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Anwendungen der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie in der Naturstoffforschung: Tropanalkaloide als Fallstudie

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DOI:

10.3791/66620

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8. März 2024

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur schnellen Massenspektrometrie (MS)/Massenspektrometrie (MS)-basierten Annotation und Klassifizierung von Tropanalkaloiden vor, die sowohl für die vorläufige Dereplikation von tropanhaltigen Proben als auch für die Entdeckung neuer Alkaloide für die Isolierung nützlich ist.

Zusammenfassung

Obwohl viele der heute verwendeten Medikamente synthetischen Ursprungs sind, bieten Naturstoffe immer noch eine reichhaltige Quelle für neuartige chemische Vielfalt und Bioaktivität und können vielversprechende Hinweise auf resistente oder neu auftretende Krankheiten liefern. Die Herausforderung ist jedoch eine zweifache: Die Forscher müssen nicht nur Naturstoffe finden und ihre Strukturen aufklären, sondern sie müssen auch herausfinden, was es wert ist, isoliert und untersucht zu werden (und was bereits bekannt ist - ein Prozess, der als Dereplikation bekannt ist). Mit dem Aufkommen moderner Analyseinstrumente hat sich das Tempo der Entdeckung und Dereplikation von Naturstoffen beschleunigt. Die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) hat sich zu einer besonders wertvollen Technik zur Identifizierung und Klassifizierung chemischer Strukturen entwickelt. Tropanalkaloide (TAs) sind pflanzliche Verbindungen von großer medizinischer und toxikologischer Bedeutung. In dieser Studie haben wir einen LC-MS/MS-basierten Screening-Workflow entwickelt, der die verschiedenen MS/MS-Konfigurationen nutzt, die auf einem Triple-Quadrupol (QQQ)-Massenspektrometer verfügbar sind, um TA-Strukturen basierend auf ihren unterschiedlichen Fragmentierungsmustern zu annotieren und zu klassifizieren. Durch die Verwendung einer Kombination aus datenabhängigen (DD) Produktionenscans, Präcursorionenscans (PrIS) und Neutralverlustscans (NLS) haben wir diese Methode auf TA-reiche Extrakte der Nachtschattengewächse Datura stramonium und Datura metel angewendet. Diese Methode ist schnell, sensitiv und wurde erfolgreich sowohl für die vorläufige Dereplikation komplexer TA-haltiger Proben als auch für die Entdeckung eines neuartigen Kandidaten für die Isolierung, Reinigung (und eventuellen Bioassay) eingesetzt.

Einleitung

Obwohl vollsynthetische Moleküle in den letzten Jahrzehnten in der Arzneimittelforschung immer mehr an Bedeutung gewonnen haben, sind fast zwei Drittel aller zugelassenen Arzneimittel der letzten 39 Jahre Naturstoffe oder von Naturstoffen inspiriert1,2  was die anhaltende Bedeutung der Naturstoffforschung unterstreicht. Alkaloide, bestimmte stickstoffhaltige Naturstoffe, werden besonders wegen ihrer medizinischen Eigenschaften geschätzt. Tropanalkaloide (TAs), die die [3.2.1.]-bizyklische, stickstoffhaltige Systeme werden hauptsächlich von Pflanzen aus den Familien der Nachtschattengewächse (Nachtschattengewächse), Erythroxylaceae und Convolvulaceae produziert. Beispiele sind Atropin, Scopolamin und Kokain; Mehrere halbsynthetische oder synthetische Tropane werden auch klinisch eingesetzt3. TAs und ihre Derivate werden zur Behandlung vieler Erkrankungen eingesetzt 3,4 und mehrere dieser Medikamente stehen auf der WHO-Liste der unentbehrlichen Arzneimittel2023 5. Aufgrund ihrer starken Wirkung werden TAs auch in der Freizeit (als Stimulanzien oder Deliranten) konsumiert und können bei der Einnahme von Pflanzen (oder Zubereitungen), die sie enthalten, Vergiftungen verursachen 6,7. TAs sind in menschlicher und tierischer Nahrung unerwünscht8 und können Tees, Gewürze, Getreide, Honig und pflanzliche Nahrungsergänzungsmittel verderben 9,10. Aufgrund ihres medizinischen Versprechens und ihrer Fähigkeit, zu vergiften, sind analytische Methoden, die bei der Entdeckung neuer TAs (und der Identifizierung bekannter TAs) helfen können, nützlich.

Bei der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) werden "Massenfilter" (z. B. Quadrupolen, Flugzeitröhren) physikalisch miteinander gekoppelt ("im Weltraum"), oder ein Gerät verwendet zusätzliche "in-time"-Reaktions-/Trennschritte. MS/MS im Weltraum verwendet verschiedene Modi, um verschiedene Ionen an den verschiedenen Massenfiltern auszuwählen und zu fragmentieren (z. B. die Quadrupole eines Triple-Quadrupol- oder QQQ-Instruments). Mit diesen verschiedenen Modi kann bestimmt werden, welche spezifischen Fragmente von einem bestimmten Ion gebildet werden (Product-Ionen-Scan), welche Ionen in einer Probe bestimmte Fragmente ergeben (Precursor-Ionen-Scan oder PrIS) oder Verluste einer charakteristischen Masse aufweisen (Neutral Loss Scan oder NLS) oder welche spezifischen Verbindungen welche spezifischen Fragmente besitzen (Mehrfachreaktionsüberwachung). MS/MS liefert daher Fragmente, die nützlich sind, um Strukturen für neue Verbindungen vorzuschlagen oder das Vorhandensein einer bestehenden Verbindung zu bestätigen. MS/MS wird zunehmend in den Bereichen Arzneimittelforschung, Naturstoffchemie und Metabolomik eingesetzt11,12 und wurde zur Profilierung alkaloidhaltiger Spezies (für die phytochemische Charakterisierung oder chemotaxonomische Analyse) und zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer Alkaloide in Lebensmitteln oder Heilpflanzen verwendet 10,13,14,15,16.

Trotz der vielen verfügbaren massenspektrometrischen Techniken gibt es Herausforderungen bei der Suche nach neuen Alkaloiden. Neben der Suche nach einem Kandidatenorganismus für das Screening ist die vollständige strukturelle Bestätigung eines Alkaloids ein mühsamer Prozess, der viele verschiedene Analysetechniken umfassen kann. Darüber hinaus könnten Forscher eine bereits bekannte Verbindung isolieren, was Arbeit, Zeit und Ressourcen verschwendet. Dies ist besonders schwierig für TAs, wo Hunderte, wenn nicht Tausende von TAs gemeldet werden, von denen viele isomer zueinander sind. Der Prozess des "Identifizierens des Bekannten und des Unterscheidens von den Unbekannten" wird als Dereplikation bezeichnet. Datenbanken der Retentionszeiten (r.t.s.) und Massenfragmente verschiedener TAs und anderer Verbindungen werden veröffentlicht, um diesen Prozess zu unterstützen 17,18. Nichtsdestotrotz ist die Dereplikation mühsam; Allein das Annotieren (d. h. das Zuweisen von mutmaßlichen Strukturen) der Alkaloide im gesamten LC-MS/MS-Chromatogramm einer Probe ist zeitaufwändig. In jüngster Zeit wurden sowohl die molekulare Vernetzung1 9,20 als auch die manuelle Dereplikation 18,21,22 für Benzylisochinolin, Monoterpen-Indol und Tropanalkaloide verwendet, und PrISs wurden für die "strukturelle Filterung" von Spektren zur Identifizierung von Pyrrolizidin- und Solanin-Alkaloiden verwendet 23,24. Es gibt jedoch keine spezifischen Methoden oder Workflows für eine schnelle LC-MS/MS-basierte Dereplikation von TA-haltigen Proben, obwohl TAs gemeinsame, leicht identifizierbare Fragmente besitzen (Abbildung 1). Die hier beschriebene Methode verwendet eine Kombination aus datenabhängigen (DD) Produktionenscans, PrISs und NLSs, um TA-Strukturen in Pflanzen zu annotieren und zu klassifizieren, basierend sowohl auf den unterschiedlichen Fragmentierungsmustern für mono-, di- und trisubstituierte Tropane (Abbildung 1A) als auch auf den Verlusten gemeinsamer Estergruppen, die in diesen Alkaloiden gefunden wurden (Abbildung 1B). Bei den untersuchten Organismen handelt es sich um mehrere Arten der Nachtschattengewächse Gattung Datura. Datura ist eine reichhaltige Quelle für verschiedene TAs und wurde im Laufe der Weltgeschichte für medizinische und kulturelle Zwecke verwendet17 - und ist aufgrund seiner zahlreichen, strukturell ähnlichen TAs eine schwierige Matrix, die es zu dereplizieren gilt, was uns ansprechende Proben liefert, an denen wir unsere Methode testen können.

Protokoll

ACHTUNG: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS), bevor Sie die aufgeführten Chemikalien verwenden.

1. Vorbereitung der Probe

ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff kann Kryoverbrennungen verursachen. Verwenden Sie Kryohandschuhe und Augenschutz in einem gut belüfteten Bereich. Alkaloidhaltige Pflanzenproben können die Haut reizen; Fassen Sie sie immer mit Handschuhen an. Methanol ist giftig und brennbar und sollte in einem Abzug fern von potenziellen Zündquellen gehandhabt werden.

HINWEIS: Theoretisch kann Kultur- oder Wildpflanzengewebe verwendet werden (getrocknet oder frisch gemahlen); Das folgende Verfahren ist nur dasjenige, das bei der Methodenentwicklung verwendet wird.

  1. Wenn das Pflanzengewebe frisch ist, frieren Sie es ein, indem Sie es in ein konisches Polypropylenröhrchen legen und 2-3 Minuten lang in flüssigen Stickstoff tauchen.
  2. Legen Sie das gefrorene Pflanzengewebe in einen vorgekühlten Mörser (in einen Styroporkühler mit flüssigem Stickstoff) und mahlen Sie das Gewebe mit einem vorgekühlten Stößel zu einem gleichmäßigen Pulver.
  3. Wiegen Sie die gewünschte Menge Gewebe mit einem vorgekühlten Spatel schnell in ein tariertes Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie sofort 20 % Methanol (bei Raumtemperatur [RT]) in einer Konzentration von 1 ml pro 100 mg Gewebe hinzu.
    HINWEIS: Methanol (20%) wird häufig zur Extraktion von TAs25 verwendet. Gelegentlich werden 0,1 % Ameisensäure zugesetzt, obwohl bei der Entwicklung dieser und anderer Methoden kein Unterschied in der Extraktionseffizienz beobachtet wurde.
  4. Legen Sie die verschlossenen Röhrchen für mindestens 3 Stunden bei RT auf einen Wippschüttler (mittlere Geschwindigkeit).
  5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 9464 x g für 10 min. Pipettieren Sie den Überstand in ein LC-MS-Autosampler-Fläschchen ab oder, falls noch trüb, filtrieren Sie zuerst durch einen 0,45-μm-Spritzenfilter.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, obwohl verarbeitete Frischpflanzenproben und Extrakte vor der Analyse in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert werden sollten, um einen möglichen Alkaloidabbau zu vermeiden.

2. Konfiguration des LC-MS-Geräts und Datenerfassung

ACHTUNG: Acetonitril ist giftig und brennbar; Halten Sie sich von Zündquellen fern und kontrollieren Sie die Dämpfe mit einem Abzug. Ameisensäure ist ätzend; Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.

  1. Verwenden Sie ein LC-MS-Gerät mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) und einer Umkehrphasen-HPLC-Säule (C18, 4,6 x 100 mm).
  2. Für die HPLC verwenden Sie 0,1 % Ameisensäure in H2O als Lösungsmittel A und 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril als Lösungsmittel B. Äquilibrieren Sie die Säule mit 99 % A und 1 % B. Konfigurieren Sie einen 30-minütigen Gradienten von 1 % bis 50 % B über 26 Minuten, kehren Sie bei 26,01 Minuten zu 1 % B zurück und halten Sie ihn 4 Minuten lang bei 1 % B. Verwenden Sie eine Säulenofentemperatur von 45 °C und eine Durchflussrate von 0,5 mL/min.
  3. Bei der LC-MS-Methode werden die folgenden Betriebsparameter für das Massenspektrometer verwendet: Grenzflächenspannung: 4,0 kV, Vernebelungsgasstrom: 3 l/min, Heizgasstrom: 10 l/min, DL-Temperatur: 250 °C, Heizblocktemperatur: 400 °C, Grenzflächentemperatur: 300 °C, Trocknungsgasstrom: 10 l/min und kollisionsinduzierter Dissoziationsgasdruck (CID) von 17 kPa.
  4. Erstellen Sie eine MS-Methode im ESI-Positivmodus, die sowohl einen Q3-Scan als auch einen Q1-Scan (100-1000 Da) umfasst, der als Vermessungsereignis fungiert (auf die Länge der LC-Methode festgelegt), wobei der automatische Isotopenausschluss aktiviert ist. Beziehen Sie einen Produktionenscan als abhängiges Ereignis des Q1-Scans (DD-Analyse) mit einem Massenfenster von 50-1000 Da, einer Kollisionszellenenergie von -20 V und einer Ereigniszeit von <0,2 s ein.
    HINWEIS: Der Zählschwellenwert für das Auslösen des DD-Produktionsionenscans von Q1 kann variabel sein, aber in der Regel wird ein Niveau von 7.000 bis 10.000 Zählungen verwendet. Bei einigen Instrumenten, wie z. B. dem, das zur Entwicklung der Methode verwendet wurde, bietet der Q3-Scan eine höhere Massengenauigkeit und Empfindlichkeit als Q1 und ist zur Bestätigung der im Q1-Scan beobachteten Ionen enthalten, obwohl er in Schritt 2.4 problemlos weggelassen werden kann.
  5. Fügen Sie der obigen MS-Methode positive PrISs hinzu, die der Länge der LC-Methode mit Kollisionszellenenergien von -20 V und Ereigniszeiten von 0,75 s entsprechen. Stellen Sie sicher, dass in allen Fällen die Funktionen "Automatischer Isotopenausschluss" oder " Isotopenentfernung" aktiviert sind. Es ist sicherzustellen, dass die für TA-Fragmente relevanten m/z-Werte (in Da, siehe Abbildung 1A) 124,1 (für monosubstituierte TAs, Massenfenster von 125-1000 Da), 122,1 und 140,1 (für disubstituierte TAs, Massenfenster ab 123 bzw. 141 Da) und 156,1 und 138,1 (für trisubstituierte TAs, Massenfenster ab 157 und 139 Da, bzw.
    HINWEIS: Während der Methodenentwicklung wurden die PrIS auf zwei verschiedene Methoden aufgeteilt, eine für mono- und disubstituierte TAs und eine für trisubstituierte TAs, obwohl sie auf jede beliebige Weise aufgeteilt oder kombiniert werden können.
  6. Erstellen Sie eine zweite MS-Methode, die die Parameter in Schritt 2.4 enthält.
    1. Fügen Sie dieser MS/MS-Methode ein Positivmoden-NLS hinzu, das der Länge der LC-Methode entspricht, mit Kollisionszellenenergien von -20 V und Ereigniszeiten von 0,75 s. Stellen Sie sicher, dass in allen Fällen die Funktionen Automatischer Isotopenausschluss oder Isotopenentzug aktiviert sind.
    2. Es ist sicherzustellen, dass die neutralen Verlustmassen, die für Ester auf TA (in Da, siehe Abbildung 1B) von Interesse sind, 100,05 (für von Tiglsäure abgeleitete Ester, Massenfenster von 110-1000 Da), 60,03 (für Acetylgruppen, Massenfenster von 100-1000 Da) und 166,06 (Phenylmilchsäureester oder Tropinsäureester, Massenfenster von 170-1000 Da) betragen.
  7. Laden Sie die LC-MS-Methode herunter und erstellen Sie Datendateien für die interessierenden Proben. Sobald die HPLC-Säule bei 45 °C äquilibriert ist, führen Sie die interessierenden Proben in einer Batch- oder Projektdatei mit geeigneten Extraktionslösungsmittel-Blindproben zwischen verschiedenen Spezies oder Gewebetypen durch. Ein typisches Injektionsvolumen beträgt 10-20 μL.
    HINWEIS: Bei besonders hohen Volumina kann der Detektor des Massenspektrometers überlastet sein. Wenn Sie sehr konzentrierte Proben verwenden, stellen Sie sicher, dass die ESI-Quelle gereinigt und das Gerät regelmäßig gestimmt wird. Das Protokoll kann hier pausiert werden, nachdem alle Daten gesammelt wurden.

3. Datenanalyse

  1. Untersuchen Sie das Gesamtionenchromatogramm der Q1- und Q3-Scans (und des DD-Produktionenscans) und notieren Sie die Muttermasse aller reichlich vorhandenen Ionen, die TA-ähnliche Merkmale aufweisen: a) Masse <500 Da für das [M+H]+ -Ion, normalerweise eine gleichmäßige Masse, b) typische rts zwischen 2 und 22 Minuten unter Verwendung der obigen LC-Methode und c) Fragmente aus der folgenden Liste: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 oder 128 Da.
  2. Untersuchen Sie das PrIS-Chromatogramm/-Kanal für m/z 124 und notieren Sie, bei welchen Peaks/Ionen r.t.s (aufgezeichnet in Schritt 3.1) dieses Fragment erzeugen. Klicken Sie sich Scan für Scan durch das Chromatogramm und untersuchen Sie die vollständigen MS/MS-Spektren, die im DD-Produktionenscan erhalten wurden, insbesondere bei Spezies mit geringerer Abundanz.
    HINWEIS: Eine echte Spezies, die dieses Fragment enthält, existiert für mehrere Scans und erscheint sowohl in den Q1- als auch in den Q3-Scans (wenn letzteres verwendet wird). Eine Tabelle ist in den Unterstützenden Informationen (Ergänzende Datei 1) angehängt, um die Anmerkungen zu erleichtern.
  3. Wiederholen Sie Schritt 3.2 mit den anderen PrIS-Chromatogrammen. Da sowohl m/z 122 als auch 140 auf disubstituierte TAs hinweisen und sowohl m/z 138 als auch 156 auf trisubstituierte TAs hinweisen, untersuchen diese Chromatogramme/Kanäle zusammen.
  4. Untersuchen Sie das NLS-Chromatogramm/die NLS-Kanäle für m/z 100, 60 und 166 und notieren Sie, welche Peaks/Ionen bei welchem rts (aufgezeichnet in Schritt 3.1) diese neutralen Verluste erzeugen. Klicken Sie sich wie beim PrIS Scan für Scan durch das Chromatogramm und vergleichen Sie es mit der Fragmentierung, die im DD-Produktionenscan erhalten wurde, insbesondere bei Spezies mit geringerer Abundanz.
  5. Unter Verwendung der Kombination von PrIS- und NLS-Daten, unterstützt durch die Ergebnisse des DD-Produktionenscans, nehmen Sie mutmaßliche Annotationen der beobachteten Alkaloide vor, indem Sie die kleinste Tropanmasse (z. B. 124, 122 oder 138) und den neutralen Verlust hinzufügen und dann die verbleibende Restmasse berücksichtigen.
    ANMERKUNG: Typische Gruppen, die TAs (und ihre Massen in Da) substituieren, sind Hydroxyl (18), Acetyl (60), Propionyl (74), Isobutyryl (88), Tigloyl (100), gesättigtes Tigloyl/2-methylbutyryl (102) oder Phenyllactat/Tropinsäure (166).
  6. Vergleichen Sie die Annotationen für Alkaloide mit denen, die in der Literatur17 und in Datenbanken (z. B. MoNA)26 berichtet werden, um zu bestimmen, welche TA-Substitutionsmuster berichtet werden (und welche potenziell neu sind). Verwenden Sie zusätzlich Standards einiger gängiger Tropanalkaloide (z. B. Atropin, Littorin, Scopolamin), die zur Bestätigung im Handel erhältlich sind.
  7. Für zusätzliche strukturelle Informationen für Proben mit geringer Abundanz (PrIS und NLS können Ionen unterhalb der Schwellenwerte für abhängige Ereignisse aufnehmen) sammeln Sie einen spezifischen Produktionenscan (unter Verwendung der interessierenden Masse als Vorläuferion) an einer konzentrierteren Probe.
    HINWEIS: Diese Methode wurde auf einem QQQ-Instrument mit niedriger Auflösung entwickelt. Für alle mutmaßlichen neuen Verbindungen sollte ein hochauflösendes MS-Instrument verwendet werden, um genaue Massenspektren zu erhalten.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der Methode zu demonstrieren, wurde eine Standardmischung von TAs (je 10 μg/ml einer Acetyltropin/Acetylpseudotropin-Mischung [monosubstituiert], je 10 μg/ml einer Mischung aus zwei Anisodamin-Isomeren [disubstituiert] zusammen mit Hyoscyamin [monosubstituiert], Littorin [monosubstituiert] und Scopolamin [trisubstituiert]) als Positivkontrolle analysiert (Abbildung 2). In Abbildung 2A ist ein vollständiges Q1-Scan-Chromatogramm (dargestellt in der Ansicht des Basis-Peak-Chromatogramms) dargestellt, wobei die TA-Standardstrukturen durch die entsprechenden Peaks gekennzeichnet sind. Das PrIS für m/z 124 (Abbildung 2B) zeigt in seinem Chromatogramm Peaks für die monosubstituierten TAs an; Ergo werden das Acetyltropin/Pseudotropin-Mix, Hyoscyamin und Littorin angezeigt. Die Peaks, die Acetyltropin und Pseudotropin im m /z 124-Chromatogramm entsprechen, sind klein (möglicherweise, weil sie eine niedrigere Konzentration als die anderen Standards aufweisen und möglicherweise weil sie ein weniger häufiges m/z 124-Fragment produzieren als die anderen monosubstituierten TAs). Nichtsdestotrotz sind sie sowohl in diesem Chromatogramm als auch im entsprechenden PrIS-Kanal immer noch nachweisbar. Abbildung 2C und Figur 2D sind PrIS-Chromatogramme für m/z 122 bzw. 140. Beim Nachweis von disubstituierten TA-Fragmenten markieren beide die beiden Isomere des Anisodamins, wobei ein stärkeres Signal auf dem m/z 140-Kanal sichtbar ist. Da verschiedene TAs Fragmente unterschiedlicher Intensität besitzen können, sollten die Kanäle m/z 122 und 140 zusammen untersucht werden. Schließlich zeigen die Kanäle m/z 156 (Abbildung 2E) und m/z 138 (Abbildung 2F), die für trisubstituierte TAs diagnostisch sind, beide einen Peak für Scopolamin (die einzige trisubstituierte TA in der Standardmischung).

Anschließend wurden NLS-Chromatogramme verwendet, um die vorhandenen Estergruppen zuzuordnen. Abbildung 2G zeigt das NLS-Chromatogramm für 60 Da (Verlust von Essigsäure aus Acetatestern): Die beiden acetylierten monosubstituierten TA-Isomere sind sichtbar. Das NLS-Chromatogramm für 166 Da (Abbildung 2I), das zur Identifizierung von Phenylmilchsäure- oder Tropenestern gedacht ist, identifiziert korrekt alle Alkaloide, die eine dieser Gruppen enthalten (Hyoscyamin, Littorin, die beiden Anisodamin-Isomere und Scopolamin). Schließlich ist, wie vorhergesagt, das Chromatogramm (Abbildung 2H) für den Verlust von 100 Da (Diagnostik von Tigloylestern) mit Ausnahme einer geringfügigen Verunreinigung bei r.t. 1,75 min leer, da keines der Standardalkaloide diese Gruppe enthält.

Anschließend wurde die Methode auf falsch positive Ergebnisse getestet. Als Negativkontrolle diente ein Wasser/Methanol-Extrakt aus einem Blatt der Tomate (Solanum lycopersicum). Obwohl Tomaten Nachtschattengewächse sind, produzieren sie keine TAs. Ein vollständiges Q1-Scan-Basen-Peak-Chromatogramm ist in Abbildung 3A dargestellt. Der PrIS für m/z 124 (Abbildung 3B) ist größtenteils leer, mit kleinen Basislinienfluktuationen, die wahrscheinlich Detektorrauschen darstellen (keine Signale stimmten mit diesen Massen in den Q1- oder Q3-Scans überein). Zwei Merkmale mit r.t.s von 2,6 und 3,4 min ergeben zwar ein 124-Fragment, aber die Untersuchung des DD-Produktionenscans zeigt, dass diese Merkmale keine anderen monosubstituierten Tropanfragmente (m/z 93 oder 142) produzieren, was darauf hindeutet, dass es sich nicht um TAs handelt. In diesem Beispiel wird auch verdeutlicht, wie nützlich es ist, den DD-Produktionenscan in diese Methode einzubeziehen, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen. In ähnlicher Weise zeigt der m/z 122-Kanal für disubstituierte TAs (Abbildung 3C) ebenfalls nur Rauschen. Die PrIS-Chromatogramme für m/z 140, m/z 138 und m/z 156 sowie die drei NLSs, die nur auf Nicht-TA-Merkmale auf den DD-Scans hindeuten, sind in der ergänzenden Abbildung 1A-F dargestellt.

Um die Verwendung dieser Methode bei der Dereplikation einer TA-haltigen Probe zu demonstrieren, wurde ein Extrakt aus der Wurzel von D. metel var. 'fastuosa' analysiert. Die Wurzeln sind der Hauptort der TA-Biosynthese bei Nachtschattengewächsen, und es wurde vorhergesagt, dass viele verschiedene TAs vorhanden sind. Das vollständige Q1-Scan-Chromatogramm ist in Abbildung 4A dargestellt. Wie erwartet wurden zahlreiche Merkmale unterschiedlicher Häufigkeit auf den PrISs für m/z 124 (Abbildung 4B), m/z 122 (Abbildung 4C), m/z 140 (Abbildung 4D), m/z 156 (Abbildung 4E) und m/z 138 (Abbildung 4F) nachgewiesen. Viele dieser TAs waren auch acetyliert oder tigloyliert oder von Phenylmilchsäure/Tropensäure abgeleitet, wie die zahlreichen Signale in den NLS-Chromatogrammen in Abbildung 4G-I zeigen.

Eine Tabelle, die als .xls Datei zur Verfügung gestellt wurde (ein leeres Blatt für den Leser ist die Ergänzungsdatei 1, D. metel root befindet sich in der Ergänzungsdatei 2), wurde verwendet, um zunächst zu dokumentieren, welche Merkmale (Massen oder r.t.s) TA-ähnlich erschienen (unter Verwendung der Kriterien in Schritt 3.1). Als nächstes wurden Fragmente und neutrale Verluste festgestellt, die zu diesen Merkmalen gehören. Die Methode ist extrem sensitiv: Die PrIS-Kanäle detektierten selbst TAs mit geringer Abundanz, die auf den entsprechenden Chromatogrammen keine sichtbaren Peaks ergaben. Unter Verwendung der Fragmente und neutralen Verluste könnte dann eine Struktur für das Alkaloid vorgeschlagen werden, indem Schritt 3.5 befolgt wird.

Ein Beispiel für die Verwendung der Spektraldaten zur Annotation von Alkaloiden ist in Abbildung 5 dargestellt. Das vollständige Q1-Scan-Chromatogramm für die D. metel-Wurzel ist in Abbildung 5A dargestellt. Es wurde ein Feature bei 14,4 min ausgewählt; Das Q1-Scan-Spektrum (Abbildung 5B) zeigt für diesen Peak eine Muttermasse von m/z 224. Das DD-Produktionen-Scan-Spektrum ist in Abbildung 5C dargestellt. Der PrIS-Kanal für m/z 124 (Abbildung 5D) zeigt an, dass das 224-Ion dieses Fragment produziert (auch im DD-Produktionenscan sichtbar). Der NLS-Kanal für 100 Da (zum Nachweis tigloylierter TAs) markiert ebenfalls m/z 224 (ebenfalls durch den DD-Produktionenscan bestätigt). Die Addition des neutralen Verlusts und des TA-Fragments mit der geringsten Masse (100 + 124 Da) ergibt die Muttermasse 224, was bestätigt, dass die Tigloylgruppe die einzige Substitution ist; eine wahrscheinliche Struktur für dieses Alkaloid ist in Abbildung 5C dargestellt. Für di- und tri-substituierte TA wurden die beobachteten neutralen Verlustmassen zur niedrigsten TA-Masse addiert, und dann wurde eine weitere Substitution vorgeschlagen, um die verbleibende Masse zu erklären: Zum Beispiel hat m/z 222 mit disubstituierten TA-Fragmenten von 140 und 122 und einem neutralen Verlust von 100 Da eine Restmasse von 100 (222-122 = 100), Wahrscheinlich handelt es sich um eine zweite Tigoyl-Gruppe. Dieser Arbeitsablauf kann intuitiv für den Eliminierungsprozess verwendet werden: Ein Merkmal, dem Tropanfragmente fehlen (auch wenn es 60, 100 oder 166 Da verlieren kann), ist wahrscheinlich kein TA. In einem Beispiel für eine gründliche und schnelle Dereplikation unter Verwendung dieses Workflows wurden 71 verschiedene TAs mit unterschiedlicher Häufigkeit und Polarität in der D. metel-Wurzel identifiziert, einschließlich mehrerer isomerer Verbindungen (Ergänzende Datei 2). Einige dieser Verbindungen wiesen Estergruppen auf, die nicht ohne weiteres zugeordnet werden konnten, und einige zusätzliche Verbindungen wurden als potenzielle TAs gekennzeichnet, konnten aber nicht mit hoher Sicherheit annotiert werden.

Ein Methanol/Wasser-Extrakt aus gemahlenen D. stramonium-Samen wurde ebenfalls analysiert. Das vollständige Q1-Scan-Basen-Peak-Chromatogramm für die D. metel-Wurzel ist in Abbildung 6A dargestellt. Der PrIS für m/z 124 ist in 6B und der PrIS für m/z 122 in 6C dargestellt; die anderen Chromatogramme sind in der ergänzenden Abbildung 2A-F dargestellt. Abbildung 6B zeigt ein sehr reichlich vorhandenes monosubstituiertes Tropanalkaloid mit einem r.t. = 12,6 min, wahrscheinlich Hyoscyamin. Die Tabelle mit den Seed-TA-Annotationen ist in der Ergänzungsdatei 3 enthalten. Die Leistung der Methode schien bei dieser speziellen Probe geringer zu sein: Zwei sehr häufige Merkmale mit einem m/z von 259 bei r.t.s von 8,5 und 10,2 Minuten ergaben Peaks auf den NLS-Chromatogrammen für 60 und 100 Da (Ergänzende Abbildung 2 D,E) mit einer Masse von m/z 260 (ein M+1-Isotop), die auf den entsprechenden Spektren angegeben war. Diese Verbindungen sind keine TAs, sondern gebildete Fragmente, die mit Beta-Carbolin-Alkaloiden übereinstimmen27. Sie sind nicht acetyliert oder tigloyliert, verlieren aber 60 oder 100 von ihrem M+1-Isotop, wodurch ihr Erscheinungsbild auf diesen beiden NLS-Kanälen falsch ist. Zusätzlich lieferte Scopolamin (r.t. = 10,5 min) ein m/z 122-Fragment aus seinem m/z 305 M+1-Isotopenpeak, ein Isotop des erwarteten m/z 121-Fragments von Scopolamin. Obwohl diese Methoden De-Isotopen-Funktionen verwenden, ist bei diesen hohen Probenkonzentrationen eine gewisse Isotopenleckage möglich. Obwohl dies ein Ereignis sein kann, das nur für das in dieser Studie oder dieser Stichprobe verwendete Instrument gilt, ist es erwähnenswert.

Vierzig TAs wurden mit dieser Methode in D . stramonium-Samen annotiert, darunter mehrere, die glykosyliert zu sein scheinen und Massen von 162 (Hexose), 146 (Deoxyhexose) oder 132 Da (Xylose oder ein ähnlicher Zucker) verlieren. Während Hexose-haltige TA bei Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29 und Atropa25 berichtet wurden, ist dies der erste Bericht über Deoxyhexose- oder Xylose-haltige TAs. Ein TA hatte eine r.t. von 13,8 min (Abbildung 7A) und eine Masse von m/z 436 (Q1-Scan in Abbildung 7B). Diese Funktion erzeugte ein Signal auf dem m/z 124-Kanal, was auf eine monosubstituierte TA hinweist (Abbildung 7D), erzeugte jedoch keine Signale auf einem anderen PrIS- oder NLS-Kanal. Der DD-Produktionenscan (Abbildung 7C) zeigte den erwarteten m/z 124 an, einen Verlust von 312 Da, möglicherweise 166 + 146 Da, vom Mutterion. Die hochauflösende MS/MS wurde an einem Quadrupol-Flugzeitmessgerät (Spektrum in Abbildung 7E) erhalten, das ein m/z 290-Fragment anzeigte, was auf Hyoscyamin oder Littorin hindeutet, das auf dem Esterhydroxylteil mit Rhamnose oder einem ähnlichen Zucker glykosyliert ist; Die gemessene genaue Masse lag auch sehr nahe an der exakten Masse, die für Rhamnosyl-Hyoscyamin oder Littorin berechnet wurde (Struktur in Abbildung 7E). Aufgrund seiner beispiellosen Struktur und Häufigkeit verdient dieses Alkaloid die Isolierung aus D. stramonium-Samen , ein Beispiel, das die Verwendung dieser Methode bei der Entdeckung neuer Alkaloide demonstriert.

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Abbildung 1: Relevante Fragmente und Verluste, die bei der MS von TAs beobachtet wurden. (A) Charakteristische Fragmente (und ihre diagnostischen Massen), die aus monosubstituierten, disubstituierten und trisubstituierten TAs gebildet wurden, sowie repräsentative Beispiele für Alkaloide in jeder Klasse. (B) Häufige neutrale Verluste, die von Estergruppen in TAs (und ihren diagnostischen Massen) beobachtet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Positivkontroll-Vorläufer-Ionen- und Neutralverlust-Scans. Bei allen Chromatogrammen ist die X-Achse die Retentionszeit und die Y-Achse die Zählung (Ionenhäufigkeit). (A) Das Gesamtionenchromatogramm der Alkaloid-Standardmischung in Basen-Peak-Chromatogrammansicht. Die Strukturen der Normen sind angegeben; Die entsprechenden Peaks sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. (B-F) sind PrIS-Chromatogramme für (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 und (F) 138. (G-I) NLS-Chromatogramme für 60 Da (Acetyl, G), 100 Da (Tigloyl, H) und 166 Da (Phenylmilchsäure/Tropensäure, I). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Negativkontroll-Vorläufer-Ionen- und Neutralverlust-Scans. Bei allen Chromatogrammen ist die X-Achse die Retentionszeit und die Y-Achse die Zählung (Ionenhäufigkeit). (A) Das Gesamtionenchromatogramm eines Methanol/Wasser-Extrakts aus S. lycopersicum-Blättern in Basen-Peak-Chromatogramm-Ansicht. (B) Das PrIS-Chromatogramm für m/z 124 zeigt nur zwei Nicht-Tropan-Merkmale bei r.t. 2,6 und 3,4 min. (C) Das PrIS-Chromatogramm für m/z 122, leer bis auf das Detektorrauschen. Die verwendeten Skalen sind die gleichen wie in Abbildung 2; die restlichen Chromatogramme sind in der ergänzenden Abbildung 1 zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Anwendung der MS/MS-Methode auf D. metel var. 'fastuosa'-Wurzeln. Bei allen Chromatogrammen ist die X-Achse die Retentionszeit und die Y-Achse die Zählung (Ionenhäufigkeit). (A) Das Gesamtionenchromatogramm eines Methanol/Wasser-Extrakts aus D. metel var. 'fastuosa'-Wurzeln in Basen-Peak-Chromatogramm. (B-F) sind PrIS-Chromatogramme für m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 und (F) 138. (G-I) sind NLS-Chromatogramme für 60 Da (Acetyl, G), 100 Da (Tigloyl, H) und 166 Da (Phenylmilchsäure/Tropensäure, I). Beachten Sie die reichlich vorhandenen Signale in jedem Chromatogramm, die zahlreichen TAs entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Anwendung der kombinierten DD-Produktionen-Scans, der Vorläuferionen-Scans und der Neutralverlust-Scan-Methode zur Erstellung der Struktur für eine TA. (A) Das Gesamtionenchromatogramm eines Methanol/Wasser-Extrakts aus D. metel var. 'fastuosa' -Wurzeln in Basen-Peak-Chromatogramm-Ansicht. Ein Peak bei r.t. = 14,4 min wird durch einen roten Pfeil angezeigt. (B) Der Q1 (Durchmusterungsscan) mit einer reichlich vorhandenen Masse von m/z 224 für diesen Peak. Für alle Spektren ist die X-Achse die Masse und die Y-Achse die Intensität. (C) Der DD-Produktionenscan, der die Fragmentierung des m/z 224-Ions zeigt, was auf einen Verlust von 100 Da und ein m/z 124-Fragment hinweist (rote Pfeile). Diese Verbindung erscheint sowohl auf dem (D) m/z 124 PrIS-Kanal als auch auf (E) dem 100 Da NLS-Kanal, was darauf hindeutet, dass sie sowohl monosubstituiert als auch tigloyliert ist (Struktur in Feld C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Anwendung der MS/MS-Methode auf D . stramonium-Samen . Bei allen Chromatogrammen ist die X-Achse die Retentionszeit und die Y-Achse die Zählung (Ionenhäufigkeit). (A) Das Gesamtionenchromatogramm eines Methanol/Wasser-Extrakts aus D. stramonium-Seeds in Basen-Peak-Chromatogramm. (B) Das PrIS-Chromatogramm für m/z 124; (C) zeigt das PrIS-Chromatogramm für m/z 140. Die restlichen Chromatogramme sind in der ergänzenden Abbildung 2 zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Annotation eines neuen Alkaloids in D. stramonium-Samen . Bei allen Chromatogrammen ist die X-Achse die Retentionszeit und die Y-Achse die Zählung (Ionenhäufigkeit). (A) Das Gesamtionenchromatogramm eines Methanol/Wasser-Extrakts aus D. stramonium-Samen in Basen-Peak-Chromatogramm-Ansicht.Ein Feature bei r.t. = 13,7 min ist angegeben. (B) Der Q1 (Durchmusterungsscan) zeigt eine Masse von m/z 436 für diesen Peak. Für alle Spektren ist die X-Achse die Masse und die Y-Achse die Intensität. (C) Der DD-Produktionenscan, der die Fragmentierung des m/z 436-Ions zeigt. (D) Diese monosubstituierte TA-Verbindung erscheint auf dem m/z 124 PrIS-Kanal. (E) Das hochauflösende MS/MS-Spektrum für diese neue TA, zusammen mit den vorgeschlagenen Strukturen und der genauen Masse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Zusätzliche Negativkontroll-Vorläufer-Ionen- und Neutralverlust-Scans. (A-C) PrIS-Chromatogramme für m/z (A) 140, (B) 156 und (C) 138. (D-F) NLS-Chromatogramme für 60 Da (Acetyl, D), 100 Da (Tigloyl, E) und 166 Da (Phenylmilchsäure/Tropensäure, F). Die verwendeten Skalen sind die gleichen wie in Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Anwendung der MS/MS-Methode auf D. stramonium-Samen; zusätzliche Chromatogramme. (A-C) sind PrIS-Chromatogramme für m/z (A) 140, (B) 156 und (C) 138. (D-F) NLS-Chromatogramme für 60 Da (Acetyl, D), 100 Da (Tigloyl, E) und 166 Da (Phenylmilchsäure/Tropensäure, F). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Leere Tabelle, die für Alkaloid-Annotationen verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Tabelle mit Alkaloid-Annotationen und -Strukturen für D. metel var. 'fastuosa' -Wurzeln. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Tabelle mit Alkaloid-Annotationen und -Strukturen für D. stramonium-Samen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Obwohl die im Protokoll bereitgestellten Geräteparameter eine zufriedenstellende Leistung ermöglichen, kann die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens eine sorgfältige Beachtung oder Optimierung mehrerer kritischer Schritte erfordern. Während der in Schritt 2.2 bereitgestellte HPLC-Lösungsmittelgradient im Allgemeinen für Tropanalkaloide geeignet ist, muss er möglicherweise in Abhängigkeit vom Tropanalkaloidprofil der zu untersuchenden Probe oder Pflanzenart modifiziert werden. Das Probeninjektionsvolumen kann auch je nach Empfindlichkeit des Instruments und der Art und Weise, wie die Methode angewendet wird, geändert werden. Bei der "tiefen" metabolischen Profilierung oder Dereplikation sollte ein größeres Injektionsvolumen verwendet werden (in dieser Studie wurden 15-20 μl verwendet), während beim einfachen Nachweis von Alkaloiden kleinere Volumina verwendet werden könnten. Bei der Verwendung großer Probenvolumina ist darauf zu achten, (a) die Ionenquelle regelmäßig zu reinigen, (b) die HPLC-Säule auf Druckänderungen oder Verstopfungen zu überwachen (es sollte immer eine geeignete Vorsäule verwendet werden), (c) eine Verschleppung zwischen den Proben zu verhindern und (d) die Chromatogramme auf mögliche "Isotopenleckagen" zu untersuchen, wie oben beschrieben. Die Grenzflächentemperaturen und -spannungen sollten nicht wesentlich von den in der Methode angegebenen abweichen, um eine vorzeitige Fragmentierung in der Quelle zu vermeiden. Obwohl eine Kollisionszellenspannung von 20 V empfohlen wird, liefert sie möglicherweise nicht für alle TAs ein optimales Chromatogrammsignal (oder diagnostische DD-Produktionenscanfragmente). Einige MS-Instrumente und -Funktionen verfügen über eine "Kollisionsenergie-Ramping"-Funktion oder die Fähigkeit, Scans bei mehreren oder optimierten Kollisionsenergien zu sammeln, was auch in einer Methode wie dieser nützlich sein könnte30.

Diese MS-Methode selbst ist auch leicht modifizierbar: Während Tiglsäure-, Essigsäure- und Phenylmilchsäure-/Tropensäureester bei Datura-Spezies üblich sind, können die TA-Ester-Substitutionsmuster bei anderen Pflanzen oder Proben unterschiedlich sein. Die NLS-Massen können verändert werden, um andere Estergruppen zu detektieren (z. B. einen Verlust von 74 Da für Propionsäureester) oder möglicherweise Glykosylierungen zu erkennen (z. B. einen Verlust von 162 Da für Hexosen). Die PrIS-Massen können ebenfalls verändert werden. Zum Beispiel wurde eine TA in beiden Datura-Proben (r.t. = 12,5 min; siehe Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2) als Norhyoscyamin oder Norlittorin (Hyoscyamin/Littorin minus die Tropan-N-Methylgruppe) auf der Grundlage ihrer DD-Produktionen-Scan-Fragmente (m/z 110 und 93) annotiert und stimmte mit den Literaturspektrenüberein 31; diese TA trat auf keinem der PrIS-Kanäle des Tropanfragments auf. Für diese beiden Massen könnte ein Kanal zum Nachweis von Nortropanen hinzugefügt werden. Das m/z 93-Fragment ist auch in den meisten monosubstituierten TAs17 vorhanden; Das Hinzufügen dieses Kanals könnte eine zusätzliche Bestätigung für das Vorhandensein eines monosubstituierten TA liefern und dazu beitragen, Fehlalarme zu reduzieren.

Neben seiner Anpassungsfähigkeit an verschiedene Arten von TAs ist ein großer Vorteil dieses Protokolls (gegenüber bestehenden Alkaloid-Annotationsmethoden) seine Geschwindigkeit. Abhängig von der Konfiguration der MS-Methode (und der verwendeten HPLC-Laufzeit) können alle MS/MS-Daten für eine Probe innerhalb von 60-90 Minuten gesammelt werden. Zum Beispiel wurden während unserer Studien die mono- und di-substituierten TA-PrISs in eine Methode eingebaut, die trisubstituierten TA-PrISs in einer anderen Methode und die NLSs in einer dritten (alle Methoden enthielten den DD-Produktionen-Scan), also insgesamt drei Injektionen zu je dreißig Minuten. Die vollständige Annotation der Probe unter Verwendung der kombinierten MS/MS-Daten ist viel schneller als die manuelle Untersuchung jedes Peaks oder das Sammeln einzelner Produktionenscans für zahlreiche interessante Peaks. Diese Methode kann an jedem Gerät mit Produktionenscan-, PrIS- und NLS-Modus durchgeführt werden und kann zur schnellen qualitativen Bewertung (d. h. sind TAs vorhanden oder nicht vorhanden?), zur Unterscheidung oder zum "Fingerabdruck" verschiedener Pflanzengattungen, Arten, Sorten oder Kultivare, Organe oder Wachstumsstadien und zum Vergleich der beobachteten TAs mit den berichteten (als Teil eines Dereplikations-Workflows) verwendet werden. Wie gezeigt, kann das Protokoll auch für die Entdeckung neuer TAs als Leitstrukturen für die Isolierung, Reinigung oder Bioassays sowie für die Identifizierung von Kandidatenspezies und Geweben verwendet werden, aus denen sie isoliert werden können. Diese Methode könnte in den Bereichen Naturstoffe und Metabolomik eingesetzt werden, unter anderem zur Unterstützung des Verständnisses der Pflanzenbiochemie und für die Erforschung von Arzneimitteln im Frühstadium. Weitere Anwendungen finden sich in der Lebensmittelsicherheit oder Forensik (z. B. Nachweis von TAs in Lebensmitteln, Nahrungsergänzungsmitteln oder Bioflüssigkeiten).

Die Methode hat mehrere Nachteile, die eine Diskussion rechtfertigen. Erstens kann je nach verwendetem Gerät und dem Zweck der Verwendung des Protokolls ein großes Probeninjektionsvolumen erforderlich sein, was in einigen Fällen zu Problemen mit der Geräteleistung und dem Potenzial für Fehlalarme führen kann (wie oben beschrieben). Zweitens wurde diese Methode an einem niedrig aufgelösten QQQ-Instrument entwickelt, und falsch positive Ergebnisse könnten aus der niedrigen Auflösung resultieren (z. B. das Merkmal, das ein m/z 124-Fragment in der Negativkontrolle enthält, das keine TA ist). Ein höher aufgelöstes Instrument würde eine bessere diagnostische Fähigkeit bieten, und für jedes vorgeschlagene neue Alkaloid sollten MS/MS-Spektren mit genauer Masse erhalten werden. Weitere Nachteile dieser Methode sind schlicht und ergreifend die Nachteile der MS/MS-Analyse insgesamt. Während MS/MS nützlich ist, um Strukturen vorzuschlagen ("Annotation", wie sie von der Metabolomics Standards Initiative32 bezeichnet wird), liefert sie keine konkreten Zuordnungen der molekularen Konnektivität ("Identifikation"). Zum Beispiel fanden wir in beiden Datura-Proben mehrere Isomere eines m/z 306 TA, das sowohl m/z 124 als auch m/z 140 Fragmente zu enthalten schien (Supplementary File 2), was eine definitive Zuordnung des Substitutionsmusters erschwert. Dies könnte einen noch unentdeckten Fragmentierungsmechanismus darstellen, und eine andere Technik (wie die Kernspinresonanzspektroskopie) könnte hilfreich sein, um Mehrdeutigkeiten aufzulösen. MS/MS-basierte Methoden haben häufig mit Isomerie zu kämpfen: Der Phenylmilchsäureester Littorin (oder seine Derivate) ist schwer von Hyoscyamin (Troponsäureester) zu unterscheiden, und andere Nachtschattengewächse enthalten TAs, die mit den isomeren Tigloyl-, Senecioyl- und Angeloylgruppen substituiert sind33,34; In Ermangelung von Standards könnten diese Verbindungen schwierig, wenn nicht gar unmöglich zu unterscheiden sein. Das Verfahren unterscheidet auch nicht zwischen Enantiomeren (z. B. 3,6- vs. 3,7-Dihydroxytropan; siehe Abbildung 1 für die Nummerierung) oder Regioisomeren (z. B. Unterscheidung von 3-Acetyl und 7-Acetyl ohne Standard). Wir haben die meisten monosubstituierten Tropane als 3-substituiert klassifiziert, basierend auf früheren Mustern, die in der Gattung Datura und anderen Nachtschattengewächsen berichtet wurden17,35. Ergo sollte neben jeder instrumentellen Analyse immer auch biochemisches Wissen oder Literatur über den untersuchten Organismus (falls vorhanden) konsultiert werden.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein Faculty Research Grant (Northern Michigan University, vergeben an M.A.C.), ein Forschungsstipendium für Studenten (Northern Michigan University, vergeben an J.C.) und das Department of Chemistry finanziert. Die Autoren danken John Berger (NMU) für die Unterstützung bei der Vorbereitung des Pflanzengewebes, Hannah Hawkins (NMU) für die LC-MS-Wartung und die Unterstützung bei der Fehlerbehebung sowie Dr. Ryan Fornwald und seinen CH 495 (Natural Products Synthesis) Studenten für die Vorbereitung des Acetyltropin-Mixes. Die Autoren danken auch Dr. Daniel Jones (Michigan State University) für die Beschaffung hochauflösender MS/MS-Spektren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acetonitril, für UHPLC, geeignet für MassenspektrometrieSigma-Aldrich900667HPLC-Lösungsmittel
ArgongasAirGasAR UHP300CID-Gas
Ameisensäure, 99% für die AnalyseThermo ScientificAC270480010HPLC-Additiv
VorsäulenhalterRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC-Säule
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Massenspektrometer; wir haben die LabSolutions-Software ausgeführt, die Standard für Shimadzu-Instrumente ist
FlüssigstickstoffAirGasNI 180LT22
Methanol, für HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400Zur Herstellung von Extraktionslösungsmittel
Mikrozentrifuge VWR2400-37
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Mörtel Fisher ScientificFB961CZum Mahlen von Pflanzengewebe
StößelFisher ScientificFB961MZum Mahlen von Pflanzengewebe
Pipette 1000 mLGilson 
Pipettenspitze 1000 mLFisher Scientific02-707-404
PflanzengewebeVerschiedene QuellenN/AKann alles sein konische oder kultivierte
Polypropylen-Röhrchen, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyrol-KühlerULINES-18312Die Art von Kühlern, in denen Reagenzien für die Molekularbiologie versendet werden, wäre passend
für Roc C18 3 µ m, 100 mm x 4,6 mmRestek9534315HPLC-Säule
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Vorsäule
SchaukelschüttlerThemo Scientific11-676-680
Fläschchen mit Schraubgewinde (9 mm)Fisher Scientific13-622-190LCMS Autosampler-Fläschchen
Spritze, 3mL Fisher Scientific03-377-27
Spritzenvorsatzfilter 0,45 &Mikro; M Avantor/VWR76479-008
Wasser, zur Verwendung in der Flüssigchromatographie und MassenspektrometrieJT Baker9831-03Zur Herstellung von Extraktionslösungsmitteln
Wasserlösung, enthält 0,1 % v/v Ameisensäure, Für UHPLC, geeignet für MassenspektrometrieSigma-Aldrich900687-1LHPLC-Lösungsmittel
F144059M

Referenzen

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LC MS MSPrecursor Ion ScanNeutral Loss ScanProdukt Ion ScanDatura stramoniumDatura metel
Anwendungen der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie in der Naturstoffforschung: Tropanalkaloide als Fallstudie
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