Methodenartikel

Wachsender mykobakterieller Biofilm als Modell zur Untersuchung von Antibiotikaresistenzen

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DOI:

10.3791/66607

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12. Juli 2024

 , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Entwicklung eines Pellikel-Biofilms. Die Methode ist auf verschiedene Kulturvolumina skalierbar und ermöglicht eine einfache Anwendung für verschiedene experimentelle Ziele. Das Methodendesign ermöglicht eine qualitative oder quantitative Bewertung des biofilmbildenden Potenzials mehrerer Mykobakterienarten.

Zusammenfassung

Viele Bakterien gedeihen in komplizierten natürlichen Gemeinschaften und weisen Schlüsselattribute der Vielzelligkeit wie Kommunikation, Kooperation und Wettbewerb auf. Die häufigste Manifestation des bakteriellen mehrzelligen Verhaltens ist die Bildung von Biofilmen, die oft mit Pathogenität verbunden sind. Biofilme bieten einen Zufluchtsort gegen antimikrobielle Wirkstoffe und begünstigen die Entstehung von Antibiotikaresistenzen. Die konventionelle Praxis der Kultivierung von Bakterien in Schüttelkolben-Flüssigkulturen repräsentiert nicht ihr richtiges physiologisches Wachstum in der Natur, was unser Verständnis ihrer komplizierten Dynamik einschränkt. Bemerkenswert ist, dass die metabolischen und transkriptionellen Profile von Bakterien, die sich in Biofilmen befinden, denen natürlich wachsender Zellen sehr ähnlich sind. Diese Parallelität unterstreicht die Bedeutung von Biofilmen als ideales Modell für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Modellorganismus, um eine Technik zur Kultivierung von Pellikel-Biofilmen zu veranschaulichen. Der Ansatz ist an verschiedene Kulturvolumina anpassbar, was seine Implementierung für verschiedene experimentelle Ziele, wie z. B. antimikrobielle Studien, erleichtert. Darüber hinaus ermöglicht das Methodendesign die qualitative oder quantitative Bewertung der Biofilmbildungsfähigkeiten verschiedener Mykobakterienarten mit geringfügigen Anpassungen.

Einleitung

Bakterien sind in der Lage, als einzellige Einheiten zu überleben; Unter den meisten physiologisch relevanten Bedingungen organisieren sie sich jedoch in Gemeinschaftsmimetika. Biofilm ist eine weithin anerkannte Gemeinschaftsorganisation von Bakterien, die aus aggregierten Zellen bestehen, die in einer selbst produzierten Matrix eingeschlossen sind1. Eine solche Assemblierung besitzt Signaturen einer frühen Vielzelligkeit und bietet eine höhere Stressresistenz für bakterielle Systeme. Biofilme sind oft tolerant gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und sind schätzungsweise für fast 80 % der mikrobiellen Infektionen verantwortlich 2,3.

Schüttelkolben und plattenbasierte Kulturen sind traditionell die üblichen Praktiken für die Bakterienkultivierung. Ihre enorme Akzeptanz und ihr Erfolg sind auf ihre einfache Handhabung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zurückzuführen. Das Fehlen eines physiologischen Kontexts schränkt jedoch das translationale Potenzial des mit solchen Systemen generierten Wissens ein4. Daher werden Biofilme zu einem attraktiven Modellsystem für die Erforschung der bakteriellen Pathophysiologie. Biofilme stellen ein dynamisches Modellsystem dar, das die natürlichen Bedingungen genau widerspiegelt und es den Forschern ermöglicht, physiologische Aspekte wie Nährstoffgradienten und räumliche Heterogenität zu replizieren 5,6.

Der Biofilm-Lebensstil ist in mykobakteriellen Studien besonders relevant, da Mykobakterien, einschließlich des berüchtigten Mycobacterium tuberculosis, geschickte Biofilmbildner sind7. Ihre Fähigkeit, in Biofilmen zu gedeihen, trägt dazu bei, dass sie während einer Infektion im Wirtsgewebe bestehen bleiben. Angesichts der inhärenten Antibiotikaresistenz, die mit dem Lebensstil von Biofilmen verbunden ist, stellt es eine große Herausforderung bei der Behandlung von mykobakteriellen Erkrankungendar 8. Biofilme stellen auch ein ideales Modellsystem für die Untersuchung des mykobakteriellen Stoffwechsels dar, da sie die Untersuchung der einzigartigen metabolischen Anpassungen und Nährstoffverwertungsstrategien ermöglichen, die von Mykobakterien in komplexen mikrobiellen Gemeinschaften eingesetzt werden9.

Während Biofilm zunehmend als besseres Modellsystem für mykobakterielle Studien akzeptiert wird10, besteht ein Bedarf an konsistenten und reproduzierbaren Standardarbeitsanweisungen, insbesondere um Parallelen zwischen Studien zu ziehen, die in verschiedenen Laboratorien durchgeführt wurden. Die hier beschriebene Methode beschreibt die Verfahren zur Biofilmbildung für eine Mykobakterienart, M. smegmatis. M. smegmatis ist ein leichter zugängliches Modell für die Untersuchung mykobakterieller Biofilme, da es nicht pathogen ist und die Kinetik der Biofilmbildung schneller ist. Die Methode kann modifiziert werden, um Anwendungen wie Antimykobakterien-Screening, Metabolitenextraktion und Omics-Studien zu ermöglichen.

Protokoll

Die Einzelheiten zu allen für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Die Medienvorbereitung von Sauton

  1. Bereiten Sie 50 ml 2,5%ige Kaliumdihydrogenphosphatlösung vor, indem Sie 1,25 g Kaliumdihydrogenphosphat sorgfältig abwiegen und in 50 ml deionisiertem Wasser auflösen.
  2. Bereiten Sie 50 ml 2,5%ige Magnesiumsulfatlösung vor, indem Sie 2,56 g Magnesiumsulfat wiegen und in 50 ml entionisiertem Wasser auflösen.
  3. Bereiten Sie 10 ml 5%ige Eisenammoniumcitratlösung vor, indem Sie 0,5 g Eisenammoniumcitrat wiegen und in 10 ml deionisiertem Wasser auflösen. Bewahren Sie es in einer bernsteinfarbenen Tube auf.
  4. Bereiten Sie 100 ml 20%ige Glukoselösung vor, indem Sie 20 g Glukose wiegen und in 100 ml deionisiertem Wasser auflösen. Die Filtersterilisation erfolgt mit einer sterilen 50-ml-Spritze und einem 0,2-μM-PVDF-Spritzenvorsatzfilter in einem Röhrchen.
  5. Bereiten Sie 10 ml sterile 1%ige Zinksulfatlösung vor, indem Sie 0,1 g Zinksulfat sorgfältig abwiegen und in 10 ml entionisiertem Wasser auflösen. Filtersterilisieren Sie mit einer sterilen 10-ml-Spritze und einem 0,2 μM PVDF-Spritzenvorsatzfilter in der Laminarhaube.
  6. Mischen Sie die vorbereiteten Komponenten in 750 mL entionisiertem Wasser, wie in Tabelle 1 beschrieben. Messen Sie den pH-Wert der Lösung und stellen Sie ihn auf 7 ein. Füllen Sie das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 900 mL auf.
  7. Autoklavieren Sie das Medium bei 15 PSI und 121 °C für 15-20 Minuten. Abkühlen lassen. Fügen Sie dann 100 μl filtersterilisiertes 1%iges Zinksulfat hinzu. Fügen Sie 100 mL filtersterilisierte 20%ige Glukose hinzu und lösen Sie sie gut auf.

2. Zubereitung von filtersterilisiertem 5% Tween-80

  1. Lösen Sie 0,5 ml Tween-80 in 9,5 ml entionisiertem Wasser.
  2. Sterilisieren Sie die Lösung mit einer sterilen 10-ml-Spritze und einem 0,2-μM-PVDF-Spritzenvorsatzfilter in der Laminarhaube.

3. Vorbereitung der Primärkultur

  1. Verwenden Sie in der Laminarhaube eine serologische Pipette, um 2 ml autoklaviertes LB-Medium in zwei sterile 14-ml-Reagenzgläser zu dispensieren.
  2. 20 μl filtersterilisiertes 5%iges Tween-80 mit einer Mikropipette in die Reagenzgläser geben.
  3. M. smegmatis wird in eines der Röhrchen geimpft, indem man seinen Kryo-Schaft mit einer Impfschlaufe hinzufügt. Das andere Reagenzglas dient als Medienkontrolle.
  4. Inkubieren Sie die Röhrchen 48 h lang in einem Schüttel-Inkubator bei 300 U/min und 37 °C.
    HINWEIS: Das Medienkontrollrohr sollte kein Wachstum aufweisen.

4. Vorbereitung der Sekundärkultur

  1. Verwenden Sie in der Laminarhaube eine serologische Pipette, um 2 ml autoklaviertes LB-Medium in zwei sterile 14-ml-Reagenzgläser zu dispensieren.
  2. 20 μl filtersterilisiertes 5%iges Tween-80 mit einer Mikropipette in die Reagenzgläser geben.
  3. Geben Sie 20 μl der Primärkultur mit einer Mikropipette in eines der Röhrchen. Bewahren Sie die andere Röhre als Mediensteuerung auf.
  4. Inkubieren Sie die Kulturen in einem Shaker-Inkubator bei 300 U/min und 37 °C, bis sie einen OD600 von 0,6 bis 0,8 erreichen.
    HINWEIS: In der Regel dauert es 12 bis 14 Stunden, um einen OD600 von 0,6 bis 0,8 zu erreichen. Es können auch andere Zelldichten verwendet werden, aber ein definierter OD600-Wert hilft bei Vergleichsstudien.

5. Einrichten des Biofilms

  1. In der laminaren Haube werden mit einer serologischen Pipette 6 ml Sauton-Medium, ergänzt mit 2 % Glukose, in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte dosiert.
  2. Beimpfen Sie die jeweiligen Wells mit 120 μL (d.h. 2%) des Sekundärinokulums mit einer Mikropipette. Halten Sie einen ungeimpften gut als Medienkontrolle.
  3. Mischen Sie das Medium und die Kultur, indem Sie mit einer 1-ml-Mikropipette auf und ab pipettieren. Decken Sie den Deckel ab und verschließen Sie die Platte vorsichtig mit Paraffinfolie.
  4. Inkubieren Sie die Platte ungestört in einem statischen Inkubator bei 37 °C für 7 Tage.

6. Aufbau von Biofilmen für stadienspezifische Beobachtungen

HINWEIS: Der gesamte Aufbau des Biofilms ist derselbe wie in Schritt 5 beschrieben. Um Biofilm zu verschiedenen Zeitpunkten zu ernten oder abzubilden, wird empfohlen, dass derselbe Biofilm in mehreren Sets auf separaten Platten angelegt wird.

  1. Um Biofilme zwischen Tag 3 und Tag 6 zu beobachten, bereiten Sie vier Platten mit identischen Bedingungen vor und verwenden Sie eine Platte pro Tag für die Bildgebung.
    HINWEIS: Die Biofilmschicht beginnt ab dem dritten Tag des Plattenaufbaus auf der Luft-Medium-Grenzfläche zu erscheinen.

7. Abschätzung der Biofilmentwicklung

  1. Visuelle Schätzung
    1. Abbildung der Platten mit einem Gel-Dokumentationssystem mit epiweißer Lichtbeleuchtung (Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Bildgebung liefert eine grobe qualitative und quantitative Schätzung des gebildeten Biofilms. Jede Kamera guter Qualität kann als Alternative verwendet werden.
  2. Schätzung des Trockengewichts
    1. Führen Sie Trockengewichtsmessungen für eine genauere Quantifizierung durch.
    2. Um das Trockengewicht zu messen, wiegen Sie zunächst ein Löschpapier.
      HINWEIS: Anstelle von Löschpapier kann auch Filterpapier verwendet werden.
    3. Extrahieren Sie den Biofilm aus der 6-Well-Platte und übertragen Sie ihn mit einem Spachtel auf das Papier.
    4. Sammeln Sie vorsichtig den größten Teil des Biofilms aus der Kultur und achten Sie darauf, keine übermäßigen Mengen des Mediums auf das Papier zu übertragen.
    5. Lege den Biofilm auf das Löschpapier.
    6. Legen Sie es für 0,5-1 h bei 50 °C in einen Inkubator, bis der Biofilm vollständig getrocknet ist.
    7. Messen Sie das kombinierte Gewicht des Papiers und des Biofilms.
      HINWEIS: Trockengewicht des Biofilms=(Gewicht des Biofilms + Papier)-(Gewicht des Papiers)

8. Antibiotika-Toleranz-Assay in Biofilmen

  1. Schätzen Sie den MIC90 von Rifampicin in M. smegmatis Planktonkultur nach dem von Irith Wiegand et al. beschriebenen Protokoll unter Verwendung von Sautons Medien11. Fügen Sie das Antibiotikum hinzu, wenn die Kulturen einen OD600 von 0,2 erreichen.
  2. Richten Sie die Platten für das Biofilmwachstum ein, wie in Schritt 5 des Protokolls beschrieben.
  3. Am vierten Tag der Inkubation geben Sie Rifampicin mit einer Mikropipette in der laminaren Haube in Kulturen mit einer MIC90-Konzentration (64 μg/ml) von den Seiten der Vertiefung.
    HINWEIS: Gehen Sie vorsichtig vor, ohne den Biofilm zu sehr zu stören. Lassen Sie eine der Vertiefungen mit Biofilm unbehandelt.
  4. Schwenken Sie die Platten langsam, um die Antibiotika zu mischen.
  5. Decken Sie die Seiten der Platten mit Paraffinfolie ab und bewahren Sie sie für das weitere Wachstum im Inkubator auf.
  6. Nach 24 Stunden werden die Platten von der Laminarhaube entfernt und Tween-80 bis zu einer Endkonzentration von 0,2 % in alle Vertiefungen mit Biofilm gegeben.
  7. Decken Sie die Platten erneut mit Paraffinfolie ab und halten Sie sie 12 h lang bei 4 °C und 100 U/min.
  8. Nehmen Sie die Platten in einer laminaren Haube heraus und homogenisieren Sie die Bestandteile mit einer 1 mL Mikropipette.
  9. Waschen Sie die Bestandteile mit Sautons Medien unter Verwendung des in Anand et al.12 beschriebenen Protokolls.
  10. Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen in 6 mL Sauton-Medium und verdünnen sie auf Endkonzentrationen von 10-4, 10-5, 10-6 und 10-7.
  11. 100 μl jeder Verdünnung mit autoklavierten Glasperlen auf LB-Agarplatten verteilen.
  12. Verschließen Sie alle Platten mit Paraffinfolie und bewahren Sie sie in einem Inkubator bei 37 °C auf.
  13. Zählen Sie nach 3 Tagen Inkubation die Kolonien auf jeder Platte. Betrachten Sie nur die Platten mit einer Koloniezahl zwischen 30 und 300.
  14. Berechnen Sie KBE/ml und die relative Abnahme von KBE/ml unter Verwendung der bereitgestellten Formeln13.
    HINWEIS: KBE/ml = (Anzahl der Kolonien × Verdünnungsfaktor) / (Volumenplattiert (in mL))
    Relative Abnahme der KBE/ml = ((KBE/ml bei unbehandelten - KBE/ml bei behandelten)) / ((KBE/ml bei unbehandelt)) × 100

Ergebnisse

Ab dem dritten Tag werden Biofilm-Pellikel mit bloßem Auge sichtbar. Obwohl der Biofilm auf dem Sauton-Medium ohne 2% Glukose wächst, wurde bei der Zugabe eine Verbesserung der Retikulation beobachtet. Wir erhielten 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) Biofilm-Trockengewicht aus jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 1,5 ml Sauton-Medium (ergänzt mit 2 % Glukose), das vier Tage lang gezüchtet wurde. In Abbildung 2 war die Biofilmentwicklung von Tag 3 bis Tag 6 sichtbar. Am 3. Tag beginnt sie, einen Film mit leichter Netzbildung zu bilden, und am 5. Tag ist sie vollständig ausgereift. Ab dem 6. Tag beginnt sich der Biofilm aufzulösen. Der MIC90 von Rifampicin (64 μg/ml) reduzierte die KBE des Biofilms um nur 25 % ± 12 % (n = 3).

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Abbildung 1: Biofilme von M. smegmatis nach 4-tägiger Inkubation in Sauton-Medien. (1) Ohne Glukose und inokuliert mit 2% Inokulum. (2) Ohne Glukose und mit 4% Inokulum beimpft. (3) Mit 2% Glukose und inokuliert mit 2% Inokulum. (4) Mit 2% Glukose und inokuliert mit 4% Inokulum. (5) und (6) sind Mediensteuerelemente. Hier befinden sich die Proben in Standard-6-Well-Platten. Die Fotos werden ohne jegliche Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Morphologie des Biofilms M. smegmatis vom 3. Tag nach der Inokulation bis zum 6. Tag. Hier befinden sich die Proben in Standard-24-Well-Platten. Die Fotos werden ohne jegliche Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

S. Nr.BestandteilArbeitsschwerpunkt (w/v)Konzentration der StammlösungVolumen/Gewicht der Stammlösung
1Kaliumdihydrogenphosphat0.05%2.50%20 mL
2Magnesiumsulfat0.05%2.50%20 mL
3Eisen(III)-Ammoniumcitrat0.01%5%1 mL
4Glycerin6%100%60 mL
5L- Asparagin0.40%NA4 g
6Zitronensäure0.20%NA2 g

Tabelle 1: Komponenten für die Medienvorbereitung von Sauton.

Diskussion

Die mehrzellige Lebensweise von Mikroben wurde vor fast einem Jahrhundert beschrieben; Klinische Studien sind jedoch nach wie vor spärlich, was vor allem auf den Mangel an robusten Methodenzurückzuführen ist 14. Methoden, die in Arbeiten zur Biofilmbiologie beschrieben werden, sind oft schwer zu adaptieren. Hier wird erwartet, dass die detaillierte Methodik, unterstützt durch die Demonstration kritischer Schritte, die Reproduzierbarkeit der Protokolle verbessert.

Das in diesem Artikel beschriebene Verfahren zur Herstellung von Biofilmen ist skalierbar und erfordert eine proportionale Zunahme des mittleren Volumens und der Inokulumgröße. Anwendungen wie die Metabolitenextraktion erfordern ein höheres Kulturvolumen, während antimikrobielle Empfindlichkeitstests eine kleinere Biomasse erfordern12. Zusätzlich kann die Größe des Inokulums angepasst werden, um die Geschwindigkeit der Biofilmbildung anzupassen. Diese Flexibilität ermöglicht es den Forschern, die Dauer von Experimenten angemessen zu steuern.

Die Wachstumsbedingungen und die Mikroumgebung spielen eine entscheidende Rolle in der Biofilmphysiologie15. Insbesondere ist das Vorhandensein von Glukose für die Bildung eines Biofilms nicht zwingend erforderlich. Nichtsdestotrotz wurde beobachtet, dass die Einschluss von 2% Glukose die Retikulation und Stabilität des Biofilms verbessert. Eine weitere interessante Beobachtung ist das Biofilm-Enhancement-Potenzial, das durch das Anbringen eines Glasdeckglases am Boden der Kulturvertiefungen entsteht. Die Zugabe von Tween-80 sowohl in Primär- als auch in Sekundärkulturen ist entscheidend für die Abschwächung der Zellaggregation.

Die Entwicklung des Biofilms umfasst unterschiedliche Wachstumsphasen wie Bindung, Reifung und Ausbreitung. Während der hier beschriebene Biofilmaufbau typischerweise 7 Tage lang inkubiert wird, werden die Pellikel ab dem 3. Tag mit bloßem Auge sichtbar. Dieser Aufbau ermöglicht es, die zeitliche Dynamik der Biofilmentwicklung zu untersuchen. Während in diesem Artikel die Schätzung des Trockengewichts zur Beurteilung der Biofilmbiomasse beschrieben wird, ist der Aufbau auch für die konventionelle Kristallviolettfärbung oder die mikroskopiebasierte Schätzung geeignet12,16.

Die Produktion von Biofilmen durch Mykobakterien spielt eine wichtige Rolle bei deren Pathogenität und verleiht eine erhöhte Resistenz gegen Arzneimittel 8,17. Wir beobachteten eine sieben- bis achtmal höhere Antibiotikatoleranz in Biofilmkulturen im Vergleich zu Schüttelkolbenkulturen. Mehrere Gruppen verwenden Biofilme als Modellsystem für die Untersuchung der bakteriellen Physiologie; Eine breitere Übernahme dieses Wachstumsmodus durch die mykobakterielle Forschungsgemeinschaft kann neuere Einblicke in die Pathophysiologie verschiedener pathogener Spezies innerhalb dieser Gattung liefern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das DBT-Ramalingaswami Fellowship unterstützt, das an Amitesh Anand vergeben wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 &Mikro; M PVDF SpritzenfilterAxivaSFNY04 R
1 mL SpitzenGenetixGXM-611000 C
10 & micro; L SpitzenGenetixGXM-6110 C
200 µ L-SpitzenGenetixGXM-61200C
6-Well-Platten aus PolypropylenTarsons980010
Braune RöhrchenTarsons546051
AutoklavHospharma
Biosicherheitswerkbank A IIMSET
Löschpapier Jedergeeignete Anbieter
ZentrifugeEppendorf
ZitronensäureSigma251275
KüvettenBio-Rad2239955
EisenammoniumcitratSigmaF5879
Gel DokumentationssystemBio-Rad
GlasperlenSigmaG8772
GlukoseSigma49139
GlycerolSigmaG5516
ImpfschleifenGenaxyHS81121C
L-AsparginSigmaA0884
LB-AgarHimediaM1151
LB-MedienHimediaM575
M. smegmatis mc2155 Kryo-SchaftATCC700084
MagnesiumsulfatSigmaM2643
MikropipettenGilson
ParafilmTarsons
PetrischaleTarsons460020
pH-MeterLabman Scientific Instruments
Plate ReaderTecan
Polypropylen ReagenzgläserGenaxyGEN-14100-PS
Kaliumphosphat monobasischSigmaP5379
RifampicinMedchemExpressHY-B0272
Serologische PipetteSPL Life Sciences95210
Shaker InkubatorEppendorf
Spatel
SpektrophotometerThermo Scientific
Statischer InkubatorCARON
Sterile 10 mL SpritzeBecton Dickinson309642
Sterile 50 mL SpritzeBecton Dickinson309653
Tween-80SigmaP1754
WaageSartorius
ZinksulfatSigmaZ0251

Referenzen

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Schlagwörter

BiofilmbildungMycobacterium smegmatisPellicle Biofilmbakterielle Multizellularit tstatische InkubationLysogeny BrothSautons MediumBiofilm Quantifizierung

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