Method Article

Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen

DOI:

10.3791/66647

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

In This Article

Summary

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Die Bildung von Superoxid-Anionen ist essentiell für die Stimulation von Blutplättchen und, wenn sie dysreguliert ist, entscheidend für thrombotische Erkrankungen. In diesem Artikel stellen wir drei Protokolle für den selektiven Nachweis von Superoxid-Anionen und die Untersuchung der redoxabhängigen Thrombozytenregulation vor.

Abstract

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Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hochgradig instabile sauerstoffhaltige Moleküle. Ihre chemische Instabilität macht sie extrem reaktiv und verleiht ihnen die Fähigkeit, mit wichtigen biologischen Molekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden zu reagieren. Superoxid-Anionen sind wichtige ROS, die durch die Reduktion der molekularen Sauerstoffreduktion (d. h. die Aufnahme eines Elektrons) erzeugt werden. Obwohl sie ursprünglich ausschließlich mit dem Altern, degenerativen und pathogenen Prozessen in Verbindung gebracht wurden, ist ihre Beteiligung an wichtigen physiologischen Reaktionen in jüngster Zeit offensichtlich geworden. Im Gefäßsystem wurde gezeigt, dass Superoxid-Anionen die Differenzierung und Funktion von glatten Gefäßmuskelzellen, die Proliferation und Migration von vaskulären Endothelzellen bei der Angiogenese, die Immunantwort und die Aktivierung von Blutplättchen bei der Blutstillung modulieren. Die Rolle von Superoxid-Anionen ist besonders wichtig bei der Fehlregulation von Blutplättchen und den kardiovaskulären Komplikationen, die mit einer Vielzahl von Erkrankungen verbunden sind, darunter Krebs, Infektionen, Entzündungen, Diabetes und Fettleibigkeit. Daher ist es in der kardiovaskulären Forschung äußerst relevant geworden, die Bildung von Superoxid-Anionen durch menschliche Blutplättchen effektiv zu messen, die redoxabhängigen Mechanismen zu verstehen, die das Gleichgewicht zwischen Blutstillung und Thrombose regulieren, und schließlich neue pharmakologische Werkzeuge zur Modulation von Thrombozytenreaktionen zu identifizieren, die zu Thrombosen und kardiovaskulären Komplikationen führen. In dieser Studie werden drei experimentelle Protokolle vorgestellt, die erfolgreich für den Nachweis von Superoxid-Anionen in Blutplättchen und die Untersuchung der redoxabhängigen Mechanismen zur Regulierung von Hämostase und Thrombose eingesetzt wurden: 1) Dihydroethidium (DHE)-basierter Superoxid-Anionen-Nachweis durch Durchflusszytometrie; 2) Visualisierung und Analyse von Superoxid-Anionen auf DHE-Basis durch Einzelthrombozyten-Bildgebung; und 3) Spin-Probe-basierte Quantifizierung des Superoxid-Anionenausstoßes in Thrombozyten durch Elektronen-Paramagnetische Resonanz (EPR).

Introduction

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Das Superoxid-Anion (O2•-) ist die funktionell relevanteste ROS, die in den Blutplättchen1 erzeugt wird. O2•- ist das Produkt der Reduktion von molekularem Sauerstoff und die Vorstufe vieler verschiedener ROS 2. Die Dismutation von O2•- führt zur Bildung von Wasserstoffperoxid (H2O2) durch spontane Reaktionen in wässriger Lösung oder durch Reaktionen, die durch Superoxiddismutasen (SODs3) katalysiert werden. Obwohl verschiedene enzymatische Quellen vorgeschlagen wurden (z. B. Xanthinoxidase4, Lipoxygenase5, Cyclooxygenase6 und Stickstoffmonoxidsynthase7), sind die mitochondriale Atmung 8,9 und die Nicotinamidadenindinukleotidphosphatoxidasen (NOXs)10 die prominentesten Quellen für Superoxidanionen in eukaryotischen Zellen. Dies scheint auch bei Blutplättchen der Fall zu sein, wo Elektronenleckagen aus der mitochondrialen Atmung11,12 und die enzymatische Aktivität von NOXs13,14 als Hauptverursacher der Superoxid-Anionenemission beschrieben wurden.

Obwohl sich mehrere Studien auf die Regulation von Blutplättchen durch O2•- konzentriert haben, gibt es keinen Konsens über die verantwortlichen molekularen Mechanismen. Die Modulation der Oberflächenrezeptoraktivität durch direkte Oxidation und Disulfidbindungsbildung wurde für verschiedene Thrombozytenrezeptoren vorgeschlagen. Die positive Regulation von Integrin αIIbβ3 durch ROS durch direkte Oxidation von Cysteinresten wurde vermutet 15,16,17. Da die Thrombozytenreaktionen auf Kollagen von der Disulfid-abhängigen Dimerisierung und der daraus resultierenden Dimerisierung des Glykoproteins VI (GPVI)18 abhängen, wurde eine Rezeptoraktivitätspotenzierung durch ROS-abhängige Oxidation vorgeschlagen19, obwohl sie experimentell nicht vollständig bewiesen werden konnte. Schließlich wurde gezeigt, dass die ROS-induzierte Oxidation der Sulfhydrylgruppen des Glykoproteins Ib (GPIb) die Thrombozytenadhäsion und die Thrombozyten-Leukozyten-Interaktion während der Entzündung fördert20. Umgekehrt wird als mögliche Folge einer verminderten Oxidation der Sulfhydrylgruppe und der Rezeptoraktivierung die Ablösung der Ektodomäne sowohl von GPVI als auch von GPIb durch die Verringerung der Bedingungenverringert 21.

Wirkmechanismen, die unabhängig von einer direkten Oxidation der Thrombozytenoberflächenrezeptoren sind, wurden ebenfalls vorgeschlagen. Es wurde gezeigt, dass ROS, einschließlich O2•-, den Kollagenrezeptor GPVI positiv modulieren, indem sie die Aktivität der Src-Homologieregion 2-haltigen Protein-Tyrosinphosphatase 2 (SHP-2) abschwächen, die die Signalkaskade dieses Rezeptorsnegativ reguliert 22. Darüber hinaus kann O2•- ONOO- (Peroxynitrit) durch schnelle Reaktion mit Stickstoffmonoxid (NO) erzeugen, das normalerweise Thrombozyten durch die NO-empfindliche Guanylylcyclase (NO-GC) hemmt, und durch die Erzeugung des negativen Thrombozytenregulators cyclic GMP (cGMP)23,24. Die daraus resultierende Abnahme des NO-Spiegels kann zu einer Thrombozytenpotenzierung führen. Alternativ wurde vermutet, dass die Erzeugung von O2•- durch NOX2 zur Lipidperoxidation und Isoprostanbildung beiträgt, die für die Aktivierung und Adhäsion der Blutplättchen essentiell ist25. Schließlich wird die extrazelluläre signalregulierte Kinase 5 (ERK5) der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK), eine Proteinkinase, die als Redoxstresssensor in Thrombozyten26 vorgeschlagen wird, durch O2•- aktiviert und induziert einen prokoagulanziellen Phänotyp in Blutplättchen (geschätzt durch durchflusszytometrische Messung der Phosphatidylserin-Externalisierung)27.

Die Dysregulation der O2•- und anderer ROS-Bildung in Blutplättchen wurde mit der übertriebenen hämostatischen Reaktion in Verbindung gebracht, die zu thrombotischen kardiovaskulären Komplikationen im Zusammenhang mit Atherosklerose, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, Fettleibigkeit und Krebs führte28,29. In diesen pathologischen Umgebungen ist die ROS-Ausstoßung durch Blutplättchen erhöht, was zu einer Potenzierung ihrer adhäsiven und aggregatorischen Reaktionen führt. Zusätzlich zu der Wirkung auf die Thrombozytenreaktion kann die Ausstoßung freier Radikale durch Blutplättchen Auswirkungen auf andere Blutzellen und Gefäßstrukturen haben, was ein wenig verstandener und wenig untersuchter Bereich der kardiovaskulären Gesundheit ist30. Trotz unseres begrenzten Verständnisses der molekularen Mechanismen, die oxidativen Stress mit thrombotischen Zuständen verbinden, hat die klinische Relevanz von Antioxidantien zum Schutz vor Herz-Kreislauf-Erkrankungen große Aufmerksamkeit erhalten. Es wurde gezeigt, dass die Antioxidantienspiegel im Plasma umgekehrt mit dem Risiko für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen korrelieren, und es wurde gezeigt, dass der Verzehr von Antioxidantien über die Nahrung vor koronarer Herzkrankheit schützt31,32. Folglich wurde die Verwendung von Antioxidantien in der Nahrung als vielversprechender Ansatz zur Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen befürwortet 33,34,35. Unter den Effekten der ROS-Erzeugung in Blutplättchen kann die Zunahme der Apoptose wichtige pathophysiologische Effekte haben36,37. Insgesamt werden zuverlässige Protokolle zum Nachweis und zur Quantifizierung des O2•--Ausstoßes von Blutplättchen in der kardiovaskulären Forschung immer wichtiger.

Die derzeit verfügbaren Techniken zum Nachweis von ROS weisen erhebliche Einschränkungen hinsichtlich der Spezifität (d. h. die chemische Natur der nachgewiesenen Oxidationsmittelmoleküle ist unbekannt) und der Zuverlässigkeit (d. h. die unerwünschte Wechselwirkung mit biologischen Molekülen und experimentellen Reagenzien führt zu verzerrten nicht-physiologischen Ergebnissen) auf38,39. Der am häufigsten verwendete Ansatz zum Nachweis von ROS in Blutplättchen basiert auf der Verwendung von Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA), das durch intrazelluläre Esterasen in Dichlordihydrofluorescein (DCFH) und folglich durch zelluläre Oxidantien, einschließlich Hydroxylradikale und Peroxidase-H2O2-Zwischenprodukte, in das hochfluoreszierende Dichlorfluorescein (DCF) umgewandelt wird40,41. Trotz seiner breiten Anwendung wurden ernsthafte Fragen hinsichtlich der Zuverlässigkeit dieses Ansatzes für die Messung von intrazellulärem ROS38 aufgeworfen. Die Oxidation von DCFH zu DCF kann in der Tat durch Übergangsmetallionen (z. B. Fe2+) oder Häm-haltige Enzyme (z. B. Cytochrome) anstelle von ROS42 induziert werden. Darüber hinaus wird DCFDA durch Zellperoxidasen in seine Form der freien Semichinonradikale (DCF•-) umgewandelt, die wiederum durch Reaktion mit molekularem Sauerstoff (O2) unter Freisetzung von O2•- zu DCF oxidiert wird, was zu einer künstlichen Amplifikation oxidativer Reaktionen führt 41,43,44 . Daher ist der Nachweis von intrazellulären ROS durch DCFDA nützlich, um erste Erkenntnisse zu gewinnen, erfordert jedoch eine vorsichtige Abwägung und umfangreiche experimentelle Kontrollen38,39.

In dieser Studie werden drei alternative Techniken zur Detektion und Messung des Schlüsselregulators der Thrombozytenfunktion O2•-1 vorgestellt. Die erste Technik ist der Nachweis mittels DHE und Durchflusszytometrie, der gegenüber DCFDA Vorteile in Bezug auf Zuverlässigkeit und Spezifität bietet. Die zweite hier vorgeschlagene Technik verwendet ebenfalls DHE, aber die Nachweismethode ist die Live-Thrombozyten-Fluoreszenzbildgebung, die die Untersuchung der Erzeugung von O2•- bei der Thrombozytensignalisierung mit schneller Kinetik und Einzelzellauflösung ermöglicht. Schließlich bietet ein Protokoll, das auf der Verwendung der Hydroxylamin-Spinsonde 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin (CMH) in EPR-Resonanzexperimenten basiert, die Möglichkeit, die Rate der O2•- Bildung durch Blutplättchen zu quantifizieren und unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.

Protocol

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Die Entnahme von peripherem Blut von einwilligenden Freiwilligen wird von der lokalen Ethikkommission und der National Health Service Health Research Authority genehmigt (REC-Referenz: 21/SC/0215; IRAS-ID: 283854).

1. Methode 1: Superoxid-Anionen-Nachweis mittels DHE mittels Durchflusszytometrie

  1. Erwärmen Sie die Natriumcitratlösung (4 % w/v) (37 °C) und verwenden Sie sie als Antikoagulans, indem Sie sie zum Zeitpunkt der Venenpunktion im Verhältnis 1:7 (0,5 % w/v endgültig) direkt ins Blut geben.
  2. Entnahme von peripherem menschlichem Blut von gesunden Probanden durch Venenpunktion der mittleren Kubitalvene.
  3. Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) aus Vollblut durch einen ersten Zentrifugationsschritt bei 200 x g für 20 Minuten.
  4. Zentrifugieren Sie PRP bei 500 x g für 10 min mit den reversiblen Thrombozytenhemmern Indomethacin (10 μM) und PGE1 (40 ng/ml).
  5. Resuspendieren Sie das resultierende Thrombozytenpellet in modifiziertem Tyrode-Puffer (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, pH 7,3) (37 °C) bei einer Dichte von 2 x 108 Thrombozyten/ml.
  6. Nach der Isolierung die Blutplättchen 30 Minuten lang bei 37 °C ruhen lassen.
  7. Bereiten Sie DHE in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Stammkonzentration von 5 mM vor.
  8. Geben Sie DHE in die Thrombozytensuspension in einer Endkonzentration von 5 μM (verdünnen Sie die Stammlösung 1 bis 1.000 mit einer endgültigen DMSO-Konzentration von 0,1 % v/v) und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 °C.
  9. Behandeln Sie die Blutplättchen 15 Minuten lang mit pharmakologischen Wirkstoffen und/oder ROS-Fängern vor der Stimulation mit den gewünschten physiologischen Reizen und Konzentrationen (z. B. 0,1 Einheiten/ml Thrombin oder 3 μg/ml Kollagen).
  10. Nach der Stimulation die Thrombozytensuspensionen 1 bis 10 in eiskaltem modifiziertem HEPES-Puffer verdünnen.
  11. Stellen Sie für die Durchflusszytometrie die Verstärkung der Seitenstreuung (SSC) und der Vorwärtsstreuung (FSC) auf 40 mV bzw. 220 mV ein und verwenden Sie logarithmische Streudiagramme, um die Partikelpopulation in der Suspension zu visualisieren (Beispiel in Abbildung 1A).
  12. (FAKULTATIV) Immunfärbung eines Aliquots der Thrombozytensuspension unter Verwendung eines Anti-CD41-Antikörpers, um die Population von Ereignissen zu identifizieren, die den Blutplättchen entsprechen (Beispiel in Abbildung 1B).
  13. Analyse der Proben mittels Durchflusszytometrie durch Anregung bei 405 nm (violetter Laser) und Emission bei 580 nm Wellenlänge, wodurch das Superoxid-Anionen-spezifische Produkt 2-Hydroxy-ethidium (2OH-Et+) selektiv nachgewiesen wird (Abbildung 2).
    HINWEIS: Eine Fixierung mit Paraformaldehyd und eine langfristige Probenlagerung sind nicht ratsam.

2. Methode 2: Superoxid-Anionen-Detektion mittels DHE mittels Einzelplättchen-Fluoreszenzbildgebung

  1. Beschichten Sie einen 8-Well-μ-Objektträger am Tag des Versuchs mit 0,1 mg/ml fibrillärem Kollagen I aus Pferdesehnen (Horm-Kollagen), 0,2 mg/ml Fibrinogen oder 1 mg/ml Poly-L-Lysin (PLL) in modifiziertem Tyrode-Puffer für 2 h bei 37 °C.
  2. Zweimal mit modifiziertem Tyrode-Puffer waschen (je 10 min).
  3. Beenden Sie die unspezifische Adhäsion durch Inkubation in modifiziertem Tyrode-Puffer plus 5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) für mindestens 30 Minuten (oder bis zum Experiment).
  4. Erwärmen Sie die Natriumcitratlösung (4 % w/v) (37 °C) und verwenden Sie sie als Antikoagulans, indem Sie sie zum Zeitpunkt der Venenpunktion im Verhältnis 1:7 (0,5 % w/v endgültig) direkt ins Blut geben.
  5. Entnahme von peripherem menschlichem Blut von gesunden Probanden durch Venenpunktion der mittleren Kubitalvene.
  6. Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) aus Vollblut durch einen ersten Zentrifugationsschritt bei 200 x g für 20 Minuten.
  7. Zentrifugieren Sie PRP bei 500 x g für 10 min mit den reversiblen Thrombozytenhemmern Indomethacin (10 μM) und PGE1 (40 ng/ml).
  8. Resuspendieren Sie das resultierende Thrombozytenpellet in modifiziertem Tyrode-Puffer (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, pH 7,3) (37 °C) bei einer Dichte von 4 x 107 Thrombozyten/ml.
  9. Nach der Isolierung die Blutplättchen 30 Minuten lang bei 37 °C ruhen lassen.
  10. Bereiten Sie DHE in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Stammkonzentration von 10 mM vor.
  11. DHE in einer Endkonzentration von 10 μM zur Thrombozytensuspension geben (die Stammlösung 1 bis 1.000 verdünnen, mit der endgültigen DMSO-Konzentration von 0,1 % v/v) und 1 min (37 °C) inkubieren.
  12. Nach der 1-minütigen Inkubation mit DHE entfernen Sie die Blockierungslösung aus den ausgewählten Vertiefungen, positionieren Sie den μ-Objektträger auf dem Mikroskoptisch, um die Bildgebung vorzubereiten, und dosieren Sie vorsichtig die Blutplättchen.
  13. Überwachen Sie die DHE-Umwandlung in 2OH-Et+ durch invertierte konfokale Bildgebung für 10 Minuten (405/580 nm ex/em), wobei die Bilder alle 10 s mit einer 40-fachen Ölimmersionslinse aufgenommen werden.
  14. (FAKULTATIV) Bei mit PLL beschichteten Vertiefungen ist die Superoxid-Anionenerzeugung als Reaktion auf einen löslichen Agonisten (z. B. 0,1 Einheiten/ml Thrombin oder 3 μg/ml Kollagen) zu überwachen, indem der Agonist 10 Minuten nach der Thrombozytendosierung und der Fluoreszenzbildsammlung für weitere 10 Minuten hinzugefügt wird, wie in Schritt 2.13 beschrieben.
  15. (FAKULTATIV) Falls erforderlich, Superoxid-Anionenfänger oder selektive Inhibitoren (z. B. NOX-Hemmer) hinzufügen, indem während des Zeitverlaufs vorsichtig an die Seite des Wells abgegeben wird, und Fluoreszenzbilder wie in 2.13 beschrieben für weitere 10 min aufnehmen.
  16. Quantifizieren Sie die Einzelzell-Fluoreszenzanalyse, indem Sie die Region of Interest (ROI) auswählen, die repräsentative einzelne Thrombozyten enthält, und die Fluoreszenzintensität in verschiedenen Frames mit dem Messwerkzeug der Imaging Suite ImageJ 1.53t analysieren.

3. Methode 3: Nachweis von Superoxid-Anionen durch Blutplättchen mittels Elektronenspinresonanz (EPR)

  1. Erwärmen Sie die Natriumcitratlösung (4 % w/v) (37 °C) und verwenden Sie sie als Antikoagulans, indem Sie sie zum Zeitpunkt der Venenpunktion im Verhältnis 1:7 (0,5 % w/v endgültig) direkt ins Blut geben.
  2. Entnahme von peripherem menschlichem Blut von gesunden Probanden durch Venenpunktion der mittleren Kubitalvene.
  3. Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) aus Vollblut durch einen ersten Zentrifugationsschritt bei 200 x g für 20 Minuten.
  4. Zentrifugieren Sie PRP bei 500 x g für 10 min mit den reversiblen Thrombozytenhemmern Indomethacin (10 μM) und PGE1 (40 ng/ml).
  5. Resuspendieren Sie das resultierende Thrombozytenpellet in modifiziertem Tyrode-Puffer (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, pH 7,3) (37 °C) bei einer Dichte von 2 x 108 Thrombozyten/ml.
  6. Nach der Isolierung die Blutplättchen 30 Minuten lang bei 37 °C ruhen lassen.
  7. 5 μM Diethyldithiocarbamat (DETC) und 25 μM Deferoxamin zur Thrombozytensuspension geben.
  8. Ohne Inkubation 200 μM 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin (CMH) zugeben.
  9. Laden Sie die Proben in Aggregationsküvetten (einschließlich teflonbeschichteter Rührmagnete) auf das Aggregometer.
  10. Fügen Sie nach 1 Minute die Stimuli in der gewünschten Konzentration hinzu (z. B. 1 Einheit/ml Thrombin oder 3 μg/ml Kollagen). 10 Min. inkubieren.
  11. (FAKULTATIV) Erhalten Sie die Erzeugung von Superoxid-Anionen zu verschiedenen Zeitpunkten, indem Sie zum gewünschten Zeitpunkt mit Schritt 3.12 fortfahren.
  12. Übertragen Sie die Thrombozytensuspension aus der Aggregationsküvette in ein Mikrozentrifugenröhrchen und schleudern Sie sie schnell bei 6.000 x g für 10 s herunter.
  13. 50 μl des Überstands in Kapillar-Mikropipetten füllen und mit EPR-Siegellack verschließen.
  14. Übertragen Sie die Proben an den EPR-Scanner.
  15. Stellen Sie den EPR-Scanner wie folgt ein: Mittelfeld 3.492,5 G, Feld-Sweep 60 G, Modulationsamplitude 2 G, Sweep-Zeit 10 s, Anzahl der Scans 10, Mikrowellenfrequenz 9,39 GHz, Mikrowellenleistung 20 mW, Wandlungszeit 327,68 ms, Zeitkonstante 5242,88 ms.
  16. Schätzen Sie die CMH-Oxidation auf CM● als die Fläche unter der Kurve (AUC) der EPR-Peaks, die unter Verwendung der oben genannten Parameter aufgezeichnet wurden.
  17. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve, in der die wie in Schritt 3.16 beschrieben gemessene EPR-Intensität auf der y-Achse und die Konzentrationen des kommerziell erhältlichen CM● auf der x-Achse (z. B. 0, 0,3, 1, 3, 10 und 30 μM) dargestellt sind.
  18. Aus der CM● -Konzentration in den Proben ermitteln Sie die Menge an Superoxidanionen, die von den Blutplättchen in den Proben erzeugt wird, unter Verwendung der im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beschriebenen Formeln.

Results

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Für die durchflusszytometrische Detektion der DHE-Fluoreszenz zeigen wir repräsentative Ergebnisse für Thrombozyten, die entweder ruhen (Abbildung 3A) oder mit 0,1 Einheiten/ml Thrombin stimuliert wurden (Abbildung 3B). DieO2•- Ausgabe wurde als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Thrombozyten quantifiziert, wie für die Stimulation mit 0,1 Einheiten/ml Thrombin (Abbildung 3C) oder 3 μg/ml Kollagen-verwandtem Peptid (CRP) (Abbildung 3D) gezeigt. Eine zwei- bis dreifache Zunahme der DHE-Färbung wurde als Folge der Thrombozytenstimulation beobachtet. Um zu bestätigen, dass O2•- gemessen wird, empfehlen wir die Verwendung der zellpermeablen O2•- -Scavenger-pegylierten Superoxiddismutase (PEG-SOD, 100 Einheiten/ml), während wir zur Identifizierung der Quelle von O2•- den NOX-Inhibitor VAS2870 (10 μM) verwenden. Sowohl für Kollagen als auch für Thrombin haben PEG-SOD und VAS2870 den durch die Thrombozytenaktivierung verursachten Anstieg der DHE-Fluoreszenz aufgehoben, was bestätigt, dass die Messung spezifisch für O2•- ist und dass ihre Quellen unter diesen Bedingungen NOX-Enzyme sind.

Für die bildgebende Detektion der DHE-Fluoreszenz präsentieren wir Daten aus Experimenten, die die Bildung von O2•- zum Zeitpunkt der Adhäsion an Kollagen oder Fibrinogen (und den folgenden 10 Minuten) (Abbildung 4A) untersuchten, oder aus Experimenten, die darauf abzielten, die O2•- -Bildung von Blutplättchen zu bewerten, die zuvor an PLL nach Stimulation mit Thrombin anhafteten (Abbildung 4B). Erwartungsgemäß löst die Adhäsion an PLL keine robuste Produktion von O2•- aus. Höchstwahrscheinlich, weil diese Form der Adhäsion von einer elektrostatischen Wechselwirkung abhängt, ohne dass eine Signalantwort45 ausgelöst wird, was diesen Ansatz geeignet macht, denO2•- -Ausgang als Reaktion auf die Zugabe löslicher Agonisten zu messen. Um zu bestätigen, dass dieses Protokoll den Nachweis von O2•- ermöglicht, können entweder Scavenger oder selektive Inhibitoren verwendet werden. In diesen Experimenten haben wir in früheren Studien gezeigt, dass N-Acetyl-Cystein (NAC) O2•- abfangen und die Thrombozytenfluoreszenz aufheben kann46. Hier zeigen wir, dass der selektive NOX-Hemmer die Fluoreszenz in Blutplättchen, die an Kollagen oder Fibrinogen haften VAS2870(Abbildung 4A) oder auf Thrombin ansprechen, effektiv und sofort abschwächt (Abbildung 4B). Dies deutet darauf hin, dass NOX unter diesen experimentellen Bedingungen die Quelle von O2•- sind. Repräsentative Filme für die DHE-Fluoreszenz (405 nm Anregung) als Reaktion auf die Adhäsion an Kollagen oder Fibrinogen oder die Stimulation von an PLL haftenden Blutplättchen durch Thrombin sind als Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2 bzw. Ergänzungsdatei 3 enthalten. Zu beachten ist, dass PEG-SOD, das in anderen Versuchsaufbauten erfolgreich als O2•- -Fänger eingesetzt wurde, in dieser Art von Experimenten nicht wirksam ist. Dafür haben wir im Moment keine klare Erklärung. Wir können die Hypothese aufstellen, dass PEG-SOD die zellulären Kompartimente erreicht, in denen O2•- in den bildgebenden Assays entweder mit schlechter Effizienz oder langsamer Kinetik eine erhöhte Fluoreszenz induziert. Zur Klärung dieses Punktes können weitere gezielte Untersuchungen erforderlich sein.

Wir haben die Messung von O2•- durch EPR in Blutplättchen in verschiedenen zuvor veröffentlichten Studien 1,13,47,48,49,50 angewendet. Ein entscheidender Schritt für diese Technik ist die Erstellung einer Kalibrierkurve unter Verwendung von kommerziell erhältlichem CM● (d.h. dem Produkt der Reaktion zwischen der Spinsonde CMH und O2•- und der mit EPR gemessenen resonanten Spezies). Die Reaktion von CMH und O2•- ist in Abbildung 5A dargestellt, und repräsentative Beispiele für das EPR-Signal, das durch unterschiedliche Konzentrationen von CM● induziert wird, sind in Abbildung 5B dargestellt. Die Daten aus verschiedenen CM●-Konzentrationen wurden verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen, die die lineare Korrelation zwischen der Menge an oxidiertem CMH und der EPR-Signalintensität in Proben beschreibt (Abbildung 5C). Die folgende Gleichung beschreibt die Korrelation zwischen der CM●-Konzentration und der EPR-Signalintensität und ist der Ausgangspunkt für die Berechnung der Kalibrierkurve für die Versuche in dieser Studie (Gleichung 1):

figure-results-1

Da sowohl die CM● -Konzentrationen als auch die entsprechende EPR-Intensität experimentell ermittelt wurden, können die Steigung und der Y-Achsen-Schnittpunkt der Kalibrierkurve berechnet werden. Im Beispiel in Abbildung 5C ist die Steigung = 1.002.169 und der Schnittpunkt = 596.383. Daher kann die Gleichung für die Kalibrierkurve wie folgt umgeschrieben werden:

figure-results-2

Durch Neuanordnen der obigen Gleichung ist es möglich, die CM● -Konzentration für verschiedene Proben auf der Grundlage ihrer EPR-Intensitätswerte zu berechnen (Gleichung 2):

figure-results-3

Sobald die Konzentration von CM● in den Proben bekannt ist, ist es möglich, die Erzeugungsrate pro Blutplättchen und Zeiteinheit mit der folgenden Gleichung zu berechnen (Gleichung 3):

figure-results-4

Unter Verwendung von Gleichung 2 kann Gleichung 3 wie folgt umgeschrieben werden (Gleichung 4):

figure-results-5

Die im Beispiel in Abbildung 5C wie folgt umgeschrieben werden kann:

figure-results-6

Die CMH-Oxidationsrate wird als Attomole von CM● ausgedrückt, die pro Thrombozyte und Minute erzeugt werden. Dieser Wert kann verwendet werden, um die O2•- Generationsrate zwischen Experimenten und Donatoren zu vergleichen, was mit Fluoreszenzsonden wie DHE (oder DCFDA) nicht möglich ist. Fluoreszenzsonden erlauben in der Regel nur eine Abschätzung des Einflusses verschiedener Bedingungen auf die O2•- -Erzeugung als Änderungen der Fluoreszenzintensität innerhalb desselben Experiments. Wie bei allen in diesem Artikel beschriebenen Techniken wurde die Spezifität des Nachweises mit ROS-Fängern (z. B. PEG-SOD, NAC) oder selektiven Inhibitoren von Enzymen, die Superoxid-Anionen erzeugen (z. B. VAS2870 zur Hemmung von NOXs), bestätigt. Hier präsentieren wir Daten zur Thrombozytenstimulation (Abbildung 6) mit Thrombin (Abbildung 6A,C,E) oder Kollagen (Abbildung 6B,D,F). Für beide Agonisten wurde PEG-SOD verwendet, um zu bestätigen, dass O2•- nachgewiesen wird, während die fehlende Wirkung für pegylierte Katalase (PEG-Cat.) darauf hindeutet, dass Wasserstoffperoxid mit dieser Technik nicht nachgewiesen wird (Abbildung 6C,D). VAS2870 beseitigt Thrombin- (Abbildung 6E) und Kollagen-induzierte (Abbildung 6F) EPR-Signale, was darauf hindeutet, dass NOXs die Hauptquelle für Thrombozyten-O2•- als Reaktion auf diese beiden Agonisten sind.

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Abbildung 1: Durchflusszytometrische Analyse von Thrombozytensuspensionen. (A) Typische Darstellung von Vorwärts- (FSC) und Seitenstreudiagrammen (SSC) für isolierte Thrombozyten. (B) Die Immunfärbung der Thrombozytensuspension mit einem Anti-CD41-Antikörper bestätigt >98% der Partikel in der Zubereitung als Thrombozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Chemische Reaktion von DHE mit Superoxid-Anion und anderen ROS und spektralen Eigenschaften seiner Produkte. Struktur und spektrale Eigenschaften von DHE und seinen beiden Oxidationsprodukten 2-Hydroxyethidium (2OH-Et+), erzeugt durch Reaktion mit Superoxid-Anionen, und Ethidium (Et+), erzeugt durch Reaktion mit anderen Arten von ROS (z. B. Hydroxylradikal und Wasserstoffperoxid). Der Anregungspeak bei 405 nm, der in der Abbildung durch ein gestricheltes blaues Rechteck hervorgehoben ist, ist spezifisch für 2OH-Et+ und kann daher zur Detektion/Messung von O2•- verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Thrombin- und kollagenabhängige Superoxid-Anionenbildung, nachgewiesen durch DHE und Durchflusszytometrie. Repräsentative Histogramme für die DHE-Färbung von (A) ruhenden und (B) Thrombin-stimulierten Thrombozyten. Der Balken zeigt DHE-Färbewerte unter 500 an, was 70,7 % bzw. 16,1 % für ruhende bzw. Thrombin-stimulierte Blutplättchen beträgt. Diese Technik wurde verwendet, um die Superoxid-Anionenbildung in (C) 0,1 Einheiten/ml Thrombin und (D) 3 μg/ml kollagenstimulierten Blutplättchen abzuschätzen. PEG-SOD (100 Einheiten/ml) wurde verwendet, um zu bestätigen, dass Superoxid-Anionen in diesem Experiment gemessen werden, während 10 μM VAS2870 verwendet wurde, um NOX-Enzyme als Quelle von Superoxid-Anionen zu identifizieren. Jeder Datenpunkt wurde als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von 50.000 Blutplättchen berechnet, und jedes Experiment wurde fünf unabhängige Male (n = 5) wiederholt, wobei die mittlere ± SEM in den Diagrammen dargestellt war. Die statistische Signifikanz wurde durch eine unidirektionale ANOVA mit Tukey-Post-Test für paarweise Vergleiche (** = p < 0,01, *** = p < 0,001) bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Kollagen-, Fibrinogen- und Thrombin-abhängige Superoxid-Anionenerzeugung, die durch DHE-Fluoreszenzbildgebung nachgewiesen wurde. (A) Die Kinetik der Superoxid-Anionenerzeugung wurde für Blutplättchen untersucht, die entweder an Kollagen oder Fibrinogen haften. Die Thrombozyten wurden 1 min nach Beginn der Bildgebung auf beschichtete μ-Objektträger dispensiert, während 10 μM VAS2870 5 min nach Beginn der Bildaufnahme hinzugefügt wurden. (B) Kinetik der Superoxid-Anionenerzeugung für Blutplättchen nach Stimulation mit Thrombin. Die Thrombozyten wurden vor Beginn der Bildaufnahme 10 Minuten lang an PLL-beschichteten μ-Objektträgern haften. Nach 2 Minuten wurden 0,1 Einheiten/ml Thrombin zugegeben, und nach weiteren 5 Minuten wurden 10 μM VAS2870 hinzugefügt (d. h. 7 Minuten nach Beginn der Bildgebung). Das experimentelle Schema wird am oberen Rand der Panels präsentiert, während repräsentative Bilder von 0 min, 1 min, 3 min, 6 min und 9 min in der Mitte der Panels gezeigt werden. Die Einzelplättchen-DHE-Fluoreszenzquantifizierung ist am unteren Rand der Panels dargestellt und wurde durch Fluoreszenzintensitätsanalyse mit ImageJ erhalten. Die Daten sind mittlere ± SEM von 8-12 Blutplättchen pro Bedingung in 4 unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Berechnung der Kalibrierkurve und der CMH-Oxidationsrate. (A) Chemische Struktur und EPR-Eigenschaften von CMH und CM●. (B) Repräsentative Beispiele für EPR-Daten für verschiedene Konzentrationen von CM● (100 nM bis 10 μM). (C) Kalibrierkurve der EPR-Intensität in Abhängigkeit von der CM● -Konzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Nachweis der Superoxid-Anionenproduktion durch Blutplättchen nach Thrombin- oder Kollagenstimulation. Der Superoxid-Anionenausstoß wurde mittels EPR mit der Spinsonde CMH in Thrombozyten gemessen, die entweder mit (A) 0,1 Einheiten/ml Thrombin oder (B) 3 μg/ml Kollagen stimuliert wurden. (C, D) Eine Konzentration von 100 Einheiten/ml des Superoxid-Anionenfängers PEG-SOD oder 100 Einheiten/ml des Wasserstoffperoxid-Fängers pegylierte Katalase (PEG-Cat.) wurde in die für beide Agonisten getesteten Bedingungen eingeschlossen. Die Quelle des Superoxid-Anions wurde durch Co-Inkubation mit dem NOX-Inhibitor VAS2870 (10 μM) untersucht. Sowohl (E)-Thrombin als auch (F)-Kollagen hängen von der NOX-Aktivität für die Bildung von Superoxid-Anionen ab. In der gesamten Abbildung wurde die CMH/Superoxid-Anionen-Reaktionsgeschwindigkeit aus den EPR-Spuren berechnet, wie im Manuskript beschrieben (Gleichung 4). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM aus 5 (C,D) und 4 unabhängigen Experimenten (E,F). Die statistische Signifikanz wurde durch eine unidirektionale ANOVA mit Tukey-Post-Test für paarweise Vergleiche (** = p < 0,01, *** = p < 0,001) bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Repräsentativer Film für DHE-Fluoreszenz (405 nm Anregung) als Reaktion auf Adhäsion an Kollagen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Repräsentativer Film für DHE-Fluoreszenz (405 nm Anregung) als Reaktion auf Adhäsionsfibrinogen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Repräsentativer Film für die DHE-Fluoreszenz (405 nm Anregung) als Reaktion auf die Stimulation von an PLL haftenden Blutplättchen durch Thrombin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

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In diesem Manuskript stellen wir drei verschiedene Techniken vor, die das Potenzial haben, die Fähigkeit zur Untersuchung der redoxabhängigen Regulation der Thrombozytenfunktion durch den selektiven Nachweis von O2•- zu verbessern. Die ersten beiden Methoden sind eine Verbesserung gegenüber bestehenden Techniken, da eine Redoxsonde verwendet wird (DHE anstelle der häufigeren, aber weniger zuverlässigen DCFDA). Diese Techniken sind daher leicht zugänglich, und die meisten Laboratorien können sie ohne besondere Ausrüstung oder Schulungskosten effektiv einsetzen. Die dritte Technik basiert auf der Verwendung von Spezialgeräten für die Analyse der Oxidation der Spinsonde CMH durch EPR. Diese Technik erfordert den Kauf von Spezialgeräten und Reagenzien sowie die entsprechende Schulung des Laborbenutzers. Daher scheint es für Laboratorien geeignet zu sein, die sich speziell auf die Untersuchung redoxabhängiger Ereignisse in Blutplättchen (oder anderen Zellen) konzentrieren.

Bei Techniken, die DHE verwenden, ist die Wellenlängenauswahl für die Anregung entscheidend, um den spezifischen Nachweis von O2•- zu erhalten. 2-Hydroxyethidium (2OH-Et+), das durch die Reaktion von DHE mit O2•- erzeugt wird, wird bei 405 nm angeregt, während Ethidium (Et+), das durch die allgemeine Reaktion von DHE mit ROS (z. B. Hydroxylradikal und Wasserstoffperoxid) erzeugt wird, einen Anregungspeak um 520 nm, aber keine Anregung bei 405 nm aufweist (Abbildung 1)51. Die Verwendung von DHE anstelle von DCFDA schützt vor den Artefakten, die durch die direkte Reaktion dieser Sonde mit zellulären Komponenten wie Peroxidasen, anderen hämhaltigen Enzymen und Metallionenreduktionsmitteln verursachtwerden 42,43,44. DHE wurde als sichereres Werkzeug für zelluläre Redoxstudien vorgeschlagen38,39. Hier schlagen wir die Verwendung von DHE mit zwei verschiedenen Auslesetechniken vor: 1) Durchflusszytometrie und 2) Fluoreszenzbildgebung.

Die Durchflusszytometrie ist im Allgemeinen eine Technik, die die gleichzeitige Handhabung mehrerer Proben mit einem niedrigen bis mittleren Durchsatz ermöglicht52. Leider erlaubt der in dieser Studie verwendete Ansatz keine Probenfixierung. Obwohl die Verdünnung der Proben mit eiskalt modifiziertem Tyrode-Puffer die Fluoreszenz in den Proben für bis zu 30 Minuten stabilisiert, muss die Analyse aller Proben in diesem Zeitrahmen durchgeführt werden. Dadurch wird die Anzahl der Proben pro Experiment deutlich eingeschränkt. Mehrere intern kontrollierte Versuchsläufe am selben Tag und mit demselben Thrombozytenpräparat sind möglich, obwohl die Ergebnisse auf Kontrollen normalisiert und nicht als unabhängige Experimente betrachtet werden sollten. Diese Technik wurde von den Autoren dieses Manuskripts verwendet, um die Rolle der redoxabhängigen Thrombozytenmodulation bei der Reaktion auf verschiedene Agonisten und Modulatoren hervorzuheben 46,50. Diese Methode kann modifiziert werden, indem eine chemisch modifizierte Version von DHE verwendet wird, die das Targeting von Mitochondrien (d.h. Mitosox)53 ermöglicht, die für Thrombozytenstudien mit Schwerpunkt auf NOX254 verwendet wurde. Dies ist eine interessante Möglichkeit, die von unseren Labors noch nicht genutzt wurde.

Das hier vorgeschlagene Fluoreszenzbildgebungsverfahren mit DHE hat den Vorteil, dass es den zeitlichen Verlauf der O2•- -Bildung in Thrombozyten bei Adhäsion (Agonisten, die auf der Oberfläche der Bildgebungsvertiefung absorbiert werden) oder Stimulation (Agonisten in Suspension) bestimmen kann. Dies ermöglicht die Interpretation des Zusammenspiels verschiedener Phasen des Thrombozytenaktivierungsprozesses und die Bewertung des Beitrags verschiedener O2•- Quellen (z.B. verschiedener ROS-erzeugender Enzyme, z.B. NOXe). Keine bestehende Technik ermöglicht diese Art der Untersuchung. Dies ist mit Kosten in Bezug auf den Assay-Durchsatz verbunden, da jede getestete Bedingung 30 Minuten dauert (einschließlich μ-Objektträger-Setup, Fokussierung und Feldauswahl, Bildgebung und Datenspeicherung). Daher ermöglicht diese Technik die Prüfung einer kleinen Anzahl von Bedingungen pro Arbeitstag (d. h. unter 10). Obwohl für die hier gezeigten Daten ein konfokales Mikroskop verwendet wurde, haben wir bestätigt, dass mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Anregungsfähigkeit von 405 nm ebenso gute Ergebnisse erzielt werden können. Dies reduziert den Bedarf an teuren konfokalen Mikroskopie-Setups und macht diese Technik erschwinglicher.

Das EPR-Protokoll wurde auf der Grundlage früherer Studien an verschiedenen Zelltypen entwickelt55. Diese Technik gilt weithin als das zuverlässigste Werkzeug für die Untersuchung der ROS-Erzeugung und die Untersuchung redoxabhängiger Ereignisse in Zellen38. Neben der überlegenen Zuverlässigkeit im Vergleich zu anderen Techniken aufgrund der Spezifität der Reaktion von Hydroxylamin-Spinsonden mit sauerstofffreien Radikalen56 ermöglicht EPR die Quantifizierung derO2•- Generationsrate und deren Vergleich zwischen verschiedenen Individuen und Experimenten. Dies ist mit fluoreszenzbasierten Techniken nicht möglich, die es uns nur ermöglichen, den Einfluss ausgewählter Bedingungen auf die Fluoreszenzintensität innerhalb eines einzigen Experiments und der Thrombozytenpräparation abzuschätzen. Obwohl dieses EPR-Protokoll als eine Technik zur Kombination mit der Thrombozytenaggregation zur parallelen Überwachung der Thrombozytenaktivierung und der O2•- Generation1 entwickelt wurde, können diese Experimente ohne die parallele Analyse der Aggregation durchgeführt werden. Auch ohne parallele Analyse der Thrombozytenaggregation empfehlen wir, die Inkubation in einem Aggregometer durchzuführen, um eine effektive Thrombozytenstimulation zu gewährleisten, die die Scherspannung erfordert, die durch kontinuierliches Rühren erzeugt wird. Wenn die Experimente in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen ohne Rühren durchgeführt werden müssen, sind die Niveaus der O2•- Produktion deutlich niedriger. Wenn dieser experimentelle Ansatz gewählt wird, empfehlen wir daher, die CMH-Inkubation auf einem rotierenden Rad und mit dichter konzentrierten Blutplättchen (d.h. 1 x 109/ml) durchzuführen, was zu einem Signal führt, das stark genug ist, um vom EPR-Spektrometer detektiert zu werden.

Zusammenfassend stellen wir Ihnen hier drei validierte Techniken zum Nachweis von O2•- in Blutplättchen vor. Sie bieten unterschiedliche Vorteile und können je nach Versuchszielen und -prioritäten gewählt werden. Die erste Technik, die auf der Verwendung von DHE durch Durchflusszytometrie basiert, ist am wenigsten aufwendig und zeitaufwändig und kann daher als Einstiegsanalytik gewählt werden. Die zweite Technik, die auf der Verwendung von DHE durch Fluoreszenzmikroskopie basiert, ermöglicht es, die schnelle Kinetik der O2•- -Erzeugung zu verstehen und zu untersuchen, wie verschiedene Signalkaskaden die oxidative Reaktion in der Zeitskala von Sekunden beeinflussen können (während andere Techniken nur die Endpunktuntersuchung von Ereignissen ermöglichen, die innerhalb von Minuten nach der Stimulation auftreten). Schließlich ermöglicht EPR die Quantifizierung der O2•- Generationsrate und deren Vergleich zwischen Experimenten und Individuen. Aus diesem Grund ist die letztere Technik besonders nützlich für klinische Studien, die darauf abzielen, die oxidative Reaktion in Blutplättchen verschiedener Individuen zu charakterisieren (z. B. Vergleich zwischen Patienten oder Patienten mit gesunden Kontrollen). Insgesamt bieten diese drei Techniken erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Methoden und stellen einen deutlichen Fortschritt in den experimentellen Werkzeugen dar, die uns zur Untersuchung redoxabhängiger Ereignisse in Blutplättchen zur Verfügung stehen.

Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) und dem Europäischen Forschungsrat (#10102507) für G. Pula finanziert.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin (CMH)Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagenz für EPR (Spin-Sonde)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NADurchflusszytometer
Rinderserum AlbuminMerck/SigmaA7030Für μ-Objektträgerbeschichtung
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbH  NOX-E.11-BES EPR-Spektrometer
Katalase– Polyethylenglykol (PEG-Kat.)Merck/SigmaC4963Wasserstoffperoxid-Scavenger (Spezifitätskontrolle)
ChronoLog Modell 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM RadikalNoxygen Science Trasfer und Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagenz für EPR (Kalibrierkontrolle)
Deferoxamin Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagenz für EPD
Diethyldithiocarbamat (DETC) Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagenz für EPD
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxid-Anionensonde
DimethylsulfoxidMerck/Sigma34869Für die Herstellung von Stammlösungen 
EPR-SiegellackplattenNoxygen Science trasfer und Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMVerbrauchsmaterial für
EPR-WasserNoxygen Science transfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagenz für EPD
Fibrinogen aus humanem PlasmaMerck/SigmaF4883Für die μ-Objektträgerbeschichtung
FITC Anti-Human-CD41 AntikörperBioLegend303704Thrombozytenspezifische Färbung für die Durchflusszytometrie
Glasküvetten Labmedics/ChronologP/N 312Verbrauchsmaterial für die Inkubation im Aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385Für die Thrombozytenstimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378Für die Thrombozytenisolierung
Mikropipetten DURAN 50µ lNoxygen Science übertragen und Diagnostik GmbHNOX-G.6.1-50µ LVerbrauchsmaterial für EPR
Poly-L-LysinhydrochloridMerck/SigmaP2658Für μ-Objektträgerbeschichtung
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515Für die Thrombozytenisolierung
Natriumcitrat (4% w/v Lösung)Merck/SigmaS5770Für die Thrombozytenisolierung
Rührstäbchen (teflonbeschichtet)Labmedics/ChronologP/N 313Verbrauchsmaterial für die Inkubation in einem Aggregometer
Superoxiddismutase– Polyethylenglykol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxid-Anionenfänger (Spezifitätskontrolle)
Thrombin aus humanem PlasmaMerck/SigmaT6884Zur Thrombozytenstimulation und Objektträgerbeschichtung
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX-Hemmer
Zeiss 510 LSM KonfokalmikroskopZeissNAKonfokales Mikroskop

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