Das aktuelle Protokoll beschreibt ein Rattenmodell des Verschlusses/der Reperfusion der mittleren Hirnarterien, das die anatomische Struktur der Hirngefäße bewahrt, ohne Schäden zu verursachen.
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Methodenartikel
Ein Rattenmodell für den Verschluss/die Reperfusion der mittleren Hirnarterie ohne Beschädigung der anatomischen Struktur der Hirngefäße
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ischämischer Schlaganfall ist die Hauptursache für langfristige Behinderung und Mortalität bei Erwachsenen weltweit. Tiermodelle des ischämischen Schlaganfalls haben wesentlich zu unserem Verständnis seiner pathologischen Mechanismen und zur Entwicklung potenzieller Behandlungsmethoden beigetragen. Gegenwärtig gibt es zwei gängige Methoden, bei denen Filamenttechniken (endovaskuläre Nahttechniken) verwendet werden, um Tiermodelle für zerebrale Ischämie zu induzieren. Diese Methoden haben jedoch inhärente Einschränkungen, wie z. B. eine verminderte Durchblutung des Gehirns, eine Schädigung des äußeren Halsschlagadersystems, eine gestörte Nahrungs- und/oder Wasseraufnahme und eine sensorische Dysfunktion des Gesichts. In diesem Artikel wird eine neue Methode zur Induktion eines ischämischen Schlaganfallmodells bei Ratten vorgestellt, ohne die zerebrale Gefäßanatomie zu beeinträchtigen. In dieser Studie wurde die Arteria carotis communis (CCA) von Sprague-Dawley-Ratten freigelegt und ein Schnitt gemacht. Anschließend wurde ein Filament durch den Schnitt in die Arteria carotis interna eingeführt, um die mittlere Hirnarterie zu verschließen. Nach 1,5 h induzierter Ischämie wurde das Verschlussfilament sowohl aus der Arteria carotis interna als auch aus der CCA vollständig entfernt. Der Schnitt in der CCA wurde anschließend mit 11-0 mikrochirurgischen Nähten unter dem Mikroskop vernäht (4-fache Vergrößerung). Durch den Einsatz mikrochirurgischer Techniken zur Reparatur der CCA wurde in dieser Studie erfolgreich eine einzigartige Methode entwickelt, um ein ischämisches Schlaganfallmodell bei Ratten zu induzieren und gleichzeitig die anatomische Integrität der zerebralen Blutgefäße zu erhalten.
Einleitung
Schlaganfall, die häufigste Todesursache und langfristige neurologische Dysfunktion bei Erwachsenen weltweit, umfasst verschiedene Arten, wobei ischämischer Schlaganfall etwa 81,9% der Fälle ausmacht, während Hirnblutungen und Subarachnoidalblutungen 14,9% bzw. 3,1% ausmachen1. Ein ischämischer Schlaganfall resultiert häufig aus Arteriosklerose oder einem Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA), was zu einer Verringerung des lokalen zerebralen Blutflusses und einer anschließenden Hirnschädigung führt. Diese Verringerung der Nährstoffversorgung der ischämischen Zellen löst einen Energiemangel aus, der zu einem Verlust der Membranintegrität, einer Zellschwellung und schließlich zur Lyse führt. Darüber hinaus tragen Faktoren wie erhöhtes intrazelluläres Kalzium, exzitatorische Aminosäurefreisetzung, erhöhte Produktion freier Radikale und Aktivierung von Entzündungszellen zur Schädigung des Hirngewebes nach einem Schlaganfall bei2.
Die Behandlungsziele für ischämische Schlaganfälle sind vielschichtig: Reduzieren Sie laufende neurologische Schäden und senken Sie die Sterblichkeit und langfristige Behinderung; verhindern Sie Komplikationen, die durch Immobilität und neurologische Dysfunktion entstehen; und minimieren Sie das Risiko eines erneuten Schlaganfalls. Angesichts der Komplexität der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls ist ein robustes Schlaganfallmodell für die Forschung und Entwicklung von Behandlungen für ischämische Schlaganfälle unerlässlich.
Derzeit ist der Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAo) ein gängiges Tiermodell für ischämischen Schlaganfall3. MCAo wird typischerweise durchgeführt, indem ein Monofilament mit Silikonspitze oder Flamme durch die zervikalen Gefäße eingeführt wird, bis es den Ursprung der mittleren Hirnarterie (MCA) erreicht. Im Jahr 1986 entwickelten Koizumi und Kollegen eine Technik, bei der ein Monofilament mit Silikonspitze durch einen Schnitt in der Arteria carotis communis (CCA) eingeführt wurde, wodurch es den Eingang der MCA erreichen und seinen Blutfluss blockieren konnte4. Im Jahr 1989 berichtete Longas Gruppe über eine weitere MCAo-Methode, bei der ein Monofilament durch einen Schnitt in der Arteria carotis externa (ECA) eingeführt wurde. Das Monofilament durchläuft dann die Bifurkation der Arteria carotis interna (ICA) und der ECA, bevor es den Ausgangspunkt der MCA5 erreicht.
Die Grenzen der beiden bestehenden Methoden zur Induktion von MCAo sind offensichtlich. Koizumis Methode erfordert eine dauerhafte Blockade des ipsilateralen CCA, was zu einer verminderten MCA-Perfusion führt, da die Reperfusion ausschließlich auf dem Kreis von Willis4 beruht. Umgekehrt beinhaltet die Longa-Methode das Schneiden der ECA, was zu einer Schädigung des ECA-Systems und einer anschließenden Beeinträchtigung der Gesichtsmuskelfunktion führt5. Diese Schädigung kann sich auf die Nahrungs- und Wasseraufnahme auswirken sowie sensorische Funktionsstörungen des Gesichts verursachen, die die Rehabilitation und die Beurteilung der neurologischen Funktion nach ischämischem Schlaganfall beeinträchtigen6.
Das aktuelle Protokoll versucht, diese Einschränkungen zu beheben, indem es eine neue Methode entwickelt, um ein ischämisches Schlaganfallmodell zu induzieren, ohne die anatomische Struktur der Hirngefäße zu beschädigen. Dieser neuartige Ansatz nutzt mikrochirurgische Techniken, um die CCA zu reparieren und so die Nachteile früherer Methoden zu vermeiden.
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Protokoll
Das experimentelle Verfahren erhielt die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee an der Yantai University (Zulassungsnummer: YTDX20230410) und entsprach den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Für diese Studie wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300 und 350 g verwendet. Eine umfassende Liste der verwendeten Tiere, Reagenzien und Geräte finden Sie in der Materialtabelle.
1. Vorbereitung von Tieren
- Halten Sie die Tiere in einer Umgebung, in der ein 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus, kontrollierte Temperatur und Luftfeuchtigkeit eingehalten werden. Stellen Sie sicher, dass sie uneingeschränkten Zugang zu Nahrung und Wasser haben.
2. Anästhesie
- Betäuben Sie die Ratten durch intraperitoneale Injektion mit einer Mischung, die Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg) enthält.
HINWEIS: Neigen Sie den Kopf und den Körper der Ratten nach unten. Die Injektionsstelle befindet sich im unteren rechten Quadranten des Abdomens des Tieres. Ziehen Sie den Kolben zurück, bevor Sie injizieren. Das durchschnittliche Injektionsvolumen beträgt 0,4 ml. - Bestätigen Sie die Einleitung der Anästhesie, indem Sie den Rückzugsreflex der Hinterpfote und den Blinzelreflex beurteilen. Wenn keine ausreichende Anästhesietiefe erreicht wird, ergänzen Sie während des chirurgischen Eingriffs mit Isofluran.
3. Verfahren zur ischämischen Modellierung
- Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente mit einem Autoklaven. Desinfizieren Sie die Operationstische und die zugehörige Ausrüstung mit 70 % Ethanol.
- Bereiten Sie die Operationsstelle vor, indem Sie das Fell um die vorgesehene Inzisionsstelle herum rasieren. Desinfizieren Sie die Haut an der Operationsstelle dreimal mit Betadin und 70% Ethanol.
- Machen Sie einen ca. 1,5 cm langen Schnitt in der Mittellinie auf der Bauchseite und öffnen Sie die oberflächliche Faszie.
- Führen Sie eine scharfe und stumpfe Dissektion durch, um die Arteria carotis externa (ECA), die Arteria carotis interna (ICA) und die Arteria carotis communis (CCA) gemäß der zuvor beschriebenen Methode freizulegen7.
- Platzieren Sie drei 4-0-Seidennähte um die CCA und eine weitere Seidennaht durch die ECA in der Nähe der ICA-Bifurkation. Binden Sie einen lösbaren Schlupfknoten auf den proximalen CCA. Ziehen Sie die Naht an der distalen CCA mit einem Blutstiller fest, um den Blutfluss zu blockieren. Binden Sie während des Nähens einen weiteren Schlupfknoten locker um den CCA, um sicherzustellen, dass das Gefäß nicht verschlossen wird.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schlupfknoten nicht zu eng ist, sondern nur ausreichend, um den Blutfluss zu blockieren, da er während der Gefäßnaht gelöst werden muss. - Machen Sie mit einer Schere einen 0,5 mm breiten Schnitt zwischen der proximalen Seidennaht und der mittleren Naht auf dem CCA.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schnitt es dem Filament (silikonbeschichtete Spitze) ermöglicht, in das CCA einzudringen. - Führen Sie ein 3 cm langes 4-0 Filament (silikonbeschichtete Spitze) in den CCA ein. Ziehen Sie die Seidennähte um das CCA fest, um das intraluminale Filament zu sichern und Blutungen zu vermeiden. Entfernen Sie dann die Naht aus dem distalen CCA.
- Führen Sie das Filament weiter in das Lumen des MCA ein und kontrollieren Sie die Nähte um das ECA, um sicherzustellen, dass das Filament nicht in das ECA eindringt. Die Einstecklänge beträgt typischerweise 18 mm bis 20 mm.
- Starten Sie einen Timer und notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Okklusion beginnt. Vernähen Sie den Halsschnitt mit 3-0 Seidenfäden und legen Sie das Tier vorsichtig in einen Aufwachkäfig. Verabreichen Sie 0,5 ml normale Kochsalzlösung intraperitoneal.
4. Mikrochirurgisches Nähen des CCA
- Betäuben Sie die Ratte 1,5 h nach der Ischämie erneut. Desinfizieren Sie die Inzisionsstelle dreimal mit 70%igem Ethanol und öffnen Sie den Schnitt erneut.
- Ziehen Sie das okkludierende Filament vorsichtig zurück, bis die weiße Spitze in der Nähe des CCA-Schnitts deutlich sichtbar ist. Platzieren Sie eine Mikroklemme horizontal in der Nähe des gesicherten intraluminalen Nahtknotens in der Nähe der CCA-Bifurkation.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die weiße Filamentspitze einzuklemmen, um ein Ablösen des Silikons und eine anschließende Thrombose zu verhindern. - Lösen Sie den gesicherten intraluminalen Nahtknoten und entfernen Sie das Filament vollständig.
- Platzieren Sie eine weitere Mikroklemme in der Nähe der Herzseite des proximalen CCA-Knotens. Anschließend entfernen Sie den Nahtknoten um das proximale CCA.
HINWEIS: Die richtige Platzierung der Klemmen ist entscheidend für die Anhebung fixierter Gefäße in späteren Schritten, um die mikrovaskuläre Naht zu erleichtern. Platzieren Sie die Klammern horizontal auf den umgebenden Muskeln, um ein Verrutschen zu verhindern. - Spülen Sie die Inzisionsstelle mit normaler Kochsalzlösung ab und trocknen Sie den Bereich mit einem sterilen Wattebausch, um das Blut zu entfernen und ein klares Operationsfeld zu erhalten.
- Unter einem Mikroskop (4-fache Vergrößerung) nähen Sie den CCA-Schnitt mit 11-0 mikrochirurgischen Nähten in einem unterbrochenen Muster, wobei je nach Schnittgröße in der Regel zwei Stiche erforderlich sind.
- Entfernen Sie nach dem Nähen die Mikroklemmen an beiden Enden des CCA, um den Blutfluss wiederherzustellen.
- Üben Sie mit einem sterilen Wattebausch 30 s lang Druck auf die CCA-Nahtstelle aus. Beobachten Sie die CCA 2 Minuten lang, um sicherzustellen, dass keine Blutungen auftreten. Nähen Sie den Halsschnitt der Ratte und legen Sie das Tier zur Narkosewiederherstellung in eine 35 °C Pflegebox, bevor Sie es in den Käfig zurückbringen.
HINWEIS: Intraperitoneal mit Meloxicam in einer Dosis von 2 mg/kg zur postoperativen Analgesie verabreichen.
5. Färben mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)
- Drei Tage nach der Ischämie-Reperfusion werden die Tiere unter tiefer Narkose mit 4% Isofluran und Zervixluxation eingeschläfert.
- Entfernen Sie die Gehirne und schneiden Sie sie mit einer Skalpellklinge in 2 mm dicke Kronenabschnitte8.
- Inkubieren Sie die Hirnabschnitte mit 2% TTC für 20 min bei 37 °C.
- Spülen Sie die Gehirnabschnitte zweimal mit 10 % Formalin aus und fixieren Sie sie dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 % Formalin.
- Nehmen Sie digitale Fotos von aufeinanderfolgenden Schnitten auf und messen Sie die Infarktbereiche quantitativ mit der Image J-Software.
6. Neurologischer Funktionstest
HINWEIS: Die neurologische Funktion wurde mit dem Garcia-Test bewertet, nach einem früheren Bericht9.
- Beurteilen Sie die spontane Aktivität, die Symmetrie in der Bewegung aller vier Gliedmaßen, das Ausstrecken der Vorderpfote, das Klettern, die Propriozeption des Körpers und die Reaktion auf Vibrissae-Berührungen. Vergeben Sie Punktzahlen basierend auf den Garcia-Testkriterien, wobei eine maximale Punktzahl von 18 Punkten auf eine normale neurologische Funktion hinweist.
7. Statistische Analyse
- Verwenden Sie GraphPad Prism, um statistische Analysen mit dem Student's t-Test durchzuführen. Geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung aus. Betrachten Sie Unterschiede zwischen den Mittelwerten als statistisch signifikant, wenn P 0,05 <.
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Ergebnisse
Der Mikronahtvorgang
Der Faden wurde bis nahe zur Einschnittstelle der A. carotis communis zurückgezogen, bis die weiße Fadenspitze sichtbar war (Abbildung 1A). Anschließend wurden Mikroklemmen an der A. carotis communis angebracht (Abbildung 1B). Unter dem Mikroskop bei 4facher Vergrößerung wurde die Einschnittstelle der A. carotis communis mit mikrochirurgischem Nahtmaterial in Einzelknopfnahttechnik verschlossen (Abbi...
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Diskussion
MCAo ist eine weit verbreitete Methode zur Erstellung von Tiermodellen für Schlaganfälle, die den bei Patienten beobachteten Schlaganfallprozess effektiv repliziert, indem der Blutfluss nach Ischämie wiederhergestelltwird 10,11,12. Unser Labor hat ein ischämisches Schlaganfallmodell entwickelt, das eine Reperfusion aus dem CCA ermöglicht, ohne das ECA zu schädigen. Nach der Induktion der Ischämie wird eine mikrochirurgische Repa...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde 2023 vom Hebei Province Introducing Foreign Intelligence Project unterstützt. Wir danken Lisa Kreiner, PhD, von Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), für die Bearbeitung des englischen Textes eines Entwurfs dieses Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10% Formalin | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. | BL913A | |
| 11-0 mikrochirurgische Nähte | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3/8 1&mal; | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) | SIGMA | T8877 | |
| 3-0 Seidennaht | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3-0 | |
| 4% Isofluran | Verifizierter Lieferant - Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd. | ||
| 6-0 Seidennaht | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 6-0 | |
| 70% Ethanol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Filament | Xinong Technologies Co Ltd. | 2838-A5 | |
| Ketamin | Verifizierter Lieferant - Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. | 230613BL | |
| Männliche Sprague Dawley Ratten | Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. | SCXK (Lu) 20190003 | |
| Mikroclips | Shanghai Jinzhong Medical Device Factory | W40150 | |
| Mikroskop | ZEISS | S100 OPMI pico | |
| Pflegebox | Beijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd. | FYL-YS-100L | |
| Xylazin | SIGMA | PHR3263 |
Referenzen
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