Methodenartikel

Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila

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DOI:

10.3791/66679

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7. Juni 2024

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1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 4Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.

Zusammenfassung

Die Transgenese in Drosophila ist ein wesentlicher Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion auf der Ebene des Organismus. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein entscheidender Schritt für die Konstruktion transgener Fliegen. Für die Mikroinjektion sind einige Arten von Geräten erforderlich, darunter ein Mikroinjektor, ein Mikromanipulator, ein inverses Mikroskop und ein Stereomikroskop. Plasmide, die mit einem Plasmid-Miniprep-Kit isoliert wurden, sind für die Mikroinjektion qualifiziert. Embryonen im Prä-Blastoderm- oder Synzytial-Blastoderm-Stadium, bei denen sich die Zellkerne ein gemeinsames Zytoplasma teilen, werden einer Mikroinjektion unterzogen. Ein Zellsieb erleichtert den Prozess der Dechorionisierung von Embryonen. Der optimale Zeitpunkt für die Dechorionierung und Austrocknung von Embryonen muss experimentell bestimmt werden. Um die Effizienz der Mikroinjektion von Embryonen zu erhöhen, müssen die mit einem Abzieher vorbereiteten Nadeln mit einem Nadelschleifer abgeschrägt werden. Beim Schleifen von Nadeln verwenden wir eine Fußluftpumpe mit Manometer, um die Kapillarwirkung der Nadelspitze zu vermeiden. Wir injizieren routinemäßig 120-140 Embryonen für jedes Plasmid und erhalten mindestens eine transgene Linie für etwa 85% der Plasmide. Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vor.

Einleitung

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist äußerst empfänglich für genetische Manipulationen und genetische Analysen. Transgene Fruchtfliegen sind in der biologischen Forschung weit verbreitet. Seit ihrer Entwicklung in den frühen 1980er Jahren ist die P-Element-Transposon-vermittelte Transgenese für die Drosophila-Forschung unverzichtbar1. In einigen Szenarien wurden auch andere Transposons wie piggyBac und Minos für die Transgenese in Drosophila verwendet2. Transgene über Transposons werden zufällig in das Drosophila-Genom eingefügt, und die Expressionsniveaus von Transgenen an verschiedenen genomischen Loci können aufgrund von Positionseffekten variieren und können daher nicht verglichen werden2. Diese Nachteile wurden durch die phiC31-vermittelte ortsspezifische Transgeneseüberwunden 3. Das Bakteriophagen-Gen phiC31 kodiert für eine Integrase, die die sequenzspezifische Rekombination zwischen den attB- und attP-Stellen in Drosophila3 vermittelt. Viele attP-Andockstellen wurden charakterisiert und sind im Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9 verfügbar.

Das phiC31-Transgenese-System für Drosophila wird von der Fliegengemeinschaft in großem Umfang eingesetzt. Unter den attP-Andockstellen sind attP18 auf dem X-Chromosom, attP40 auf dem zweiten Chromosom und attP2 auf dem dritten Chromosom in der Regel die bevorzugten Stellen für die Transgenintegration auf jedem Chromosom, da Transgene an den drei Stellen ein hohes Maß an induzierbarer Expression aufweisen, während sie ein geringes Maß an basaler Expression aufweisen5. Kürzlich fanden van der Graaf und Kollegen jedoch heraus, dass die attP40-Stelle in der Nähe des Msp300-Genlocus und an attP40 integrierte Transgene in Drosophila10 eine nukleare Clusterbildung der Larvenmuskulatur verursachen. In einer anderen aktuellen Studie fanden Duan und Kollegen heraus, dass das homozygote attP40-Chromosom die normale glomeruläre Organisation der Or47b-Geruchsrezeptor-Neuronenklasse in Drosophilastört 11. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei der Planung von Experimenten und der Interpretation von Daten strenge Kontrollen einbezogen werden sollten.

Drosophila ist aufgrund seines kurzen Lebenszyklus, seiner geringen Kosten und seiner einfachen Wartung ein idealer Modellorganismus für die In-vivo-Abfrage der Genfunktion. Das genomweite genetische Screening beruht auf dem Aufbau genomweiter transgener Bibliotheken in Drosophila 12,13,14,15. Wir haben zuvor 5551 UAS-cDNA/ORF-Konstrukte basierend auf dem binären GAL4/Upstream Activating Sequence (GAL4/UAS)-System generiert, das 83% der Drosophila-Gene abdeckt, die beim Menschen in der Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16 konserviert sind. Die UAS-cDNA/ORF-Plasmide können für die Erstellung einer transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila verwendet werden. Die effiziente Mikroinjektionstechnologie für Embryonen kann die Erstellung transgener Fliegenbibliotheken beschleunigen.

Bei der Mikroinjektion von Embryonen wird die Nadelspitze normalerweise gegen ein Deckglasgebrochen 17. Dadurch verstopfen häufig die Nadeln oder verursachen das Austreten großer Mengen an Zytoplasma, und wenn diese Probleme auftreten, müssen neue Nadeln verwendet werden. Obwohl das Anfasen von Nadeln die Effizienz der Mikroinjektion verbessern kann, gelangt die Schleiflösung während des Schleifvorgangs in die abgeschrägte Spitze. Die Mahllösung in der abgeschrägten Spitze verdunstet nicht schnell auf natürliche Weise; Daher können Nadeln nicht direkt nach dem Anfasen für die Mikroinjektion verwendet werden. Diese Faktoren verringern die Effizienz von Mikroinjektionsverfahren für Embryonen. Am Beispiel der phiC31-vermittelten ortsspezifischen Transgenese in Drosophila wird ein Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vorgestellt. Um zu verhindern, dass die Schleiflösung in die Nadel eindringt, verwenden wir eine Luftpumpe, die Luftdruck in der Nadel ausübt und so verhindert, dass die Schleiflösung in die abgeschrägte Spitze eindringt. Abgeschrägte Nadeln sind direkt nach dem Anfasen bereit für die Probenbeladung und Mikroinjektion.

Protokoll

1. Herstellung von Plasmiden

  1. Isolieren Sie Plasmide aus 4-ml-Bakterienkulturen über Nacht mit einem Plasmid-Miniprep-Kit. Eluieren Sie mit 40 μl Elutionspuffer.
    HINWEIS: Die Isolierung von Plasmiden mit einem Plasmid-Midi-Prep-Kit ist nicht erforderlich. Ein Plasmid-Miniprep-Kit kann die experimentellen Anforderungen für die Mikroinjektion von Embryonen vollständig erfüllen. In diesem Protokoll enthalten die präparierten UAS-cDNA/ORF-Plasmide zehn Kopien von UAS, einen Hsp70-Minimalpromotor, eine attB-Stelle, ein mini-weißes Gen und ein Gen von Interesse.
  2. Bestimmen Sie die Plasmid-DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und lagern Sie es bei -80 °C im Gefrierschrank.
    HINWEIS: Die Plasmidkonzentration ist für eine erfolgreiche Mikroinjektion des Embryos nicht entscheidend, da Plasmidkonzentrationen im Bereich von 20 ng/μl bis 1683 ng/μl gut für die Transgenese in Drosophila geeignet sind (Ergänzende Tabelle 1).
  3. Kurz vor der Mikroinjektion die Plasmide auftauen und bei 13000 x g für 5 min zentrifugieren.
  4. Übertragen Sie 10 μl jedes Plasmids aus der oberen Schicht der Flüssigkeit in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.

2. Nadeln ziehen

  1. Schalten Sie einen Nadelabzieher mit ausgewählten Einstellungen ein (Hitze: 500, Zug: 50, Vel: 60, Verzögerung: 90, Druck: 200, Rampentest: 510).
  2. Führen Sie eine Kapillare aus Borosilikatglas (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,75 mm, 10 cm Länge) in den Nadelabzieher ein und schließen Sie den Deckel.
  3. Drücken Sie die Pull-Taste . Jede Glaskapillare bildet zwei Nadeln.

3. Schleifnadeln (Abbildung 1)

  1. Verwenden Sie einen Nadelschleifer, der mit einer geeigneten Schleifplatte (für Spitzengrößen von 0,7-2,0 μm) eines Nadelschleifers montiert ist.
  2. Befeuchten Sie das Tuch (Referenzdraht) mit Schleiflösung (100 mL destilliertes Wasser mit 0,9 g NaCl, 1 mL Netzmittel) und fixieren Sie das Tuch.
  3. Schalten Sie den Nadelschleifer ein und drehen Sie die Schleifplatte weiter.
  4. Verbinden Sie eine Nadel mit einem Manometer über einen Silikonkapillarschlauch mit einer Fußluftpumpe und montieren Sie die Nadel dann auf einen Nadelhalter des Nadelschleifers. Stellen Sie den Winkel der Nadel relativ zur Schleifplatte auf 35° ein (Abbildung 1A, B).
  5. Stellen Sie die Position der Nadelspitze direkt über der Oberfläche der Schleifplatte ein, indem Sie einen groben Bedienknopf unter dem Mikroskop verwenden (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Die in Abschnitt 2 erhaltenen gezogenen Nadeln haben eine Verjüngung von 6-8 mm und eine Spitze von weniger als 1 μm (Abbildung 1D), wie in der Bedienungsanleitung des Abziehers beschrieben.
  6. Halten Sie den Innendruck der Nadel mit der Fußluftpumpe bei 40 psi. Stellen Sie die Position der Nadelspitze mit einem feinen Drehknopf unter dem Mikroskop ein und lassen Sie die Spitze der Nadel die Schleifplatte berühren.
  7. 3-5 s mahlen. Wenn winzige Luftblasen aus der Nadelspitze austreten, entladen Sie die Nadel (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Während des Schleifvorgangs verhindert die Verwendung einer Luftpumpe, dass die Schleiflösung abgesaugt wird.
  8. Lege die gemahlenen Nadeln in einen Aufbewahrungskoffer.
    HINWEIS: Verwenden Sie so oft wie möglich frisch gemahlene Nadeln, obwohl die gemahlenen Nadeln vor der Mikroinjektion mindestens einige Wochen in einem Aufbewahrungsbehälter aufbewahrt werden können.

4. Vorbereiten von Pipetten zum Laden von Plasmiden

  1. Eine 200-μl-Pipette mit der äußeren Flamme eines Alkoholbrenners erhitzen.
  2. Sobald es zu schmelzen beginnt, dehnen Sie die Pipette.
  3. Schneiden Sie das versiegelte Ende der gedehnten Pipette mit einer Schere ab, und die gedehnte Pipette ist dann bereit, die DNA in eine gemahlene Nadel zu laden.
    HINWEIS: Alternativ sind extrem lange und feine Spitzen zum Befüllen von geschliffenen Nadeln im Handel erhältlich.
  4. Legen Sie diese Pipetten in eine autoklavierte Kunststoffbox.

5. Entnahme von Embryonen

  1. Fliegen (vas-phiC31; + ; attP2), die phiC31-Integrase exprimieren und 3 Tage nach dem Schlüpfen die attP2-Andockstelle tragen, werden aus 50 Fläschchen gesammelt und in einen Käfig (φ 90 mm x 150 mm) gebracht. Gib etwas frische Hefepaste in die Mitte jeder Trauben-Agar-Platte18.
  2. Bereiten Sie 2-4 Käfige mit Fliegen vor. Halten Sie die Käfige und Platten bei 25 °C und wechseln Sie die Platten täglich für 2-4 Tage.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde das vas-phiC31-Transgen (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) auf dem ersten Chromosom und das attP2-Transgen (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) auf dem dritten Chromosom kombiniert. Der resultierende Stamm (vas-phiC31; + ; attP2) wird in diesem Protokoll verwendet. Hefepaste muss täglich zubereitet werden, und frische Hefepaste muss an die Fliegen verfüttert werden. Die ersetzten Käfige müssen gereinigt und getrocknet werden, um die verbleibenden Embryonen in den Käfigen zu entfernen.
  3. Wechseln Sie am Tag der Mikroinjektion die Käfige und Platten am Morgen. Wechseln Sie dann alle 30 Minuten die Platten und entnehmen Sie Embryonen von diesen Platten. Wechseln Sie alle Käfige und Platten bei Raumtemperatur (RT) und halten Sie die Käfige und Platten anschließend bei 25 °C.
    HINWEIS: Einige Protokolle bevorzugen es, die Käfige und Platten für die Eiablage bei 18 °C zu inkubieren. Das hängt von der Anzahl der Embryonen ab, die man für die Mikroinjektion benötigt.

6. Dechorionierung von Embryonen

  1. Bereiten Sie 30 % Bleichmittel vor, indem Sie 60 ml Bleichmittel (mit einem Gehalt an aktivem Chlor von 34-46 g/l) und 140 ml doppelt destilliertes Wasser mischen.
  2. Entfernen Sie die restlichen Fliegen auf den Traubensaft-Agarplatten mit einer Bürste oder Pinzette und spülen Sie die Embryonen in ein Zellsieb mit doppelt destilliertem Wasser.
  3. Trocknen Sie das Zellsieb mit den Embryonen mit Seidenpapier ab.
  4. Geben Sie es in eine Petrischale mit 30 % Bleiche und schwenken Sie das Zellsieb von Hand oder einem horizontalen Shaker 1,5 Minuten lang bei 60 U/min.
    HINWEIS: Das Spülen ist ein kritischer Schritt. Wenn die Spülzeit nicht lang genug ist, löst sich die Hülle eines Embryos nicht vollständig. Wenn die Spülzeit zu lang ist, wird der Embryo weich und bricht leicht. Das Zellsieb sollte vollständig in das 30%ige Bleichmittel getaucht werden. Tragen Sie ein Paar Gummihandschuhe und einen Laborkittel, um Verletzungen durch Bleichmittel zu vermeiden.
  5. Spülen Sie die Embryonen 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser, das in einer Labor-Plastikwaschflasche aufbewahrt wird, um die Bleichmittelreste zu entfernen. Wählen Sie die schwimmenden Embryonen für die Aufstellung aus.

7. Embryonen aneinanderreihen

  1. Den festen Traubensaft-Agar mit einer Klinge in lange Streifen schneiden.
    HINWEIS: Verwenden Sie violetten Traubensaft, um das Aneinanderreihen weißer Embryonen zu erleichtern.
  2. Übertragen Sie die Embryonen mit einem Pinsel auf einen langen Streifen.
  3. Richten Sie etwa 60 Embryonen mit einer Präpariernadel entlang des Randes eines langen Streifens aus, wobei ihr Hinterteil zur Außenseite des Streifens zeigt. Stellen Sie etwa 60 Embryonen innerhalb von 5 Minuten auf.
    HINWEIS: Die Mikropyle ist ein kegelförmiger Vorsprung am vorderen Pol des Embryos, durch den das Sperma eintritt, um die Eizelle zu befruchten (Abbildung 2A). Anhand des kegelförmigen Vorsprungs am vorderen Pol des Embryos ist es daher einfach, den hinteren Teil des dechorionierten Embryos zu bestimmen.
  4. Legen Sie ein doppelseitiges Klebeband von 18 mm in Längsrichtung entlang der Kante eines Deckglases (18 mm x 18 mm) und entfernen Sie die Papierunterlage. Drücken Sie das Deckglas vorsichtig auf die ausgerichteten Embryonen. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen in der Mitte des Klebebandes festgeklebt sind.

8. Austrocknen von Embryonen

  1. Legen Sie das Deckglas mit den aufgereihten Embryonen in eine Schachtel mit Trockenmittel. Die Trocknungszeit variiert je nach Temperatur und Luftfeuchtigkeit.
    HINWEIS: Die Trocknungszeit ist für die Mikroinjektion entscheidend und muss experimentell bestimmt werden. Die Trocknungszeit beträgt in der Regel 9-10 min im Sommer und 17-18 min im Winter.
  2. Bedecken Sie die Embryonen mit Halogenkohlenwasserstofföl.
    HINWEIS: Tropfen Sie nicht zu viel Öl auf die Embryonen, da das überschüssige Öl den Klebstoff überlaufen lassen kann. Das Volumenverhältnis von Halogenkohlenwasserstofföl 700 und Halogenkohlenwasserstofföl 27 beträgt 1:3.

9. Mikroinjektion von Embryonen

  1. Laden Sie 2 μl DNA mit der gedehnten Pipette in die Nadel. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen in der Nadel befinden. Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter des Mikromanipulators ein.
  2. Legen Sie die ausgerichteten Embryonen, die mit Halogenkohlenwasserstofföl bedeckt sind, unter ein inverses Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die hinteren Enden der Embryonen zur Nadel zeigen.
  3. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel in die Nähe der Embryonen zu bringen. Säubern Sie die Nadel. Stellen Sie sicher, dass ein Tropfen Flüssigkeit, der aus der Nadel austritt, sichtbar ist. Ausgehend von 300 hPa Einspritzdruck und 20 hPa Gleichgewichtsdruck den Einspritzdruck und den Gleichgewichtsdruck anpassen, um die optimale Größe des Flüssigkeitstropfens zu gewährleisten.
  4. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel in die hinteren Enden der Embryonen einzuführen, und verwenden Sie den Fußschalter, der mit dem Mikroinjektor verbunden ist, um die DNA zu injizieren (Abbildung 2). Ist ein kleiner Halo sichtbar, wird die DNA erfolgreich in den Embryo injiziert.
    HINWEIS: Wählen Sie die mehrkernigen Embryonen für die Injektion aus und töten Sie die älteren Embryonen mit der Schaltfläche "Reinigen". Wenn nach der Injektion eine große Menge Zytoplasma austritt, werden die Embryonen untergetrocknet. Wenn nach der Injektion nur eine geringe oder keine Menge Zytoplasma austritt, gelten Injektionen als erfolgreich. Wenn mehr als ein Drittel der Embryonen nach der Injektion Zytoplasma austritt, verlängern Sie die Trocknungszeit um 1-2 Minuten. Wenn mehr als ein Drittel der Embryonen übergetrocknet sind, verkürzen Sie die Trocknungszeit um 1-2 Minuten.
  5. Entferne die Nadel aus dem Embryo. Bewegen Sie die Nadel zum hinteren Ende des nächsten Embryos. Wiederholen Sie die obigen Schritte.
  6. Legen Sie die injizierten Embryonen in eine Agarplatte. Stellen Sie die Platte in einen Raum mit 18-20 °C. Am nächsten Tag stellen Sie die Platte bei einer Temperatur von 25 °Cund einer Luftfeuchtigkeit von 50%-60% in einen Inkubator und inkubieren Sie sie 1 Tag lang.
    HINWEIS: Halten Sie die Embryonen nach der Injektion bei einer Temperatur von 18-20 °C, um ihre Entwicklung zu verlangsamen, die Integration von Plasmid-DNA in das Drosophila-Genom zu erleichtern und die Überlebensrate der injizierten Embryonen zu erhöhen.

10. Larven sammeln

  1. Verwenden Sie eine Präpariernadel, um das Essen in einem Fläschchen abzukratzen und zu lösen. Versorgen Sie die Lebensmittel mit ein paar Tropfen destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Lassen Sie das destillierte Wasser in das Futter aufnehmen, um ein Ertrinken der Larven zu verhindern.
  2. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator.
  3. Sammeln Sie die geschlüpften Larven mit einem Pinsel unter einem Stereomikroskop und übertragen Sie sie in das Fläschchen.
  4. Stellen Sie das Fläschchen bei einer Temperatur von 25 °Cund einer Luftfeuchtigkeit von50%-60% in einen Inkubator.

11. Gewinnung transgener Fliegen

  1. Sammeln Sie die geschlüpften Fliegen, nachdem das Fläschchen 10 Tage lang bei 25 °Cinkubiert wurde.
  2. Kreuzen Sie eine einzelne männliche Fliege mit drei jungfräulichen weiblichen Fliegen der TM2/TM6C Sb1 Tb1 Balancer und kreuzen Sie eine einzelne weibliche Fliege mit drei männlichen Fliegen der TM2/TM6C Sb1 Tb1 Balancer.
  3. Legen Sie die Kreuze bei einer Temperatur von 25 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50%-60% in einen Inkubator.
  4. Untersuchen Sie die Nachkommen auf Fliegen mit orangefarbenen Augen. Dies sind die transgenen Fliegen (Abbildung 3A-C).
    HINWEIS: Fliegen, die eine Kopie des Transgens an der attP2-Andockstelle tragen, haben orangefarbene Augen.
  5. Kreuzen Sie eine einzelne orangeäugige männliche Fliege mit drei jungfräulichen weiblichen Fliegen der TM2/TM6C Sb1 Tb1 Balancer, um einen Bestand anzulegen.
    HINWEIS: Es müssen mehr als eine Generation von Kreuzungen eingerichtet werden, um das phiC31-Transgen auf dem ersten Chromosom durchzustreichen.

Ergebnisse

Die Spitze einer Injektionsnadel wird von einem Nadelschleifer abgeschrägt (Abbildung 1). Man kann 50-60 Nadeln in einer Stunde abschrägen. DNA wird im Prä-Blastoderm- oder Synzytial-Blastoderm-Stadium, wo sich die Zellkerne ein gemeinsames Zytoplasma teilen, in den hinteren Teil eines Embryos mikroinjiziert (Abbildung 2A). Der hintere Teil eines Embryos kann anhand der Mikropyle am vorderen Teil des Embryos leicht lokalisiert werden (Abbildung 2A). Embryonen im zellulären Blastoderm- und Gastrulationsstadium können nicht für die Injektion verwendet werden, da jeder Zellkern in diesen Stadien von einer Zellmembran umgeben ist und daher die Chance, transgene Fliegen zu erhalten, nahezu Null ist (Abbildung 2B). Übergetrocknete Embryonen werden bei der Punktion deformiert und können nicht für Mikroinjektionen verwendet werden (Abbildung 2C). Untergetrocknete Embryonen können eine große Menge Zytoplasma extrudieren, wenn sie mit der Nadel gestochen werden (Abbildung 2D), was zu einer geringeren Überlebensrate der Embryonen führt. Bei Embryonen, die angemessen getrocknet werden, kann bei der Injektion eine kleine Menge Zytoplasma austreten (Abbildung 2E).

Die Drosophila-Linie , die die phiC31-Integrase exprimiert und die attP2-Andockstelle trägt, die in diesem Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen verwendet wird, hat weiße Augen (Abbildung 3A), und die gealterten Fliegen dieses Genotyps haben rosa Augen, die auf akkumuliertes rotes fluoreszierendes Protein zurückzuführen sind, das spezifisch im Auge exprimiert wird (Abbildung 3B). Wir verwenden das Mini-White-Gen als selektiven Marker für die Transgenese in Drosophila, und transgene Fliegen werden anhand der Augenfarbe von hellgelb bis rot identifiziert. Transgene Fliegen, die ein Transgen an der attP2-Andockstelle tragen, haben orangefarbene Augen (Abbildung 3C), die man leicht an Fliegen erkennen kann, die keine Transgene tragen.

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Abbildung 1: Schleifen der Nadeln. (A) Eine Fußluftpumpe mit Manometer wird verwendet, um Luftdruck auf die Nadel auszuüben. (B) Eine Nadel wird in einem Winkel von 35° zur Oberfläche einer Schleifplatte auf einer Nadelschleifmaschine montiert. (C) Verwenden Sie einen groben Einstellknopf, um die Nadelspitze knapp über der Oberfläche der Schleifplatte zu positionieren, und verwenden Sie dann einen Feineinstellknopf, um mit dem Abschrägen der Spitze zu beginnen. (D) Die Spitze einer gezogenen Nadel befindet sich unter einem Mikroskop. Maßstabsbalken = 10 μm. (E) Eine abgeschrägte Nadel befindet sich unter einem Mikroskop. Die abgeschrägte Spitze der Nadel ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Drosophila-Embryonen , die für die Mikroinjektion geeignet sind. (A) Ein Drosophila-Embryo im Prä-Blastoderm- oder Synzytial-Blastoderm-Stadium kann in den hinteren Pol des Embryos injiziert werden, der durch eine rote Ellipse gekennzeichnet ist. Die Mikropyle am vorderen Pol des Embryos ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. (B) Ein Drosophila-Embryo im zellulären Blastodermstadium kann nicht für die Mikroinjektion verwendet werden. (C) Ein Embryo, der übertrocknet ist, sieht deformiert aus. (D) Eine unzureichende Austrocknung eines Embryos führt nach der Injektion zu einer großen Menge an zytoplasmatischen Leckagen. (E) Für eine erfolgreiche Injektion kann eine kleine Menge Zytoplasma austreten. Maßstabsleisten = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Augenfarbe von transgenen Drosophila , die ein Transgen an der attP2-Andockstelle tragen. (A) Die attP2-Injektionsleitung, die die phiC31-Integrase (vas-phiC31; + ; attP2) exprimiert, hat ein weißes Auge. RFP, das spezifisch im Auge exprimiert wird, wird als selektiver Marker für das phiC31-Transgen verwendet. (B) Die gealterte attP2-Injektionsleitung, die phiC31-Integrase exprimiert, weist ein rosa Auge auf, das auf das akkumulierte RFP-Protein im Auge zurückzuführen ist. (C) Fliegen, die ein Transgen tragen, das in die attP2-Andockstelle integriert ist, haben ein orangefarbenes Auge. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Transgenese in Drosophila als Ergebnis der Mikroinjektion von 100 verschiedenen Plasmiden im Embryo. Insgesamt wurden 100 verschiedene Plasmide mit unterschiedlichen Konzentrationen von 20 ng/μl bis 1683 ng/μl in Embryonen injiziert, und für 85 der 100 Plasmide wurden transgene Fliegen gewonnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Wirksamkeit der Mikroinjektion von Embryonen für die Transgenese bei Drosophila. Insgesamt wurden 120 verschiedene Plasmide in Embryonen injiziert, und für 101 der 120 Plasmide wurden transgene Fliegen gewonnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila vor. Für die phiC31-vermittelte ortsspezifische Transgenese injizierten wir 120-140 Embryonen für jedes Plasmid und erhielten mindestens eine transgene Linie für etwa 85% der Plasmide (Ergänzende Tabelle 2). Unserer Erfahrung nach ist Plasmid-DNA, die mit einem Plasmid-Miniprep-Kit isoliert wurde, für die Transgenese in Drosophila ausreichend. Plasmid-DNA-Konzentrationen von 20 ng/μl bis 1683 ng/μl haben möglicherweise keinen offensichtlichen Einfluss auf die Erfolgsrate der Transgenese, da die meisten von ihnen transgene Fliegen produzieren können (Ergänzende Tabelle 1).

Die Vorbereitung von Injektionsnadeln ist entscheidend für eine effiziente Mikroinjektion von Embryonen. Eine Injektionsnadel wird geschlossen, nachdem sie von einem Nadelabzieher gezogen wurde. Bei der routinemäßigen phiC31-vermittelten Transgenese bei Drosophila wird die Spitze einer Nadel in der Regel durch ein Deckglasdurchbrochen 17. Die zufällig zerbrochenen Nadeln sind jedoch oft nicht gut für die Mikroinjektion von Embryonen geeignet, da sie verstopfen oder zum Austreten einer großen Menge Zytoplasma führen können und daher während der Injektion durch eine neue ersetzt werden müssen. Injektionsnadeln, deren Spitzen von einer Schleifmaschine abgeschrägt werden, werden in der Regel nicht blockiert oder lösen keine großen zytoplasmatischen Leckagen aus, was die Häufigkeit des Nadelwechsels verringert. Wir haben festgestellt, dass die Schleiflösung in die abgeschrägte Spitze einer Nadel eindringen kann, sobald die Spitze während des Schleifens geöffnet ist. Sobald sie in die Nadel gelangt, trocknet die Schleiflösung nicht schnell auf natürliche Weise aus. Um ein Absaugen der Mahllösung zu verhindern, verbinden wir eine Injektionsnadel mit einer Fußluftpumpe mit Manometer. Beim Schleifen der Nadelspitze verwenden wir die Luftpumpe, um Luftdruck auf die Nadel auszuüben, wodurch verhindert wird, dass die Schleiflösung in die abgeschrägte Spitze eindringt, so dass die abgeschrägte Nadel sofort verwendet werden kann. Zusammen mit dem Manometer sollte die Fußluftpumpe mit dem Manometer dazu beitragen, die Transgenese in Drosophila zu beschleunigen, insbesondere bei einer großen Anzahl von Plasmiden.

Die Identifizierung von Embryonen im Prä-Blastoderm- oder Synzytial-Blastoderm-Stadium ist für die Mikroinjektion von entscheidenderBedeutung 19,20, da die Injektion von Embryonen in späteren Stadien kaum transgene Fliegen produziert. Fliegen, die weniger als 10 Tage alt sind, werden für die Eiablage verwendet, da sie tendenziell mehr Eier legen als ältere. Bei der Dechorionierung von Embryonen wird ein Zellsieb verwendet, um die Bleichbehandlung und das Spülen der Embryonen mit doppeltem destilliertem Wasser zu vereinfachen. Nach dem Spülen des Embryos zeigen die schwimmenden Embryonen an, dass die Eierschalen gut behandelt wurden und für die anschließende Mikroinjektion verwendet werden können. Sowohl die Dechorionierungs- als auch die Trocknungszeit von Embryonen sind entscheidend für die Mikroinjektion und sollten experimentell optimiert werden, da eine längere Dechorionierungs- oder Trocknungszeit die Embryonen töten kann. Die Dechorionierungs- und Trocknungszeit wird durch die Temperatur und Luftfeuchtigkeit beeinflusst, die von Ort zu Ort und von Zeit zu Zeit variieren und sollte entsprechend der embryonalen Schlupfrate angepasst werden.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Arbeit wurde vom Scientific Research Fund for High-Level Talents der University of South China unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 μ m Cell StrainerNEST258367
3M doppelseitig klebend3M415
BorosilikatglasSUTTERB100-75-10
Diamant-SchleifplatteSUTTER104E
FLAMING/BROWN Mikropipette AbzieherSUTTERP-1000
Fuß Luftpumpe mit ManometerShenfengSF8705D
Halogenkohlenwasserstofföl 27SigmaH8773
Halogenkohlenwasserstofföl 700SigmaH8898
Inverses MikroskopNikonECLIPSE Ts2R
MikroinjektionspumpeeppendorfFemtoJet 4i
MikromanipulatoreppendorfTransferMan 4r
Mikropipette AnfaserSUTTERBV-10
Mikroskop-Deckglas (18 mm x 18 mm)CITOLAS10211818C
Objektträger (25 mm x 75 mm)CITOLAS188105W
Petrischale (90 mm x 15 mm)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Stereo MikroskopNikonSMZ745

Referenzen

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