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Methodenartikel

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

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DOI:

10.3791/66613

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24. Mai 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Zusammenfassung

Verschiedene Techniken zur Isolierung von Knochenmark aus adulten Mäusen sind gut etabliert. Die Isolierung von Knochenmark aus neonatalen Mäusen ist jedoch eine Herausforderung und zeitaufwändig, aber für einige Modelle translational relevant und notwendig. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und unkomplizierte Methode zur Aufbereitung von Knochenmarkzellen von 7-9 Tage alten Welpen. Diese Zellen können dann weiter isoliert oder in bestimmte Zelltypen von Interesse differenziert werden. Makrophagen sind wichtige Immunzellen, die eine wichtige Rolle bei Entzündungen und Infektionen spielen. Während der Entwicklung tragen neonatale Makrophagen wesentlich zum Gewebeumbau bei. Darüber hinaus unterscheiden sich der Phänotyp und die Funktionen neonataler Makrophagen von denen ihrer erwachsenen Gegenstücke. Dieses Protokoll beschreibt auch die Differenzierung von neonatalen Makrophagen von den isolierten Knochenmarkzellen in Gegenwart von L929-konditioniertem Medium. Oberflächenmarker für differenzierte neonatale Makrophagen wurden mittels durchflusszytometrischer Analyse untersucht. Um die Funktionalität zu demonstrieren, wurde die phagozytäre Effizienz auch mit pH-sensitiven Farbstoff-konjugierten Escherichia coli getestet.

Einleitung

Das Knochenmark umschließt sowohl hämatopoetische als auch mesenchymale Stammzellpopulationen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelllinien differenziert werden können. Hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark führen zu myeloischen und lymphoiden Linien1. Mesenchymale Stammzellen produzieren Osteoblasten (Knochen), Adipozyten (Fett) oder Chondrozyten (Knorpel)2. Diese Zellen haben vielfältige Anwendungen im Bereich der Zellbiologie und des Tissue Engineering, einschließlich der Gentherapie 3,4. Im Knochenmark vorkommende Vorläuferzellen differenzieren sich in Gegenwart von linienspezifischen Wachstumsfaktoren in spezifische Zelltypen. Erythropoietin fördert die Proliferation von erythroiden Vorläuferzellen, der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF) stimuliert das Wachstum neutrophiler Kolonien und Thrombopoietin reguliert die Produktion von Blutplättchen, um nur einige Beispiele für linienspezifische Wachstumsfaktorenzu nennen 5. Das mit Zelloberflächenantigen markierte FACS und die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) sind etablierte Methoden zur Isolierung und Reinigung der spezifischen Zelltypen aus dem Knochenmark6.

Obwohl Neugeborenenstudien Fortschritte machen, um die Ursachen für den Tod von Neugeborenen zu finden und die Komplikationen bei Frühgeburten zu behandeln, bleibt die direkte therapeutische Entwicklung ein ungedeckter medizinischer Bedarf. Smith und Davis stellten fest: "Pädiatrische Patienten bleiben therapeutische Waisen"7. Es gibt mehrere Herausforderungen, wie z. B. kleine Stichproben, lebenslange Auswirkungen des Ergebnisses und ethische Fragen bei der Einholung der Einwilligung in klinischen Studien mit Neugeborenen8. Daher besteht ein hoher Bedarf an in vivo und in vitro Studienmodellen, die spezifisch für Neugeborene sind, um translationale Relevanz zu erreichen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen anatomischen und Gewebeebenen, kurzen Schwangerschaftszeiten und Wurfgrößen sind Nagetiere das am besten untersuchte Säugetiermodellsystem.

Hier beschreiben wir ein detailliertes, sehr praktikables und reproduzierbares Verfahren zur Isolierung von Knochenmark von 7-9 Tage alten Mausbabys und deren Fähigkeit, sich in Makrophagen zu differenzieren. Eine Vielzahl von Zelllinien konnte jedoch durch die Verwendung unterschiedlicher Differenzierungssignale erreicht werden. Wir zeigen auch das Vorhandensein von Zelloberflächenmarkern und das Vorhandensein von in vitro phagozytärer Aktivität, die für aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMDMs) erwartet wird.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von den West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees genehmigt und gemäß den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Research Council durchgeführt. Für diese Studie wurden C57BL/6J-Maus-Welpen verwendet. Die Details zu allen verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Medien

  1. Bereiten Sie 3 ml MEM-Nährmedien, die mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, 25 mM HEPES und Penicillin (100 μg/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) ergänzt sind, in einem 5 ml-Zentrifugenröhrchen vor und bewahren Sie es auf Eis auf.
  2. Falls für die Lagerung von Knochenmarkvorläuferzellen in flüssigem Stickstoff erforderlich, bereiten Sie Gefriermedien vor, die 10 % DMEM, 80 % FBS und 10 % DMSO enthalten.
  3. Für ein vollständiges DMEM bereiten Sie DMEM vor, das mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, 25 mM HEPES und Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) ergänzt wird.
  4. Für die Makrophagendifferenzierung bereiten Sie DMEM zu, das mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, Penicillin (100 E/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) und 10 % L929-Zellüberstand 9,10,11 ergänzt wird.

2. Vorbereitung des L929-Zellüberstands

  1. In flüssigem Stickstoff gelagerte L929-Zellen werden aufgetaut und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml vollständigem DMEM überführt. Zentrifugieren Sie bei 350 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml vollständigem DMEM-Medium und säen Sie sie in einen T25-Gewebekulturkolben mit einer Dichte von 2×105 Zellen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler mit 0,4 % Trypanblau. Bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren, bis eine Konfluenz von 70 % erreicht ist.
  3. Um die Zellen zu lösen, waschen Sie sie zuerst mit 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Aspirieren Sie das PBS und ersetzen Sie es durch 2,5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA.
  4. Bei 37 °C mit 5 % CO2 5 min inkubieren und 5 ml vollständiges DMEM hinzufügen.
  5. Sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie bei 350 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  6. Das Zellpellet wird in 15 mL vollständigem DMEM-Medium resuspendiert und in einen T75-Kolben überführt.
  7. Bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren, bis die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, dann das Medium auffangen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Die M-CSF-haltigen Medien werden durch einen 0,45 μm Filter filtriert und bei -80 °C in 5 mL Aliquots eingefroren.

3. Vorbereitung der Tiere

  1. Trennen Sie die 7-9 Tage alten C57BL/6J-Mausbabys (ein Wurf von 6 Jungtieren) vorsichtig unter einer Biosicherheitswerkbank vom Muttertier und setzen Sie sie in einen separaten Käfig.
  2. Tränken Sie einen Wattebausch in 2 ml tierärztlichem Isofluran in einer Glasglocke oder einer anderen Auffangkammer.
  3. Lege einen Welpen in die Kammer und schließe den Deckel. Überwachen Sie das Neugeborene ca. 90 s lang, um sicherzustellen, dass es bewegungslos und bewusstlos wird.
  4. Entferne den Welpen schnell und enthaupte ihn mit einer scharfen Schere (nach institutionell anerkannten Protokollen), bevor der Welpe wieder zu Bewusstsein kommt.
    HINWEIS: Neugeborene atmen nicht tief genug, um allein durch Isofluran-Inhalation eingeschläfert zu werden.
  5. Stellen Sie sicher, dass der Deckel des Behälters geschlossen ist, nachdem jeder Welpe entfernt wurde. Der gleiche Wattebausch kann für 5-7 Welpen verwendet werden.

4. Isolierung des Knochenmarks von Neugeborenen

  1. Sterilisieren Sie den Körper des Neugeborenen mit 70% Ethanol.
  2. "Machen Sie mit einer Pinzette und einer chirurgischen Schere mit feiner Spitze einen Schnitt zwischen den
    Bauch und Hinterbeine. Entfernen Sie die Haut, indem Sie in Richtung des Fußes der Hintergliedmaßen ziehen.
  3. Kratzen Sie das Bindegewebe und die Muskeln, die an den Knochen befestigt sind, mit einer scharfkantigen Pinzette ab.
  4. Schneiden Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen, wie in Abbildung 1 gezeigt, mit einer Schere ab, um sie zu lösen und zu entfernen. Lege diese Knochen mit einer Pinzette in den Medienschlauch auf Eis. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Welpen.
  5. Übertragen Sie die Knochen mit Hilfe einer Pinzette in ein 40 μm Sieb mit einem Entnahmeröhrchen. Zerkleinern Sie die Knochen und geben Sie das Mark frei, indem Sie mit einem 3-ml-Spritzenkolben gegen das Sieb drücken.
  6. Die Zellsuspension bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  7. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren von 0,2 % NaCl, einer hypotonen Lösung für die Lyse von Erythrozyten. Fügen Sie sofort ein gleiches Volumen von 1,6 % NaCl hinzu, um die Lösung isotonisch zu machen.
  8. Bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und die Lyselösung entfernen.
  9. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem DMEM für den sofortigen Gebrauch oder in Einfriermedien zur Lagerung und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
    HINWEIS: Für die vorliegende Studie ergab diese Methode 6,55 (± 1,44) × 106 Knochenmarkzellen/Welpen (Abbildung 1E).
  10. Lagern Sie die Zellen bei -80 °C in Gefriermedien oder verwenden Sie sie sofort wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Aufgrund des Alters sind die Knochen transparent und klar genug, um das Knochenmark durch sie hindurch sichtbar zu machen. Es ist wichtig, beim Ziehen an den Knochen vorsichtig zu sein, da der leichte Druck auf sie ausreichen kann, um das Knochenmark freizusetzen. Das Knochenmark in den Knochen von Neugeborenen hat die Form einer Flüssigkeit und nicht eines intakten Fadens, wie es in erwachsenen Knochen zu finden ist. Es ist schwierig, das Knochenmark zu entnehmen, wenn es bei der Entnahme der Knochen austritt.

5. Differenzierung neonataler Makrophagen aus dem Knochenmark

  1. Saatgut 2 × 107 Knochenmarkzellen pro T75-Kolben in 10 ml vollständigem DMEM, das 10 % L929-Zellüberstand (2,5 ml) als M-CSF-Quelle enthält. Die Kulturschalen werden bei 37 °C mit 5 % CO2 5 Tage lang inkubiert. Fügen Sie 2 ml L929-konditioniertes Medium am Tag 3 der Differenzierung hinzu.
  2. Beobachten Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop mit einem inversen Mikroskop und einem bildgebenden System mit 20-facher Vergrößerung. Bei der Differenzierung sollten Makrophagen adhärent, länglich und heterogen erscheinen (Abbildung 2).
  3. Um die Makrophagen für nachgelagerte Assays zu ernten, aspirieren Sie das Differenzierungsmedium.
  4. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS, um nicht adhärente Zellen und Serumproteine zu entfernen, die die Ablösung beeinträchtigen. Aspirieren Sie das PBS.
  5. Ernten Sie die Zellen, indem Sie 5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA in den Kolben geben. Den Kulturkolben 5 Minuten lang bei 37 °C mit einem 5 % CO2 - Inkubator aufstellen und 5 ml DMEM hinzufügen.
  6. Pipettieren Sie die Zellen, um sie zu lösen, und zentrifugieren Sie sie bei 350 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  7. Dissoziieren Sie das Zellpellet in 1 ml vollständigem DMEM und zählen und überprüfen Sie die Zellviabilität mit Trypanblau. BMDMs, die mit dieser Methode isoliert werden, betragen 7,05 (± 2,52) ×105 Zellen/PUP (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Beobachten Sie das Vorhandensein von spindelförmigen Zellen, die am zweiten Tag der Differenzierung zu erscheinen beginnen (Abbildung 1B, rote Pfeile). Wenn die Farbe des Mediums gelb wird, was darauf hinweist, dass es verbraucht ist, fügen Sie am Tag 4 der Differenzierung weitere L929-konditionierte Medien hinzu. Ein vollständiger Austausch des Mediums wird nicht empfohlen.

6. Immunmarkierung und durchflusszytometrische Analyse

  1. Blockieren Sie die unspezifische Antikörpermarkierung der BMDMs (2x105/Markierung) durch Behandlung mit 10 μL/107 Zellen FcR-Blockierungsreagenz gemäß den Empfehlungen des Herstellers in einem Volumen von 100 μL/Markierung Durchflusszytometrie-Puffer (PBS ergänzt mit 2 mM EDTA und 0,5 % Rinderserumalbumin). 10 Minuten auf Eis halten.
    HINWEIS: Die Zellen können in großen Mengen oder in einzelnen Vertiefungen oder Röhrchen verstopft werden. Alle nachfolgenden Schritte zeigen Mengen und Volumina pro Einzelzellmarkierung bei einem Endvolumen von 100 μl an.
  2. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μl Durchflusszytometrie-Puffer hinzufügen und bei 525 x g für 7 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  3. Entfernen Sie den Überstand und säen Sie die Zellen in einer 96-Well-Platte mit U-Boden bei einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Well. Färbezellen durch Zugabe von FVS780-Lebend-/Totzellzählfarbstoff, verdünnt auf das 3.000-fache und 0,625 μl BV786-CD11b, PE-F4/80 und AlexaFluor488-CD206 in 100 μl Durchflusszytometrie-Puffer entweder einzeln oder in Kombination 12,13,14,15. Inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang auf Eis, das mit Folie bedeckt ist.
  4. Fügen Sie 100 μl Durchflusszytometrie-Puffer hinzu und waschen Sie die Zellen, indem Sie sie 7 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 525 x g zentrifugieren.
  5. Saugen Sie den Überstand an und wirbeln Sie das Zellpellet vorsichtig ein. 100 μl 0,4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  6. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 μl Durchflusszytometriepuffer und Pellet durch Zentrifugation bei 525 x g für 7 min bei Raumtemperatur.
  7. Resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl Durchflusszytometrie-Puffer und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer.

7. In-vitro-Assay zur Bewertung der phagozytären Wirksamkeit von Makrophagen aus dem Knochenmark von Neugeborenen

  1. Resuspendieren Sie die BMDMs in vollständigem DMEM ohne Phenolrot oder Antibiotika und säen Sie sie mit einer Dichte von 2 × 105/Quadrant in einer 35 mm Quad-Schale bei einem Volumen von 500 μL aus.
  2. Um das bakterielle Inokulum bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 25 oder einem anderen gewünschten MOI vorzubereiten, entnehmen Sie einen vorberechneten Bestand an Escherichia coli O1:K1:H7, der bei -80 °C gelagert wurde.
  3. Aliquotieren Sie das gewünschte Bakterienvolumen in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Bakterien, indem Sie PBS zu einem Gesamtvolumen von 1 ml hinzufügen. Pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Waschschritt.
  4. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 50 μl PBS und fügen Sie grün fluoreszierenden pH-sensitiven Farbstoff bis zu einer Endkonzentration von 500 μM hinzu. Dies ist ein pH-empfindlicher Farbstoff ohne Fluoreszenzsignal bei neutralem pH-Wert und fluoresziert während des Prozesses der Phagozytose hell in sauren Umgebungen, wie z. B. angesäuerten Phagosomen.
  5. Inkubieren Sie die Bakterienzellen 20 Minuten lang im Dunkeln für die Farbstoffkonjugation.
  6. Waschen Sie die Bakterien viermal mit 1 mL PBS durch Zentrifugation bei 1000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  7. Resuspendieren Sie die Bakterien in 500 μl vollständigem DMEM ohne Phenolrot und geben Sie sie in die BMDM-Kulturen.
  8. Inkubieren Sie die BMDMs bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Inkubator für 4 h und fügen Sie dann 200 ng eines zellpermeablen roten Fluoreszenzfarbstoffs hinzu, der die Lysosomen färbt.
    HINWEIS: Phagozytenbakterien können durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden.

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Ergebnisse

Mit der in dieser Studie beschriebenen Methode können 25 bis 37 Millionen Knochenmarkzellen aus einer Wurfgröße von fünf C57BL/6-Maus-Welpen erfolgreich isoliert werden. Diese Methode wurde mit Wurfgrößen von 5 bis 7 Welpen validiert. Das Mindestalter für die Isolation in unseren Experimenten lag bei 7 Tagen. Abhängig von der Wurfgröße und der Anzahl der für das Experiment erforderlichen Zellen von weniger als einer Million könnten die Forscher dieses Protokoll für Mäuse ausprobieren, die jünger als 7 Tage sind. In Gegen...

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Diskussion

Die Forschung an neugeborenen Mausmodellen kann eine Reihe von Herausforderungen mit sich bringen. Neugeborene haben ein sich entwickelndes Immunsystem, das im Vergleich zu Erwachsenen einzigartig ist8. Daher sollte nicht davon ausgegangen werden, dass Daten, die aus adulten Tiermodellen generiert wurden, auf Neugeborene zutreffen, und mehrere veröffentlichte Arbeiten haben diese Idee gut artikuliert18,19. Daher sind neonatalspezifische Mo...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die für diesen Artikel relevant sind.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R01 AI163333] an CMR unterstützt. Wir danken für die zusätzliche finanzielle Unterstützung der West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility durch die folgenden Zuschüsse: WV CTSI Grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE Grant GM121322 und NIH Grant OD016165.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
40 & Mikro; m SiebGreiner542040Zellkultur
96 Well rund (U) BodenplatteThermo Scientific12-565-65Zellkultur
Anti-Maus CD11b-BV786BD Biosciences740861FACS-Analyse
Anti-Maus CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709FACS-Analyse
Anti-Maus F4/80-PEBD Biosciences565410FACS-Analyse
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCAutomatisierter Zellzähler
DMEMHycloneSH30022.01Zellkultur
DMSOVWRWN182Zellkultur
DPBS, 1xCorning21-031-CVZellkultur
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775Infektion
EVOS FL Invitrogen12-563-649Zell-Bildgebungssystem 
FBSAvantor 76419-584Zellkultur
FluoroBright BMDMThermo fisher ScientificA1896701Farbstofffreie Nährmedien
GlutaminCytivaSH30034.01Zellkultur
HEPESCytivaSH30237.01Zellkultur
L-929ATCCDifferenzierung
LSRFortessaBecton DickinsonDurchflusszytometer
Lysotracker rot DND 99InvitrogenL7528Fluoreszenzfarbstoff
MEMCorning15-010-CVZellkultur
Penicillin /StreptomycinHycloneSV30010Zellkultur
pHrodo grün STP Ester InvitrogenP35369Fluoreszenzfarbstoff
T75 KolbenCell star658170Zellkultur
Trypsin-EDTAGibco25300120Zellkultur
Zeiss 710 ZeissP20GM103434Konfokal

Referenzen

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