Schneller Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Infektionen der unteren Atemwege verursachen, durch mikrofluidische Chip-basierte schleifenvermittelte isotherme Amplifikation

Zusammenfassung

Verschiedene bakterielle Krankheitserreger können Atemwegsinfektionen verursachen und zu ernsthaften Gesundheitsproblemen führen, wenn sie nicht genau erkannt und sofort behandelt werden. Der schnelle und genaue Nachweis dieser Erreger durch schleifenvermittelte isotherme Amplifikation ermöglicht ein effektives Management und eine effektive Kontrolle von Atemwegsinfektionen im klinischen Umfeld.

Zusammenfassung

Atemwegsinfektionen (RTIs) gehören zu den häufigsten Problemen im klinischen Umfeld. Die schnelle und genaue Identifizierung bakterieller Krankheitserreger wird praktische Leitlinien für das Management und die Behandlung von RTI liefern. Diese Studie beschreibt eine Methode zum schnellen Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Atemwegsinfektionen verursachen, mittels Mehrkanalschleifen-vermittelter isothermer Amplifikation (LAMP). LAMP ist ein empfindliches und spezifisches Diagnosewerkzeug, das bakterielle Nukleinsäuren schnell und mit hoher Genauigkeit und Zuverlässigkeit nachweist. Die vorgeschlagene Methode bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen bakteriellen Kultivierungsmethoden, die zeitaufwändig sind und oft eine höhere Empfindlichkeit für den Nachweis niedriger Mengen an bakteriellen Nukleinsäuren erfordern. In diesem Artikel werden repräsentative Ergebnisse der K . pneumoniae-Infektion und ihrer multiplen Koinfektionen mit LAMP zum Nachweis von Proben (Sputum, Bronchialspülflüssigkeit und Alveolarspülflüssigkeit) aus den unteren Atemwegen vorgestellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Mehrkanal-LAMP-Methode ein schnelles und effizientes Mittel zur Identifizierung einzelner und mehrerer bakterieller Krankheitserreger in klinischen Proben bietet, was dazu beitragen kann, die Ausbreitung bakterieller Krankheitserreger zu verhindern und die angemessene Behandlung von RTIs zu unterstützen.

Einleitung

Atemwegsinfektionen (RTIs), die durch bakterielle Krankheitserreger verursacht werden, tragen weltweit in erster Linie zur Morbidität und Mortalität bei¹. Es ist definiert als alle Symptome der oberen oder unteren Atemwege, die von 2-3 Tagen anhaltendem Fieber begleitet werden. Während Infektionen der oberen Atemwege häufiger sind als Infektionen der unteren Atemwege, sind chronische und wiederkehrende Atemwegsinfektionen auch häufige klinische Erkrankungen, die große Risiken für den Einzelnen darstellen und eine erhebliche Belastung für die Gesundheitssysteme darstellen². Zu den häufigen bakteriellen Erregern von RTIs gehören unter anderem Streptococcus pneumoniae³, Haemophilus influenzae⁴, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia. Diese pathogenen Bakterien besiedeln in der Regel die Schleimhautoberflächen des Nasopharynx und der oberen Atemwege des Wirts und verursachen typische Symptome von RTIs wie Halsschmerzen und Bronchitis. Sie verursachen eine Lungenentzündung, wenn sie sich von den oberen Atemwegen auf sterile Bereiche der unteren Atemwege ausbreiten und sich über die Atemwege von Mensch zu Mensch ausbreiten^{können 5}. In schweren Fällen können sie auch zu invasiven bakteriellen Erkrankungen führen, insbesondere zu bakteriämischer Lungenentzündung, Meningitis und Sepsis, die weltweit die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Menschen aller Altersgruppen sind.

Herkömmliche Tests auf RTI umfassen mikrobiologische Kulturen unter Verwendung von Rachenabstrichen und Sputumproben der Atemwege⁶. Darüber hinaus weisen serologische Tests wie der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Antikörper oder Antigene im Serum nach, während Agglutinationstests die Agglutinationsreaktion von Antikörpern und Antigenen zum Nachweis einer Infektion beobachten⁷. Mikrobielle Kulturen gelten als Goldstandard für die Diagnose von RTIs, aber ihre niedrige Positivitätsrate, ihre geringe Zuverlässigkeit und ihr langer Nachweiszyklus schränken die diagnostische Effizienz ein⁸. In Wirklichkeit ist eine schnelle und genaue Diagnose von RTIs entscheidend für die präzise Ausrottung des bakteriellen Erregers. Schnelle und effektive Nachweismethoden können dazu beitragen, die Übertragungsrate von Krankheitserregern zu verringern, die Infektionsdauer zu verkürzen und den unnötigen Einsatz von Antibiotika zu verringern ^9,10. Molekularbiologisch basierte Methoden beschleunigen den Nachweis erheblich, wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der die DNA-Sequenz eines Zielgens zum Nachweis von Krankheitserregern amplifiziert wird. Die traditionelle PCR erfordert jedoch komplexe Temperaturzyklusgeräte, die umständlich und zeitaufwändig sind. Darüber hinaus endet jede DNA-Amplifikation mittels PCR (mit Ausnahme der Real-Time-PCR) mit der elektrophoretischen Trennung des Produkts, was ebenfalls Zeit in Anspruch nimmt. Für die Visualisierung des Produkts werden Farbstoffe benötigt, von denen viele mutagen oder krebserregend sind. Daher ist es zwingend erforderlich, kontinuierlich neue Methoden und Technologien für die Diagnose von bakteriellen RTI-Erregern zu entwickeln.

Die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) ist eine neuartige und aufstrebende molekulare Technologie, die ursprünglich von Notomi et al. im Jahr 2000¹¹ entwickelt wurde. LAMP kann DNA unter stabilen isothermen Bedingungen ohne komplexe Temperaturwechselgeräte amplifizieren, was es für einen schnellen Nachweis geeignet macht und die Komplexität und Kosten der Ausrüstung reduziert¹². LAMP kann niedrige Konzentrationen der Ziel-DNA mit hoher Empfindlichkeit nachweisen¹³. Es werden mehrere spezifische Primer verwendet, um die Selektivität für Zielsequenzen zu verbessern und die Möglichkeit falsch positiver Ergebnisse zu verringern¹⁴. LAMP wird aufgrund seiner Leichtigkeit, Geschwindigkeit und intuitiven Bedienung, auch bei der Erkennung von RTIs, nach und nach in klinischen Labors weit verbreitet. In dieser Studie untersuchten wir die Wirksamkeit von LAMP bei der Detektion niedrigerer RTIs in klinischen Proben (Sputum, Bronchialspülflüssigkeit und Alveolarspülflüssigkeit), wie in Abbildung 1 gezeigt. Es ist offensichtlich, dass LAMP Vorteile wie Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit gegenüber herkömmlichen Tests bei der Erkennung von niedrigerem RTI bietet, was es zu einer vielversprechenden Anwendung macht.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der LAMP-Detektionsmethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

Alle Proben für diese Studie wurden vom Ethikprüfungsausschuss des Volkskrankenhauses der Provinz Guangdong bewertet und genehmigt (Zulassungsnummer: KY2023-1114-01). Alle Teilnehmer unterschrieben vor den Experimenten eine schriftliche Einverständniserklärung. Die für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die im Protokoll verwendeten Abkürzungen sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.

1. Entnahme klinischer Proben aus den unteren Atemwegen

1. Sputum-Sammlung
   1. Reinigen Sie die Mundhöhle und die Zähne mit sauberem Wasser und stellen Sie gegebenenfalls sicher, dass die Prothese entfernt wird. Husten Sie kräftig, um tiefen Atemwegsauswurf in einen Sputumbehälter (mindestens 0,6 ml) auszustoßen.
   2. Vermeiden Sie eine Kontamination mit Speichel oder Nasenausfluss. Wenn der Husten schwierig ist, verabreichen Sie eine 100 g/l NaCl-Lösung bei 45 °C, um den Abwurf zu erleichtern. Füllen Sie die Probe in einen sterilen, verschließbaren Behälter um.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Sputumproben morgens und vor der Einnahme von antibakteriellen Arzneimitteln entnommen werden.
2. Bronchialspülflüssigkeit (BLF)
   1. Führen Sie den Auffangkopf aus dem Nasenloch oder der Tracheostomiestelle (ca. 30 cm tief) in die Luftröhre ein. Injizieren Sie 5 mL Kochsalzlösung, stellen Sie einen Unterdruck her, drehen Sie den Kollektorkopf und ziehen Sie ihn langsam zurück.
   2. Sammeln Sie den extrahierten Schleim und spülen Sie den Sammler einmal mit einer Probenahmelösung (physiologische Kochsalzlösung oder steriles Wasser für Injektionszwecke). Alternativ können Sie einen pädiatrischen Harnkatheter an eine 50-ml-Spritze anschließen, um die Entnahme zu ersetzen.
3. Alveoläre Lavageflüssigkeit (ALF)
   1. Identifizieren Sie den Ort der Läsion durch bildgebende Untersuchungen des Brustkorbs. Wählen Sie den wichtigsten oder am schnellsten fortschreitenden Bereich für die Spülung aus.
   2. Während der Spülung werden 1-2 ml 2 % Lidocain durch den Biopsiekanal in das Bronchialsegment injiziert, wobei das lavierte Lungensegment¹⁵ örtlich betäubt wird. Bei Patienten unter intravenöser Vollnarkose, die immer noch starke Atemwegsreaktionen aufweisen, injizieren Sie 1-2 ml 2% Lidocain.
   3. Nach örtlicher Betäubung führen Sie ein faseroptisches Bronchoskop durch den Mund oder die Nase ein und gelangen über den Pharynx in den Bronchus des rechten Mittellappens oder das linguale Segment der linken Lunge. Platzieren Sie seine Spitze an der Öffnung des Bronchialams und führen Sie langsam sterile physiologische Kochsalzlösung ein.
   4. Verabreichen Sie 30-50 mL Kochsalzlösung pro Sitzung mit 100-250 mL Volumen (max. 300 mL). Sammeln Sie den extrahierten Schleim in einem verschlossenen sterilen Behälter.

2. DNA-Extraktion

1. Basierend auf der Viskosität von Proben der unteren Atemwege eine angemessene Menge von 10 % NaOH hinzufügen. Bei Proben mit niedriger Viskosität das 2-3-fache des Volumens der Probe der Verflüssigungslösung hinzufügen. Bei Proben mit mäßiger Viskosität das 5-6-fache des Volumens der Probe der Verflüssigungslösung hinzufügen. Bei Proben mit hoher Viskosität das 8-10-fache des Volumens der Probe der Verflüssigungslösung hinzufügen.
   1. Das Volumen von 10 % NaOH wird entsprechend der Viskosität der Probe angepasst. Die Proben werden mit einem Vortex-Mischer 15 s lang so gleichmäßig wie möglich dispergiert und 30 Minuten lang bei 37 °C zur Verflüssigung inkubiert.
      HINWEIS: Bei dickeren Proben ist das NaOH-Volumen zu erhöhen oder die Verflüssigungszeit zu verlängern. Die Verflüssigungsqualität der Proben hat direkten Einfluss auf die spätere Extraktionseffizienz. Im Idealfall sollten verflüssigte Proben eine gleichbleibende, nicht klebrige Konsistenz aufweisen.
2. Pipettieren Sie 1 ml der verflüssigten Probe in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Bei einer Drehzahl von 15.777 × g für 5 min bei 2-6 °C zentrifugieren, dann mit einer Pipette den Überstand entfernen und verwerfen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie beim Absaugen der Probe das Ziehen von Verunreinigungen vom Boden des Röhrchens. Wenn viele Verunreinigungen vorhanden sind, kann die Probe vor der Aspiration 1 min lang bei 1.753-2.739 × g zentrifugiert werden.
3. Geben Sie 1 ml Waschlösung in das Zentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es ein, um den Niederschlag vom Boden des Röhrchens anzuheben. Es besteht keine Notwendigkeit, es vollständig zu verteilen.
   1. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 15.777 × g für 5 Minuten, entsorgen Sie den Überstand und versuchen Sie, den Niederschlag nicht zu berühren.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Waschlösung gründlich entfernt wird, um eine Beeinträchtigung der nachfolgenden Verstärkung zu vermeiden.
4. Geben Sie 100 μl Nukleinsäure-Extraktionslösung in das Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Niederschlag zu aspirieren und gründlich zu mischen. Übertragen Sie die Flüssigkeit und den Niederschlag zusammen in ein Nukleinsäure-Extraktionsröhrchen. Die Zusammensetzung der Nukleinsäure-Extraktionslösung ist in Tabelle 1 dargestellt.
5. Legen Sie die Nukleinsäure-Extraktionsröhrchen in einen Vortex-Mischer und wirbeln Sie sie mindestens 5 Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit ein. Nach dem Vortexen die Nukleinsäure-Extraktionsröhrchen in ein Metallbad mit konstanter Temperatur überführen und 5 min lang auf 100 °C erhitzen.
6. Bei 15.777 × g bei 2-6 °C 5 min zentrifugieren und beiseite stellen.
   HINWEIS: Wenn die PCR-Amplifikationsreaktion innerhalb von 24 h durchgeführt wird, kann die Nukleinsäure bei 4 °C gelagert werden. Lagern Sie die Nukleinsäure nach der Amplifikation bei -20 °C. Für die Langzeitlagerung (über 24 h hinaus) die Nukleinsäure bei -20 °C lagern. Wenn die Probe wieder verwendet werden kann, tauen Sie sie auf natürliche Weise auf, wirbeln Sie sie zum Mischen ein, erhitzen Sie sie 5 Minuten lang in einem 95 °C heißen Wasserbad, zentrifugieren Sie sie 1 Minute lang bei 10.956 × g und verwenden Sie den Überstand für die PCR-Amplifikation.

Lösung	Komponenten	Zahl	Spezifikation
Waschlösung	10 mM EDTA	1 Flasche	24 mL/Flasche
Reagenz für die Nukleinsäure-Extraktion	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, Nukleinsäure-Konservierungsmittel	2 Röhren	1,2 mL/Flasche
Nukleinsäure-Extraktionsröhrchen	Glasperlen	1 Beutel	24 Flaschen/Beutel

Tabelle 1: Zusammensetzung des Nukleinsäure-Extraktionsreagenzes.

3. Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation und Mikrofluid-Chip

1. Reagenz und mikrofluidischer Chip
   1. Führen Sie isotherme Amplifikationsreaktionen auf einem mikrofluidischen scheibenförmigen Chip durch (siehe Materialtabelle). Führen Sie die Verstärkung bei konstanter Temperatur bei 65 °C durch.
   2. Durchführung einer Echtzeit-Fluoreszenzanalyse unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffeinbauverfahrens¹⁴ auf dem mikrofluidischen Chip-Nukleinsäureanalysator mit konstanter Temperaturamplifikation. Beobachten Sie eine S-förmige Amplifikationskurve für positive Proben unter Verwendung einer Polymerase mit Strangverdrängungsfunktion.
2. Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation
   1. Targeting von sechs Sequenzbereichen mit vier spezifischen Primern, darunter zwei innere Primer und zwei äußere Primer (im Lieferumfang des LAMP-Kits enthalten).
      HINWEIS: Die DNA wird kontinuierlich repliziert und bei konstanter Temperatur unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsfunktion amplifiziert. Der Reaktionsprozess umfasst die hantelförmige Matrizensynthesephase, die zyklische Amplifikationsphase, die Elongations- und die Recyclingphase, wodurch schließlich eine Mischung aus DNA-Fragmenten mit stängelschleifen- und blumenkohlähnlichen Strukturen gebildet wird. Detaillierte Informationen finden Sie in den Anweisungen des Kits (Ergänzende Datei 1).
   2. Fügen Sie dem Reaktionssystem Zwei-Schleifen-Primer hinzu, um die Reaktionseffizienz zu verbessern, die an die Stammschleifenstrukturen bindet und die Strangverdrängungssynthese und zyklische Replikation initiiert. Die Zusammensetzung des Nukleinsäure-Nachweiskits für Krankheitserreger der Atemwege ist in Tabelle 2 dargestellt.
      HINWEIS: Das Reagenzienkit verwendet die LAMP-Methode. Das Prinzip basiert auf dem dynamischen Gleichgewicht der DNA bei etwa 65 °C, wobei jeder Primer, der sich durch die Basenpaarung an der komplementären Stelle der doppelsträngigen DNA erstreckt, dazu führt, dass der andere Strang dissoziiert und ein Einzelstrang gebildet wird.
3. Mikrofluidischer Chip
   HINWEIS: Jeder mikrofluidische Chip (siehe Materialtabelle) ist mit 24 Reaktionsvertiefungen ausgestattet, die gegen den Uhrzeigersinn nummeriert sind, wobei der Einlass und Auslass für Vertiefung 1 der Reaktionsvertiefung 1 entspricht (Abbildung 2). Ein spezifischer Satz von Primern für die Amplifikation und den Nachweis einer bestimmten Nukleinsäure-Zielsequenz wird in jede Reaktionsvertiefung eingebettet und fixiert.
   1. Mischen Sie die DNA der Probe mit dem Amplifikationsreagenz. Injizieren Sie die Mischung in den Chip und verteilen Sie sie auf jede Reaktionsvertiefungszentrifuge bei 1.000 × g für 30 s bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Unabhängige isotherme Amplifikationsreaktionen und Echtzeit-Fluoreszenzdetektion treten in jeder Reaktionsvertiefung auf dem Chip auf. Wenn eine S-förmige Amplifikationskurve in einer bestimmten Reaktionsvertiefung nachgewiesen wird, ist der entsprechende Nachweisindex für diese Vertiefung positiv.

Komponenten	Zusammensetzung	Zahl
Chip	Zündkapseln	12 Plätze
Siegelfolie	/	1 Blatt
Reagenz für die isotherme Amplifikation	Fluoreszierender Farbstoff, Enzym	270 μL/Röhrchen
Positive Regelung	Genomische DNA von Escherichia coli	160 μL/Röhrchen

Tabelle 2: Zusammensetzung des Nukleinsäure-Nachweiskits für Krankheitserreger der Atemwege.

Abbildung 2: Strukturdiagramm des Scheibenchips. Die Reaktionsvertiefungen sind fortlaufend gegen den Uhrzeigersinn nummeriert, wobei der Einlass-/Auslassanschluss 1 der Reaktionsvertiefung Nummer 1 entspricht. Die Reaktionsvertiefungen 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 und 24 sind Negativkontrollen. Die Reaktionsvertiefung 6 ist eine Positivkontrolle (E. coli). Die Reaktionsvertiefung 12 ist eine interne Positivkontrolle, und die Reaktionsvertiefung 23 ist eine externe Positivkontrolle. Die Reaktionsvertiefung 2 weist spn nach. Die Reaktionsvertiefung 3 detektiert sau. Die Reaktionsvertiefung 5 weist MRSA nach. Die Reaktionsvertiefung 8 weist kpn nach. Die Reaktionsvertiefung 9 weist pae nach. Die Reaktionsvertiefung 11 weist aba nach. Die Reaktionsvertiefung 14 detektiert sma. Die Reaktionsvertiefung 15 detektiert hin. Bitte beachten Sie Tabelle 5 für Beispieldetails. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Probenvorbereitung und Bakteriennachweis

1. Bereiten Sie das isotherme Amplifikationsreaktionssystem vor
   1. Nehmen Sie das isotherme Amplifikationsreagenz aus dem Kit und lassen Sie es bei Raumtemperatur vollständig auftauen. Vorsichtig schütteln, um gründlich zu mischen, und kurz zentrifugieren, um sich am Boden des Röhrchens zu sammeln.
   2. Pipettieren Sie im Bereich der Lagerung und Vorbereitung des Reagenziens 20 μl des isothermen Amplifikationsreagenzes in ein vorbereitetes 200-μl-Zentrifugenröhrchen. Decken Sie das Röhrchen ab und bringen Sie es mit einem Zentrifugenröhrchen pro Probe in den Probenvorbereitungsbereich.
   3. Geben Sie im Probenvorbereitungsbereich 34,5 μl der Zielnukleinsäureprobe hinzu. Leicht schütteln, um gründlich zu mischen, und kurz zentrifugieren, um sich am Boden des Röhrchens zu sammeln. Das Gesamtvolumen jedes Nukleinsäureamplifikationsreaktionssystems beträgt 54,5 μl (Tabelle 3).
2. Verfahren zum Beladen der Späne
   1. Beschriften Sie auf der Chipverpackung die Probennummer. Öffnen Sie den Mikrofluidik-Chip mit dem Verpackungsetikett nach oben.
   2. Platzieren Sie den Chip mit den Ein- und Auslassanschlüssen nach oben. Ziehen Sie mit einer Pipette 50 μl des vorbereiteten Amplifikationsreaktionssystems und geben Sie es durch die Einlassöffnung in den Hauptkanal des Chips. Hören Sie auf, nachzufüllen, wenn der Hauptkanal gefüllt ist, und wischen Sie überschüssige Flüssigkeit um die Einlass- und Auslassöffnungen herum schnell mit fusselfreiem Tuch ab.
   3. Nehmen Sie mit einer Pinzette eine Dichtungsfolie auf und bedecken Sie sie mit den Ein- und Auslassöffnungen. Drücken Sie eine saubere Pipettenspitze in einer Richtung auf die Siegelfolie. Sorgen Sie für eine dichte Abdichtung.
3. qPCR-Reaktion
   1. Nachdem die Lichtquelle des Nukleinsäureanalysators das Vorheizen abgeschlossen hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Fach öffnen . Legen Sie den Chip mit der Vorderseite nach oben auf das Fach und stellen Sie sicher, dass der kleine Zylinder aus dem Mittelspalt des Späns herausragt, um ihn zu sichern. Richten Sie die mittlere Positioniervorrichtung im Fach an der großen zentralen Bohrung im Chip aus.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Fach schließen , um den Chip in den Nukleinsäureanalysator einzusetzen.
   3. Geben Sie im Bereich Probeninformationen auf der Nachweisschnittstelle die Informationen zum Testen der Probe ein. Probennummer, Chipnummer und Probentyp sind obligatorisch; andere sind optional.
   4. Klicken Sie im Operationsbereich auf die Schaltfläche Detektion starten , um die Probenerkennung zu starten. Das Gerät führt Stichprobentests gemäß dem voreingestellten Programm durch.
      HINWEIS: Nach Abschluss der Erkennung führt die zugehörige Software des Geräts automatisch eine Datenanalyse durch. Gleichzeitig leitet der Nukleinsäureanalysator einen automatischen Kühlprozess ein. Sobald die Temperatur auf 37 °C sinkt, öffnet das Gerät automatisch das Fach und wirft den Chip zur Entnahme aus. Die Ergebnisse werden vom System automatisch interpretiert (Tabelle 4).
4. Standards für die Qualitätskontrolle
   1. In diesem Reagenzienkit sind in jedem Chip eine positive und neun negative Qualitätskontrollen enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Nachweisergebnisse für die positive Qualitätskontrolle positiv sind und gleichzeitig die Ergebnisse für alle neun negativen Qualitätskontrollen negativ sind.
      HINWEIS: Die Ergebnisse werden auf der rechten Seite des Bildes mit dem Hinweis "Quality Control Results: Experiment Normal (Positive Normal, Negative Normal)" angezeigt, was darauf hinweist, dass die Testergebnisse gültig sind. Ein erneuter Test ist erforderlich, wenn ein Ergebnis falsch ist und das Probentestergebnis als ungültig erachtet wird. Eine positive interne Kontrolle mit humanspezifischen Primern ist in dem Chip eingeschlossen, deren Ergebnis für klinische Probentests positiv ist, während es negativ ist, wenn die Probe einen niedrigen Gehalt an humangenomischer DNA aufweist, was auf eine niedrigere Zellzahl hinweist. Sammeln Sie in solchen Fällen Proben erneut und testen Sie sie erneut.
5. Ergebnisermittlung
   1. Verwenden Sie nach Abschluss der Detektion die Maximalmethode der zweiten Ableitung in Kombination mit kommerziell geschützten Algorithmen in der Software, um den ersten Wendepunkt der S-förmigen Amplifikationskurve während der schnellen Amplifikationsphase zu berechnen. Einzelheiten sind im Abschnitt "Grundsätze des Tests" in den Anweisungen für das Nukleinsäure-Nachweiskit für Atemwegserreger (Ergänzende Datei 1) beschrieben.
      HINWEIS: Der TP-Wert ist die Zeitdifferenz zwischen dem Wendepunkt und dem Ursprung. Das Ergebnis wird auf der Grundlage der TP- und positiven Beurteilungswerte interpretiert. Wenn der TP-Wert für einen Erkennungsindex kleiner oder gleich dem positiven Beurteilungswert für diesen Index ist, wird er als positiv interpretiert. Wenn der TP-Wert den positiven Beurteilungswert übersteigt, wird er gemäß den Kriterien für "positiven Entscheidungswert" in der Anleitung als negativ interpretiert. Der "Fluoreszenzkurvenbereich" zeigt die normalisierte Kurve an, und der Bereich "Detektionsergebnis" zeigt die Qualitätskontroll- und Detektionsergebnisse für jeden Parameter an (Tabelle 5).

Reaktant	Volumen (μl)
Reagenz für die isotherme Amplifikation	20
Template-DNA	34.5

Tabelle 3: Isothermes Amplifikationsreaktionssystem.

Schritt	Eins	Zwei
Temperatur (°C)	37	65
Zeit (min)	3	47

Tabelle 4: Reaktionsprogramm der Nukleinsäureamplifikation.

Name des Indikators	Positiver Kontrollwert
Streptococcus pneumoniae (sp)	30
Staphylococcus aureus (sau)	34
Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (mrsa)	22
Klebsiella pneumoniae (kpn)	29
Pseudomonas aeruginosa (PAE)	36
Acinetobacter baumannii (aba)	36
Stenotrophomonas maltophilia (sma)	27
Haemophilus influenzae (hin)	36

Tabelle 5: Positiver Kontrollwert für den Infektionsindikator.

Ergebnisse

Bei diesem Experiment kommt eine isotherme Amplifikationstechnologie zum Einsatz, bei der Reaktionen auf einem mikrofluidischen Scheibenchip durchgeführt werden. Die Reaktion erfolgt auf einem mikrofluidischen Chip-Nukleinsäureanalysator unter Verwendung einer Fluoreszenzfarbstoff-Insertionsmethode. Die isotherme Reaktion wird bei einer konstanten Temperatur von 65 °C durchgeführt, gleichzeitig wird eine Echtzeit-Fluoreszenzanalyse durchgeführt. Positive Proben werden unter Einwirkung von Polymerase mit Kettenverdrängungsfunktionalität amplifiziert, was zu einer S-förmigen Amplifikationskurve führt. Dieser einstufige Prozess schließt die Amplifikation und den Nachweis des Zielgens ab. In dieser Studie wurden 7 Proben mit unterschiedlichen experimentellen Ergebnissen ausgewählt, um die Zuverlässigkeit des Versuchsdesigns zu demonstrieren. Der Großbuchstabe S steht für eine Stichprobe. S1 ist eine Probe, die mit einem einzigen Stamm von K. pneumoniae infiziert ist. S2 bis S7 sind Proben mit polymikrobiellen Infektionen, die alle mit K. pneumoniae infiziert sind. Für effektive Detektionsergebnisse kann die Interpretation über die normalisierten Fluoreszenzkurven erfolgen, die in den Bildern angezeigt werden. Ein positiver Indikator wird durch eine Verstärkungskurve mit einer S-Form dargestellt, während eine horizontale Linie einen negativen Indikator darstellt (Abbildung 3).

Abbildung 3: Repräsentative Nukleinsäure-Amplifikationsergebnisse über LAMP. Der Großbuchstabe S steht für Sample. S1 ist eine Probe, die mit einem einzigen KPN-Stamm infiziert ist. S2 bis S7 sind Proben mit polymikrobiellen Infektionen, die alle mit kpn infiziert sind. S2 stellt eine Probe dar, die mit kpn und sma infiziert ist. S3 bezeichnet eine Probe, die gleichzeitig mit kpn, sau und MRSA infiziert ist. S4 steht für eine Probe, die gleichzeitig mit kpn, sau, MRSA und aba infiziert ist. S5 zeigt eine Probe an, die gleichzeitig mit kpn, sma, sau, MRSA und aba infiziert ist. S6 bezeichnet eine Probe, die gleichzeitig mit kpn, sma, pae, sau, MRSA und aba infiziert ist. S7 stellt eine Probe dar, die gleichzeitig mit kpn, sma, pae, sau, MRSA, aba und E. coli infiziert ist. Bitte beachten Sie Tabelle 5 für Beispieldetails. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dieses Reagenzienkit verwendet die ROC-Methode, um positive Schwellenwerte für acht Testindikatoren zu berechnen. Wenn der TP-Wert eines Erkennungsindikators kleiner oder gleich dem entsprechenden positiven Schwellenwert ist, wird er als positiv interpretiert. Umgekehrt, wenn der TP-Wert eines Erkennungsindikators größer als sein positiver Schwellenwert ist, wird er als negativ interpretiert. Die positiven Schwellenwerte für die einzelnen Indikatoren sind in Tabelle 5 aufgeführt. Die richtig positiven TP-Werte, die wir für die 7 Proben mit unterschiedlichen experimentellen Ergebnissen nachgewiesen haben, sind in Tabelle 6 dargestellt.

PROBE	KPN	Sma	PAE	Sau	MRSA	hin	Aba	öko
	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)
S1	19.68 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S2	17.73 (+)	18.30 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S3	16.73 (+)	U (-)	U (-)	18.05 (+)	12.18 (+)	U (-)	U (-)	U (-)
S4	21.66 (+)	U (-)	U (-)	27.07 (+)	19.61 (+)	U (-)	18.29 (+)	U (-)
S5	16.16 (+)	20.85 (+)	U (-)	23.80 (+)	17.13 (+)	U (-)	15.22 (+)	U (-)
S6	11.20 (+)	16.79(+)	17.18(+)	23.09 (+)	16.14 (+)	U (-)	14.28 (+)	U (-)
S7	14.69 (+)	24.84(+)	19.70(+)	24.07(+)	14.16 (+)	- (+)	15.23 (+)	20.12 (+)
Jede Probe+/-, qualitatives Ergebnis; +, positives Ergebnis; -, negatives Ergebnis.

Tabelle 6: Tabelle der TP-Werte für den Nachweis nach einer Infektion.

Ergänzende Tabelle 1: Liste der Abkürzungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Anweisungen für Nukleinsäure-Nachweiskits für Atemwegserreger. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Atemwegsinfektionen sind weit verbreitete Krankenhausinfektionen, die schwerwiegende Folgen für die Patienten haben und die Sterblichkeitsraten in die Höhe treiben¹⁶. Die rechtzeitige und genaue Identifizierung potenzieller Krankheitserreger, gefolgt von wirksamen Antibiotika, ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Behandlung und einer Verbesserung der Prognose, insbesondere angesichts der Einschränkungen traditioneller Kulturmethoden¹⁷. In dieser Studie haben wir eine LAMP-basierte Methode zur Bestimmung einzelner oder mehrerer Infektionen für einen schnellen und präzisen Nachweis von RTIs verwendet. Dieses Schnelldetektionssystem wird durch die Kombination der LAMP-Technologie mit der Mikrofluidik-Technologie etabliert. Die Nukleinsäure aus klinischen Proben wie Sputum, BLF und ALF kann schnell extrahiert werden. Dieses extrahierte Material erleichtert den schnellen und präzisen Nachweis bakterieller Krankheitserreger und leitet die klinische Praxis für eine verbesserte Kontrolle und Behandlung von RTIs.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die LAMP-Ergebnisse im Vergleich zu kulturbasierten Methoden und Polymerase-Kettenreaktionen eine Sensitivität, Spezifität und keine Kreuzreaktion mit anderen Bakterien in Reinkulturen und Blutproben von 100 % erreichten¹⁸. LAMP-Assays können Krankheitserreger auch direkt aus biologischen Flüssigkeiten wie Blut, Pleura- und Bauchfellflüssigkeit sowie Liquor cerebrospinalis nachweisen¹⁹. Es wurde bereits gezeigt, dass exogene DNA und Inhibitoren die Sensitivität der PCR signifikant verringern können, und für LAMP-Assays ist eine Aufreinigung von DNA aus klinischen Proben nicht erforderlich²⁰. Bei dieser Technik werden Hefegene und Primer während des Amplifikationsprozesses verwendet, um die Normalität der Amplifikation zu beurteilen und so die Qualifikation der externen Qualitätskontrolle zu bestimmen. Interne Kontrollen, die Primer aus menschlichen Genen verwenden, bestimmen die Normalität der Probenahme, der Nukleinsäureextraktion und der Amplifikationsprozesse. Die gleichzeitige Nutzung von internen und externen Kontrollen gewährleistet die Zuverlässigkeit der Ergebnisse. Gleichzeitig werden auch mehrere positive und negative Kontrollbohrungen eingerichtet, was die Genauigkeit des Tests erheblich gewährleistet. Der mikrofluidische LAMP-Chip verfügt über ähnliche Fähigkeiten wie die qPCR beim Nachweis klinischer Proben. Es zeichnet sich durch eine hohe Empfindlichkeit und eine starke Nachweisfähigkeit aus und bietet eine zuverlässige Grundlage für einen schnellen klinischen Nachweis und eine präzise Behandlung²¹. Die mikrobielle Kultur dauert 3-5 Tage oder sogar länger, und einige Krankheitserreger, wie Chlamydia pneumoniae und Legionella pneumophila, können nicht kultiviert werden. Im Gegensatz dazu erkennt LAMP mehrere bakterielle Krankheitserreger, auch solche, die nicht kultiviert werden können, in weniger als 3 Stunden, was die Nachweisgeschwindigkeit erheblich erhöht.

Es können auch mehrere Erkennungen durchgeführt werden. Der LAMP-Mikrofluidik-Chip ist in verschiedene Reaktionseinheiten unterteilt, die mehrere Krankheitserreger parallel nachweisen, um die Unabhängigkeit jeder Reaktion und die Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten^22,23. Die Daten des China Network Antibacterial Surveillance Center zeigten, dass die Prävalenz von K. pneumoniae im Jahr 2022 an erster Stelle unter den Bakterienisolaten aus Atemwegsproben stand¹⁵. Unter den Atemwegsproben, die vom Volkskrankenhaus der Provinz Guangdong im Jahr 2022 gesammelt wurden, lag die Positivrate von K. pneumoniae, die vom LAMP getestet wurden, bei 18,6 %, was auch eines der Bakterien mit der höchsten Prävalenz ist. Von allen K. pneumoniae-positiven Proben waren 30,6 % Infektionen, die ausschließlich durch K. pneumoniae verursacht wurden, und 29,7 % Infektionen, bei denen K. pneumoniae mit anderen Bakterienarten koexistierte. Darüber hinaus gab es Dreifachinfektionen (23,9 %) und Vierfachinfektionen (10,5 %) mit K. pneumoniae-Infektionen, die mit etwa 95 % die Mehrheit der KP-positiven Proben ausmachten. Es gab nur sehr wenige Fälle von Fünffach- und Sechsfachinfektionen, und bis jetzt wurden keine Infektionen über das Sechsfache hinaus festgestellt. Die Ergebnisse zeigen sechs repräsentative Szenarien, die jeweils die Nachweisergebnisse von Infektionen repräsentieren, die allein durch K. pneumoniae oder durch die Koexistenz mit 1-5 anderen Bakterienarten verursacht werden.

Darüber hinaus kann die in dieser Studie verwendete LAMP-Chip-Technologie auch bakterielle Resistenzen nachweisen. Es weist Methicillin-resistente MRSA über das mecA-Gen nach. Wenn die Vertiefungen, die Staphylococcus aureus repräsentieren, und die Vertiefungen für das mecA-Gen positiv sind, stellen sie eine Methicillin-MRSA-Infektion dar. Die Forscher forschen kontinuierlich an Methoden, um gleichzeitig Krankheitserreger und Antibiotikaresistenzen schnell nachzuweisen. So basiert beispielsweise eine Schnelldiagnosemethode für Helicobacter-pylori-Infektionen und Antibiotikaresistenzen auf der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)²⁴. Ein weiterer Ansatz besteht in der schnellen Vorhersage multiresistenter K. pneumoniae durch Deep-Learning-Analyse von SERS-Spektren (surface-enhanced Raman scattering)²⁵ und einer Methode zum Nachweis von K . pneumoniae - und Carbapenemase-Genen unter Verwendung von SERS-Spektren²⁶. Darüber hinaus gibt es eine Klassifikations- und Vorhersagemethode für verschiedene MLST-Profile (Multi-Locus Sequence Typing) von K. pneumoniae-Stämmen , die auf der SERS-Spektrenanalyse^{basiert 27}. Wir werden in der Folge auch einen sensitiven und genauen Nachweis von K. pneumoniae und Carbapenemase-Genen entwickeln, dessen Leistung mit klinischen Goldstandardmethoden vergleichbar ist, die zeitaufwändig sind oder auf teuren Spezialinstrumenten basieren. Darüber hinaus ist der ideale diagnostische Ansatz schnell, genau, kostengünstig und benutzerfreundlich¹⁸. Eine Studie zur Schätzung der Kosten für Reagenzien für aktuelle Diagnosetechnologien zeigte, dass Probentests auf der Grundlage der PCR-Technologie bis zu 6,4 bis 7,7 US-Dollar kosten, verglichen mit nur 0,71 bis 2 US-Dollar für die LAMP-Technologie²⁸.

Die Mehrkanal-Schleifen-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) bietet zwar erhebliche Vorteile für den schnellen Nachweis bakterieller Krankheitserreger bei Atemwegsinfektionen, hat aber auch ihre Grenzen. Die hohe Empfindlichkeit von LAMP birgt das Risiko einer Kreuzkontamination, bei der eine minimale DNA-Kontamination zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann²⁹; Daher sind strenge Probenhandhabungs- und Verfahrensprotokolle erforderlich, um dieses Risiko zu mindern. Trotz der Einfachheit der Methode erfordert die Interpretation der Ergebnisse spezielles Fachwissen und Erfahrung, um Fehlinterpretationen oder Diagnosefehler zu vermeiden, was die Notwendigkeit eines gut ausgebildeten Personals unterstreicht. Das Erkennen dieser Einschränkungen ist essentiell für die effektive Anwendung und Weiterentwicklung der LAMP-Methode im Bereich der klinischen Diagnostik. Zusammengenommen kann die LAMP-Methode in Kombination mit einem mikrofluidischen Chip verschiedene bakterielle Krankheitserreger parallel schnell nachweisen. Es hat die Vorteile einer hohen Sensitivität und starken Spezifität sowie die Eigenschaften von niedrigen Kosten, Schnelligkeit und Bequemlichkeit. Es zeigt eine erhebliche praktische Bedeutung für die Prävention und Kontrolle von RTIs, die durch pathogene Infektionen im klinischen Umfeld verursacht werden. Das wesentliche Merkmal des in dieser Studie vorgeschlagenen LAMP-Tests besteht darin, dass er für das Laborpersonal leicht zu beherrschen ist, was für Primärkrankenhäuser, Krankheitsprävention, Kontrollzentren sowie Inspektions- und Quarantäneabteilungen eine große Hilfe ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das LAMP-Mikrofluidik-Chip-System ein leistungsstarkes Detektionswerkzeug in klinischen Laboren ist, das die Herausforderungen bei hohen Kosten und geringer Durchlaufzeit in der klinischen Infektionsdiagnose lösen kann und einen signifikanten Anwendungswert im klinischen Umfeld hat.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Badeinkubator (MK2000-2)	ALLSHENG		Sorgen Sie für eine konstante Temperaturumgebung
Bronchialspülflüssigkeitssammelkopf	TIANPINGHUACHANG	SEDA 20172081375	Sammeln von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit
Faseroptisches Bronchoskop	OLYMPUS	SEDA 20153062703	Ein flexibles Bronchoskop, das mit einer faseroptischen Lichtquelle und einer Kamera ausgestattet ist, um die Atemwege und Strukturen in der Lunge visuell zu untersuchen. Unterstützung beim Sammeln der bronchoalveolären Lavage
HR1500-B2	Haier	SEDA 20183541642	Biosicherheitswerkbank
NAOH	MACKLIN	S817977	Verflüssigte viskose Probe der unteren Atemwege
Nukleinsäure-Nachweiskit für Krankheitserreger der Atemwege	Capitalbio Technology	SEDA 20173401346	Test auf Bakterieninfektion
Nukleinsäure-Extraktionsreagenz	Capitalbio Technology	SEDA 20160034	für DNA Extraktion
RTisochip-W	Capitalbio Technology	SEDA 20193220539	Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation
THERMO ST16R	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20180585	Zentrifugieren Sie die Restflüssigkeit von der Wand des Röhrchens.
Vortex-Mischer VM-5005	JOANLAB		Zum Mischen von Reagenzien