Der Gehalt an Lipidhydroperoxid ist der am häufigsten verwendete Indikator für den feroptotischen Zelltod. Dieser Artikel zeigt die Schritt-für-Schritt-Durchflusszytometrie-Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in Zellen nach Ferroptose-Induktion.
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Methodenartikel
Entschlüsselung des ferroptotischen Phänotyps des Medulloblastoms
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Wechselwirkung von Eisen und Sauerstoff ist ein integraler Bestandteil der Entwicklung des Lebens auf der Erde. Nichtsdestotrotz fasziniert und rätselt diese einzigartige Chemie immer wieder und führt zu neuen biologischen Unternehmungen. Im Jahr 2012 erkannte eine Gruppe der Columbia University diese Wechselwirkung als zentrales Ereignis, das zu einer neuen Art des regulierten Zelltods namens "Ferroptose" führt. Das Hauptmerkmal der Ferroptose ist die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden aufgrund von (1) dysfunktionaler antioxidativer Abwehr und/oder (2) überwältigendem oxidativem Stress, der am häufigsten mit einem erhöhten Gehalt an freiem labilem Eisen in der Zelle zusammenfällt. Dies wird normalerweise durch die kanonische antiferroptotische Achse verhindert, die aus dem Cystintransporter xCT, Glutathion (GSH) und GSH-Peroxidase 4 (GPx4) besteht. Da es sich bei der Ferroptose nicht um eine programmierte Art des Zelltods handelt, sind keine für die Apoptose charakteristischen Signalwege beteiligt. Der gebräuchlichste Weg, diese Art des Zelltods nachzuweisen, ist die Verwendung von lipophilen Antioxidantien (Vitamin E, Ferrostatin-1 usw.), um ihn zu verhindern. Diese Moleküle können sich oxidativen Schäden in der Plasmamembran nähern und diese entgiften. Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Aufklärung des ferroptotischen Phänotyps ist der Nachweis der vorangegangenen Akkumulation von Lipidhydroperoxiden, für die der spezifische Farbstoff BODIPY C11 verwendet wird. Das vorliegende Manuskript wird zeigen, wie Ferroptose in Wildtyp-Medulloblastomzellen mit Hilfe verschiedener Induktoren induziert werden kann: Erastin, RSL3 und Eisendonor. In ähnlicher Weise werden die xCT-KO-Zellen verwendet, die in Gegenwart von NAC wachsen und nach der Entfernung von NAC einer Ferroptose unterzogen werden. Der charakteristische "bubble" Phänotyp ist unter dem Lichtmikroskop innerhalb von 12-16 Stunden ab dem Zeitpunkt der Auslösung der Ferroptose sichtbar. Darüber hinaus wird eine BODIPY C11-Färbung mit anschließender FACS-Analyse verwendet, um die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden und den daraus resultierenden Zelltod mit der PI-Färbemethode zu zeigen. Um die ferroptotische Natur des Zelltods nachzuweisen, wird Ferrostatin-1 als spezifisches Ferroptose-verhinderndes Mittel verwendet.
Einleitung
Ferroptose ist eine neu kontextualisierte, von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) abhängige Art des Zelltods1. Neben ROS spielt Eisen eine entscheidende Rolle(n) bei dieser Art des Zelltods, daher der Name2. Der letzte und ausführende Schritt der Ferroptose ist die eisenkatalysierte Akkumulation oxidativer Schäden an Lipiden in der Plasmamembran, die schließlich zu einer Beeinträchtigung der Membranintegrität und selektiven Permeabilität und schließlich zum Zelltod durch Blasenbildung führt. Das Lipid-Hydroperoxidationsereignis ist ein natürlich vorkommendes Phänomen. Seine Ausbreitung in der Zellmembran wird jedoch durch....
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Protokoll
Die vorliegende Studie wurde mit DAOY-Wildtyp-Medulloblastom-Zelllinien (WT) durchgeführt, die bei 37 °C mit 5 % CO2 in DMEM-Medium und 8 % FBS supplementiert wurden. Die xCT-deletierte Zelllinie wurde unter den gleichen Bedingungen aufrechterhalten, wobei die Experimente in Medien durchgeführt wurden, die mit 1 mM N-Acetylcystein (NAC) ergänzt wurden. Die Zellen wurden regelmäßig mit einem kommerziell erhältlichen Mykoplasmen-Detektionskit auf Mykoplasmen untersucht und bis zur 10. Passage kultiviert.
1. Ernte und Aussaat der Zellen
HINWEIS: Alle Schritte wer....
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Ergebnisse
Die Medulloblastom-Zelllinie DAOY wurde in einem Standard-DMEM-Medium kultiviert, das mit 8 % FBS ergänzt wurde, bis sie eine Konfluenz von etwa 60 % erreichte. Am Tag des Experiments wurden die Zellen geerntet und 1.00.000 Zellen pro Well in 6-Well-Platten plattiert, wie aus Tabelle 1 hervorgeht. Am folgenden Tag wurden die Zellen (in dreifacher Ausfertigung) entweder mit 1 μM Erastin, 0,3 μM RSL3 oder 250 μM FAC behandelt. Die Platten wurden dann bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator gelegt.......
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Diskussion
Das primäre Kennzeichen des ferroptotischen Zelltods ist die unkontrollierte Akkumulation von Lipidhydroperoxiden in der Plasmamembran. Diese oxidative Schädigung kann auf enzymatische oder nicht-enzymatische Weise auftreten, aber in beiden Fällen ist die Reaktion eisenabhängig/katalysiert, was den Namen dieser Art des Zelltods erklärt. Die Lipidhydroperoxidation wird oft indirekt durch Messung der Abbauprodukte der Lipidhydroperoxidation geschätzt, wie z. B. 4-Hydroxy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) oder Malonaldehyd (MDA). D.......
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Offenlegungen
Wir erklären, dass für die hier vorgestellte Studie kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Regierung des Fürstentums Monaco sowie von der "Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer" (GEMLUC) und der Flavien-Stiftung unterstützt, die die Mittel für den Kauf von BD FACS Melody zur Verfügung stellte.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Zellzähler | Beckman | Schar Z1 | |
| DMEM mittel | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminiumcitrat | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fötales Bovin-Serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz | Thermo | Fisher 11599686 | |
| N-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mykoplasmen-Nachweiskit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| Propidiumiodid | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin - EDTA 10X - 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
Referenzen
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-depende....
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Nachdrucke und Genehmigungen
