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Methodenartikel

Base Recording: Eine Technik zur Analyse der Reaktionen von Geschmacksneuronen in Drosophila

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DOI:

10.3791/66665

⸱

1. März 2024

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, 2Department of Entomology, The Connecticut Agricultural Experiment Station

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine selten verwendete Methode der elektrophysiologischen Aufzeichnung, die Basisaufzeichnung, ermöglicht die Analyse von Merkmalen der Geschmackscodierung, die mit herkömmlichen Aufzeichnungsmethoden nicht untersucht werden können. Die Basenaufzeichnung ermöglicht auch die Analyse von Geschmacksreaktionen auf hydrophobe Reize, die mit herkömmlichen elektrophysiologischen Methoden nicht untersucht werden können.

Zusammenfassung

Insekten schmecken die Außenwelt durch Geschmackshaare oder Sensillen, die an ihren Spitzen Poren haben. Wenn ein Sensillum mit einer potenziellen Nahrungsquelle in Kontakt kommt, dringen Verbindungen aus der Nahrungsquelle durch die Pore ein und aktivieren Neuronen im Inneren. Seit über 50 Jahren werden diese Reaktionen mit einer Technik namens Trinkgeldaufzeichnung aufgezeichnet. Diese Methode hat jedoch große Einschränkungen, einschließlich der Unfähigkeit, die neuronale Aktivität vor oder nach dem Reizkontakt zu messen, und der Anforderung, dass Geschmacksstoffe in wässrigen Lösungen löslich sind. Wir beschreiben hier eine Technik, die wir Base Recording nennen und die diese Einschränkungen überwindet. Base Recording ermöglicht die Messung der Aktivität von Geschmacksneuronen vor, während und nach dem Stimulus. Auf diese Weise ermöglicht es eine umfassende Analyse von OFF-Reaktionen, die nach einem Geschmacksreiz auftreten. Es kann verwendet werden, um hydrophobe Verbindungen wie langkettige Pheromone zu untersuchen, die eine sehr geringe Löslichkeit in Wasser aufweisen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Basenaufzeichnung die Vorteile der Einzelsensillum-Elektrophysiologie als Mittel zur Messung der neuronalen Aktivität bietet - hohe räumliche und zeitliche Auflösung, ohne dass genetische Werkzeuge erforderlich sind - und die wichtigsten Einschränkungen der traditionellen Tip-Recording-Technik überwindet.

Einleitung

Insekten, zu denen auch drosophilide Fliegen gehören, verfügen über ein ausgeklügeltes Geschmackssystem, das es ihnen ermöglicht, komplexe chemische Informationen aus ihrer Umgebung zu extrahieren. Dieses System ermöglicht es ihnen, die chemische Zusammensetzung verschiedener Substanzen zu erkennen und zwischen nahrhaften und schädlichen Substanzen zu unterscheiden 1,2.

Das Herzstück dieses Systems sind spezialisierte Strukturen, die als Geschmackshaare oder Sensillen bekannt sind und strategisch an verschiedenen Körperteilen angeordnet sind. Bei drosophilen Fliegen befinden sich diese Sensillen auf dem Labellum, dem Hauptgeschmacksorgan des Fliegenkopfes 1,2,3,4, sowie an den Beinen und Flügeln 1,2,5,6. Das Labellum befindet sich an der Spitze des Rüssels und enthält zwei Lappen 4,7,8. Jeder Lappen ist mit 31 Geschmackssensillen bedeckt, die als kurz, lang und intermediärkategorisiert sind 4,7,8. Diese Sensillen beherbergen jeweils 2-4 Geschmacksneuronen 1,2,9,10. Diese Geschmacksneuronen exprimieren Mitglieder von mindestens vier verschiedenen Genfamilien, nämlich dem gustatorischen Rezeptor (Gr), dem ionotropen Rezeptor (Ir), dem Taschendieb (Ppk) und den Genen des transienten Rezeptorpotentials (Trp) 1,2,11,12,13 . Diese Vielfalt an Rezeptoren und Kanälen stattet Insekten mit der Fähigkeit aus, eine breite Palette chemischer Verbindungen zu erkennen, einschließlich sowohl nichtflüchtiger als auch flüchtiger Signale 1,2,14.

Seit über 50 Jahren quantifizieren Wissenschaftler die Reaktion von Geschmacksneuronen und ihren Rezeptoren mit einer Technik namens tip recording 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Diese Methode hat jedoch große Einschränkungen. Erstens kann die neuronale Aktivität nur während des Kontakts mit dem Reiz gemessen werden und nicht vor oder nach dem Kontakt. Diese Einschränkung schließt die Messung der spontanen Spike-Aktivität aus und verhindert die Messung von OFF-Reaktionen. Zweitens können nur Geschmacksstoffe getestet werden, die in wässrigen Lösungen löslich sind.

Diese Einschränkungen können durch eine selten verwendete alternative elektrophysiologische Technik namens "Base Recording" überwunden werden. Hier beschreiben wir diese Technik, die wir von einer Methode adaptiert haben, die von Marion-Poll und Kollegenverwendet wurde 24, und zeigen die entscheidenden Geschmackscodierungsmerkmale, die sie jetzt bequem messen kann14.

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Protokoll

Das folgende Protokoll entspricht allen Tierhaltungsrichtlinien der Yale University.

1. Fliegen

  1. 10-15 frisch geschlüpfte Fliegen bei 25 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 Uhr in frische Standard-Kulturfläschchen legen.
  2. Verwenden Sie Fliegen, wenn Sie 3-7 Tage alt sind.

2. Chemosensorische Reize

  1. Erhalten Sie chemosensorische Reize von höchster verfügbarer Reinheit. Bewahren Sie sie bis zur Verwendung wie vom Verkäufer empfohlen auf.
  2. Lösen Sie chemosensorische Reize auf und verdünnen Sie sie auf die gewünschten Konzentrationen in Wasser oder einem anderen gewünschten, ungiftigen Lösungsmittel wie Paraffinöl. Die vorbereiteten Lösungen werden bei gelösten festen Verbindungen mindestens 1 h lang gerührt.

3. Glas-Stimulus-Kapillare

  1. Ziehen Sie mit einem Pipettenabziehinstrument an einer Glaskapillare, um den Stimulus von einer Borosilikatglaskapillare (100 mm Länge, 1 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser) zu halten. Ziel ist ein Spitzendurchmesser zwischen 3 μm und 10 μm.
  2. Füllen Sie die Glaskapillare mit der bevorzugten Reizlösung mit einer Microloader-Pipettenspitze. Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, die durch leichtes Klopfen entfernt werden können.
  3. Wenn der Reiz an der Spitze kristallisiert, reinigen oder ersetzen Sie die Glasreizkapillare.

4. Referenz- und Aufzeichnungselektroden

  1. Verwenden Sie Wolframstäbe (127 μm Durchmesser und 76,2 mm Länge) sowohl für Referenz- als auch für Aufzeichnungselektroden. Schärfen Sie die Referenz- und Aufzeichnungselektroden an der Spitze auf einen Durchmesser von ca. 1 μm (die Formen dieser Elektroden sind in Delventhal et al.36), indem sie mehrere Sekunden lang wiederholt entweder in eine 10%ige KNO3 (~1 M) Lösung oder eine 10%ige KOH (1,8 M) Lösung getaucht werden.
    HINWEIS: Diese Lösung benötigt Strom (0,3-3 mA), um diesen Vorgang zu erleichtern.

5. Vorbereitung der Fliege für das Base Recording

  1. Ziehe eine einzelne Fliege aus dem Fläschchen in einen Aspirator. Ziehen Sie den Sauger heraus und fangen Sie das Tier ein, indem Sie einen Finger über das Ende legen.
  2. Stoßen Sie die Fliege in eine 200 μl Pipettenspitze aus Kunststoff aus. Halten Sie das Ende des Aspirators in der Pipettenspitze und schieben Sie die Fliege mit dem Kopf voran nach vorne in Richtung des schmalen Endes der Pipettenspitze.
  3. Schneiden Sie die Pipettenspitze an jedem Ende (d. h. vorne und hinten zum Tier) mit einer Rasierklinge ab.
  4. Verwende entweder Ton oder ein kleines Stück Watte, um die Fliege weiter nach vorne zu schieben, bis die Hälfte des Kopfes aus dem Ende der abgeschnittenen Pipettenspitze herausragt. Drücke mit einer Pinzette sanft, bis die Labellum an der Vorderseite des Kopfes freiliegt.
  5. Befestigen Sie die getrimmte Pipettenspitze mit Ton auf einem Glasobjektträger (Abbildung 1).
  6. Positionieren Sie die Labellum unter dem Stereomikroskop seitlich auf einem Deckglas, so dass ein Lappen mit seinen 31 Geschmackssensillen freigelegt wird (Abbildung 1). Der Deckglas hält die Labellum an Ort und Stelle.

6. Elektrophysiologie-Prüfstand

  1. Wählen Sie einen Raum für die Einrichtung der Bohranlage, der über eine stabile Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit (<70 %) verfügt und von elektrischen und mechanischen Geräuschquellen wie Kühlschränken und Zentrifugen isoliert ist.
  2. Stellen Sie das Mikroskop in die Mitte eines Antivibrationstisches.
  3. Befestigen Sie einen manuellen Mikromanipulator am Vibrationstisch (Abbildung 2).
  4. Befestigen Sie eine Edelstahlwelle, die die Wolfram-Referenzelektrode hält, am manuellen Mikromanipulator (Abbildung 2).
  5. Verbinden Sie motorisierte Manipulatoren - einen mit einer Halterung für die Aufzeichnungselektrodensonde und einen zweiten mit einer Halterung, die mit einer Edelstahlwelle für die Glasreizkapillare verbunden ist - mit Ständern an denselben Tisch (Abbildung 2).
  6. Schließen Sie die Aufzeichnungselektrodensonde an ein IDAC-System (Intelligent Data Acquisition Controller) oder ein anderes Verstärker-/Digitalisierersystem an.
  7. Verbinden Sie dieses IDAC-System mit dem Computer an der Workstation.
  8. Erden Sie die manuellen und motorisierten Manipulatoren an der gleichen Stelle innerhalb des Bohrgeräts.
  9. Installieren Sie die entsprechende Erfassungssoftware für das IDAC-System auf dem Computer. Stellen Sie sicher, dass die Treiber für die digitale Erfassung mit dem Betriebssystem (z. B. Windows XP-7, -8 oder -10) auf dem Computer kompatibel sind.

7. Aufnahme von taste sensilla

  1. Legen Sie den Objektträger mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 10x) auf den Mikroskoptisch. Bewegen Sie den Tisch, bis das Labellum in der Mitte des Sichtfelds sowohl bei Objektiven mit niedriger als auch bei hoher Vergrößerung (z. B. 50x) scharf ist.
  2. Führen Sie die Referenzelektrode mit dem Objektiv mit geringer Vergrößerung in das Auge ein. Um die Referenzelektrode einzuführen, richten Sie das Auge auf die Seite der Fliege, die der Seite mit der Aufzeichnungselektrode gegenüberliegt, z. B. wenn sich die Aufzeichnungselektrode von rechts nähert, platzieren Sie die Referenzelektrode im linken Auge. Verwenden Sie einen manuellen Mikromanipulator für ein präzises Einführen.
  3. Bringen Sie die Spitze der Glasreizkapillare in der Mitte des Sichtfelds sowohl von Objektiven mit geringer als auch von hoher Vergrößerung mit einem motorisierten Mikromanipulator in den Fokus (Abbildung 3).
  4. Bringen Sie die Aufzeichnungselektrode bei geringer Vergrößerung mit einem zweiten motorisierten Mikromanipulator in die Nähe des Labellums.
  5. Bei starker Vergrößerung wird die Aufzeichnungselektrode mit dem motorisierten Mikromanipulator in die Basis eines Geschmackssensillums eingeführt, bis das Geräusch der neuronalen Feueraktivität aus dem Audioausgang des IDAC-Systems zu hören ist.
  6. Sobald ein stabiles Signal hergestellt wurde, beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Signals mit der Software, die im Lieferumfang des IDAC-Systems enthalten ist (Abbildung 4A-D). Um die Aufnahme zu starten, drücken Sie die Schaltfläche Aufnahme starten.
  7. Bringen Sie die Spitze der Stimulusglaskapillare mit dem motorisierten Manipulator zur Abdeckung der Spitze des Geschmackssensillums.
  8. Um den Reiz zu beenden, entfernen Sie die Glasreizkapillare mit dem motorisierten Manipulator aus dem Sensillum.
  9. Markieren Sie Start und Ende der Stimulation manuell mit einem Pedal. Das Pedal ist mit dem IDAC verbunden, und seine Kommunikation mit der Software wird über den IDAC erleichtert, um den Start/das Ende des Stimulus zu markieren.

8. Würdigung

  1. Nutzen Sie die verschiedenen Funktionen der Software, die mit dem IDAC-System geliefert wird, um Spike-Populationen nach Amplitude zu sortieren (wenn möglich) und die Reaktionsdynamik zu analysieren.
    1. Um Spitzen zu zählen, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die gewünschte Aufzeichnung und öffnen Sie ein Fenster, aus dem Sie auswählen können. Wählen Sie To Spikes aus, und öffnen Sie ein weiteres Fenster mit dem Namen Convert waves to spikes. Geben Sie einen Namen in das Feld Neu ein und drücken Sie die Schaltfläche OK .
    2. Die Eingabe des Namens in das Feld Neu in Schritt 8.1.1 führt zur Ansicht Amplitudenhistogramm . Wählen Sie die zu zählende Amplitude aus und schließen Sie diese Ansicht. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um einen Zähler hinzuzufügen.
    3. Untersuchen Sie die Spitzen manuell, um Schlussfolgerungen auf der Grundlage der Analyse mit Software zu bestätigen.
      HINWEIS: Die Software ermöglicht auch den Export von Daten in verschiedenen Formaten für die weitere Analyse.

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Ergebnisse

Abbildung 4A zeigt spontane Spikes, die von einem Sensillum ausgehen. Sie fallen in zwei Klassen, die auf der Amplitude basieren, wobei die größeren Spikes von dem Neuron stammen, das empfindlich auf Bitterstoffe reagiert, und die kleineren Spikes von dem Neuron, das auf Zucker reagiert. Die Beziehung zwischen Spike-Amplitude und funktioneller Spezifität wurde durch genetische Experimente bestätigt 4,14,37,38,39 .

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Diskussion

Bei Aufzeichnungen von einigen Arten von Sensillen kann es schwierig sein, die Spikes verschiedener Neuronen zu unterscheiden. Zum Beispiel produzieren die Zuckerneuronen und mechanosensorischen Neuronen von S- und I-Sensillen Spikes mit ähnlichen Amplituden, was es schwierig macht, sie zu unterscheiden 4,14. Wir stellen fest, dass die Verwendung einer sehr scharfen Wolfram-Aufzeichnungselektrode das Feuern des mechanosensorischen Neurons reduziert, ebenso wie di...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Zina Berman für die Unterstützung, Lisa Baik für ihre Kommentare zum Manuskript und anderen Mitgliedern des Carlson-Labors für die Diskussion. Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium K01 DC020145 an H.K.M.D. unterstützt; und NIH gewährt J.R.C. R01 DC02174, R01 DC04729 und R01 DC011697.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MikroskopOlympusBX51WIausgestattet mit einem 50X Objektiv (LMPLFLN 50X, Olympus) und 10X Okularen.
AntivibrationstischTMC63-7590E
motorisierte MikromanipulatorenHarvard Apparatus und Mä rzhä Benutzer MikromanipulatorenMikromanipulator PM 10 Piezo Mikromanipulator
manuell MikromanipulatorenMä rzhä Benutzer MikromanipulatorenMM33 Mikromanipulator
Magnetische StänderENCOModell #625-0930
Referenz  und Aufzeichnung ElektrodenhalterOckenfels Syntech GmbH
Stimulus GlaskapillarhalterOckenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended ProbeOckenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus ControllerOckenfels Syntech GmbHStimulus Controller CS 55
Personal ComputerDellVostroKompatibilität mit digitalem Erfassungssystem und Software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Aluminiumfolie und/oder Faradayscher KäfigAbschirmung gegen elektromagnetisches Rauschen
Borosilikatglas KapillarenWorld Precision Instruments1B100F-4
PipettenabzieherSutter Instrument CompanyModell P-97 Flaming/Braun Mikropipette Abzieher
StereomikroskopOlympusVMZ 1x-4xFür die Fliegenvorbereitung
p200 PipettenspitzenGenerisch
Tipps für Microloader EppendorfE5242956003
1 ml SpritzeGenerische
Krokodilklemmen
LeistungstransformatorenSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BZusammengesetzt aus P1000 Pipettenspitzen, flexiblen Kunststoffschläuchen und Netz
ModelliermasseGenerische
PinzettenGenerisches
KunststoffschläucheSaint GobainTygon S3™ E-3603
Standard-KulturfläschchenArchon ScientificSchmale 1-Unzen-Polystyrolgefäße mit jeweils 10 ml Glukosemedium, vorgeladen mit Celluloseacetat-Stopfen
Berberinchlorid (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatoniumbenzoat (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Diethyl-m-Toluamid (DEET)Sigma-AldrichCat# Artikel-Nr.: 36542

Referenzen

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