Methodenartikel

Stabilisierung einer Femurosteotomie mit einer Plattenfixation bei Ambystoma mexicanum

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DOI:

10.3791/66648

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12. April 2024

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1Research Institute of Molecular Pathology, 2Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Berlin Institute of Health Centre for Regenerative Therapies, Berlin Institute of Health at Charité - Universitätsmedizin Berlin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll für die femorale Osteotomie unter Verwendung der internen Plattenfixation bei reifen Axolotln vorgestellt. Mit dem Verfahren können vergleichende Studien zur Regeneration und Frakturheilung von Gliedmaßen bei aquatischen Amphibien durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Der Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist ein vielversprechender Modellorganismus für die regenerative Medizin aufgrund seiner bemerkenswerten Fähigkeit, verlorene oder beschädigte Organe wie Gliedmaßen, Gehirn, Herz, Schwanz und andere zu regenerieren. Studien an Axolotln geben Aufschluss über zelluläre und molekulare Signalwege, die die Aktivierung von Vorläuferzellen und die Gewebewiederherstellung nach Verletzungen steuern. Dieses Wissen kann angewendet werden, um die Heilung von regenerationsinkompetenten Verletzungen, wie z.B. Knochenpseudarthrose, zu erleichtern. Im aktuellen Protokoll wird die Stabilisierung der Femurosteotomie mittels eines internen Plattenfixationssystems beschrieben. Das Verfahren wurde für die Anwendung bei Wassertieren (Axolotl, Ambystoma mexicanum) angepasst. Es wurden ≥20 cm lange Axolotl von der Schnauze bis zur Schwanzspitze mit vollständig verknöcherten, mausgrößengroßen, vergleichbaren Femuren verwendet, wobei besonderes Augenmerk auf die Positionierung und Fixierung der Platte sowie auf die postoperative Versorgung gelegt wurde. Diese Operationstechnik ermöglicht eine standardisierte und stabilisierte Knochenfixierung und könnte für einen direkten Vergleich mit der Regeneration von Axolotl-Gliedmaßen und analogen Studien zur Knochenheilung bei Amphibien und Säugetieren nützlich sein.

Einleitung

Der Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist ein wichtiges Modell für die Organregeneration, einschließlich des Schwanzes, des Rückenmarks, des Gehirns, des Herzens, der Kiemen und der Gliedmaßen 1,2,3,4,5. Detaillierte Studien zur Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen deckten Mechanismen der Zelldedifferenzierung und der Bildung eines Stammzellpools, des Blastems, an der Amputationsstelle auf. Aufgrund der Fähigkeit der Blastemzellen, alle fehlenden Gliedmaßenteile, einschließlich eines gemusterten Skeletts 6,7, zu rekonstruieren, scheint der Axolotl ein attraktiver Modellorganismus für Knochenheilungsstudien zu sein. In jüngster Zeit konzentrierten sich mehrere Studien mehr auf die Knochenbiologie bei Axolotln und beschrieben die Skelettmorphologie, die zelluläre Zusammensetzung und die Ossifikationsdynamik.

Bei Säugetieren wurde festgestellt, dass der Knochenheilungsprozess in langen Knochen über die endochondrale Ossifikation erfolgt und aus mehreren Stadien besteht: Hämatom, Granulationsgewebe und Bildung von weichem Kallus, Kallusverknöcherung in harten Kallus und gewebten Knochen sowie Knochenumbau8. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass ähnliche Stadien bei der Knochenheilung von Axolotln beobachtet werdenkönnen 9.

Bisher wurden Axolotl-Frakturen in einem unstabilisierten System untersucht, wobei der Knochen einfach mit einer Iridektomieschere geschnitten wird. Die großen Frakturen wurden beim Zeugopoden erzeugt, wo die Osteotomie an einem der Knochen durchgeführt wird, während der andere als Stütze dient10,11. Im Gegensatz dazu werden Frakturen routinemäßig bei Säugetieren, einschließlich Ratten und Mäusen, unter Verwendung zuverlässiger Fixationssysteme wie intramedulläre Stifte und Knochenausrichtungsplatten untersucht, um die Frakturgröße zu kontrollieren und die Knochenausrichtung sicherzustellen.

Die Methode zielt somit darauf ab, eine stabilisierte und gleichmäßige Fixierung des Axolotl-Femurs vor der Osteotomie zu gewährleisten. Um Axolotl-Studien besser mit Säugetieren, einschließlich Mäusen und Menschen, vergleichbar zu machen, wurden die intramedulläre Pin12, der externe Plattenfixateur13,14 und die interne Knochenausrichtungsplatte 15,16,17 in Betracht gezogen. Es hat sich gezeigt, dass letzteres eine korrekte Knochenfixierung gewährleistet und es ermöglicht, einen Spalt einer bestimmten Größe zu schaffen, indem ein oder zwei Schnitte mit einer Gigly-Säge mit einem bestimmten Durchmesser verwendet werden. Da Axolotl die aquatischen Larven von Ambystoma mexicanum darstellen, könnte der externe Fixateur aufgrund der offenen Wunde und des Kontakts mit Wasser postoperative Komplikationen verursacht haben. Da Axolotl auch sehr spät in ihrer Entwicklung (20 Jahrealt, 18) keine sekundären Ossifikationszentren entwickeln und daher der bei Mäusen verwendete Standard-Marknagel möglicherweise nicht daran gehindert werden kann, die Epiphysen zu punktieren, wurde die Entscheidung getroffen, eine interne Plattenfixationsmethode bei großen Axolotln anzuwenden. Bei großen Axolotln ähneln die Femurgröße und der Grad der Ossifikation denen einer erwachsenen Maus, was eine mittlere diaphysäre Osteotomie mit Titanplattenfixation ermöglicht1.

Die Größe des Frakturspalts bestimmt maßgeblich die Heilungsdynamik und das Ergebnis. Bei einer Maus heilen beispielsweise 0,25 mm stabilisierte Frakturen aufgrund ihrer geringen Größe und starren Stabilisierung hauptsächlich durch intramembranöse Ossifikation; eine 0,7 mm große Fraktur heilt durch endochondrale Ossifikation ab, wobei sich um die Fraktur ein knorpeliger Kallus bildet; Große Defekte, wie z. B. 3,5 mm Defekte mit kritischer Größe, heilen nicht vollständig und werden daher zur Modellierung von Knochenbrüchen ohne Pseudarthroseverwendet 16. In dieser Studie wurde das Plattenfixationsprotokoll des Axolotl-Femurs vor der Osteotomie am Beispiel eines 0,7 mm Frakturspaltes erstellt, mit dem ultimativen Ziel, die Knochenheilung des Axolotls mit der der Maus zu vergleichen9.

Nach der Osteotomie durchliefen die Frakturen den Prozess der endochondralen Ossifikation, wenn auch langsamer als bei Mäusen, möglicherweise aufgrund des aquatischen Lebensstils der Axolotl und der langsameren Zellteilungsraten. Bei der hier vorgestellten Methode wird die 0,7 mm Spaltosteotomie mit starrer Plattenfixation gezeigt; Es sind jedoch möglicherweise auch andere Spaltgrößen und halbflexible Fixatatoren sowie Platten aus unterschiedlichen Materialien möglich. Insgesamt kann die hier vorgestellte Methode für die standardisierte Knochenfixation verwendet werden und wird hilfreich für Studien sein, die die Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen mit der Knochenheilung vergleichen oder die Knochenheilung bei Axolotln unter verschiedenen Bedingungen untersuchen, um eine standardisierte Frakturfixierung zu gewährleisten.

Protokoll

Das folgende Verfahren wurde mit Genehmigung des Magistrats Wien (GZ: MA 58-65248-2021-26) durchgeführt. 5-8 Jahre alt, ≥ 20 cm lange Axolotl (Ambystoma mexicanum) von der Schnauze bis zur Schwanzspitze (Ambystoma mexicanum) wurden für Frakturoperationen und Amputationen verwendet. Für die Operationen wurden sowohl Männer als auch Frauen eingesetzt. Axolotl wurden in der Einrichtung des Forschungsinstituts für Molekulare Pathologie gezüchtet. Schmerzen und Infektionsrisiko wurden mit geeigneten Analgetika und Antibiotika behandelt, um ein erfolgreiches Ergebnis zu gewährleisten. Die für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

  1. Baden Sie das Tier etwa 15-20 Minuten lang in 0,03%iger Benzocainlösung, bis die vollständige Sedierung erreicht ist und es keine reflexartigen Bewegungen mehr gibt, wenn die Gliedmaßen mit der Pinzette berührt werden.
  2. Legen Sie das Tier mit der Bauchseite nach unten auf feuchte, in 0,03%ige Benzocainlösung getränkte Papiertücher und decken Sie es mit Benzocain-getränkten Papiertüchern ab. Die Haut von Wassertieren wie Axolotln reagiert empfindlich auf Austrocknung, daher ist es wichtig, die Körperoberfläche zu bedecken, um Austrocknung zu verhindern und die Hautatmung (Haut) zu gewährleisten.
  3. Strecken Sie die Hintergliedmaße aus, um sie mit einer Ringzange zu bedienen. Verwende keine Desinfektionsmittel wie Ethanol, da Axolotl-Haut empfindlich auf Chemikalien reagiert und leicht gereizt werden kann. Verwenden Sie stattdessen 0,7x PBS (A-PBS) mit 50 U/mL Penicillin und 20 μg/mL Streptomycin zur Reinigung der Gliedmaße und später zur Knochenspülung beim Sägen.
    HINWEIS: Die Infektion ist im Allgemeinen kein Problem für die Operationen, die an Axolotln durchgeführt werden. Aufgrund des aquatischen Charakters dieser Tiere und der auf der Hautoberfläche platzierten Nähte empfehlen wir jedoch den Einsatz von Antibiotika, um eine Kontamination der Operationsstelle zu verhindern.

2. Chirurgie

HINWEIS: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente. Hierfür eignen sich gängige Sterilisationsmethoden wie Hitzesterilisation, Autoklavieren und Waschen in 70%igem Ethanol mit anschließender gründlicher Entfernung der Alkoholreste. Wenn Sie an mehreren Tieren arbeiten, sterilisieren Sie die Werkzeuge zwischendurch mit einem Heißperlensterilisator oder 70 % Ethanol.

  1. Machen Sie einen seitlichen Längsschnitt (1,5-2 cm) mit einem Skalpell über dem Oberschenkelknochen, der den gesamten Oberschenkel in der oberen hinteren Extremität überspannt. Um dies zu tun, tasten Sie den Knochen ab, bevor Sie die Haut schneiden.
  2. Verschieben Sie die Muskeln und Nerven vorsichtig von der Operationsstelle, ohne zu schneiden. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um dies effizient zu tun.
  3. Legen Sie vorsichtig eine gebogene Pinzette unter den Oberschenkelknochen, um ihn für die Operation freizulegen.
  4. Legen Sie eine starre 7,75 mm 4-Loch-Fixatorplatte zusammen mit der Femurdiaphyse, vermeiden Sie es, die Gelenke zu berühren, und befestigen Sie sie mit einer Pinzette in der ausgerichteten Position.
  5. Verwenden Sie vier 2 mm Titanschrauben, um den Knochen an der Platte zu befestigen.
    HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Schrauben haben ein komplexes Design und bestehen aus 4 Teilen: dem Hauptteil (wird in den Knochen eingeschraubt), dem Schraubenkopf (ermöglicht das Entfernen der Schrauben und der Platte mit dem quadratischen Ringschlüssel), dem schmaleren Hals (wird als Bruchstelle verwendet, sobald die Schraube im Knochen festgezogen ist) und einem Schraubengriff (wird zur Befestigung am Schraubendreher und der Sägeführungsvorrichtung verwendet).
  6. Die Reihenfolge der Schraubbefestigung ist wichtig. Beginnen Sie zuerst mit den inneren Schrauben und dann mit den beiden äußeren Schrauben, um sicherzustellen, dass die Platte mit der Knochenachse ausgerichtet ist. Verwenden Sie einen manuellen Bohrer, um das erste Loch in den Knochen zu bohren, um die Schraube leicht einsetzen zu können, gefolgt von der 1. Schraubenplatzierung . Bohren Sie in der Mitte des Knochenumfangs, um auf einer Seite dünneren Knochen zu vermeiden, der zu einem spontanen Knochenbruch führen kann. Verwenden Sie während des Bohrens eine Bewässerung mit 0,7x PBS + 1 % Stift/Streptokokken. Brechen Sie den Griff der 1. (optional: 1. und 2.) Schraube(n) nicht ab.
  7. Setzen Sie die Sägeführungsvorrichtung auf die 1. (optional : 1. und 2. ) Schraube(n) auf und richten Sie sie mit Knochen und Platte aus.
    HINWEIS: In diesem Protokoll werden eine Platte, Schrauben, eine Sägeführungsvorrichtung und eine Säge vom selben Hersteller bereitgestellt und so optimiert, dass sie zueinander passen. Die Sägeführungsvorrichtung kann in verschiedenen Größen erhältlich sein, um mit verschiedenen Platten und Sägegrößen kompatibel zu sein.
  8. Verwenden Sie die Sägeführungsvorrichtung, um die restlichen Schrauben zu bohren und einzusetzen. Stellen Sie sicher, dass die Platte mit dem Knochen ausgerichtet ist. Brechen Sie die Griffe der Schrauben ab.
  9. Legen Sie ein Stück Kunststofffolie (6-7 mm x 4-5 cm), das durch Abwischen mit 70 % Ethanol sterilisiert und dann autoklaviert oder hitzesterilisiert (140 °C für 4 Stunden) unter den Oberschenkelknochen, um Schäden am Weichgewebe während des Osteotomieprozesses zu vermeiden.
    HINWEIS: Zu diesem Zweck kann ein Stück Plastikfolie, abgeschnitten ein Beutel für die Wärmesterilisation verwendet werden.
  10. Gigly Drahtsäge zwischen Knochen und Schutzfolie platzieren.
  11. Schneiden Sie den Knochen mit der 0,66 mm Gigly-Drahtsäge und erzeugen Sie einen einzigen Schnitt von 0,7 mm im Oberschenkelknochen. Verwenden Sie während des Sägens eine konstante Spülung mit 0,7x PBS + 1% Stift/Streptokokken, um Gewebeschäden und Reibung zu minimieren.
  12. Entfernen Sie die Säge, die Sägeführung und brechen Sie mit einem Schraubendreher die Schraubengriffe von den Schrauben ab.
  13. Entfernen Sie die Schutzfolie und spülen Sie die Operationsstelle mit 0,7x PBS + 1% Pen/Streptokokken.
  14. Bedecken Sie die Oberseite der Platte und der Schrauben mit sterilem Knochenbienenwachs, um Haut und Muskeln vor Reizungen durch die Ränder der Schrauben zu schützen.
  15. Lege Muskeln und Haut auf das Knochenbienenwachs.
  16. Verschließen Sie die Schnittstelle mit einer synthetischen Naht 7.0 (Polypropylen/Polyethylen) mit einfachen unterbrochenen Nähten. Synthetisches Nahtmaterial wird verwendet, um die Kontamination mit wassergetragenen Bakterien und Pilzen zu minimieren.

3. Postoperatives Management

  1. Um das Tier wieder zu wecken, setzen Sie es in ein Becken mit frischem künstlichem Teichwasser, ergänzt mit 50 U/ml Penicillin, 20 μg/ml Streptomycin und analgetischem Butorphanol (0,5 mg/l Wasser).
  2. Beobachten Sie, wie das Tier beginnt, Kiemen zu bewegen, Schritte zu machen und zu schwimmen - normalerweise innerhalb von 1 Stunde nach der Operation.
  3. Halten Sie das Tier 3 Tage lang in künstlichem Teichwasser mit 50 U/ml Penicillin und 20 μg/ml Streptomycin, bevor Sie es in den Fäkalientank zurückbringen. Um eine Analgesie zu gewährleisten, fügen Sie Butorphanol (0,5 mg/L Wasser) hinzu.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Nähte an Ort und Stelle bleiben und eine ordnungsgemäße Wundheilung erfolgt.

Ergebnisse

Der hier beschriebene chirurgische Eingriff (Abbildung 1) dauert zwischen 20 min und 30 min und erfordert einen Chirurgen und eine Assistentin. Optional können Sie ein binokulares Dissektionsmikroskop oder ein Lupensystem verwenden.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des chirurgischen Eingriffs und des Versuchsaufbaus. (A) Der Femur wird durch Hautdissektion und Abziehen von Muskeln aus dem Operationsfeld freigelegt. (B) Eine Titanplatte ist mit dem Oberschenkelknochen ausgerichtet. (C) 1erstes inneres Loch wird mit einem manuellen Bohrer erstellt. (D) In das 1. Loch wird eine Schraube eingesetzt. (E) Die Säge- und Bohrführung wird eingesetzt und am Griff der 1. Schraube befestigt. (F) Die restlichen Schrauben werden in der angegebenen Reihenfolge angebracht. (G) Die Säge und die Bohrschablone werden vorsichtig entfernt und die Griffe der Schrauben werden beim Drehen des Schraubendrehers abgebrochen, da der Knochen im Vergleich zum Schraubenhals steifer ist. (H) Sicherheitsfolie und Gigly-Säge werden unter den Knochen gelegt. (I) Die Osteotomie wird unter ständiger Spülung der Schneidstelle durchgeführt. (J) Die Schraubenköpfe werden mit sterilem Knochenbienenwachs bedeckt, bevor die Muskeln ersetzt und die Haut durch Stiche verschlossen werden. (D,E,F): Die Zahlen geben die Reihenfolge an, in der Löcher gebohrt und Schrauben platziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Besonderes Augenmerk muss auf die Platten-Knochen-Ausrichtung und die Plattenbefestigungsschritte gelegt werden (Abbildung 2). Die Varianz des Alters der Axolotl führt zu leichten Unterschieden in der Oberschenkelgröße, der Form und dem Ossifikationsgrad. Daher war es in einigen Fällen schwierig, eine gute Plattenposition zu finden, um genügend Platz für die Schraubbefestigung zu gewährleisten. Insgesamt wurde bei 23,5 % der Tiere ein Fixationsversagen beobachtet, das auf schmalere oder weniger verknöcherte Knochen bei jüngeren Tieren zurückzuführen sein könnte (Abbildung 3). Das Versagen der Fixation führte zu einer Fehlstellung des osteotomisierten Knochens. Dies war erkennbar am Vorhandensein von gelösten Schrauben, einer Verschiebung der Knochenfragmente mit einer Fehlstellung von der Knochenachse von >20° oder einer ausgeprägten lateralen Verschiebung. Während die ersten bei der Entnahme der Proben beobachtet werden konnten, sind die anderen möglicherweise erst nach der MikroCT-Analyse offensichtlich. Während sich das Granulationsgewebe bei richtig ausgerichteten Gliedmaßen 3 Wochen nach der Operation in der Frakturlücke befand, schien es bei den falsch ausgerichteten Proben viel größer zu sein, möglicherweise in dem Versuch, den Knochen zu stabilisieren.

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Abbildung 2: Überblick über den chirurgischen Eingriff und das resultierende Tier mit Osteotomie der linken Hintergliedmaße. (A) Die Hauptschritte der Operation werden dargestellt: Femurfreilegung, korrekte Ausrichtung der Titanplatte, Verwendung einer Sägeschablone zum Erstellen von Löchern im Knochen mit einem manuellen Bohrer und Einsetzen der Schrauben, Verwendung von Schutzfolie und Sägeführung (gelber Pfeil) für die Osteotomie, 0,7 mm Femurfraktur (weißer Pfeil), wobei die Schraubenköpfe mit sterilem Knochenbienenwachs bedeckt sind (violetter Pfeil) und das Endergebnis mit geschlossener Extremität. (B) Tier nach der Operation. Der Pfeil zeigt die linke hintere Extremität, an der die Osteotomie durchgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Verwendung von sterilem Knochenbienenwachs vor dem Nähen der Haut (Abbildung 2) reduzierte die postoperative Wiederöffnung der Haut über der Fixierplatte. Die Gliedmaße blieb funktionsfähig und konnte kurz nach Entfernung der Narkose zum Stehen und Gehen verwendet werden.

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Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Axolotl-Platten-fixierten Osteotomie. (A) MicroCT-Scans von intakten und frakturierten Femuren. Beachten Sie eine Lücke im Knochen 3 Wochen nach der Fraktur. 23,5 % der Gliedmaßen wiesen eine fehlgeschlagene Fixierung auf, was zu einer Knochenfehlstellung führte. In den fixierten Proben bildet sich 6-9 Monate nach der Fraktur harter Kallus. (B) Safranin O/Hellgrün-Färbung von intakten und frakturierten Femuren. Man beachte eine Lücke mit Granulationsgewebe im Knochen 3 Wochen nach der Fraktur. 6 Monate nach der Fraktur besteht der harte Kallus aus verwobenem Knochen und Knorpel. Maßstabsleisten: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die MikroCT und die histologische Analyse (Safranin O/Hellgrün-Färbung) ermöglichten die Visualisierung der Position der Knochenfragmente und der Größe des Frakturspalts sowie des Knochenheilungszustands. Die MicroCT-Daten wurden mit einer nominalen Auflösung von 10,05 μm in einem kommerziell erhältlichen Probenscanner erfasst und mit kompatibler Software (siehe Materialtabelle) analysiert, wie in Polikarpova et al.9 beschrieben. Im Gegensatz zu Säugetieren, bei denen eine Fraktur gleicher Größe (0,7 mm) 3-5 Wochen nach der Operation mit knorpeligem und knöchernem Kallus verschlossen wird, wurde beim Axolotl 3 Wochen nach der Operation kein Kallus beobachtet. Typischerweise war ein knorpeliger Kallus 3 Monate nach der Operation sichtbar9 und ein verknöcherter knöcherner Kallus - 6 Monate nach der Operation (Abbildung 3).

Diskussion

Die derzeit beschriebene Methode der Femurplattenfixation und Osteotomie ermöglicht die Anwendung bei Wassertieren, wie z.B. Ambystoma mexicanum (Axolotl). Diese chirurgische Methode wurde kürzlich verwendet, um die Frakturheilung und Regeneration der Gliedmaßen bei Axolotln mit der Frakturheilung bei Mäusenzu vergleichen 9. Wie bei Mäusen kann eine 4-Loch-Fixatorplatte mit selbstbrechenden Schrauben am Knochen befestigt werden, und mit einer Gigly-Säge kann eine Fraktur der einheitlichen Größe15 erzeugt werden. Die Plattenfixierung erleichtert die Beibehaltung der Spaltgröße und gewährleistet die Ausrichtung des Knochenfragments. Die Analgesiemethode wurde auch durch die Implementierung von Butorphanol-Baden optimiert, da es weniger invasiv ist (im Vergleich zu Buprenorphin-Injektionen), von dem nicht berichtet wird, dass es die Knochenheilung beeinflusst (wie bei Carprofen). Da jedoch wenig über die Schmerztherapie bei Amphibien im Allgemeinen und postoperative Schmerzen im Besonderen bekannt ist, kann der Einsatz einer präventiven analgetischen Behandlung als weitere Verfeinerung des Verfahrens vorgeschlagen werden. Hier könnte die Adaption von Protokollen, die bei anderen Amphibienarten verwendet werden, in Betracht gezogen werden19. Für eine weitere objektive Beurteilung des Gesundheitszustands des Tieres nach der Operation wird die Implementierung und Anwendung spezifischer Scoresheets für die Definition von Interventionen und menschlichen Endpunkten empfohlen.

Anders als bei der für Maus16 beschriebenen Methode wird eine Kunststofffolie verwendet, um das darunterliegende Gewebe vor der Osteotomie zu schützen. Aufgrund des aquatischen Charakters und der weniger ausgeprägten Gliedmaßenmuskulatur benötigten Axolotl außerdem ein Bienenwachsschutzpflaster auf der Oberseite der Platte und der Schrauben, sowie ein besonderes Augenmerk auf die Verwendung von synthetischen Hautstichen, da sich Biofilme auf den resorbierbaren Nähten ansammelten (Polyglactin 910-basiert). Das Penicillin-Streptomycin wird im Rahmen der postoperativen Behandlung eingesetzt, um eine Kontamination von Wunden und Nähten zu verhindern.

Die Methode wurde für 5-8 Jahre alte, ≥20 cm lange Axolotl von der Schnauze bis zum Schwanz optimiert und damit auf große, eher alte Tiere beschränkt. Dies könnte auch der Grund für die langsamere Heilung der Knochen als bei Säugetieren sein, da die Zellproliferationsraten bei so alten Tieren insgesamt niedriger sind. Dies kann jedoch von Vorteil sein, wenn man die feineren Schritte der Knochenheilung klären muss20. Ein weiteres wichtiges Merkmal der Methode ist der kommerzielle Charakter der wichtigsten Verbrauchsmaterialien, die im Protokoll verwendet werden: Fixierungsplatte, Schrauben und Gigly-Säge. Durch die optimierte Kompatibilität dieser Geräte werden Knochendefekte von zuverlässiger Größe und Abstand zu den Knochenenden erzeugt. Im aktuellen Protokoll wird das Aufbringen einer Titanmetallplatte auf Axolotl-Knochen beschrieben. Für Mäuse wurden PEEK-Kunststoffplatten entwickelt, um die mikroCT-Bildgebung der Proben zu erleichtern17. Die PEEK-Platten in Axolotln wurden ebenfalls mit ähnlichen Ergebnissen getestet; Sie konnten jedoch nur bei größeren Tieren angewendet werden, da die Kunststofffixatorplatten im Vergleich zu den Metallplatten etwas voluminöser voluminös waren.

In dieser Studie verwendeten wir 5-8 Jahre alte Tiere und beobachteten bei 23,5 % aller Operationen ein Fixationsversagen, mit höheren Misserfolgsraten bei den jüngeren Tieren. Wir empfehlen daher, ältere Tiere mit einem höheren Grad an Knochenverknöcherung einzusetzen. Die Durchfallquote war unabhängig vom Geschlecht; Somit sind beide Geschlechter gleich qualifiziert. Für die Planung der Stichprobengröße sollte ein Stichprobenverlust von ca. 20 % aufgrund des ungünstigen Ergebnisses berechnet werden. Die genaue Anzahl der Tiere hängt vom Versuchsdesign und der Anzahl der zu analysierenden Bedingungen ab. Die empfohlene Mindesttierzahl pro Gruppe sollte jedoch 5+20% = 6 Tiere betragen.

Insgesamt stellt diese Methode eine deutliche Verbesserung gegenüber den bisher verwendeten nicht fixierten oder benachbarten knochenfixierten Operationen dar. Darüber hinaus ist es mit dieser Methode möglich, große Axolotl zu untersuchen, deren Knochen in Größe und Reifung denen ähneln, die in Mausstudien verwendet wurden. Dies ist wichtig, da die Mikro-CT aufgrund des Ossifikationsgrades nur bei großen Axolotln möglich ist.

Die Methode ist ein wichtiger Fortschritt auf diesem Gebiet, da sie einen direkten Vergleich der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen mit der Frakturheilung ermöglicht, mit kontrollierter Lückengröße und korrekter Knochenausrichtung (bei 76,5 % der durchgeführten Operationen). Darüber hinaus können mit PEEK-Kunststoff-Fixierungsplatten Mikro-CT und Röntgenstrahlen zur Bewertung des Knochenheilungsprozesses verwendet werden. Schließlich kann die hier beschriebene Operation für andere aquatische Amphibien wie Molche und Frösche angepasst werden, was die artübergreifende Untersuchung der Heilung von Knochenbrüchen weiter erleichtert.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Die Autoren danken Sabine Stumpp für die hervorragende technische Unterstützung und Lidia Grösser für die Unterstützung bei den Operationen. Diese Forschung wurde gefördert durch den österreichischen Wissenschaftsfonds [Hertha Firnberg Fellowship Nummer T-1219], ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems], DFG [SFB 1444].

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,66 mm Gigly Seilsäge RISystemRIS.590.120
7.0 Optilen-Naht BraunC3090538
Benzocain Sigma-AldrichE1501der Verwendung auf 0,03 %  verdünnen auf 0,03 %  vor der Verwendung
Butorphanol (Butomidor 10 mg/ml)Richter Pharma AG-verdünnenauf 0,5 mg/L  vor der Verwendung
Bohrer 0,30 mmRISystemRIS.590.200
Dumont #5 Pinzette - Standard/InoxFine Science Tools11251-20
HandbohrmaschineRISystemRIS.390.130besser mindestens 3 Stück
Micro CT DatenanalysatorBruker, Billerica, MA, USASkyScan NRecon Software
Micro CT ProbenscannerBruker, Billerica, MA, USASkyScan 1172 
Moria MC31b Irispinzette - glatt, gebogen, 10 cmFine Science Tools11373-12FST2 Stück
MouseFix Bohrer-& Sägeführung 1,75 mm, starrRISystemRIS.301.102
MouseFix Platte 4 Loch, starrRISystemRIS.401.110
MouseFix Schraube, L = 2,00 mmRISystemRIS.401.100benötigt 4 pro Knochen
Narrow Pattern PinzetteVWRFSCI11002-12
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
RingzangeFine Science Tools11103-09
Skalpell #15B Braun, Thermo Fischer Scientific5518032
Vierkant-Ringschlüssel 0,50 mmRISystemRIS.590.111
Steriles Knochenwachs, 2,5 gEthicon, Johnson & JohnsonW810
Feinschere für Studenten - Gerade/11,5 cmFeinwerkzeuge91460-11
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Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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