, einem Lektin, das menschliches Muzin färbt. (B) Das dreidimensionale Wachstum von zottenartigen und kryptenartigen Strukturen des Epithels kann in den x- und y-Abschnitten des z-Stapels nachgewiesen werden. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzung: WGA = Weizenkeimagglutinin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Fixierte epitheliale Seite des Darms auf dem Chip ohne zottenartigen Auswuchs. Repräsentatives Immunfluoreszenzbild der Epithelzellschicht, die mit Suberoylanilidhydroxamsäure (SAHA), einem Histon-Deacetylase-Inhibitor, behandelt wurde, der die Zellproliferation verhindert. Das Gewebe wurde mit Methanol fixiert. Ein Z-Stack von 1 μm Schnitten wurde mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Eine orthogonale maximale Projektion dieses Z-Stapels wird angezeigt. (A) Die DNA in den Zellkernen wurde mit DAPI gefärbt. In (B) werden die Adhärenverbindungen mit E-Cadherin gefärbt, und in (C) werden die Tight Junctions mit ZO-1 gefärbt. Tight Junctions und Adherens Junctions sind kolokalisiert, wie in der Überlagerungsabbildung (D) zu sehen ist. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzung: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Erreger-abhängige Immunantwort von integrierten angeborenen Immunzellen: Diese Abbildung ist modifiziert von Kaden et al.8. Das Darm-on-Chip-Modell, das nicht mit C. albicans SC5314 infiziert (-) oder infiziert (+) war, wurde auf (A) Permeabilität mit FITC-Dextran (3-5 kDa) und (B) Zytokinsekretion analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Lösung/MediumZusammensetzung
Kollagen-Stammlösung0,5 mg/ml Kollagen i.v. in 0,5 mM Essigsäure
Iso-PufferPBS -/-, 1 mg/mL Rinderserumalbuminfraktion V, 2 mM EDTA
Monozyten-DifferenzierungsmediumHämatopoetisches Zellmedium + 10 % humanes autologes Serum + 10 ng/ml rekombinanter Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) + 10 ng/ml rekombinanter Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF)
Reagenz für Trypsin-Dissoziation0,25% Trypsin + 1 mM EDTA in PBS -/-
Reagenz zur Monozytenablösung4 mg/mL Lidocain + 5 mM EDTA in PBS -/-
EG-konditioniertes MediumEC-Medium +10 % humanes autologes Serum +10 ng/mL M-CSF + 10 ng/mL GM-CSF
C2-mittelDMEM hoher Glukosegehalt (4,5 g/l) + 10 % FBS + 1 % GlutaMax + 1 % MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren + 1 mM Natriumpyruvat + 10 μg/ml humanes Holo-Transferrin
Stammlösung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran1 mg/mL in vorgewärmtem C2-Medium ohne Phenolrot
Blockierende und permeabilisierende Lösung3% normales Eselserum (NDS) + 0,1% Saponin in PBS +/+
Lösung zum Färben0,3% normales Eselserum (NDS) + 0,1% Saponin in PBS +/+
Waschlösung0,1% Saponin in PBS +/+
Carnoy's Fixiermittel60 % Ethanol, 30 % Chloroform, 10 % Eisessig

Tabelle 1: Liste und Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen. Abkürzung: PBS -/- = Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Magnesium und Calcium.

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Generierung eines immunkompetenten Darm-on-Chip-Modells. Wir haben spezifische Techniken und mögliche Auslesemethoden wie Immunfluoreszenzmikroskopie, Zytokin- und Metabolitenanalyse, Durchflusszytometrie, Protein- und Genanalyse sowie Permeabilitätsmessung beschrieben.

Das beschriebene Modell besteht aus primären HUVECs, Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen, die mit einer 3D-Schicht von Darmepithelzellen kokultiviert wurden, die Aspekte von schleimsernden, absorptiven, enteroendokrinen und Paneth-Zell-ähnlichen Populationen repräsentieren, wie zuvorbeschrieben 6,14. Bei der Durchführung der Protokollschritte müssen einige kritische Punkte beachtet werden. Bei allen Schritten sollte die Bildung von Luftblasen innerhalb des mikrofluidischen Systems verhindert werden. Pipettieren Sie daher immer rückwärts (nehmen Sie das Volumen ab dem zweiten Stopp auf und dosieren Sie nur bis zum ersten Stopp), wenn Sie den Biochip oder den Schlauch anfassen. Um hohen Druck oder Scherkräfte auf Zellen innerhalb des Biochips zu vermeiden, pipettieren Sie beim Pipettieren im Biochip immer vorsichtig und halten Sie die gegenüberliegende Kammer geschlossen (z. B. beim Wechseln des Mediums in der oberen Kammer die untere Kammer mit den entsprechenden Stopfen schließen). Der Biochip ermöglicht die Aussaat von Zellen auf zwei Seiten einer PET-Membran. Daher kann das Modell mit darmzottenartigen Strukturen unter der PET-Membran aufgebaut werden oder auf der Membran nach oben wachsen. Je nach Forschungsinteresse hat die eine oder andere Ausrichtung der Zellen bestimmte Vorteile in Bezug auf die physikalische Interaktion, wie z.B. die schwerkraftunterstützende Zellanheftung von zirkulierenden, im Strömungsmedium suspendierten Zellen.

Durch die mikrofluidische Medienströmung bilden die polarisierten Darmzellen ein dreidimensionales Gewebe, das kryptenartigen und zottenartigen Strukturen ähnelt und durch ein dichtes Netz von Tight Junctions und Adhärensverbindungen eine tiefe apikale Gewebebarriere bildet6. Darüber hinaus erhöhen die integrierten angeborenen Immunzellen die intestinale Barrierefunktion und ermöglichen eine detaillierte Untersuchung der Zytokin- und Immunzellantworten auf verschiedene Reize, einschließlich spenderspezifischer Immunantworten 3,6. Das Modell bietet eine physiologisch relevante Plattform, um mikrobielle Kommensale (z.B. Lactobacillus rhamnosus6) und Krankheitserreger (z.B. Candida albicans 6,8 ) des menschlichen Darms zu untersuchen. Das Modell wurde genutzt, um Mechanismen der Veränderung der mikrobiellen Zusammensetzung des Darms und die Regulation der mukosalen Immunantwort zu untersuchen6. In der Studie zeigten wir, wie die physiologische Immuntoleranz des Darmlumens nachgebildet und die homöostatische Besiedlung durch lebende Mikroorganismen unterstützt werden kann. Darüber hinaus reduzierte die Präbesiedlung der luminalen Seite des Modells mit probiotischem Lactobacillus rhamnosus die Gewebeinvasion von Candida albicans und beschränkte seine Translokation in das Gefäßkompartiment, ähnlich wie in vivo. Die Studie bewies das Potenzial des Modells, mikrobielle Interaktionen, Immunantworten und Pathogenitätsmechanismen des Darms unter physiologisch relevanten Bedingungen in vitro zu untersuchen.

Dennoch hat diese Chipplattform Einschränkungen, nämlich die Verwendung von aus Krebs gewonnenen Darmzellen, die nicht vollständig in der Lage sind, den menschlichen Darm zu repräsentieren, und die Verwendung von primären Endothel- und Immunzellen. Hypoxische Kulturbedingungen können durch Kultivierung des Modells in einem Hypoxie-Inkubator unter perfundierten Bedingungen ermittelt werden, um die in vivo-Situation des menschlichen Darms besser widerzuspiegeln.

Im Vergleich zu anderen OoC-Plattformen, wie z.B. dem von Kim et al.14,15 veröffentlichten "gut-on-a-chip"-Modell, ist die anfängliche Zellzahl, die das vorgestellte Gewebemodell bildet, etwa 10-fach höher. Dies ermöglicht beispielsweise die gleichzeitige Analyse von bis zu drei Immunfluoreszenz-Färbepanels innerhalb eines einzigen Experiments. Die größeren Zellzahlen rationalisieren Endpunktanalysen, einschließlich Durchflusszytometrie, Western-Blot-Analyse und andere Standard-Assays, die Zellkulturüberstände wie Zytokin-Profiling und Laktatdehydrogenase (LDH)-Messung erfordern. Die Gewinnung mehrerer Messwerte aus einem einzigen Experiment reduziert die Gesamtkosten und die Versuchszeit. Aufgrund der standardisierten Biochip-Plattform mit Industrieschnittstellen und Footprints (mikroskopisches Slide-Format des Chips, Ports im Luer-Lock-Format und Ausrichtung auf der 96-Well-Matrix) sind Standard-Hardwarelösungen von einem breiten Spektrum von Herstellern verfügbar. Dazu gehören auch viele Membranen aus unterschiedlichen Materialien und Porengrößen. Die Porengröße kann das Zellwachstum und die Gewebeintegrität16 sowie die Zellmigration beeinflussen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein detailliertes und anpassungsfähiges Darm-on-Chip-Modell darstellt, das entscheidende Elemente der menschlichen Darmumgebung repliziert. Es bietet eine skalierbare und effektive Plattform für die Durchführung umfangreicher Forschungen über die Darmmikrobiota und das intestinale Wirtsgewebe, mit besonderem Schwerpunkt auf Immunantworten des Wirts und der intestinalen Pathophysiologie. Damit ist das Modell in der Lage, die Lücke zwischen traditionellen In-vitro-Modellen und der Humanbiologie zu schließen, was es zu einem unverzichtbaren Werkzeug für eingehende Studien zur Darmbiologie macht.

Offenlegungen

M.R. ist Geschäftsführer der Dynamic42 GmbH und hält Anteile an dem Unternehmen. A.S.M. ist wissenschaftlicher Berater der Dynamic 42 GmbH und hält Anteile an dem Unternehmen.

Danksagungen

Die Arbeiten wurden finanziell unterstützt durch den Sonderforschungsbereich PolyTarget 1278 (Projektnummer 316213987) an V.D.W. und A.S.M. A.F. und A.S.M. würdigen ferner die finanzielle Unterstützung durch den Exzellenzcluster "Balance of the Microverse" im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder - EXC 2051 - Projekt-ID 690 390713860. Wir danken Astrid Tannert und dem Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) dafür, dass sie uns Zugang zu ihrem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ZEISS LSM980 zur Verfügung gestellt haben. Abbildung 1C und Abbildung 2 wurden mit Biorender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-Platte schwarz, klarer BodenThermo Fisher10000631Verbrauchsmaterialien
EssigsäureRoth3738.4Chemikalien
Alexa Fluor 488 AffiniPure, Esel, Anti-Maus-IgG (H+L)Jackson Immuno Research715-545-150Sekundäre Antikörper-Gefäßfärbung und Epithelfärbung
Alexa Fluor 647 AffiniPure, Esel, Anti-Kaninchen-IgG (H+L)Jackson Immuno Research711-605-152Sekundäre Antikörper-Epithelfärbung
Alexa Fluor 647, Esel, Anti-Kaninchen-IgG (H+L)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenA31573Sekundäre Antikörper-Gefäßfärbung
Axiocam ERc5s KameraZeiss426540-9901-000Technische Ausstattung
Basalmedium MV, phenolrotfreiPromocellC-22225Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
BiochipDynamic 42BC002Mikrofluidische Verbrauchsmaterialien
BSA-Fraktion VGibco15260-037Zellkultur-Verbrauchsmaterialien
C2BBe1 (Klon von Caco-2)ATCCCRL-2102Epithelzellquelle
ChloroformSigmaC2432Chemikalien
CO2-InkubatorHeracell150iTechnische Ausstattung
Kollagen IV aus menschlicher PlazentaSigma-AldrichC5533Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Deckgläser (24 x 40 mm; #1.5)Menzel-Glä ser15747592Verbrauchsmaterialien
Cy3 AffiniPure, Esel, Anti-Ziegen-IgG (H+L)Jackson Immuno Research705-165-147Sekundäre Antikörper-Gefäßfärbung
Cy3 AffiniPure, Esel, Anti-Ratte IgG (H+L)Jackson Immuno Research712-165-150Sekundäre Antikörper-Epithelfärbung
Descosept PURDr.Schuhmacher00-323-100Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
DMEM high glucoseGibco41965-062Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
DMEM high glucose ohne PhenolrotGibco31053028Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
DPBS (-/-)Gibco14190-169Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
DPBS (+/+)Gibco14040-133Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
EDTA-LösungInvitrogen15575-038Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Endothelzellwachstumsmedium PromocellC-22020Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Ergänzungsmischung für EndothelzellwachstumsmittelPromocellC-39225Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Ethanol 96%, unvergälltNordbrand-Nordhausen410Chemikalien
Fötales RinderserumInvitrogen10270106Zellkultur Verbrauchsmaterialien
Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran (3-5 kDa)Sigma AldrichFD4-100MGChemikalien
Fluoreszierendes EindeckmediumDakoS3023Chemikalien
Gentamycin (10mg/ml)Sigma AldrichG1272Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050061Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
HistopaqueSigma-Aldrich10771Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Hoechst (BisBenzimid) H33342Sigma-Aldrich14533Epithelfärbung
Holotransferrin (5 mg/ml) Transferrin, Holo, HumanplasmaMillipore616397Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Humane rekombinante GM-CSFPeprotech300-30Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Humane rekombinant M-CSFPeprotech300-25Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
BeleuchtungsgerätZeissHXP 120 CEinrichtung des Fluoreszenzmikroskops
Laser-Scanning-MikroskopZeissCLSM980Einrichtung des Fluoreszenzmikroskops
LidocainhydrochloridSigma-AldrichL5647Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Lipopolysaccharid (LPS)SigmaL2630Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Loftex WipesLoftex1250115Verbrauchsmaterialien
Röhrchen mit niedrigem Aufsatz (PS, 5 mL)Falcon352052Verbrauchsmaterialien
Luer-Adapter für die obere Kappe (M)Mo Bi TecM3003Mikrofluidische Verbrauchsmaterialien
Mini-Luer-Stecker mit Steckern, Viererreihe, PP, undurchsichtigMicrofluidic Chipshop09-0556-0336-09Mikrofluidische Verbrauchsmaterialien
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren LösungGibco11140Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
MethanolRoth8388.2Chemikalienmikroskop
ZeissAxio Observer 5Aufbau des Fluoreszenzmikroskops
ObjektträgerMenzelMZ-0002Verbrauchsmaterialien
Monoklonal, Maus, Anti-Human-CD68-Antikörper ( KP1)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen14-0688-82Primärer Antikörper Gefäßfärbung
Monoklonaler, Ratte, Anti-Human-E-Cadherin-Antikörper (DECMA-1)Sigma-Aldrich, MilliporeMABT26Primärer Antikörper Epithelfärbung
Multiskan Go PlattenleserThermo Fisher51119300Technische Ausrüstung
Normales EselsserumBiozolLIN-END9010-10Chemikalien
SchnittsZeissApoTomeFluoreszenzmikroskop
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140-122Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
PlugsCole ParmerGZ-45555-56Mikrofluidische Verbrauchsmaterialien
Polyklonale, Ziegen-, Anti-Human-VE-Cadherin-AntikörperR& D SystemsAF938Primärer Antikörper Gefäßfärbung
Polyklonal, Kaninchen, Anti-Mensch Von-Willebrand-Faktor-AntikörperDakoA0082Primärer Antikörper Gefäßfärbung
Polyklonaler, Kaninchen, Anti-Human-ZO-1-AntikörperThermo Fisher Scientific, Invitrogen61-7300Primärer Antikörper Epithelfärbung
MikroskopZeissEplax Vp232Aufbau des Fluoreszenzmikroskops
Primovert MikroskopZeiss415510-1101-000Technische Ausstattung
Reglo ICC SchlauchpumpeIsmatecISM4412Technische Ausstattung
SAHA (Vorinostat)Sigma AldrichSML0061-25MGChemikalien
SaponinFluka47036Chemikalien
S-Monovette, 7,5 mL Z-GelSarstedt01.1602Verbrauchsmaterialien
S-Monovette, 9,0 mL K3ESarstedt02.1066.001Verbrauchsmaterialien
NatriumpyruvatGibco11360-088Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
Tank 4,5 mLChipShop10000079Mikrofluidik Verbrauchsmaterialien
Trypanblau gefärbt 0,4%InvitrogenT10282Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
TrypsinGibco11538876Verbrauchsmaterialien für Zellkulturen
SchläucheDynamic 42ST001Mikrofluidische Verbrauchsmaterialien
Pinzetten (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1Verbrauchsmaterialien
Weizenkeim-Agglutinin (WGA)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenW32464Epithelfärbung
X-VIVO 15LonzaBE02-060FZellkultur-Verbrauchsmaterialien, Hämatopoetisches Zellmedium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterilGreiner Bio-One662 160Verbrauchsmaterialien
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterilGreiner Bio-One657 160Verbrauchsmaterialien
Zen Blue SoftwareZeissVersion 3.7Mikroskopie-Software
Aufbau des optischen Netzteil

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Immunantwort im Darm3D ZillusstrukturenKrypten hnliche Strukturengewebest ndige Makrophagendendritische Zellenmikrofluidischer BiochipInfiltration von ImmunzellenPermeationsassayImmunfluoreszenzmessung
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