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Methodenartikel

Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen

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DOI:

10.3791/66647

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29. März 2024

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Bildung von Superoxid-Anionen ist essentiell für die Stimulation von Blutplättchen und, wenn sie dysreguliert ist, entscheidend für thrombotische Erkrankungen. In diesem Artikel stellen wir drei Protokolle für den selektiven Nachweis von Superoxid-Anionen und die Untersuchung der redoxabhängigen Thrombozytenregulation vor.

Zusammenfassung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hochgradig instabile sauerstoffhaltige Moleküle. Ihre chemische Instabilität macht sie extrem reaktiv und verleiht ihnen die Fähigkeit, mit wichtigen biologischen Molekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden zu reagieren. Superoxid-Anionen sind wichtige ROS, die durch die Reduktion der molekularen Sauerstoffreduktion (d. h. die Aufnahme eines Elektrons) erzeugt werden. Obwohl sie ursprünglich ausschließlich mit dem Altern, degenerativen und pathogenen Prozessen in Verbindung gebracht wurden, ist ihre Beteiligung an wichtigen physiologischen Reaktionen in jüngster Zeit offensichtlich geworden. Im Gefäßsystem wurde gezeigt, dass Superoxid-Anionen die Differenzierung und Funktion von glatten Gefäßmuskelzellen, die Proliferation und Migration von vaskulären Endothelzellen bei der Angiogenese, die Immunantwort und die Aktivierung von Blutplättchen bei der Blutstillung modulieren. Die Rolle von Superoxid-Anionen ist besonders wichtig bei der Fehlregulation von Blutplättchen und den kardiovaskulären Komplikationen, die mit einer Vielzahl von Erkrankungen verbunden sind, darunter Krebs, Infektionen, Entzündungen, Diabetes und Fettleibigkeit. Daher ist es in der kardiovaskulären Forschung äußerst relevant geworden, die Bildung von Superoxid-Anionen durch menschliche Blutplättchen effektiv zu messen, die redoxabhängigen Mechanismen zu verstehen, die das Gleichgewicht zwischen Blutstillung und Thrombose regulieren, und schließlich neue pharmakologische Werkzeuge zur Modulation von Thrombozytenreaktionen zu identifizieren, die zu Thrombosen und kardiovaskulären Komplikationen führen. In dieser Studie werden drei experimentelle Protokolle vorgestellt, die erfolgreich für den Nachweis von Superoxid-Anionen in Blutplättchen und die Untersuchung der redoxabhängigen Mechanismen zur Regulierung von Hämostase und Thrombose eingesetzt wurden: 1) Dihydroethidium (DHE)-basierter Superoxid-Anionen-Nachweis durch Durchflusszytometrie; 2) Visualisierung und Analyse von Superoxid-Anionen auf DHE-Basis durch Einzelthrombozyten-Bildgebung; und 3) Spin-Probe-basierte Quantifizierung des Superoxid-Anionenausstoßes in Thrombozyten durch Elektronen-Paramagnetische Resonanz (EPR).

Einleitung

Das Superoxid-Anion (O2•-) ist die funktionell relevanteste ROS, die in den Blutplättchen1 erzeugt wird. O2•- ist das Produkt der Reduktion von molekularem Sauerstoff und die Vorstufe vieler verschiedener ROS 2. Die Dismutation von O2•- führt zur Bildung von Wasserstoffperoxid (H2O2) durch spontane Reaktionen in wässriger Lösung oder durch Reaktionen, die durch Superoxiddismutasen (SODs3) katalysiert werden. Obwohl verschiedene enzymatische Quellen vorgeschlagen wurden (z. B. Xanthinoxidase4, Lipoxygenase5, Cyclooxygenase6 und Stickstoffmonoxidsynthase7), sind die mitochondriale Atmung 8,9 und die Nicotinamidadenindinukleotidphosphatoxidasen (NOXs)10 die prominentesten Quellen für Superoxidanionen in eukaryotischen Zellen. Dies scheint auch bei Blutplättchen der Fall zu sein, wo Elektronenleckagen aus der mitochondrialen Atmung11,12 und die enzymatische Aktivität von NOXs13,14 als Hauptverursacher der Superoxid-Anionenemission beschrieben wurden.

Obwohl sich mehrere Studien auf die Regulation von Blutplättchen durch O2•- konzentriert haben, gibt es keinen Konsens über die verantwortlichen molekularen Mechanismen. Die Modulation der Oberflächenrezeptoraktivität durch direkte Oxidation und Disulfidbindungsbildung wurde für verschiedene Thrombozytenrezeptoren vorgeschlagen. Die positive Regulation von Integrin αIIbβ3 durch ROS durch direkte Oxidation von Cysteinresten wurde vermutet 15,16,17. Da die Thrombozytenreaktionen auf Kollagen von der Disulfid-abhängigen Dimerisierung und der daraus resultierenden Dimerisierung des Glykoproteins VI (GPVI)18 abhängen, wurde eine Rezeptoraktivitätspotenzierung durch ROS-abhängige Oxidation vorgeschlagen19, obwohl sie experimentell nicht vollständig bewiesen werden konnte. Schließlich wurde gezeigt, dass die ROS-induzierte Oxidation der Sulfhydrylgruppen des Glykoproteins Ib (GPIb) die Thrombozytenadhäsion und die Thrombozyten-Leukozyten-Interaktion während der Entzündung fördert20. Umgekehrt wird als mögliche Folge einer verminderten Oxidation der Sulfhydrylgruppe und der Rezeptoraktivierung die Ablösung der Ektodomäne sowohl von GPVI als auch von GPIb durch die Verringerung der Bedingungenverringert 21.

Wirkmechanismen, die unabhängig von einer direkten Oxidation der Thrombozytenoberflächenrezeptoren sind, wurden ebenfalls vorgeschlagen. Es wurde gezeigt, dass ROS, einschließlich O2•-, den Kollagenrezeptor GPVI positiv modulieren, indem sie die Aktivität der Src-Homologieregion 2-haltigen Protein-Tyrosinphosphatase 2 (SHP-2) abschwächen, die die Signalkaskade dieses Rezeptorsnegativ reguliert 22. Darüber hinaus kann O2•- ONOO- (Peroxynitrit) durch schnelle Reaktion mit Stickstoffmonoxid (NO) erzeugen, das normalerweise Thrombozyten durch die NO-empfindliche Guanylylcyclase (NO-GC) hemmt, und durch die Erzeugung des negativen Thrombozytenregulators cyclic GMP (cGMP)23,24. Die daraus resultierende Abnahme des NO-Spiegels kann zu einer Thrombozytenpotenzierung führen. Alternativ wurde vermutet, dass die Erzeugung von O2•- durch NOX2 zur Lipidperoxidation und Isoprostanbildung beiträgt, die für die Aktivierung und Adhäsion der Blutplättchen essentiell ist25. Schließlich wird die extrazelluläre signalregulierte Kinase 5 (ERK5) der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK), eine Proteinkinase, die als Redoxstresssensor in Thrombozyten26 vorgeschlagen wird, durch O2•- aktiviert und induziert einen prokoagulanziellen Phänotyp in Blutplättchen (geschätzt durch durchflusszytometrische Messung der Phosphatidylserin-Externalisierung)27.

Die Dysregulation der O2•- und anderer ROS-Bildung in Blutplättchen wurde mit der übertriebenen hämostatischen Reaktion in Verbindung gebracht, die zu thrombotischen kardiovaskulären Komplikationen im Zusammenhang mit Atherosklerose, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, Fettleibigkeit und Krebs führte28,29. In diesen pathologischen Umgebungen ist die ROS-Ausstoßung durch Blutplättchen erhöht, was zu einer Potenzierung ihrer adhäsiven und aggregatorischen Reaktionen führt. Zusätzlich zu der Wirkung auf die Thrombozytenreaktion kann die Ausstoßung freier Radikale durch Blutplättchen Auswirkungen auf andere Blutzellen und Gefäßstrukturen haben, was ein wenig verstandener und wenig untersuchter Bereich der kardiovaskulären Gesundheit ist30. Trotz unseres begrenzten Verständnisses der molekularen Mechanismen, die oxidativen Stress mit thrombotischen Zuständen verbinden, hat die klinische Relevanz von Antioxidantien zum Schutz vor Herz-Kreislauf-Erkrankungen große Aufmerksamkeit erhalten. Es wurde gezeigt, dass die Antioxidantienspiegel im Plasma umgekehrt mit dem Risiko für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen korrelieren, und es wurde gezeigt, dass der Verzehr von Antioxidantien über die Nahrung vor koronarer Herzkrankheit schützt31,32. Folglich wurde die Verwendung von Antioxidantien in der Nahrung als vielversprechender Ansatz zur Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen befürwortet 33,34,35. Unter den Effekten der ROS-Erzeugung in Blutplättchen kann die Zunahme der Apoptose wichtige pathophysiologische Effekte haben36,37. Insgesamt werden zuverlässige Protokolle zum Nachweis und zur Quantifizierung des O2•--Ausstoßes von Blutplättchen in der kardiovaskulären Forschung immer wichtiger.

Die derzeit verfügbaren Techniken zum Nachweis von ROS weisen erhebliche Einschränkungen hinsichtlich der Spezifität (d. h. die chemische Natur der nachgewiesenen Oxidationsmittelmoleküle ist unbekannt) und der Zuverlässigkeit (d. h. die unerwünschte Wechselwirkung mit biologischen Molekülen und experimentellen Reagenzien führt zu verzerrten nicht-physiologischen Ergebnissen) auf38,39. Der am häufigsten verwendete Ansatz zum Nachweis von ROS in Blutplättchen basiert auf der Verwendung von Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA), das durch intrazelluläre Esterasen in Dichlordihydrofluorescein (DCFH) und folglich durch zelluläre Oxidantien, einschließlich Hydroxylradikale und Peroxidase-H2O2-Zwischenprodukte, in das hochfluoreszierende Dichlorfluorescein (DCF) umgewandelt wird40,41. Trotz seiner breiten Anwendung wurden ernsthafte Fragen hinsichtlich der Zuverlässigkeit dieses Ansatzes für die Messung von intrazellulärem ROS38 aufgeworfen. Die Oxidation von DCFH zu DCF kann in der Tat durch Übergangsmetallionen (z. B. Fe2+) oder Häm-haltige Enzyme (z. B. Cytochrome) anstelle von ROS42 induziert werden. Darüber hinaus wird DCFDA durch Zellperoxidasen in seine Form der freien Semichinonradikale (DCF•-) umgewandelt, die wiederum durch Reaktion mit molekularem Sauerstoff (O2) unter Freisetzung von O2•- zu DCF oxidiert wird, was zu einer künstlichen Amplifikation oxidativer Reaktionen führt 41,43,44 . Daher ist der Nachweis von intrazellulären ROS durch DCFDA nützlich, um erste Erkenntnisse zu gewinnen, erfordert jedoch eine vorsichtige Abwägung und umfangreiche experimentelle Kontrollen38,39.

In dieser Studie werden drei alternative Techniken zur Detektion und Messung des Schlüsselregulators der Thrombozytenfunktion O2•-1 vorgestellt. Die erste Technik ist der Nachweis mittels DHE und Durchflusszytometrie, der gegenüber DCFDA Vorteile in Bezug auf Zuverlässigkeit und Spezifität bietet. Die zweite hier vorgeschlagene Technik verwendet ebenfalls DHE, aber die Nachweismethode ist die Live-Thrombozyten-Fluoreszenzbildgebung, die die Untersuchung der Erzeugung von O2•- bei der Thrombozytensignalisierung mit schneller Kinetik und Einzelzellauflösung ermöglicht. Schließlich bietet ein Protokoll, das auf der Verwendung der Hydroxylamin-Spinsonde 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin (CMH) in EPR-Resonanzexperimenten basiert, die Möglichkeit, die Rate der O2•- Bildung durch Blutplättchen zu quantifizieren und unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.

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Protokoll

Die Entnahme von peripherem Blut von einwilligenden Freiwilligen wird von der lokalen Ethikkommission und der National Health Service Health Research Authority genehmigt (REC-Referenz: 21/SC/0215; IRAS-ID: 283854).

1. Methode 1: Superoxid-Anionen-Nachweis mittels DHE mittels Durchflusszytometrie

  1. Erwärmen Sie die Natriumcitratlösung (4 % w/v) (37 °C) und verwenden Sie sie als Antikoagulans, indem Sie sie zum Zeitpunkt der Venenpunktion im Verhältnis 1:7 (0,5 % w/v endgültig) direkt ins Blut geben.
  2. Entnahme von peripherem menschlichem Blut von gesunden Probanden durch Venenpunktion der mittleren Kubitalvene.
  3. Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) aus Vollblut durch einen ersten Zentrifugationsschritt bei 200 x g für 20 Minuten.
  4. Zentrifugieren Sie PRP bei 500 x g für 10 min mit den reversiblen Thrombozytenhemmern Indomethacin (10 μM) und PGE1 (40 ng/ml).
  5. Resuspendieren Sie das resultierende Thrombozytenpellet in modifiziertem Tyrode-Puffer (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, pH 7,3) (37 °C) bei einer Dichte von 2 x 108 Thrombozyten/ml.
  6. Nach der Isolierung die Blutplättchen 30 Minuten lang bei 37 °C ruhen lassen.
  7. Bereiten Sie DHE in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Stammkonzentration von 5 mM vor.
  8. Geben Sie DHE in die Thrombozytensuspension in einer Endkonzentration von 5 μM (verdünnen Sie die Stammlösung 1 bis 1.000 mit einer endgültigen DMSO-Konzentration von 0,1 % v/v) und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 °C.
  9. Behandeln Sie die Blutplättchen 15 Minuten lang mit pharmakologischen Wirkstoffen und/oder ROS-Fängern vor der Stimulation mit den gewünschten physiologischen Reizen und Konzentrationen (z. B. 0,1 Einheiten/ml Thrombin oder 3 μg/ml Kollagen).
  10. Nach der Stimulation die Thrombozytensuspensionen 1 bis 10 in eiskaltem modifiziertem HEPES-Puffer verdünnen.
  11. Stellen Sie für die Durchflusszytometrie die Verstärkung der Seitenstreuung (SSC) und der Vorwärtsstreuung (FSC) auf 40 mV bzw. 220 mV ein und verwenden Sie logarithmische Streudiagramme, um die Partikelpopulation in der Suspension zu visualisieren (Beispiel in Abbildung 1A).
  12. (FAKULTATIV) Immunfärbung eines Aliquots der Thrombozytensuspension unter Verwendung eines Anti-CD41-Antikörpers, um die Population von Ereignissen zu identifizieren, die den Blutplättchen entsprechen (Beispiel in Abbildung 1B).
  13. Analyse der Proben mittels Durchflusszytometrie durch Anregung bei 405 nm (violetter Laser) und Emission bei 580 nm Wellenlänge, wodurch das Superoxid-Anionen-spezifische Produkt 2-Hydroxy-ethidium (2OH-Et+) selektiv nachgewiesen wird (Abbildung 2).
    HINWEIS: Eine Fixierung mit Paraformaldehyd und eine langfristige Probenlagerung sind nicht ratsam.

2. Methode 2: Superoxid-Anionen-Detektion mittels DHE mittels Einzelplättchen-Fluoreszenzbildgebung

  1. Beschichten Sie einen 8-Well-μ-Objektträger am Tag des Versuchs mit 0,1 mg/ml fibrillärem Kollagen I aus Pferdesehnen (Horm-Kollagen), 0,2 mg/ml Fibrinogen oder 1 mg/ml Poly-L-Lysin (PLL) in modifiziertem Tyrode-Puffer für 2 h bei 37 °C.
  2. Zweimal mit modifiziertem Tyrode-Puffer waschen (je 10 min).
  3. Beenden Sie die unspezifische Adhäsion durch Inkubation in modifiziertem Tyrode-Puffer plus 5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) für mindestens 30 Minuten (oder bis zum Experiment).
  4. Erwärmen Sie die Natriumcitratlösung (4 % w/v) (37 °C) und verwenden Sie sie als Antikoagulans, indem Sie sie zum Zeitpunkt der Venenpunktion im Verhältnis 1:7 (0,5 % w/v endgültig) direkt ins Blut geben.
  5. Entnahme von peripherem menschlichem Blut von gesunden Probanden durch Venenpunktion der mittleren Kubitalvene.
  6. Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) aus Vollblut durch einen ersten Zentrifugationsschritt bei 200 x g für 20 Minuten.
  7. Zentrifugieren Sie PRP bei 500 x g für 10 min mit den reversiblen Thrombozytenhemmern Indomethacin (10 μM) und PGE1 (40 ng/ml).
  8. Resuspendieren Sie das resultierende Thrombozytenpellet in modifiziertem Tyrode-Puffer (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, pH 7,3) (37 °C) bei einer Dichte von 4 x 107 Thrombozyten/ml.
  9. Nach der Isolierung die Blutplättchen 30 Minuten lang bei 37 °C ruhen lassen.
  10. Bereiten Sie DHE in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Stammkonzentration von 10 mM vor.
  11. DHE in einer Endkonzentration von 10 μM zur Thrombozytensuspension geben (die Stammlösung 1 bis 1.000 verdünnen, mit der endgültigen DMSO-Konzentration von 0,1 % v/v) und 1 min (37 °C) inkubieren.
  12. Nach der 1-minütigen Inkubation mit DHE entfernen Sie die Blockierungslösung aus den ausgewählten Vertiefungen, positionieren Sie den μ-Objektträger auf dem Mikroskoptisch, um die Bildgebung vorzubereiten, und dosieren Sie vorsichtig die Blutplättchen.
  13. Überwachen Sie die DHE-Umwandlung in 2OH-Et+ durch invertierte konfokale Bildgebung für 10 Minuten (405/580 nm ex/em), wobei die Bilder alle 10 s mit einer 40-fachen Ölimmersionslinse aufgenommen werden.
  14. (FAKULTATIV) Bei mit PLL beschichteten Vertiefungen ist die Superoxid-Anionenerzeugung als Reaktion auf einen löslichen Agonisten (z. B. 0,1 Einheiten/ml Thrombin oder 3 μg/ml Kollagen) zu überwachen, indem der Agonist 10 Minuten nach der Thrombozytendosierung und der Fluoreszenzbildsammlung für weitere 10 Minuten hinzugefügt wird, wie in Schritt 2.13 beschrieben.
  15. (FAKULTATIV) Falls erforderlich, Superoxid-Anionenfänger oder selektive Inhibitoren (z. B. NOX-Hemmer) hinzufügen, indem während des Zeitverlaufs vorsichtig an die Seite des Wells abgegeben wird, und Fluoreszenzbilder wie in 2.13 beschrieben für weitere 10 min aufnehmen.
  16. Quantifizieren Sie die Einzelzell-Fluoreszenzanalyse, indem Sie die Region of Interest (ROI) auswählen, die repräsentative einzelne Thrombozyten enthält, und die Fluoreszenzintensität in verschiedenen Frames mit dem Messwerkzeug der Imaging Suite ImageJ 1.53t analysieren.

3. Methode 3: Nachweis von Superoxid-Anionen durch Blutplättchen mittels Elektronenspinresonanz (EPR)

  1. Erwärmen Sie die Natriumcitratlösung (4 % w/v) (37 °C) und verwenden Sie sie als Antikoagulans, indem Sie sie zum Zeitpunkt der Venenpunktion im Verhältnis 1:7 (0,5 % w/v endgültig) direkt ins Blut geben.
  2. Entnahme von peripherem menschlichem Blut von gesunden Probanden durch Venenpunktion der mittleren Kubitalvene.
  3. Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) aus Vollblut durch einen ersten Zentrifugationsschritt bei 200 x g für 20 Minuten.
  4. Zentrifugieren Sie PRP bei 500 x g für 10 min mit den reversiblen Thrombozytenhemmern Indomethacin (10 μM) und PGE1 (40 ng/ml).
  5. Resuspendieren Sie das resultierende Thrombozytenpellet in modifiziertem Tyrode-Puffer (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, pH 7,3) (37 °C) bei einer Dichte von 2 x 108 Thrombozyten/ml.
  6. Nach der Isolierung die Blutplättchen 30 Minuten lang bei 37 °C ruhen lassen.
  7. 5 μM Diethyldithiocarbamat (DETC) und 25 μM Deferoxamin zur Thrombozytensuspension geben.
  8. Ohne Inkubation 200 μM 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin (CMH) zugeben.
  9. Laden Sie die Proben in Aggregationsküvetten (einschließlich teflonbeschichteter Rührmagnete) auf das Aggregometer.
  10. Fügen Sie nach 1 Minute die Stimuli in der gewünschten Konzentration hinzu (z. B. 1 Einheit/ml Thrombin oder 3 μg/ml Kollagen). 10 Min. inkubieren.
  11. (FAKULTATIV) Erhalten Sie die Erzeugung von Superoxid-Anionen zu verschiedenen Zeitpunkten, indem Sie zum gewünschten Zeitpunkt mit Schritt 3.12 fortfahren.
  12. Übertragen Sie die Thrombozytensuspension aus der Aggregationsküvette in ein Mikrozentrifugenröhrchen und schleudern Sie sie schnell bei 6.000 x g für 10 s herunter.
  13. 50 μl des Überstands in Kapillar-Mikropipetten füllen und mit EPR-Siegellack verschließen.
  14. Übertragen Sie die Proben an den EPR-Scanner.
  15. Stellen Sie den EPR-Scanner wie folgt ein: Mittelfeld 3.492,5 G, Feld-Sweep 60 G, Modulationsamplitude 2 G, Sweep-Zeit 10 s, Anzahl der Scans 10, Mikrowellenfrequenz 9,39 GHz, Mikrowellenleistung 20 mW, Wandlungszeit 327,68 ms, Zeitkonstante 5242,88 ms.
  16. Schätzen Sie die CMH-Oxidation auf CM● als die Fläche unter der Kurve (AUC) der EPR-Peaks, die unter Verwendung der oben genannten Parameter aufgezeichnet wurden.
  17. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve, in der die wie in Schritt 3.16 beschrieben gemessene EPR-Intensität auf der y-Achse und die Konzentrationen des kommerziell erhältlichen CM● auf der x-Achse (z. B. 0, 0,3, 1, 3, 10 und 30 μM) dargestellt sind.
  18. Aus der CM● -Konzentration in den Proben ermitteln Sie die Menge an Superoxidanionen, die von den Blutplättchen in den Proben erzeugt wird, unter Verwendung der im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beschriebenen Formeln.

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Ergebnisse

Für die durchflusszytometrische Detektion der DHE-Fluoreszenz zeigen wir repräsentative Ergebnisse für Thrombozyten, die entweder ruhen (Abbildung 3A) oder mit 0,1 Einheiten/ml Thrombin stimuliert wurden (Abbildung 3B). DieO2•- Ausgabe wurde als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Thrombozyten quantifiziert, wie für die Stimulation mit 0,1 Einheiten/ml Thrombin (Abbildung 3C) oder 3 μg/ml Kollag...

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Diskussion

In diesem Manuskript stellen wir drei verschiedene Techniken vor, die das Potenzial haben, die Fähigkeit zur Untersuchung der redoxabhängigen Regulation der Thrombozytenfunktion durch den selektiven Nachweis von O2•- zu verbessern. Die ersten beiden Methoden sind eine Verbesserung gegenüber bestehenden Techniken, da eine Redoxsonde verwendet wird (DHE anstelle der häufigeren, aber weniger zuverlässigen DCFDA). Diese Techniken sind daher leicht zugänglich,...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) und dem Europäischen Forschungsrat (#10102507) für G. Pula finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin (CMH)Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagenz für EPR (Spin-Sonde)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NADurchflusszytometer
Rinderserum AlbuminMerck/SigmaA7030Für μ-Objektträgerbeschichtung
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbH  NOX-E.11-BES EPR-Spektrometer
Katalase– Polyethylenglykol (PEG-Kat.)Merck/SigmaC4963Wasserstoffperoxid-Scavenger (Spezifitätskontrolle)
ChronoLog Modell 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM RadikalNoxygen Science Trasfer und Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagenz für EPR (Kalibrierkontrolle)
Deferoxamin Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagenz für EPD
Diethyldithiocarbamat (DETC) Noxygen Science transfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagenz für EPD
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxid-Anionensonde
DimethylsulfoxidMerck/Sigma34869Für die Herstellung von Stammlösungen 
EPR-SiegellackplattenNoxygen Science trasfer und Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMVerbrauchsmaterial für
EPR-WasserNoxygen Science transfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagenz für EPD
Fibrinogen aus humanem PlasmaMerck/SigmaF4883Für die μ-Objektträgerbeschichtung
FITC Anti-Human-CD41 AntikörperBioLegend303704Thrombozytenspezifische Färbung für die Durchflusszytometrie
Glasküvetten Labmedics/ChronologP/N 312Verbrauchsmaterial für die Inkubation im Aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385Für die Thrombozytenstimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378Für die Thrombozytenisolierung
Mikropipetten DURAN 50µ lNoxygen Science übertragen und Diagnostik GmbHNOX-G.6.1-50µ LVerbrauchsmaterial für EPR
Poly-L-LysinhydrochloridMerck/SigmaP2658Für μ-Objektträgerbeschichtung
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515Für die Thrombozytenisolierung
Natriumcitrat (4% w/v Lösung)Merck/SigmaS5770Für die Thrombozytenisolierung
Rührstäbchen (teflonbeschichtet)Labmedics/ChronologP/N 313Verbrauchsmaterial für die Inkubation in einem Aggregometer
Superoxiddismutase– Polyethylenglykol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxid-Anionenfänger (Spezifitätskontrolle)
Thrombin aus humanem PlasmaMerck/SigmaT6884Zur Thrombozytenstimulation und Objektträgerbeschichtung
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX-Hemmer
Zeiss 510 LSM KonfokalmikroskopZeissNAKonfokales Mikroskop

Referenzen

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