Ein Modell eines abdominalen Aortenaneurysmas der Maus durch periadventielle Calciumchlorid- und Elastase-Infiltration

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Etablierung eines Modells für ein abdominales Aortenaneurysma der Maus unter Verwendung von Calciumchlorid und Elastase vor, das die Vorteile früherer Modellierungsmethoden kombiniert. Dieses Modell kann verwendet werden, um die pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen, die abdominalen Aortenaneurysmen zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Das abdominale Aortenaneurysma (AAA) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die mit hohen Sterblichkeitsraten einhergeht. Sie zeichnet sich durch eine dauerhafte Erweiterung der Bauchschlagader mit einer Zunahme des Arteriendurchmessers um mindestens 50% aus. Verschiedene Tiermodelle von AAA wurden eingeführt, um die pathophysiologischen Veränderungen nachzuahmen und die zugrunde liegenden Mechanismen von AAA zu untersuchen. Unter diesen Modellen werden die Calciumchlorid (CaCl₂)- und Elastase-induzierten AAA-Modelle häufig bei Mäusen verwendet. Diese Methoden haben jedoch gewisse Einschränkungen. Die traditionelle intraluminale Perfusion der porzinen Pankreas-Elastase (PPE) ist mit hohen technischen Schwierigkeiten und einer hohen Rupturrate verbunden, während die periadventitielle Verabreichung von PSA zu inkonsistenten Ergebnissen führt. Darüber hinaus fehlen dem CaCl_{2-induzierten} AAA-Modell humane AAA-Merkmale wie Atherothrombose und Aneurysmaruptur. Daher wurde die kombinierte Anwendung von CaCl₂ und PSA als Ansatz vorgeschlagen, um die Erfolgsraten zu erhöhen und eine größere Durchmesservergrößerung in AAA-Tiermodellen zu induzieren. Dieses Manuskript stellt ein umfassendes Protokoll zur Etablierung eines Maus-AAA-Modells durch periaortale Infiltration von PPE und CaCl₂ im infrarenalen Segment der abdominalen Aorta vor. Durch die Befolgung dieses Protokolls können wir eine AAA-Bildungsrate von ca. 90% bei technischer Einfachheit und Reproduzierbarkeit erreichen. Weitere Ultraschall- und histologische Experimente bestätigen, dass dieses Modell die morphologischen und pathologischen Veränderungen, die bei humaner AAA beobachtet wurden, effektiv repliziert.

Einleitung

Ein Bauchaortenaneurysma (AAA) ist definiert als eine Durchmesserzunahme von mehr als 50 % oder ein maximaler Aortendurchmesser von mehr als 3 cm in der Bauchaorta. Diese Erkrankung stellt eine erhebliche Bedrohung für das Leben dar, mit einer Sterblichkeitsrate von etwa 90 % nach Aneurysmaruptur ^1,2,3. Derzeit sind die offene chirurgische Reparatur und die endovaskuläre Aortenreparatur (EVAR) die einzigen verfügbaren Eingriffe für AAA-Patienten ^4,5,6. Es gibt jedoch keine ausreichenden Beweise für die Wirksamkeit medizinischer Behandlungen bei der Hemmung der Aneurysmabildung oder der Verlangsamung der Wachstumsrate der Bauchaorta bei Patienten, die keine chirurgischen Indikationen haben⁷. Nichtsdestotrotz werden unspezifische Behandlungen, einschließlich der anhaltenden Überwachung des maximalen Aneurysmadurchmessers, der Blutdruckkontrolle, der Thrombozytenaggregationshemmung und der Statine, eingesetzt, um das Risiko einer plötzlichen Aneurysmaruptur und möglicher kardiovaskulärer und neurologischer Ereignisse so weit wie möglich zu reduzieren. Trotzdem bleibt die Rolle von Thrombozytenaggregationshemmern und Statinen bei der Vorbeugung von Aneurysmarupturen umstritten und erfordert weitere Studien 5,7,8,9,10.

Ein stabiles AAA-Tiermodell ist für die Untersuchung der Pathogenese von AAA von entscheidender Bedeutung, und es wurden zahlreiche Methoden eingeführt, um ein solches Modell zu etablieren 11,12,13. Derzeit werden Calciumchlorid (CaCl₂), Elastase, Angiotensin II (Ang II), Xenotransplantate und transgene Modelle zur Etablierung von Nagetier-AAA-Modellen verwendet 11,12,13. Unter diesen wird Ang II am häufigsten bei Mäusen verwendet, während CaCl₂ und Elastase auch bei Mäusen und Ratten weit verbreitet sind 11,12,13,14. Das Ang II-induzierte AAA-Modell ist das einzige Tiermodell, das in der Lage ist, Atherosklerose zu induzieren, die der menschlichen AAA-Pathologie sehr ähnlich ist, einfach und reproduzierbar ist und die Notwendigkeit einer Laparotomie überflüssig macht 11,12,13. Im Gegensatz zu den Modellen, die durch CaCl₂ oder Elastase induziert werden, ist die Lokalisation der durch Ang II induzierten Aneurysmen jedoch unsicher und wird häufig in der absteigenden Aorta oder der suprarenalen abdominalen Aorta beobachtet, mit einem erhöhten Risiko für eine Ruptur 11,12,13,14. Die Aneurysma-Inzidenzrate des Ang II-induzierten AAA-Modells bei gendefizienten Mäusen kann bis zu 100 % betragen, während nur 39 % der C57BL/6-Mäuse Aneurysmen entwickelten, und der Zeitaufwand und die wirtschaftlichen Kosten für die Gewinnung von gendefizienten Mäusen hoch sind^13,15.

Ursprünglich von Gertz et al. eingeführt, wurde CaCl₂ verwendet, um die Aneurysmabildung in der Halsschlagader zu induzieren, und später von Chiou et al. modifiziert, um ein AAA-Modell in Mäusen zu etablieren^16,17. Trotz seiner Fähigkeit, den Abbau elastischer Fasern, Gefäßentzündungen und den Abbau der extrazellulären Matrix zu induzieren, fehlen CaCl₂ jedoch mehrere humane AAA-Merkmale, darunter Atherothrombose, intraluminaler Thrombus (ILT) und Aneurysmaruptur^12,18. Darüber hinaus bleiben die Bildungsrate und der prozentuale Durchmesserzuwachs der periaortalen CaCl-2-Applikation instabil ^13,19. Das erste intraluminale Perfusionsmodell der porzinen Pankreas-Elastase (PPE) zur Induktion von AAA wurde 1990 von Anidjar et al. entwickelt, gefolgt von Bhamidipati et al. Bericht über die periadventitielle PSA-Infiltration in einem Mausmodell^20,21. Heutzutage verwenden die meisten Elastase-induzierten AAA-Tiermodelle das Bhamidipati-Protokoll aufgrund seiner Machbarkeit und minimalinvasiven Natur. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Inzidenzrate und der maximale Durchmesser von AAA variieren können und im Allgemeinen niedriger sind als bei der intraaortalen PSA-Perfusion. Darüber hinaus neigen Aneurysmen, die durch periaortale Anwendung von Elastase induziert werden, zur spontanen Heilung 11,12,20,21,22,23.

Um diese Einschränkungen zu beheben, schlugen Tanaka et al. einen Kombinationsansatz vor, der intraluminale PSA-Perfusion und CaCl 2-Infiltration umfasst, um ein AAA-Modell bei Ratten zu etablieren, das zufriedenstellende Ergebnisse lieferte²⁴. Darüber hinaus zeigten Zhu et al., dass das PPE + CaCl_2-Modell Vorteile wie höhere Überlebensraten und erhöhte Aneurysmabildungsraten sowohl im Vergleich zur einzelnen PSA-Gruppe als auch zur PPE + BAPN-Gruppe^{bietet 25}. Dieser kombinierte Ansatz weist zudem eine gute Stabilität und Reproduzierbarkeit auf. Darüber hinaus etablierten Bi et al. erfolgreich ein Kaninchen-AAA-Modell durch die Kombination von periaortalem CaCl₂ und Elastase-Inkubation. Das durchschnittliche Dilatationsverhältnis betrug 65,3 % ± 8,9 % an Tag 5, das weiter auf 86,5 % ± 28,7 % an Tag 15 anstieg und signifikant auf 203,6 % ± 39,1 % an Tag 30²⁶ anstieg. Es gibt jedoch derzeit keine Literatur, die über die Induktion von AAA bei Nagetieren durch Kombination von periaortalem CaCl₂ und Elastase-Applikation berichtet.

Dieses Manuskript stellt ein Standardprotokoll für die Etablierung eines murinen AAA-Modells durch die kombinierte Verwendung von periadventtiellem CaCl₂ und Elastase-Infiltration vor. In den folgenden Abschnitten werden detaillierte chirurgische Verfahren vorgestellt und repräsentative Ergebnisse des murinen AAA-Modells vorgestellt.

Protokoll

Das Tierversuchsprotokoll entsprach dem National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Pub No. 86/23, 1985) und wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des West China Hospital der Sichuan University (Zulassungsnummer 202311300012) genehmigt. Für diese Studie wurden acht bis zehn Wochen alte männliche C57/B6J-Mäuse verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Holen Sie sich die Tiere und füttern Sie sie mit normalem Futter mit sauberem Wasser unter Standardbedingungen (Temperatur 24 °C, Luftfeuchtigkeit 40%-50%, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus).
2. Schneiden Sie ein Wattepad in 40 mm x 4 mm große Streifen und sterilisieren Sie es zusammen mit Schere, Pinzette und anderen chirurgischen Geräten.
3. Setzen Sie das Tier in die Induktionskammer des Anästhesiegeräts und verwenden Sie 3 % bis 3,5 % Isofluran, um eine Anästhesie schnell einzuleiten (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Verschreiben Sie zusätzlich Butorphanol (1 mg/kg, intramuskuläre Injektion) als präventives Analgesiemedikament.
   1. Nehmen Sie die Maus aus der Kammer, wenn sie nicht mehr auf Schmerzstimulation reagiert, legen Sie dann eine Maske auf die Maus und halten Sie die Narkosetiefe mit 1 % bis 1,5 % Isofluran aufrecht. Überwachen Sie die Atemfrequenz und -tiefe alle 5-10 Minuten.
4. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf das Heizkissen, verwenden Sie Klebeband, um die Gliedmaßen zu immobilisieren, und tragen Sie Augensalbe auf, um Trockenheit zu verhindern.
5. Verwenden Sie einen Elektrorasierer oder eine Haarentfernungslotion, um die Haare im Bauchbereich vollständig zu entfernen, und desinfizieren Sie diesen Bereich dann mindestens dreimal mit mit Povidon-Jod und Ethanol getränkten Wattestäbchen in kreisenden Bewegungen.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Platzieren Sie die Maus unter einem Stereomikroskop. Machen Sie mit einer Schere einen Längsschnitt von ca. 2-2,5 cm entlang der Mittellinie des Bauches.
2. Betreten Sie die Bauchhöhle durch die Linea alba (transabdominaler Zugang), legen Sie einen Retraktor an, um die Bauchhöhle freizulegen, und packen Sie den Darm und den Dickdarm in die rechte Bauchhälfte mit normaler, mit Kochsalzlösung getränkter Gaze.
3. Führen Sie eine stumpfe Trennung von Binde- und Fettgewebe neben der infrarenalen Bauchschlagader und der unteren Hohlvene (IVC) mit einer Pinzette und Wattestäbchen durch. Präparieren Sie vorsichtig die Bauchschlagader und legen Sie die Lücke zwischen der Bauchschlagader und dem darüber liegenden Psoas major frei, wie zuvor erwähnt²⁵.
   1. Führen Sie die sterilisierten Wattepadstreifen in diesen Spalt ein und achten Sie dabei äußerst darauf, die Lendenwirbelarterie oder Vene nicht zu beschädigen. Es ist nicht notwendig, die Bauchschlagader von der IVC zu isolieren.
4. Tränken Sie den Wattebausch mit 0,9 M CaCl₂ und legen Sie ihn für 15 min auf die Adventitia der Bauchschlagader. Verwenden Sie sterilisierte Gaze, um die Bauchhöhle während des Infiltrationsprozesses abzudecken.
5. Entfernen Sie vorsichtig den mit CaCl₂ getränkten Wattebausch und waschen Sie das infiltrierte Segment mit 0,9%iger Kochsalzlösung.
6. Verdünnen Sie die Elastase auf 2 mg/ml (8 U/ml) mit ddH₂O. Tragen Sie mit einer Insulinspritze 50 μl verdünnte Elastase auf das infrarenale Segment der Bauchaorta auf und wickeln Sie die Wattepadstreifen ein, um die Bauchaorta und die IVC zu bedecken. Verwenden Sie sterilisierte Gaze, um die Bauchhöhle während des Infiltrationsprozesses abzudecken. Verwenden Sie in der Scheingruppe 0,9 % normale Kochsalzlösung, um CaCl₂ und PSA zu ersetzen.
7. 15 min später die Mull- und Wattepadstreifen vorsichtig entfernen. Bewegen Sie den Darm und den Dickdarm wieder in ihre ursprüngliche Position, bedecken Sie die behandelte Aorta mit dem Mesenterium und befeuchten Sie den Darm, um Adhäsionen zu verhindern.
8. Verschließen Sie die Muskelschicht und die Haut getrennt mit einem nicht resorbierbaren 6-0-Polypropylen-Nahtmaterial. Desinfizieren Sie das Operationsgebiet mit Povidon-Jod und Ethanol.
9. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen und überwachen Sie ihren Atemstatus, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt. Notieren Sie die Operationszeit und die Anzahl der Versuchstiere. Verschreiben Sie Carprofen (5 mg/kg, subkutan) als postoperative Analgesie für mindestens 3 Tage nach der Operation, gemäß tierärztlicher Empfehlung.

3. Ultraschalluntersuchung

1. Führen Sie 21 Tage nach der Operation eine Ultraschalluntersuchung durch, um die Inzidenzrate von AAA zu bewerten.
2. Betäuben Sie die Maus (nach institutionell anerkannten Protokollen) und entfernen Sie die Bauchhaare wie zuvor beschrieben.
3. Platzieren Sie die Maus auf dem Heizkissen des Nagetier-Ultraschallgeräts. Tragen Sie Ultraschall-Koppelmittel auf den Bauch auf und messen Sie den maximalen Durchmesser des Aneurysmas und den Durchmesser des normalen Segments der Bauchaorta.
   1. Berechnen Sie den erhöhten Prozentsatz der infrarenalen Bauchaorta. Das Kriterium für eine erfolgreiche AAA-Bildung ist, dass der maximale Durchmesser der AAA im Vergleich zum Durchmesser des normalen Segments der infrarenalen Bauchschlagader um 50% oder mehr zugenommen hat.
4. Wischen Sie das restliche Ultraschall-Kolosse nach der Untersuchung mit einer Serviette ab und legen Sie die Maus auf das Heizkissen, bis sie sich vollständig erholt hat.

4. Entnahme der abdominalen Aorta und pathologische Experimente

1. Opfern Sie die Maus durch eine Überdosierung von Isofluran am Tag nach der Ultraschalluntersuchung (nach institutionell anerkannten Protokollen).
2. Öffnen Sie die Brust- und Bauchhöhle und führen Sie eine Perfusion mit 1x PBS durch den linken Ventrikel durch, bis Lunge und Leber weiß werden, nach dem in der früheren Literatur^{beschriebenen Verfahren 27}.
3. Verwenden Sie einen digitalen Messschieber, um den Außendurchmesser der infrarenalen Aorta zu messen. Entnehmen Sie die infrarenale Bauchschlagader unter einem Stereomikroskop und lagern Sie das Gefäß 24-48 h lang in 4% Paraformaldehyd.
4. Entfernen Sie das Binde- und Fettgewebe, das die Bauchschlagader umgibt. Betten Sie die Aorta in Paraffin ein, um Schnitte vorzubereiten, und schneiden Sie die Schnitte in 3-5 μm große Scheiben, wie zuvor beschrieben^18,28.
5. Führen Sie Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen (H&E), Masson-Trichrome und Elastic-Van Gieson (EVG)-Färbungen auf den entparaffinisierten Scheiben mit den entsprechenden Färbekits gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
   1. Analysieren Sie die Gefäßstruktur und Entzündungen mit der H&E-Färbung, beobachten Sie den Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) und der Kollagenfasern mit der Masson-Trichrom-Färbung und untersuchen Sie elastische Fasern mit der EVG-Färbung.

Ergebnisse

In dieser Studie wurden insgesamt 24 Mäuse eingeschlossen und nach dem Zufallsprinzip zugeteilt: 12 in der Sham-Gruppe bzw. 12 in der PPE + CaCl_2-Gruppe . Alle Daten sind, sofern nicht anders angegeben, als Mittelwerte ± Standardabweichungen angegeben. Die durchschnittliche Betriebszeit betrug 55.67 min ± 4.08 min. Es gab keine intraoperativen Todesfälle oder Aneurysmarupturen, und die Überlebensrate innerhalb von 21 Tagen nach der Operation betrug 100 %. Es wurden keine schweren intestinalen Adhäsionen oder Komplikationen im Zusammenhang mit der Dissektion der abdominalen Aorta beobachtet.

In der PPE + CaCl_2-Gruppe entwickelten 11 von 12 Mäusen (91,67%) 21 Tage nach der Operation AAA, während in der Sham-Gruppe keine Aneurysmabildung beobachtet wurde. Der durchschnittliche maximale Innendurchmesser der infrarenalen Bauchaorta betrug 1,29 mm ± 0,18 mm in der PPE + CaCl_2-Gruppe , verglichen mit 0,50 mm ± 0,04 mm in der Sham-Gruppe. Die durchschnittliche prozentuale Zunahme des Innendurchmessers der infrarenalen Bauchschlagader in der PPE + CaCl_2-Gruppe betrug 99,50 % ± 25,42 %. Der durchschnittliche maximale Durchmesser der äußeren infrarenalen Aorta betrug 1,49 mm ± 0,19 mm in der PPE + CaCl_2-Gruppe , verglichen mit 0,61 mm ± 0,04 mm in der Sham-Gruppe.

Repräsentative Bilder der abdominalen Aorta in den Gruppen Sham und PPE + CaCl₂ unter Stereomikroskop und Ultraschall wurden in Abbildung 1A,B gezeigt. Die statistischen Analyseergebnisse des durchschnittlichen infrarenalen abdominalen Aorta, des maximalen Innen- und Außendurchmessers in den Gruppen PPE + CaCl₂ und Sham sind in Abbildung 1C,D dargestellt. Eine weitere histologische Untersuchung mit H&E-Färbung zeigte eine Verdickung der Aortenwand und eine Infiltration von Entzündungszellen in der PPE + CaCl_2-Gruppe, während die Trichrom-Färbung von Masson einen Abbau der extrazellulären Matrix und eine Ablagerung von Kollagenfasern in der Aortenwand zeigte. Die EVG-Färbung zeigte einen Abbau elastischer Fasern (Abbildung 1E).

Abbildung 1: Ergebnisse des AAA-Modells von Mäusen, das durch periadventielle CaCl₂ - und Elastase-Infiltration etabliert wurde. (A) Repräsentative Bilder der normalen Bauchschlagader und der AAA unter dem Stereomikroskop. (B) Transversale und longitudinale Ultraschallbilder der Bauchschlagader in der Gruppe Sham und PPE + CaCl₂ . (C) Statistische Analyse des maximalen Innendurchmessers der infrarenalen Bauchschlagader in der Gruppe Sham und PPE + CaCl₂ , ****p < 0,0001. (D) Vergleich des äußeren infrarenalen Aortendurchmessers von Sham und PPE + CaCl_2-Gruppe , ****p < 0,0001. (E) H&E-, Masson- und EVG-Färbebilder der abdominalen Aorta. Maßstabsstäbe: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Erforschung der molekularen Mechanismen von AAA erfordert ein stabiles Tiermodell. Folglich wurden seit seiner ersten Entwicklung durch Economou et al. in den 1960er Jahren zahlreiche AAA-Tiermodelle etabliert²⁹. Unter diesen Modellen wird CaCl₂ aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit, technischen Einfachheit und zuverlässigen Reproduzierbarkeit häufig bei Nagetieren eingesetzt. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die perivaskuläre CaCl-2-Infiltration bei der Etablierung von AAA instabil ist. Bi et al. und Freestone et al. berichteten, dass nur etwa 60% der Ratten AAA entwickelten, selbst wenn das Kriterium für die AAA-Bildung als eine Zunahme von 20% im Vergleich zum normalen Segment der abdominalen Aorta definiert wurde. Beide Studien stellten fest, dass nach einer einzigen periaortalen Inkubation von 0,5 mol/L CaCl₂ für 20 min keine Aneurysmabildung beobachtet wurde 13,19,26,30.

Darüber hinaus besteht in der bestehenden Literatur derzeit kein Konsens über die optimale Konzentration der CaCl_{2-Infiltration}, die Expositionszeit und die Nachbeobachtungsdauer¹¹. Damit ist das Elastase-induzierte AAA-Modell das am zweithäufigsten verwendete Nagetiermodell für die Untersuchung von AAA. Die intraaortale PSA-Infusion ist jedoch mit einer hohen perioperativen und postoperativen Sterblichkeitsrate von bis zu 40 % verbunden. Darüber hinaus wurden im PPE-induzierten AAA-Modell bemerkenswerte geschlechtsspezifische Diskrepanzen beobachtet, wobei weibliche Mäuse im Vergleich zu ihren männlichen Artgenossen 11,20,25,31,32,33 eine viel geringere prozentuale Zunahme des Aortendurchmessers aufwiesen.

Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde eine modifizierte Version des Elastase-induzierten AAA-Modells mit perivaskulärer Elastase-Infiltration als praktikable und weniger invasive Alternative eingeführt. Es ist jedoch zu beachten, dass die Aneurysmabildungsrate und der Durchmesser bei diesem Ansatz weniger stabil waren als bei der intraluminalen PSA-Perfusion 11,12,21,22. Daher schlugen die Forscher eine Kombination aus periadventiellem CaCl₂ und Elastase-Inkubation vor, um AAA bei Kaninchen zu etablieren, was sich als einfach, effektiv und reproduzierbar erwiesen hat²⁶.

In der Zwischenzeit etablierte eine andere Studie ein AAA-Modell bei Ratten, indem sie PSA-Perfusion und CaCl 2-Inkubation kombinierte, und zeigte, dass das PPE + CaCl_2-Modell hohe Überlebensraten, hohe Aneurysmabildungsraten und eine gute Reproduzierbarkeit aufweist²⁵. Derzeit gibt es jedoch keine Literatur darüber, wie die periaortale PSA + CaCl_{2-Infiltration} zur Etablierung von AAA bei Mäusen und deren Ergebnisse verwendet werden kann.

Dieser Artikel zeigt, dass die AAA-Inzidenzrate und der Anstieg des prozentualen Durchmessers der Aorta unter Verwendung dieses Protokolls ohne perioperative Todesfälle stabil blieben, was durch Ultraschall- und Histologieuntersuchungen bestätigt wurde. Darüber hinaus induziert dieses Protokoll effektiv morphologische und pathologische Veränderungen, die denen bei menschlicher AAA ähneln. Darüber hinaus war die durchschnittliche Betriebszeit für dieses Protokoll auf weniger als 1 Stunde begrenzt, einschließlich 15 Minuten CaCl_{2-Infiltration} und 15 Minuten PSA-Inkubation. Dieses chirurgische Protokoll ist robust und einfach zu implementieren, wobei leicht verfügbare Materialien verwendet werden. Diese Vorteile deuten auf eine mögliche Anwendung in der zukünftigen Grundlagenforschung hin.

Es bestehen Diskrepanzen in der Rate der Aneurysmaentwicklung in PPE- oder CaCl_{2-induzierten} AAA-Tiermodellen, und aktuelle chemisch induzierte Modelle können keine 100%ige Erfolgsrate bei der Etablierung von AAA^{garantieren 11,12,13}. Obwohl pathologische Veränderungen, die mit AAA assoziiert sind, wie chronische Entzündungen, Intima-/Mediendicke, elastischer Zusammenbruch, Verkalkung und intraluminaler Thrombus, nach PSA- oder CaCl 2-Infiltration beobachtet werden können, kann die Erweiterung der Aorta oder die Bildung eines Aneurysmas dazu neigen, spontan zu heilen, da die chemische Anwendungsdauer begrenzt ist und keine anhaltende Aktivität bietet, sobald der Reiz aufhört^{12, 23}. Urheberrecht Darüber hinaus kann das chirurgische Verfahren zur Etablierung der AAA nicht vollständig standardisiert werden, was zu möglichen Schwankungen im Ausmaß der Exposition der abdominalen Aorta führt, was sich auf die Aneurysmabildung auswirken kann. Aber selbst bei Mäusen, bei denen die Modellierung nicht erfolgreich war, zeigte der Durchmesser der Bauchaorta immer noch eine signifikante Ausdehnung von 44%, was darauf hindeutet, dass diese Methode eine erhebliche Vergrößerung der Bauchaorta induzieren kann, obwohl sie nicht immer die diagnostischen Kriterien für ein Bauchaortenaneurysma erfüllt.

Von besonderer Bedeutung ist, dass dieses Protokoll mehrere entscheidende Schritte umfasst. In erster Linie ist es zwingend erforderlich, die infrarenale Bauchschlagader während der Etablierung des Maus-AAA-Modells adäquat freizulegen. Die Maximierung der Trennung von Binde- und Fettgewebe, das die Bauchschlagader umgibt, ermöglicht eine bessere Infiltration von CaCl₂ und Elastase in die mittlere Schicht der infrarenalen Bauchaorta, wodurch die Rate der Aneurysmabildung erhöht^{wird 22}. Darüber hinaus kann es nach einer CaCl 2-Infiltration einfacher sein, Bindegewebe und Fettgewebe zu trennen. Wenn die anfängliche Dissektion des umgebenden Gewebes nicht zufriedenstellend ist, ist es daher ratsam, das an die Bauchschlagader angrenzende Bindegewebe nach der CaCl_{2-Infiltration} weiter zu trennen. Die Freilegung der Bauchschlagader birgt jedoch das Risiko einer Schädigung der Lendenarterie und der Vene, was während oder nach der Operation zu schweren Blutungen und tödlichen Folgen führen kann. Daher ist bei der Entnahme von Binde- und Fettgewebe um die Bauchschlagader größte Vorsicht geboten. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Trennung der Bauchschlagader von der unteren Hohlvene (IVC). Frühere Studien und experimentelle Befunde deuten immer wieder darauf hin, dass die Frage, ob die IVC von der Bauchaorta entfernt wird oder nicht, keinen Einfluss auf die Aneurysmabildung hat, so dass sie für dieses Verfahren unnötig ist^18,22.

Diese Studie hat mehrere Einschränkungen. Erstens fehlen Basisdaten über die Inzidenzrate von Aneurysmen und pathologischen Veränderungen der Bauchschlagader zu verschiedenen Zeitpunkten. Darüber hinaus wurden die Konzentrationen wichtiger Biomarker, die an der AAA-Entwicklung beteiligt sind, wie MMP2, MMP9, TIMP1 und SMA, nicht bewertet. Zweitens wurde diese Methode bisher nicht bei Mäusen angewendet und es fehlen Querschnittsvergleiche mit anderen häufig verwendeten Modellen, insbesondere solchen, die nur PSA oder CaCl₂ verwenden, um die Aneurysmabildung und die pathologischen Merkmale zu beurteilen. Drittens fehlen der durch diese Methode induzierten AAA mehrere Merkmale der humanen AAA, einschließlich Atherosklerose und intramuraler Thrombose. Darüber hinaus unterscheiden sich die Konzentrationen von CaCl₂ und Elastase, die bei dieser Methode verwendet werden, sowie die Infiltrationszeit geringfügig von denen in früheren Studien. Diesen Fragen wollen die Autoren in zukünftigen Studien durch experimentelle Untersuchungen nachgehen.

Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist seine Anwendbarkeit auf größere Tiermodelle, wie z. B. Schweine oder Hunde. Derzeit haben einzelne chemische Wirkstoffe wie Elastase, Kollagenase oder CaCl₂ nicht gezeigt, dass sie in der Lage sind, eine 50%ige Erweiterung der Bauchaorta bei Nicht-Nagetieren, mit Ausnahme von Kaninchen, zu induzieren. Nur Kombinationen von Chemikalien und Angioplastie oder anderen chirurgischen Verfahren haben das Potenzial gezeigt, die Aneurysmabildung bei Hunden und Schweinen zu induzieren^11,34. Frühere Forschungen haben auch gezeigt, dass Aneurysmen während einer 5-monatigen Nachbeobachtung in einem Kaninchen-AAA-Modell, das durch Elastase³⁵ induziert wurde, Anzeichen einer Regeneration zeigten. Obwohl Bi et al. die Induktion von AAA bei Kaninchen unter Verwendung dieses Protokolls nachgewiesen haben, sind weitere Studien erforderlich, um die Validität und die Langzeitergebnisse bei Schweinen oder Hunden zu bestimmen²⁶.

Die letzte Einschränkung betrifft die Einbeziehung nur männlicher Mäuse, da die Induktion von AAA bei weiblichen Mäusen unter Verwendung von Elastase mit niedrigeren Raten der Aneurysmabildung und einem geringeren Prozentsatz der Aortendilatation verbunden ist 11,13,33,36. Studien von Xue et al. haben jedoch gezeigt, dass die perivaskuläre Anwendung von Elastase allein zu einer Inzidenzrate von 90% von AAA bei weiblichen Mäusen führte. Dies deutet darauf hin, dass dieses Protokoll auch bei weiblichen Mäusen wirksam sein kann²², obwohl weitere Studien gerechtfertigt sind, um seine Wirksamkeit zu bestätigen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass eine Schädigung der Gefäßstruktur und der elastischen Fasern nur auf der Seite auftritt, die mit CaCl₂ und Elastase infiltriert ist, und dass auf der Seite, die an die Vena cava inferior (IVC) angrenzt, aufgrund ihrer Nähe keine pathologischen Veränderungen auftreten. Wie bereits erwähnt, haben diese Faktoren jedoch keinen Einfluss auf die Inzidenzrate von AAA oder die prozentuale Zunahme der Größe der abdominalen Aorta während der AAA-Entwicklung.

Zusammenfassend stellt dieses Manuskript ein neuartiges, sicheres, stabiles und reproduzierbares Maus-AAA-Modell vor, das eine hohe Inzidenzrate von AAA, eine signifikante Erweiterung der abdominalen Aorta und pathophysiologische Veränderungen zeigt, die denen bei humaner AAA ähneln. Trotz seiner Einschränkungen birgt dieses Maus-AAA-Modell ein großes Potenzial für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die AAA zugrunde liegen, und für die Entwicklung wirksamer Therapieansätze für Patienten mit dieser Erkrankung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anästhesiegerät	RWD	R550
Butorphanol	Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd	220608BP	1ml: 1mg
C57BL / 6JGpt Männliche Mäuse	GemPharmatech	N000013
Calciumchlorid	Sigma Aldrich	C4901	100 g
Carprofen	MCE	HY-B1227	100 mg
Chow Diät	Dossy Versuchstiere Co.Ltd
Digital Caliper		Greener IP54
Ethanol	Jinhe Pharmaceutical Co.Ltd	539682	75%/500 mL
EVG Färbekit	Solarbio	G1597
GraphPad Prism	Graphpad		Ver 9.0.0
H& E Färbeset	Servicebio	G1076
Insulinspritze	BD	2143420
Isofluran	RWD	R510-22-4	100 mL
Masson Färbeset	Servicebio	G1006
Normale Kochsalzlösung	Servicebio	G4702	500 mL
Paraformaldehyd	Biosharp	BL539A	4%/500 mL
PBS, 1x	Servicebio	G4202	500 mL
Schweinepankreas-Elastase	Sigma Aldrich	E1250	100 mg
Povidin Jod	Yongan Pharmazeutisches Co.Ltd		5%/100 mg
Prolen Polypropylen Naht	Ethicon LLC	8709H
Nagetier-Ultraschallsystem	Fujifilm	Vevo 3100LT
Stereomikroskop	Olympus	SZ61
Ultraschall Koppelmittel	Keppler	KL-250	250 g