Intrakamerale Injektion bei Ratten mit geringem Risiko für Nebenwirkungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur intrakameralen Injektion bei Ratten unter Verwendung eines zentralen Hornhautschnitts und eines langen Tunnels in die Vorderkammer. Diese Injektionsmethode minimiert das Risiko einer versehentlichen Gewebeschädigung und verbessert dadurch die Präzision und Reproduzierbarkeit.

Zusammenfassung

Die intrakamerale Injektion ist eine Standardverabreichungsroutine in der Augenheilkunde. Die Anwendung der intrakameralen Injektion bei Nagetieren zu Forschungszwecken ist aufgrund der begrenzten Abmessungen und der Anatomie des Auges, einschließlich des kleinen Kammerwasservolumens, der Linsenkrümmung und der Linsendicke, eine Herausforderung. Mögliche Schäden während intrakameraler Injektionen führen zu unerwünschten Wirkungen und experimenteller Variabilität. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur intrakameralen Injektion bei Ratten, das Präzision und Reproduzierbarkeit ermöglicht.

Als Versuchsmodelle wurden Sprague-Dawley-Ratten verwendet. Da die Linsenposition bei Ratten in die Vorderkammer hineinragt, ist eine Injektion aus der Peripherie, wie sie beim Menschen erfolgt, ungünstig. Daher wird mit einer 31 Gauge 0,8 mm Stilettoklinge ein Schnitt im zentralen Hornhautbereich erstellt, um einen selbstdichtenden Tunnel in die Vorderkammer zu bilden. Ein Schnitt in einem flachen Winkel ermöglicht es, einen langen Tunnel zu schaffen, der den Verlust des Kammerwassers und die Flachheit der Vorderkammer minimiert. Eine 34-Gauge-Nanonadel wird zur Injektion in den Tunnel eingeführt. Dies ermöglicht eine Durchdringung mit minimalem Reibungswiderstand und vermeidet das Berühren der Linse. Die Injektion von Trypanblau ermöglicht die Visualisierung des Vorhandenseins des Farbstoffs in der Vorderkammer durch Schlitzmikroskopie und schließt Leckagen aus. Die Bioverfügbarkeit in der Hornhautendothelschicht wird durch die Injektion von Hoechst-Farbstoff nachgewiesen, der die Kerne der Hornhautendothelzellen nach der Injektion färbte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein Verfahren zur genauen intrakameralen Injektion bei Ratten implementiert. Dieses Verfahren kann für die intrakamerale Verabreichung verschiedener Medikamente und Verbindungen in experimentellen Rattenmodellen verwendet werden, wodurch die Effizienz und Reproduzierbarkeit der ophthalmologischen Forschung erhöht wird.

Einleitung

Die Bioverfügbarkeit von Verbindungen, die durch topische Verabreichung an die Augenoberfläche abgegeben werden, ist stark begrenzt und liegt in der Regel <5 %¹. Verbindungen, die durch Augentropfen verabreicht werden, werden hauptsächlich durch Drainage, induzierte Tränenfluss, Tränenflüssigkeitsumsatz und Bindehautabsorption ausgeschieden. Darüber hinaus wird die Permeation von Verbindungen durch die Augenoberfläche durch die Hornhaut-Konjunktiva-Barriere stark eingeschränkt ^1,2,3. Die Hornhaut besteht aus drei Hauptschichten: dem äußersten Epithel, dem intermediären Stroma und dem innersten Endothel. Das oberflächliche Hornhautepithel ist durch starke Tight Junctions miteinander verbunden und erzeugt einen hohen parazellulären Widerstand, der die Hauptbarriere für die Durchlässigkeit der Substanz darstellt. Mehrere Epithelschichten begrenzen zusätzlich die Permeation von hydrophilen und großen Molekülen durch die Interzellularräume des Hornhautepithels. Das Stroma, das dem Epithel folgt, besteht aus Kollagenfasern und enthält wässrige Poren. Im Gegensatz zum Hornhautepithel ermöglicht das Stroma die Bewegung von hydrophilen Arzneimitteln; Es ist jedoch sehr undurchlässig für lipophile Verbindungen ^1,2,3. Zusammen stellen das Hornhautepithel und die Stromaschichten wichtige Gewebebarrieren dar, die die Absorption von Arzneimitteln begrenzen. Es wird nicht davon ausgegangen, dass das Hornhautendothel den Medikamententransport einschränkt.

Eine Alternative zur Hornhautverabreichung ist die Bindehaut. Die Bindehaut ist eine Multiepithelschicht, die die Innenseite der Augenlider und den vorderen Teil der Sklera bedeckt. Die Bindehaut zeichnet sich durch weniger Tight Junctions als das Hornhautepithel aus, was eine bessere Permeabilität von hydrophilen Arzneimitteln ermöglicht. Die Vaskularisierung der Bindehaut führt jedoch zu einer systemischen Resorption eines großen Teils der verabreichten Moleküle, was wiederum die Bioverfügbarkeit der in die Vorderkammer abgegebenen Verbindungen stark einschränkt ^1,2. Eine effiziente Möglichkeit, die Barrieren der äußeren Augenpermeabilität zu umgehen, besteht darin, das Medikament direkt in den interessierenden Bereich zu verabreichen. Zum Beispiel ist die intravitreale Injektion für die Verabreichung in den Glaskörper^{üblich 4}. Ebenso wird die intrakamerale Injektion für die Verabreichung in die Vorderkammer⁵ verwendet. Die Etablierung einer effizienten Konzentration in der Vorderkammer ist entscheidend für verschiedene klinische Situationen, wie z. B. die Behandlung von Infektionen durch intrakamerale Injektion von Antibiotika und postoperative entzündungshemmende Behandlungen bei Kataraktoperationen. Trotz des Vorteils der verbesserten Bioverfügbarkeit der Substanz, die durch die intrakamerale Injektion gewährt wird, gibt es große Sicherheitsbedenken, die berücksichtigt werden sollten. Zum Beispiel kann die intrakamerale Injektion von Medikamenten einen erhöhten Augeninnendruck, ein toxisches Vordersegmentsyndrom und ein toxisches Endothelzellzerstörungssyndrom induzieren ^5,6. Daher ist es wichtig, in präklinischen Studien die Wirksamkeit und Sicherheit von Arzneimitteln, die durch intrakamerale Injektionen verabreicht werden, sorgfältig zu bewerten, um die Behandlungseffizienz zu maximieren und mögliche Nebenwirkungen bei Patienten zu minimieren.

Experimentelle Tiermodelle sind in präklinischen Studien unverzichtbar, um neue Therapien zu untersuchen. Kleine Nagetiere wie Mäuse und Ratten sind die am häufigsten verwendeten Versuchstiere für solche Zwecke. Diese Tiere weisen zahlreiche Ähnlichkeiten mit der menschlichen Anatomie und Physiologie auf und liefern wertvolle Erkenntnisse. Darüber hinaus ist ihr Einsatz aufgrund ihrer geringen Größe, der einfachen Wartung, der schnellen Trächtigkeit und der Fähigkeit, eine große Anzahl von Nachkommen zu produzieren, wirtschaftlich vorteilhaft⁷.

Trotz der weit verbreiteten Verwendung kleiner Nagetiere in Modellen für Augenkrankheiten stellen ihre einzigartigen Augenabmessungen und ihre Anatomie erhebliche Herausforderungen bei experimentellen Manipulationen dar. So werden beispielsweise Verfahren wie intrakamerale Injektionen, die beim Menschen relativ einfach sind, bei Mäusen und Ratten technisch anspruchsvoll. Die Herausforderungen ergeben sich aus Faktoren wie dem geringen Volumen des Kammerwassers, der relativ großen und unflexiblen Linse und der obstruktiven Positionierung und Krümmung der Linse in den Augen der Nagetiere (Abbildung 1)⁸. Diese Herausforderungen erhöhen das Risiko von Schäden bei intrakameralen Injektionen bei Nagetieren, was zu potenziellen Nebenwirkungen führt und zu experimenteller Variabilität führt, die sich auf die Gültigkeit der Studienschlussfolgerungen auswirken kann. In unserer Forschung ist es uns gelungen, ein Verfahren zur sicheren intrakameralen Injektion bei Ratten zu entwickeln. Bei dieser Technik wird ein langer, flacher, selbstdichtender Tunnel in der Hornhaut in die Vorderkammer geschaffen. Diese Methode gewährleistet nicht nur die Präzision, sondern verbessert auch die experimentelle Reproduzierbarkeit und löst die Probleme, die mit Injektionstechniken bei kleinen Nagetieren verbunden sind.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der anatomischen Merkmale des vorderen Augenabschnitts des Auges von Ratte und Mensch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protokoll

Die Versuche im Protokoll wurden vom Nationalen Genehmigungsausschuss für Tierwissenschaften genehmigt und entsprechen der ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 8-10 Wochen wurden für die vorliegende Studie verwendet und 12/12 h Hell-Dunkel-Zyklen ausgesetzt. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung der Tiere

1. Bereiten Sie eine Anästhesiemischung aus Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht in 0,8 ml) und Xylazin (4 mg/kg Körpergewicht in 0,2 ml) vor und injizieren Sie es intraperitoneal in einer einzigen Injektion, um die Ratten zu betäuben.
2. Injizieren Sie das Analgetikum Buprenorphin (0,03 mg/kg) intraperitoneal in einer einzigen Injektion.
3. Tragen Sie ein topisches Augenanästhetikum 0,4% Oxybuprocain auf beide Augen auf.

2. Erstellen eines selbstdichtenden Hornhauttunnels

1. Stabilisieren Sie das Auge, indem Sie die obere Sklera mit einer chirurgischen Augenzange an der vertikalen Mittellinie neben dem hornhautnahen Übergang halten.
2. Unter einem Operationsmikroskop wird eine sterile Stilettoklinge von 0,8 mm und 31 g in der parazentralen Hornhautregion in der vertikalen Mittellinie (über der Mitte der Pupille) in einer flachen Position in einem Winkel platziert, der so nah wie möglich an der Horizontalen liegt (Abbildung 2).
3. In dieser Position punktieren Sie die Hornhaut, um einen Schnitt zu machen und einen langen Tunnel (2-3 mm) zu schaffen, bis er in den zentralen Bereich der Vorderkammer eindringt. Vermeiden Sie es, das Objektiv zu berühren (Abbildung 2).
   HINWEIS: Ein erfolgreicher Tunnel führt nicht zum Austreten des Kammerwassers und zur Flachheit der Vorderkammer.
4. Tragen Sie topische 0,3 % Loxocinsäure und 0,1 % Dexamethason auf das injizierte Auge auf.
5. Untersuchen Sie unter Schlitzmikroskopie wie folgt.
   1. Beobachten Sie die Tiefe der vorderen Kammer des injizierten Auges im Vergleich zum nicht injizierten Auge.
      HINWEIS: Die Tiefe sollte ähnlich sein.
   2. Beobachten Sie die Linse des injizierten Auges im Vergleich zum nicht injizierten Auge.
      HINWEIS: Das Objektiv sollte klar sein. Die Opazität kann auf eine Beschädigung der Linse während des chirurgischen Eingriffs hinweisen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Klinge sowie des Schnittwinkels und der Schnittposition. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Option 1: Intrakamerale Injektion von Trypanblau zur Beurteilung der erfolgreichen Injektion in die Vorderkammer

1. Laden Sie 5 μl Trypanblau in eine sterile 10 μl Glasspritze von Hamilton mit einer stumpfen 34-G-Nadel.
   HINWEIS: Die Injektion von Trypanblau wird als Mittel zur Bewertung des Erfolgs der Injektion während der Modellkalibrierung oder der Einrichtungsphase beschrieben. In den Versuchsanordnungen kann die Spritze mit einer Lösung der Verbindung der Wahl beladen werden.
2. Führen Sie die geladene Spritzennadel durch den in Abschnitt 2 geschaffenen Tunnel in die Vorderkammer ein.
3. Injizieren Sie und halten Sie die Nadel nach der Injektion 2-3 Sekunden lang an Ort und Stelle, bis die gesamte Flüssigkeit verschwunden ist.
4. Entfernen Sie die Nadel, indem Sie sie vorsichtig und langsam herausziehen, um ein Auslaufen aus dem Hornhauttunnel zu vermeiden.
5. Unter Schlitzmikroskopie untersuchen. Bewerten Sie die Tiefe der Vorderkammer, um eine Flachheit auszuschließen, und überprüfen Sie das Vorhandensein von Trypanblau in der Vorderkammer.
6. Wiederholen Sie die Schlitzuntersuchung nach 24 h, 48 h und 72 h.

4. Option 2: Intrakamerale Injektion von Hoechst zur Beurteilung der Bioverfügbarkeit von injiziertem Material in die Endothelzellschicht

1. Geben Sie 5 μl Hoechst in eine sterile 10-μl-Glasspritze von Hamilton mit einer stumpfen 34-G-Nadel.
   HINWEIS: Die Injektion von Hoechst wird als Mittel zur Bewertung der Bioverfügbarkeit von injiziertem Material durch Aufnahme in die Endothelzellschicht beschrieben und ist während der Modellkalibrierung oder der Einrichtung nützlich. In den Versuchsanordnungen kann die Spritze mit einer Lösung der Verbindung der Wahl beladen werden.
2. Führen Sie die geladene Spritzennadel durch den in Abschnitt 2 geschaffenen Tunnel in die Vorderkammer ein.
3. Injizieren Sie und halten Sie die Nadel nach der Injektion 2-3 Sekunden lang an Ort und Stelle, bis die gesamte Flüssigkeit verschwunden ist.
4. Entfernen Sie die Nadel, indem Sie sie vorsichtig und langsam herausziehen, um ein Auslaufen aus dem Schnitt des Hornhauttunnels zu vermeiden.
5. Etwa 15-20 Minuten nach der Injektion euthanasieren Sie die Ratten durch intraperitoneale Injektion von 500 mg/kg Natriumpentobarbiton.
6. Enukleieren Sie beide Augen und isolieren Sie die Hornhaut. Sammeln Sie die nicht injizierte Hornhaut als Kontrolle.
7. Färben Sie beide Hornhäute mit 0,5 % Alizarin Rot S gemäß den Anweisungen des Herstellers, um Endothelzellen zu identifizieren.
8. Untersuchen Sie unter einem Lichtmikroskop, um die Alizarinrot-Färbung von Endothelzellen abzubilden, und unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Hoechst-Färbung im Vergleich zur nicht injizierten Hornhaut als Kontrolle zu beobachten.

Ergebnisse

Sprague Dawley-Ratten wurden intracameral mit 5 μl Trypanblau gemäß dem oben beschriebenen Protokoll injiziert. Die Spaltlampenuntersuchung unmittelbar nach der Injektion zeigte, dass die Kammer mit Trypanblau gefärbt war, was darauf hindeutet, dass das injizierte Material die Vorderkammer erreicht hatte (Abbildung 3). Darüber hinaus war die Tiefe der vorderen Kammer intakt, was darauf hindeutet, dass die Injektion kein Austreten des Kammerwassers und keine Flachheit der Kammer verursachte.<...

Diskussion

Präklinische Forschungsmodelle sollten eine kontrollierte und reproduzierbare Umgebung bieten, um die Zuverlässigkeit und Anwendbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. In der ophthalmologischen Forschung werden Augeninjektionsmodelle häufig in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt, die von der Erstellung von Krankheitsmodellen über das Testen neuer Behandlungen bis hin zur Bewertung von Gewebereaktionen und potenziellen Nebenwirkungen reichen.

Intrakam...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alizarin Rot	Alpha Aesar	042040.5
Buprenorphin	Richter Pharma	102047
Dexamethason 0,1%	Fisher Pharmaceutical	393102-0413
Hamilton Glasspritze 10 μ L	Hamilton Co.
Hoeschst	Merck	B2261
Ketamin	Bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
Ofloxacin 0,3% Augentropfen	Allergan	E92170
Oxybuprocainhydrochlorid 0,4%	Fisher Pharmaceutical	N/A
Pentobarbital-Natrium 200 mg/mL	CTS	N/A
Schlitzmikroskop	Haag-streit bern	b-90019115
Sprague-Dawley Rats	Envigo	N/A
Stiletto Klinge 31 G 0.8 mm	Tecfen medical (skymed)	QKN2808
Operationsmikroskop	Zeiss	OPMI-6 CFC
Trypan Blue	Sartorius	03-102-1B
Xylazin	Eurovet Animal Health

721711615648