Live-Bildgebung zur Quantifizierung der zellulären Strahlenempfindlichkeit in patienteneigenen Tumororganoiden

Zusammenfassung

Im Folgenden stellen wir einen einfachen Live-Imaging-Ansatz zur Quantifizierung der Empfindlichkeit von patienteneigenen Tumororganoiden gegenüber ionisierender Strahlung vor.

Zusammenfassung

Die Strahlentherapie (RT) ist eine der tragenden Säulen des modernen klinischen Krebsmanagements. Allerdings sind nicht alle Krebsarten gleich empfindlich gegenüber Strahlung, oft (aber nicht immer) aufgrund von Unterschieden in der Fähigkeit bösartiger Zellen, oxidative DNA-Schäden zu reparieren, die durch ionisierende Strahlen hervorgerufen werden. Klonogene Assays werden seit Jahrzehnten eingesetzt, um die Empfindlichkeit von kultivierten Krebszellen gegenüber ionisierender Bestrahlung zu beurteilen, vor allem, weil bestrahlte Krebszellen oft verzögert sterben, was mit kurzfristigen Durchflusszytometrie- oder mikroskopiegestützten Techniken schwer zu quantifizieren ist. Leider können klonogene Assays als solche nicht für komplexere Tumormodelle, wie z. B. patientenabgeleitete Tumororganoide (PDTOs), eingesetzt werden. In der Tat kann die Bestrahlung etablierter PDTOs ihr Wachstum als mehrzellige Einheiten nicht unbedingt aufheben, es sei denn, ihr stammartiges Kompartiment wird vollständig beseitigt. Darüber hinaus kann die Bestrahlung von PDTO-abgeleiteten Einzelzellsuspensionen die Empfindlichkeit maligner Zellen gegenüber RT im Kontext etablierter PDTOs möglicherweise nicht richtig rekapitulieren. In diesem Artikel beschreiben wir eine Adaption konventioneller klonogener Assays, bei der etablierte PDTOs ionisierender Strahlung ausgesetzt werden, gefolgt von Einzelzelldissoziation, Replattierung unter geeigneten Kulturbedingungen und Live-Bildgebung. Nicht bestrahlte (Kontroll-)PDTO-abgeleitete stammähnliche Zellen reformieren wachsende PDTOs mit einer PDTO-spezifischen Effizienz, die durch Bestrahlung dosisabhängig negativ beeinflusst wird. Unter diesen Bedingungen können die Effizienz und Wachstumsrate der PDTO-Bildung als Maß für die Strahlenempfindlichkeit auf Zeitrafferbildern quantifiziert werden, die aufgenommen wurden, bis die Kontroll-PDTOs eine vordefinierte Raumbelegung erreichen.

Einleitung

Die externe Strahlentherapie (RT) ist eine der tragenden Säulen der modernen Onkologie und spiegelt nicht nur eine ausgeprägte Antikrebsaktivität wider, die mit einem klar definierten Spektrum allgemein beherrschbarer Nebenwirkungen einhergeht¹, sondern auch eine außergewöhnlich weit verbreitete klinische Verfügbarkeit (die meisten Krebszentren in den Industrieländern sind mit modernen Linearbeschleunigern für externe Strahlen-RT ausgestattet)². In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung wird die RT weltweit mit Erfolg sowohl für kurative Zwecke, im Allgemeinen im Rahmen der Erkrankung im Frühstadium ^3,4, als auch für palliative Anwendungen eingesetzt, um Symptome (z. B. Schmerzen) von metastasierenden Tumoren einzudämmen⁵. Allerdings sind nicht alle Malignome gleich empfindlich gegenüber RT, was eine Reihe von Merkmalen in Krebszellen und Mikroumgebungen widerspiegelt 6,7,8,9. Als eigenständiges Beispiel wurden verschiedene krebsassoziierte genetische und epigenetische Veränderungen, die die DNA-Reparatur und die Redoxhomöostase beeinflussen, mit einer erhöhten oder verringerten intrinsischen Strahlenempfindlichkeit in Verbindung gebracht, was weitgehend die Fähigkeit der RT widerspiegelt, Krebszellen abzutöten, indem sie direkte und reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-abhängige Schäden an der DNA und anderen Makromolekülen verursacht 10,11,12,13.

In den letzten Jahrzehnten wurden klonogene Assays routinemäßig eingesetzt, um die Strahlenempfindlichkeit von kultivierten menschlichen und murinen Krebszellen zu beurteilen 14,15,16. Während Chemotherapeutika und andere Stressoren bösartige Zellen oft relativ schnell abtöten, lösen RT, die in klinisch relevanten Dosen eingesetzt werden, meist eine verzögerte Form des Zelltods aus, die nicht einfach mit kurzfristigen Durchflusszytometrie- oder Mikroskopie-gestützten Techniken quantifiziert werden kann, wie z. B. der Messung der zellulären Aufnahme von lebenswichtigen Farbstoffen (die abgestorbene Zellen selektiv färben) 24-72 Stunden nach Exposition gegenüber einem zytotoxischen Stimulus¹⁷. Abgesehen davon, dass sie einfach sind und sich auf recht kostengünstige Reagenzien stützen, haben sich klonogene Assays als besonders praktisch erwiesen, da sie die Implementierung des sogenannten "linearen quadratischen" Modells ermöglichen, das ein relativ einfaches mathematisches Werkzeug für die quantitative Analyse der RT-Dosis-Wirkungs-Beziehung darstellt^18,19. In ähnlicher Weise haben kultivierte Krebszellen (einschließlich etablierter Zelllinien sowie primärer, von Patienten stammender Zellen) eine geeignete Plattform für die Prüfung verschiedener Aspekte der Krebsbiologie geboten, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) der Empfindlichkeit gegenüber der Behandlung auf eine ziemlich einfache, aber vereinfachte Weise, wobei eine wesentliche Einschränkung das Fehlen einer strukturierten Tumormikroumgebung (TME) ^ist20, ²¹. Urheberrecht In der Tat sind zweidimensionale Krebszellkulturen von Natur aus nicht in der Lage, die Zell-Zell-Kommunikation und die Wechselwirkungen mit der extrazellulären Matrix zu rekapitulieren, wie sie bei Krebs auftreten^22,23. Patienten-abgeleitete Tumor-Organoide (PDTOs) haben sich als Tumormodelle herausgestellt, die eine solche Einschränkung zumindest teilweise umgehen 24,25,26.

Leider können herkömmliche klonogene Assays nicht eingesetzt werden, um die Strahlenempfindlichkeit von PDTOs zu beurteilen. Einerseits muss die Bestrahlung etablierter PDTOs ihr Wachstum als mehrzellige Einheit nicht unbedingt beeinträchtigen, es sei denn, ihr stammartiges Kompartiment - das für die Bildung und Reifung von PDTOs verantwortlich ist, aber im Vergleich zu differenzierteren PDTO-bildenden Zellen eine erhöhte Resistenz gegen DNA-Schäden aufweist²⁷ - wird vollständig beseitigt. Auf der anderen Seite kann die Bestrahlung von PDTO-abgeleiteten Einzelzellsuspensionen die Strahlenempfindlichkeit von PDTO-bildenden (einschließlich stammartigen) Zellen, wie sie im Zusammenhang mit gebildeten PDTOs gezeigt wird, nicht richtig rekapitulieren. Im Folgenden stellen wir eine Technik vor, die die Live-Bildgebung von Brustkrebs-PDTOs nutzt, um die PDTO-bildende Wirksamkeit und Wachstumsrate von PDTO-abgeleiteten Zellen, die zuvor ionisierender Bestrahlung ausgesetzt waren, im Vergleich zu ihren unbestrahlten Gegenstücken zu überwachen. Mit den erforderlichen Variationen, die weitgehend die Differentialbiologie der einzelnen PDTOs widerspiegeln (z. B. Anforderungen an Kulturmedien, Wachstumsrate), erwarten wir, dass dieses Protokoll für die Untersuchung der Strahlenempfindlichkeit in einer breiten Palette von PTDOs sowohl mammären als auch nicht-mammären Ursprungs geeignet ist.

Protokoll

Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Organoid-Kultur

HINWEIS: TNBC#1 PDTOs wurden in unserem Labor auf der Grundlage von Tumorgewebe etabliert, das chirurgisch von einer Patientin mit dreifach negativem Brustkrebs (TNBC) entnommen wurde, die eine Einverständniserklärung zur Teilnahme an einem Biobanking-Protokoll gegeben hatte (IRB21-06023682). Nach Validierung durch Histologie und RNA-Sequenzierung (RNAseq) werden TNBC#1 PDTOs in 66% Matrigeltropfen (sogenannte "Domes") in angereichertem DMEM/F12-Kulturmedium kultiviert (Tabelle 1) und alle 2-3 Wochen im Verhältnis 1:2-1:10 verabreicht²⁸.

1. Seed-PDTOs im Verhältnis 1:2-1:10 etwa 2 Wochen vor der Bestrahlung in separaten, nicht adhärenten 6-Well-Platten, eine pro getesteter Strahlendosis (plus Negativkontrollen, die von PDTOs bereitgestellt werden, die nicht ionisierender Strahlung ausgesetzt sind).
2. Geben Sie alle 3-4 Tage 3 ml frisches, angereichertes DMEM/F12-Kulturmedium zu den PDTOs.
   HINWEIS: Die Aussaat- und Kulturbedingungen können eine gewisse Anpassung erfordern, um zu verhindern, dass PDTOs ein sehr erkennbares, ringförmiges Aussehen annehmen, das auf eine Kernnekrose unter dem Mikroskop hinweist, und um eine optimale Lebensfähigkeit bei der Bestrahlung zu gewährleisten.

2. Strahlung

1. PDTOs sind bereit für die Bestrahlung, sobald sie die durchschnittliche Größe (ca. 100 μm, wie vorläufig in der Hellfeldmikroskopie mit einer Skalenreferenz bestimmt) und die Kuppelbelegung (ca. 80%) erreicht haben. Passieren Sie die PDTOs in dieser Phase, um eine Überfüllung zu vermeiden.
2. Bestrahlen Sie die PDTO-haltigen Kuppeln mit dem SARRP-Bestrahlungsgerät (Small Animal Research Radition Platform) (oder einem alternativen Bestrahlungsgerät für In-vitro - oder In-vivo-Anwendungen ) im Open-Field-Modus (ohne Kollimator) und liefern Sie Einzeldosen von 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy und 10 Gy. Nicht bestrahlte PDTOs bieten geeignete Negativkontrollbedingungen.
   HINWEIS: Die Kalibrierung von Dosimetrietests sollte vor jedem Experiment durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die in Matrigel eingeschlossenen PDTOs die geplante Strahlendosis erhalten. Diese Dosen wurden auf der Grundlage vorläufiger Bewertungen der Strahlenempfindlichkeit von TNBC#1-PDTOs ausgewählt und können daher Anpassungen für andere PDTOs erfordern.

3. Dissoziation

1. Waschen Sie unmittelbar nach der Bestrahlung jede PDTO-haltige Matrigelkuppel mit 2 mL angereichertem DMEM/F12-Kulturmedium und resuspendieren Sie sie in 1-3 mL TrypL-E mit einer p1000-Mikropipette. Wiederholen Sie den Vorgang etwa 30 Mal für jede Vertiefung.
2. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie für ~5 min in einem Wasserbad bei 37 °C.
3. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
4. Entfernen Sie überschüssiges TrypL-E, um ~1 mL im Röhrchen zu belassen, und fügen Sie das 3-fache des ursprünglichen Enzymvolumens (siehe Schritt 3.1) angereichertes DMEM/F12-Medium hinzu, um die Zellen zu waschen.
5. Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 40 μm Maschenfilter. Dieser Schritt stellt sicher, dass keine Zellcluster bei der Beschichtung verbleiben und dass jedes neue PDTO aus einer einzelnen Zelle stammt.
6. Zählen Sie die Zellen nach der Färbung mit 10 % Trypanblau in PBS in einem automatisierten Zellzähler und resuspendieren Sie sie, um 800 Zellen in 50 μl angereichertem DMEM/F12-Medium plus 66 % Matrigel bei 4 °C zu erhalten (Bedingungen für 1 Dome).
7. Plattieren Sie jede Kuppel in einem einzelnen Well aus einer Live-Imaging-kompatiblen 48-Well-Kulturplatte, ohne dass sich Blasen bilden. Es werden technische Verdreifachungen für jede Strahlendosis empfohlen.
8. Legen Sie die Platten für 30 min in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO₂), um das Matrigel zu verfestigen.
9. Fügen Sie 0,5-1 ml angereichertes DMEM/F12-Medium hinzu, entfernen Sie potenzielle Blasen und platzieren Sie die Platten im Live-Imaging-System in einem Zellkultur-Inkubator. Lassen Sie die Platte vor der Bildgebung etwa 30 Minuten lang auf die eingestellte Temperatur ausgleichen.
   HINWEIS: Matrigel verfestigt sich bei Temperaturen >4 °C, was bedeutet, dass diese Temperatur beibehalten werden sollte, bis eine Verfestigung erforderlich ist.

4. Live-Bildgebung

1. Wählen Sie in der Incucyte-Software die Option Schedule to Aquire aus.
2. Klicken Sie auf das Pluszeichen in der oberen linken Ecke von Launch Add Vessel.
3. Um wiederholt oder einmal zu scannen, wählen Sie Nach Zeitplan scannen und klicken Sie dann auf Weiter.
4. Um ein Schiff zu erstellen oder wiederherzustellen, wählen Sie Schiff neu erstellen und klicken Sie dann auf Weiter.
5. Um den Scan-Typ auszuwählen, wählen Sie Organoid und klicken Sie dann auf Weiter.
6. Scan-Einstellungen: Wählen Sie QC < ' Phase + Hellfeld-Bildkanäle. "4x Ziel" wird automatisch ausgewählt. Klicken Sie dann auf Weiter.
7. Auswahl des Schiffes: Wählen Sie die passende softwarevalidierte Platte entsprechend der Katalognummer aus.
8. Standort des Schiffes: Wählen Sie die Position der Platte auf dem Instrument entsprechend dem Layout aus und klicken Sie dann auf Weiter.
9. Scan-Muster: Wählen Sie die Vertiefungen entsprechend dem Plattenlayout aus und klicken Sie dann auf Weiter.
10. Gefäß-Notizbuch: Typenschild (Optional: Name Zellentyp und Durchgang). Erstellen Sie eine Tafelkarte, indem Sie auf das Pluszeichen in der oberen rechten Ecke des Plattenlayouts klicken, "Tellerkarte erstellen".
11. Geben Sie im Plate Map-Editor den Zellentyp an, indem Sie im Abschnitt Zellen auf das Symbol Neue Zelle erstellen klicken, wenden Sie sie auf die entsprechenden Wells an, indem Sie auf das Pluszeichen klicken, und wählen Sie die entsprechenden Wells aus. Optional: Die Anzahl der geseedeten Zellen und Passagen kann angegeben werden. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Zelllinie.
12. Geben Sie die Behandlung an, indem Sie auf das Symbol Neue Zelle erstellen im Abschnitt Wachstumsbedingungen klicken, wenden Sie sie auf die entsprechenden Vertiefungen an, indem Sie auf das Plus-Symbol klicken, und wählen Sie die entsprechenden Vertiefungen aus. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Versuchsbedingung. Klicken Sie anschließend auf Okay > Weiter.
13. Analyse-Setup: "Analyse auf später verschieben" wird automatisch ausgewählt; Klicken Sie auf Weiter.
14. Zeitplan für den Scan: Wählen Sie, ob Sie zweimal täglich scannen möchten, auf unbestimmte Zeit. Klicken Sie auf Weiter. Überwachen Sie die Dunkelheit von Kontroll-PDTOs für den idealen Endpunkt, da sie dazu neigen, zusammenzubrechen, wenn sie überwuchert sind.
15. Zusammenfassung: Überprüfen Sie die Zusammenfassung und klicken Sie auf Zum Zeitplan hinzufügen.
    HINWEIS: Scan-Eigenschaften können visualisiert werden, und der Zeitplan kann bei Bedarf bearbeitet werden, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Scan-Zeitleiste klicken.

5. Würdigung

1. Wählen Sie in der kompatiblen Software Ansicht aus. Diese kann auch von einem Rechner aus bedient werden, der über das Intranet mit dem System verbunden ist.
2. Wählen Sie das gewünschte Experiment mit einem Doppelklick darauf aus.
3. Wählen Sie das Symbol Analyse starten aus.
4. Wählen Sie die Option Neue Analysedefinition erstellen aus, und klicken Sie dann auf Weiter.
5. Art der Analyse: Wählen Sie Organoid aus und klicken Sie auf Weiter.
6. Bildkanäle: "Phase + Hellfeld" ist standardmäßig ausgewählt, klicken Sie auf "Weiter".
7. Wählen Sie einen Satz repräsentativer Bilder für die Analyse aus. Klicken Sie auf Weiter. Es wird empfohlen, frühe und späte Zeitpunkte und unterschiedliche Behandlungsbedingungen zu wählen, z. B. Kontrolle und unterschiedliche Strahlendosen.
8. Führen Sie die Analysedefinition für TNBC#1 mit den folgenden Schritten durch:
   1. Auf Bild: Wählen Sie "Vorschau aktuell " oder "Vorschau aller Bilder", um die Standardmaske des aktuellen oder ausgewählten Bildes anzuzeigen. Wiederholen, wenn Analyseparameter geändert werden, um die Maske zu aktualisieren.
   2. Segmentierung: Legen Sie den Radius auf 300, die Empfindlichkeit des Hintergrunds auf 80, die Kantenteilung auf EIN und die Kantenempfindlichkeit auf 70 fest.
   3. Bereinigung: Stellen Sie die Lochfüllung auf 5E+05 μm² und die Größe auf 0 Pixel ein.
   4. Filter: Legen Sie keine minimale oder maximale Fläche, die minimale Exzentrizität auf 0,19 und keine maximale Exzentrizität fest. Klicken Sie auf Weiter.
9. Scan-Zeiten und -Wells: Wählen Sie alle gewünschten Scan-Zeitpunkte und -Wells aus. Klicken Sie auf Weiter. Optional: Wählen Sie Zukünftige Scans analysieren aus.
10. Analysedefinition speichern und anwenden: Geben Sie den Definitionsnamen ein und klicken Sie auf Weiter.
11. Visualisieren Sie die Zusammenfassung und klicken Sie auf Fertigstellen.
12. Es wird ein Popup-Fenster angezeigt, in dem der Benutzer darüber informiert wird, dass die Analyse in die Analysewarteschlange aufgenommen wurde. Klicken Sie auf OK. Sobald sich das Fenster Analysewarteschlange öffnet, können die verbleibenden Aufgaben visualisiert werden.
13. Rufen Sie bei Bedarf die abgeschlossene Analyse in der Ansicht ab, indem Sie den blauen Pfeil in der Spalte Analysen neben dem Schiffsnamen auswählen und mit der rechten Maustaste auf den Namen der Analysedefinition klicken. Visualisieren Sie anschließend entweder die Rohdaten in der Software, indem Sie auf Diagrammanalysemetriken klicken, oder exportieren Sie sie zur weiteren Analyse, indem Sie Analysedefinition exportieren auswählen.
    HINWEIS: Der Export von Rohdaten kann im Fenster "Metriken der Diagrammanalyse" angepasst werden. Die Anzahl der Organoide, die Gesamtfläche, die durchschnittliche Exzentrizität und die Dunkelheit können separat exportiert werden, und die Daten können im Rolldown-Menü "Gruppierung auswählen" organisiert werden, indem Sie auf "Keine", "Spalten", "Zeilen" oder "Platten-Map-Replikationen" klicken. Für TNBC#1, für den Export von Rohdaten, Diagrammanalysemetriken und für die Rolldownoption Gruppierung auswählen wurde die Option Keine ausgewählt. Diese Importparameter wurden auf der Grundlage von vorläufigen Bewertungen mit TNBC#1 PDTOs ausgewählt. Sie können daher Anpassungen für andere PDTOs erfordern, was in der Software auf der Grundlage der "Vorschau"-Funktionen möglich ist. Wir empfehlen, die Importparameter für (1) frühe Bilder, die hauptsächlich einzelne Zellen oder kleine PDTOs enthalten, und (2) Bilder, die zu späten Zeitpunkten aufgenommen wurden, anzupassen, um sicherzustellen, dass große PDTOs auch unter Kontroll- und Behandlungsbedingungen erfasst werden.

Ergebnisse

TNBC#1 PDTOs wurden an Tag 0 einer Einzelstrahlendosis von 0 (unbestrahlte Kontrollen), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy oder 10 Gy ausgesetzt. Unmittelbar danach wurden PDTOs dissoziiert, um für jede experimentelle Bedingung eine einzellige Suspension zu erhalten. PDTO-abgeleitete Zellen wurden anschließend in 48-Well-Platten innerhalb von 66 % Matrigel-Kuppeln (je 50 μl) ausgesät, die in der Mitte der Wells abgelagert wurden, in 3 technischen Replikaten pro Zustand. Die Platten wurden in ein Live-Imaging-System gelegt und alle 6 Stunden mit dem Organoid-Modul 4X-Objektiv für insgesamt 30 Tage abgebildet. Die Bestrahlung von TNBC#1-PDTOs mit RT in einer Einzeldosis von 2 Gy verzögerte das Nachwachsen von PDTOs signifikant, während Strahlendosen ≥4 Gy (bis zu 10 Gy) die Regeneration wachsender PDTOs verhinderten (Abbildung 1).

Abbildung 1: Live-Bildgebung von patientenabgeleiteten Tumororganoiden (PDTOs). Brustkrebs TNBC#1-Tumororganoide (PDTOs) wurden unbehandelt gelassen oder der angegebenen Strahlendosis ausgesetzt, kurz darauf folgte Dissoziation, Replatination und Bildgebung mit einem Lebendzell-Bildgebungssystem. Es werden repräsentative Bilder nach Kontrastanpassung (A) und quantitativen Auswertungen (B, Mittelwert ± SEM) berichtet. Abbildungsmaßstab: 1,19 x 1,16 mm (1,38 mm²). Maßstab: 400 μm; Einschübe: 200 μm. ****p < 0,001 (bidirektionale ANOVA, im Vergleich zu 0 Gy); ^####p < 0,001 (bidirektionale ANOVA im Vergleich zu 2 Gy). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bestandteil	Konzentration
DMEM F/12	1-mal
GlutaMax	1-mal
Hepes	ca. 10 mM
PenStrep	100 U/ml
Nr. B27	1-mal
Nac	ca. 1,25 Mio.
Nicotinamid	ca. 10 mM
TGFbeta-Rezeptor-Inhibitor A83-01	0,5 μM
p38 MAP-Inhibitor p38i SB202190	1 μM
Birne	10%
Rspondin Medien	10%
FGF10	20 ng/ml
FGF7	5 ng/ml
NR (Heregulin)	5 nM
Primocin	100 μg/ml
Y-27632 (RhoKi)	5 μM
Epidermaler Wachstumsfaktor hEGF	5 ng/ml

Tabelle 1: Zusammensetzung des PDTO-Kulturmediums.

Diskussion

Hier beschreiben wir eine Adaption konventioneller klonogener Assays, die Brustkrebs-PDTOs und Live-Imaging nutzen, um die PDTO-Strahlenempfindlichkeit basierend auf (1) der Persistenz von PTDO-bildenden stammähnlichen Zellen nach PDTO-Bestrahlung in vitro und (2) der Wachstumsrate der PDTOs, die diese Zellen erzeugen (können), zu quantifizieren. Zu den kritischen Schritten dieses Protokolls gehören (1) die Etablierung von PDTOs für eine Kuppelbelegung, die eine gute Lebensfähigkeit ermöglicht, (2) die PDTO-Exposition gegenüber ionisierender Strahlung in verschiedenen Dosen, einschließlich simulierter bestrahlter Kontrollbedingungen; (3) PDTO-Dissoziation in einzelne Zellen; (4) Replattierung von PDTO-abgeleiteten Einzelzellen; und (5) Live-Bildgebung bis zu einer vordefinierten Kuppelbelegung unter Kontrollbedingungen.

Mit minimalen Modifikationen, die hauptsächlich mit der Effizienz der PDTO-Bildung und der PDTO-Wachstumsrate unter Kontrollbedingungen zusammenhängen (die wahrscheinlich zwischen verschiedenen PDTOs erheblich variieren), erwarten wir, dass dieses Protokoll an mehrere kommerziell erhältliche Live-Imaging-Plattformen sowie an zahlreiche PDTOs sowohl mammaler als auch nicht-mammärer Abstammung angepasst werden kann. Einerseits wird erwartet, dass die Effizienz der PDTO-bildenden Grundlinie bei der Einzelzelldispersion die Anzahl der Einzelzellen beeinflusst, die neu ausgesät werden müssen, um neue PDTOs mit einer Dichte zu erhalten, die nicht nur eine bildbasierte PDTO-Quantifizierung, sondern auch das normale Wachstum unbehandelter PDTOs ermöglicht. Auf der anderen Seite wird erwartet, dass die PDTO-Wachstumsrate die Dauer des Assays beeinflusst, da die Verschmelzung benachbarter PDTOs vermieden werden sollte, um optimale analytische Kapazitäten zu erhalten. Daher ist die Bestimmung der PDTO-Formungseffizienz und der PDTO-Wachstumsrate unter Kontrollbedingungen für jedes einzelne PDTO entscheidend für die korrekte Implementierung dieses Protokolls.

Obwohl sich diese Methode als ziemlich einfach erweist, hat sie einige Einschränkungen. Erstens kann eine zu geringe Anzahl von PDTO-bildenden Zellen die Regeneration normal wachsender PDTOs bei der Einzelzelldissoziation beeinträchtigen. Während eine routinemäßige PDTO-Passage durch unvollständige Dissoziation erreicht werden kann, beruhen quantitative Bewertungen, wie sie in diesem Protokoll angeboten werden, auf der Erzeugung einer einzelligen Suspension (die während der Zählung visuell bestätigt werden kann). Zweitens kann eine zu langsame Wachstumsrate die Dauer des Assays erheblich verlängern und möglicherweise zu einer ungenauen Abschätzung der Strahlenempfindlichkeit führen. Es ist in der Tat denkbar, dass eine verlängerte Kulturzeit, wie sie für langsam wachsende PDTOs erforderlich ist, um eine endpunktkompatible Größe zu erreichen, zusätzliche Chancen für subletal bestrahlte PDTO-bildende Zellen bietet, sich von Stress zu erholen und nachweisbare (wenn auch langsam wachsende) PDTOs wiederherzustellen. Schließlich wird erwartet, dass die Dissoziation von PDTOs kurz nach der Bestrahlung zusätzlichen Stress auf PDTO-bildende Zellen ausübt, was möglicherweise die Strahlenempfindlichkeit als Folge einer veränderten Zell-Zell-Kommunikation in den frühen Phasen der Genesung erhöht. Eine Verzögerung der Dissoziation um 24-72 h könnte Einblicke in den relativen Beitrag der konservierten Zell-Zell-Kommunikation zur Fähigkeit von PDTO-bildenden Zellen geben, sich von makromolekularen Schäden, wie sie durch RT auferlegt werden, zu erholen.

Während Live-Imaging-Plattformen eine bequeme Methode zur Überwachung der PDTO-Bildung und des PDTO-Wachstums in Längsrichtung bieten, können auch Einzelendbilder für dasselbe Ziel verwendet werden. In diesem Fall sollte darauf geachtet werden, dass benachbarte PDTOs vor der Bildgebung nicht verschmelzen, und die Wachstumsrate kann als Funktion der PDTO-Größe beurteilt werden, die auf die Dauer des Assays normiert ist.

Im Zeitalter der personalisierten Krebsmedizin ist die Beurteilung der Sensitivität einzelner Tumoren gegenüber der Behandlung von größter Bedeutung, da sie einige Hinweise für die Entwicklung individualisierter Therapiestrategien mit verbesserter Wirksamkeit liefert²⁹. Das hierin beschriebene Protokoll fügt sich in dieses Unterfangen ein, indem es einen bequemen Ansatz zur Abschätzung der zellulären Empfindlichkeit einzelner PDTOs gegenüber ionisierender Strahlung (allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen Modalitäten) bietet. Es muss jedoch noch gezeigt werden, ob die Messung der Strahlenempfindlichkeit von Krebszellen durch PDTOs das Ansprechen einzelner Krebspatienten auf die fokale RT genau vorhersagt. Die Korrelation der Strahlenempfindlichkeit verschiedener PDTOs gegenüber Bestrahlung mit dem klinischen Ansprechen auf RT ihrer jeweiligen Spender wird wichtige Einblicke in diese Möglichkeit liefern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
40 & Mikro; m mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM f/12	Corning	12634-010
Epidermaler Wachstumsfaktor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digitales inverses Fluoreszenzmikroskop	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte-Software 2021A	Sartorius-Version		: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius-Modell		SX1
Incucyte-validierte 48-Well-Platte	Corning	3548
Matrigel	Discovery Laborbedarf	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Gekauft vom Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Unbehandelte 6-Well-Platte	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP-Inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Gekauft vom Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta-Rezeptor-Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypanblau-Fleck (0,4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049