Methodenartikel

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

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DOI:

10.3791/66690

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21. Juni 2024

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1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Endothelzellen der Maus aus der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Zusammenfassung

Die Bauchspeicheldrüse ist ein lebenswichtiges Organ für die Aufrechterhaltung des metabolischen Gleichgewichts im Körper, unter anderem aufgrund ihrer Produktion von Stoffwechselhormonen wie Insulin und Glucagon sowie Verdauungsenzymen. Die Bauchspeicheldrüse ist auch ein stark vaskularisiertes Organ, ein Merkmal, das durch das komplizierte Netzwerk der Pankreaskapillaren erleichtert wird. Dieses ausgedehnte Kapillarnetzwerk besteht aus stark gefensterten Endothelzellen (ECs), die für die Entwicklung und Funktion der Bauchspeicheldrüse wichtig sind. Dementsprechend kann die Dysfunktion der ECs zur Dysfunktion der Bauchspeicheldrüse bei Krankheiten wie Diabetes und Krebs beitragen. Daher ist die Erforschung der Funktion der Pankreas-ECs (pECs) nicht nur für das Verständnis der Biologie der Bauchspeicheldrüse, sondern auch für die Entwicklung ihrer Pathologien wichtig. Mausmodelle sind wertvolle Werkzeuge zur Erforschung von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Es gibt jedoch kein etabliertes Protokoll mit ausreichenden Details für die Isolierung von Maus-pECs aufgrund der relativ kleinen Population von ECs und der reichlich vorhandenen Verdauungsenzyme, die möglicherweise aus dem Azinusgewebe freigesetzt werden und zu Zellschäden und damit zu einer geringen Ausbeute führen können. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir ein Protokoll zur Anreicherung und Wiederherstellung von Maus-pECs entwickelt, das eine sanfte physikalische und chemische Dissoziation und Antikörper-vermittelte Selektion kombiniert. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine robuste Methode, um intakte und lebensfähige ECs aus der gesamten Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren. Dieses Protokoll eignet sich für mehrere Downstream-Assays und kann auf verschiedene Mausmodelle angewendet werden.

Einleitung

Die Bauchspeicheldrüse, der Schlüssel zur Stoffwechselkontrolle und Homöostase, ist ein stark vaskularisiertes Organ. Die Bauchspeicheldrüse hat sowohl endokrine als auch exokrine Funktionen und steuert die Regulation des Blutzuckerspiegels bzw. der Verdauungsenzyme. Diese beiden Kompartimente sind durch das ausgedehnte Netzwerk der Blutgefäße der Bauchspeicheldrüse miteinander verbunden und erleichtern den Austausch und Transport von Sauerstoff, Hormonen und Enzymen. Entscheidend ist, dass dieses dichte Kapillarnetzwerk die Langerhans-Insel durchdringt, eine Gruppe hormonregulierender Zellen innerhalb der Bauchspeicheldrüse, die für ihre endokrine Funktion verantwortlich ist und aus den Glucagon-sezernierenden Alpha-Zellen (α-Zellen, den insulin-sezernierenden Beta-Zellen (β) und den Somatostatin-sezernierenden Delta-Zellen (δ) besteht 1,2. Obwohl die Inselzellen nur 1-2 % der Pankreasmasse ausmachen, erhalten sie 20 % des gesamten Blutflusses3, was die Bedeutung des Gefäßsystems der Inselzellen unterstreicht. Die Pankreaskapillaren bestehen hauptsächlich aus stark gefensterten Endothelzellen (ECs), die von muralen Perizyten umgeben sind. Diese kapillaren ECs spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, Reifung und (Dys-)Funktion der Inselzellen und bilden enge Wechselwirkungen mit verschiedenen endo- und exokrinen Zellen4 (Abbildung 1).

Endotheliale Dysfunktion wurde sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetes beobachtet, den häufigsten Erkrankungen, die durch eine Inseldysfunktion der Bauchspeicheldrüse verursacht werden 5,6. Sowohl die mikrovaskuläre Dichte als auch die Morphologie der Inselzellen können bei Diabetes verändert sein7. Darüber hinaus zeichnet sich der Bauchspeicheldrüsenkrebs, ein hochaggressiver Tumor, der sich auch als Diabetes manifestieren kann, durch eine hohe mikrovaskuläre Dichte mit schlechter Durchblutungaus 8. Angesichts der zentralen strukturellen und funktionellen Rolle von ECs sowohl im normalen als auch im erkrankten Pankreasgewebe besteht ein erheblicher Bedarf, die pECs in Entwicklung, Physiologie und Pathologie zu untersuchen, um die Mechanismen aufzudecken, die Gesundheit oder Krankheiten antreiben.

Zahlreiche Protokolle wurden für die Isolierung von ECs aus verschiedenen murinen (z. B. Gehirn 9,10, Lunge11, Herz12, Leber13, Skelettmuskulatur14 und Fettgewebe15) und menschlichen (z. B. Gehirn16, viszerales Fettgewebe17,18, periphere Nerven19, Lunge 20,21,22 und Mesenterialarterie 23) entwickelt) Gewebe. Diese Protokolle beinhalten typischerweise die Verwendung enzymatischer Verdaue (z. B. durch Kollagenase, Trypsin24, Dispase24, 25 und Liberase26), gefolgt von einem Antikörper-basierten Anreicherungsschritt. Darüber hinaus beruhen diese Protokolle tendenziell auf verlängerten Verdauungsdauern in hohen Enzymkonzentrationen mit kräftigem Rühren bei 37 °C (Tabelle 1). Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften der Bauchspeicheldrüse, einschließlich der Tatsache, dass sie eine Vielzahl von endogenen Verdauungsenzymen beherbergt, können diese bestehenden Protokolle nicht direkt auf die Isolierung von pECs angewendet werden. Erstens unterscheidet sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (EZM) der Bauchspeicheldrüse von anderen Geweben. Während Kollagenase häufig für die EC-Isolierung verwendet wird, gibt es mehrere Subtypen mit unterschiedlichen gewebespezifischen Dissoziationsfähigkeiten, die daher optimiert werden müssen. Zweitens, und das ist entscheidend für die pEC-Isolierung, kann die Freisetzung und Aktivierung von endogenen Enzymen der Bauchspeicheldrüse den Isolierungsprozess erheblich behindern. Zu diesem Zweck muss darauf geachtet werden, den Bruch der exokrinen Azinuszellen (die Hauptquelle für Zymogene, Proteasen und RNase27) zu minimieren, was zu weiteren Zellschäden führen und zu einer geringen Zellviabilität führen und die Gesamterholung beeinträchtigenkann 27,28,29.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir Methoden aus bestehenden EC-Isolationsprotokollen angepasst und ein neues Protokoll etabliert, das für die EC-Isolierung aus der Bauchspeicheldrüse der Maus geeignet ist. Konkret beschreiben wir hier einen Arbeitsablauf (Abbildung 2) mit Kollagenase Typ I (typischerweise für die Lungen-EC-Isolierung eingesetzt), niedrigeren Verdauungstemperaturen und ohne Unruhe (um die Aktivierung von Pankreaszymogenen zu verhindern) undDNase 30,31,32 Supplementierung (zur Verhinderung von DNA-induzierter Apoptose und Verbesserung der Zellviabilität) und einem Antikörper gegen CD31 33 (PECAM1, ein Pan-EC-Marker). Das beschriebene Protokoll erzeugt EC-Populationen, die aus der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert wurden und für die Erstellung von Genexpressionsprofilen und Proteinassays verwendet werden können.

Protokoll

Die Gewebeisolierung wurde gemäß dem genehmigten Studienprotokoll #17010 vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, Kalifornien, USA) durchgeführt. Hier verwenden wir Tie-2CreERT2; Rosa26-TdTomato-Mauslinie im C57BL/6-Hintergrund im Alter von 8 - 12 Wochen. In dieser Linie werden ECs mit TdTomato markiert, wenn sie mit Tamoxifen induziert werden, wie zuvor beschrieben34. Dieses Protokoll kann jedoch für alle Altersgruppen von erwachsenen Mäusen mit unterschiedlichen Genotypen und genetischen Hintergründen angepasst werden.

1. Gewebeentnahme (geschätzte Zeit: 1-2 h)

HINWEIS: Die geschätzte Zeit beträgt 15 Minuten/Tier, empfohlen werden maximal 3 Tiere pro Dissoziationsprobe.

  1. Euthanasieren Sie die Tiere durch eine Überdosis Kohlendioxid (CO2), gefolgt von einer sekundären Todesbestätigung. Vor der Dissektion den ganzen Körper mit 70%igem Ethanol (EtOH) besprühen, wodurch der Operationsbereich vollständig desinfiziert wird.
  2. Strecken Sie die Gliedmaßen aus und sichern Sie sie mit Stecknadeln. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt durch die Haut und das Bauchfell, beginnend im unteren Bauchbereich und bis in den Brustbereich.
  3. Legen Sie den Brustkorb frei, indem Sie das Zwerchfell durchtrennen, und heben Sie den Brustkorb an, um das Herz freizulegen.
  4. Führen Sie eine Nadel (25G-30G), die mit einer Spritze verbunden ist, die eiskaltes, steriles PBS enthält, in den linken Ventrikel des Herzens ein.
  5. Beginnen Sie die Perfusion, indem Sie das PBS mit einer Geschwindigkeit von 5 - 10 ml/min durch das Herz injizieren. Hören Sie nach der Injektion von 10 ml auf oder bis sich Leber und Nieren verfärben.
  6. Nach der Perfusion lokalisieren Sie die Bauchspeicheldrüse (unterhalb des Magens und am Zwölffingerdarm befestigt)35 (Abbildung 3A) und entfernen Sie sie vorsichtig mit einer Präparierschere und einer Pinzette.
  7. Nach der Isolierung wird die Bauchspeicheldrüse in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml eiskaltem PBS + 0,2 mg/ml Trypsin-Inhibitor überführt und auf Eis gelegt (Abbildung 3B).
    HINWEIS: In diesem Schritt kann die Bauchspeicheldrüse von maximal 3 Mäusen gepoolt und in 1 Röhrchen übertragen werden. Die Proben können für eine maximale Zeit von 2 Stunden auf Eis aufbewahrt werden.

2. Kollagenase-Vorbereitung (geschätzte Zeit: 15-30 min)

  1. Bereiten Sie Lösungen und Puffer wie unten beschrieben vor.
    1. Dissoziationslösung: Kollagenase Typ I in ein 50-ml-Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+; siehe Materialtabelle) und 0,001 U/ml DNase I + 0,2 mg/ml Trypsin-Inhibitor geben.
    2. Dissoziationsstopplösung: Fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS 1x, ohne Ca2+, Mg2+; dasselbe gilt für alle anderen PBS in diesem Protokoll; siehe Materialtabelle), 5 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,001 U/ml DNase I oder DMEM + 10 % FBS + 0,001 MU/ml DNase I hinzu.
    3. Waschpuffer: Fügen Sie PBS 1x, 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,001 U/ml DNase I + 0,05 mg/ml Trypsininhibitor hinzu.
  2. Puffer vollständig auflösen und durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. Beiseite stellen und auf Eis legen.

3. Aufschluss (geschätzte Zeit: 40 min-1 h)

  1. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse aus dem eiskalten PBS und legen Sie sie auf eine Petrischale auf Eis. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe (z. B. Milz, Fett, Ablagerungen) vorsichtig mit einer chirurgischen Schere und Pinzette (Abbildung 3C).
    HINWEIS: Es ist wichtig, Fett zu entfernen, da ein Überschuss an Lipiden die Verdauung des Gewebes beeinträchtigen kann.
  2. Übertragen Sie die getrimmte Bauchspeicheldrüse der Maus in ein 5-ml-Röhrchen mit 1 ml Dissoziationslösung.
  3. Halten Sie das Röhrchen auf Eis und hacken Sie das Pankreasgewebe mit einer Präparierschere in feine pipetierbare Stücke, z.B. 0,5 mm oder 1 mm. Lysat in ein 50-ml-Röhrchen umfüllen und auf Eis halten.
  4. Geben Sie zusätzliche Bauchspeicheldrüse in das 5-ml-Röhrchen, mit dem das Pankreasgewebe zunächst zerkleinert wurde, und fügen Sie zusätzlich 1 ml Kollagenase hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf für mehrere Bauchspeicheldrüsenpräparate.
  5. Geben Sie 2 ml Kollagenaselösung in das 5-ml-Röhrchen, um restliches Bauchspeicheldrüsengewebe zu entfernen, und übertragen Sie es in das 50-ml-Röhrchen. Das Gesamtkollagenasevolumen sollte 5 ml für 3 Bauchspeicheldrüsen oder 3 ml für eine einzelne Bauchspeicheldrüse betragen.
  6. Sobald alle Proben mechanisch dissoziationiert wurden, werden die 50-ml-Röhrchen mit den homogenisierten Gewebelysaten in ein 37 °C warmes Wasserbad überführt und 10 Minuten lang inkubiert.
    HINWEIS: Rühren oder wirbeln Sie das Gewebegemisch während dieses Vorgangs nicht kräftig auf, da dies zum Bruch des Azinusgewebes und zur Freisetzung von reichlich endogenen Enzymen und DNA führen kann.
  7. Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Wasserbad und schwenken Sie sie vorsichtig, um sie gut zu vermischen, und lassen Sie sie weitere 10 Minuten im Wasserbad (Gesamtzeit: 20 Minuten).
    HINWEIS: 30 min im 37 °C warmen Wasserbad nicht überschreiten, um eine Überverdauung zu vermeiden.
  8. Stellen Sie die Röhrchen auf Eis und lassen Sie das Homogenat durch die Schwerkraft absetzen. Nach dem Absetzen wird der Überstand durch einen 70-μm-Filter geleitet und 5 ml Dissoziationsstopplösung hinzugefügt.
  9. Geben Sie zusätzlich 1 ml Dissoziationslösung zu dem restlichen Pellet und zerreiben Sie es mit einer 18-G-Nadel.
  10. Das restliche Homogenat wird durch den Filter geleitet und mit zusätzlichen 5 ml Dissoziationsstopplösung gewaschen.
  11. Spin-Zellen-Suspension bei 300 x g für 10 min, bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand vollständig durch Aspiration und halten Sie das Zellpellet auf Eis.
  12. Das Zellpellet mit 1 mL Waschpuffer resuspendieren und in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen.
  13. Nehmen Sie ein kleines Aliquot aus dem resuspendierten Zellpellet (10 μl) und mischen Sie es mit Trypanblau im Verhältnis 1:1, um die Zellen mit einem Zellzähler zu zählen und die Lebensfähigkeit zu messen.

4. Anreicherung der Endothelzellen (EC) (geschätzte Zeit: 2-3 h)

  1. 1 μl anti-CD31-Biotin-Antikörper pro 1 x 107 gezählten Zellen zugeben und 30 min bei 4 °C auf einem Rotator inkubieren (ca. 5 μl pro 3 Bauchspeicheldrüse).
  2. 20 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen zugeben und 40 min bei 4 °C auf einem Röhrchenrotator inkubieren.
  3. Stellen Sie einen Magnetständer mit dem Säulentrennerhalter auf und setzen Sie die Säule auf. Säule mit 3 mL Waschpuffer äquilibrieren.
  4. Geben Sie die Probe in die Säule und waschen Sie sie mit insgesamt 9 mL Waschpuffer.
    HINWEIS: Wenn die Zellkonzentration hoch ist, verdünnen Sie die Zellen mit zusätzlichen 2 ml Waschpuffer in einem separaten Röhrchen. Geben Sie jeweils 1 ml Probe in die Säule, um ein Verstopfen der Säule zu verhindern.
  5. Nehmen Sie die Säule aus dem Säulenhalter und legen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Geben Sie 5 ml Waschpuffer in die Säule. Verwenden Sie den Kolben, um die Zellen in der Säule nach unten zu drücken und die Elution (die angereichertes EC enthält) zu sammeln.
  6. Schleudern Sie den Durchfluss und die Elutions-/EC-Fraktion bei 300 x g für 10 min bei 4 °C herunter. Zählen Sie die Zellen und messen Sie die Lebensfähigkeit wie in Schritt 3.13.
  7. Validierung der EC-Anreicherung mittels qPCR von Flow-Through- und EC-Fraktionen. Verwenden Sie NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) als allgemeinen Marker für endokrine Zellen und Thrombozyten- und Endothelzelladhäsionsmolekül (Pecam1) als Marker für EC33. Verwenden Sie 36B4 (Rplp0, saures ribosomales Phosphoprotein p0) als interne Kontrolle für die Normalisierung der Genexpression.
    HINWEIS: In diesem Schritt können gesammelte Proben für Protein- oder RNA-Analysen verwendet werden.

5. Kultivierung von pECs

  1. Bereiten Sie das M199-Medium vor. Ergänzen Sie M199 Medium mit einer Endkonzentration von 20 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 % Penicillin-Streptomycin.
  2. Eine 60 mm Zellkulturplatte mit Kollagen Typ I (1 mg/ml in 0,1 M Essigsäure) bestreichen und 30 Minuten bei Raumtemperatur ziehen lassen.
  3. Entfernen Sie Kollagen Typ I und spülen Sie die Platte zweimal mit 1X PBS aus. Geben Sie 2 ml des vorbereiteten M199-Mediums hinzu und stellen Sie die Zellkulturplatte für 5 Minuten in einen Standard-Zellkulturinkubator (5 % CO2, 37 °C).
  4. Sobald die Zellen isoliert wurden, geben Sie die isolierten Zellen in eine vorgewärmte M199-Zellkulturplatte. Bewahren Sie die Zellen ca. 14 Tage unter Kulturbedingungen auf und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.

Ergebnisse

Nach diesem Protokoll können etwa 2 x 106 lebende Zellen gewonnen werden, wenn 3 Maus-Bauchspeicheldrüsen gepoolt werden, und 750.000 Zellen aus einer einzigen Maus-Bauchspeicheldrüse. Um die Anreicherung von EC zu validieren, führten wir die folgenden Analysen durch: 1) quantitative PCR: Im Vergleich zu den Flow-Through-Proben (d.h. den nicht-CD31-Antikörper-gebundenen Fraktionen) wiesen die EC-Fraktionen signifikant höhere Spiegel von Pecam1 (kodiert für CD31) und Kdr (kodierend für VEGFR2), zwei EC-Markergene33, und niedrigere Spiegel von NK6 Homöobox 1 (Nkx6.1)), einem Transkriptionsfaktor in den endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse, auf (Abbildung 4A); 2) Western Blotting: EC-angereicherte Proben aus drei Präparaten (pEC-1-3) zeigten starke Signale von CD31 in der erwarteten Größe (~130 kDa). Im Vergleich dazu zeigten die Eingangs- und FT-Proben ein minimales CD31-Signal. Als Positivkontrolle zeigten auch Lysate von MS1-Zellen, einer pEC-Zelllinie, ein starkes CD31-Signal (Abbildung 4B); 3) Trypanblau-Färbung: Wir fanden heraus, dass die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen bei etwa 50 % lag (Abbildung 4C); 4) Durchflusszytometrie nach einem veröffentlichten Protokoll15 : Durch Gating an der lebenden Zellpopulation (Abbildung 4D) fanden wir heraus, dass die CD31+-Zellen bei 88 % und die TdTomato+-Zellen bei 76 % lagen. Bemerkenswert ist, dass die Mehrzahl der isolierten Zellen CD31 und TdTomato co-exprimiert (Abbildung 4E). Als Negativkontrollen zeigten die ungefärbten MS1-Zellen und MS1, die mit IgG inkubiert wurden, keine lebenden Zellen, wie sie mit CD31 markiert waren. Als Positivkontrolle, d.h. MS1-Zellen, die für CD31 gefärbt wurden, zeigten sie nahezu 100% lebende CD31+-Zellen (Abbildung 4F). Wir kultivierten auch die isolierten Zellen, führten eine Immunfluoreszenzfärbung von PECAM1 nach einem veröffentlichten Protokolldurch 36 und bildeten TdTomato ab, das robuste Signale beider Marker in den isolierten Zellen zeigte, was auf das Vorhandensein von ECs hindeutet (Abbildung 4G).

Pankreasdiagramm zur Veranschaulichung von Intra-Insel-ECs für die Untersuchung der Gefäßstruktur und die Analyse der zellulären Interaktion.
Abbildung 1: Illustration der Vaskularisation der Bauchspeicheldrüse und der Pankreasinseln. Eine bildliche Darstellung der Endothelzellen (ECs) der Bauchspeicheldrüse und der Intra-Insel-ECs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diagramm zur Vorbereitung der einzelligen Bauchspeicheldrüse; Zentrifugation, CD31-Biotin-Markierung, Durchflussanalyse.
Abbildung 2: Überblick über den Arbeitsablauf. 1) Pankreasdissektion, 2) mechanischer Verdau, 3) Enzyminkubation, 4) Zentrifugation, 5a) Entfernung des Überstands und 5b) sekundärer Kollagenaseverdau der Zellpellets mit Verreibung zur Filterung in 6), 7) und 8) Rekonstitution von Pellets und Antikörperbindung, 9) Inkubation von Mikrobeads, 10) Anreicherung von MACS-Säulen, 11) Zellzählung für die Lebensfähigkeit und 12) nachgelagerte Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Gewebedissektion, die den Entnahme-, Isolierungs- und Trimmprozess der Bauchspeicheldrüse in der biologischen Forschung zeigt.
Abbildung 3: Schritte der Gewebeverarbeitung. Bilder von (A) der Bauchhöhle, (B) der isolierten Bauchspeicheldrüse der Maus und (C) der getrimmten Bauchspeicheldrüse der Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse der Genexpression, CD31-Analyse, DAPI, Zellsortierung, Fluoreszenz und Durchflusszytometrie.
Abbildung 4: Validierung isolierter EC-Fraktionen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus. (A) qPCR von FT-Proben und angereicherter EC-Fraktion mit CD31 zur Anreicherung. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) und Nkx6.1 (pankreatischer β-zellspezifischer Transkriptionsfaktor)33. * bedeutet p <0,05 im Vergleich zu FT auf der Grundlage von t-Tests . n = 3-4 gepoolte Proben, bestehend aus je 3 Mäusen. (B) Western-Blotting von CD31. pEC-1-3 zeigen angereicherte ECs aus 3 separaten gepoolten Mausproben an. Zelllysate von 30 mg wurden auf jede Spur geladen, gefolgt von einer Ponceau S-Färbung. (C) Zellzählung und Trypanblau-Färbung von angereicherten pECs für den Viabilitätsassay. (D) Durchflusszytometrische Gating-Strategie für Maus-pECs, die mit 4'-, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und CD31-Antikörpern gefärbt wurden. (E) Durchflusszytometrische Histogramme von ungefärbtem MS1 (oben links), MS1, gefärbt mit AlexaFluor-488-Sekundärantikörper (IgG-Kontrolle; oben rechts), MS1, gefärbt mit CD31 (unten links) und den isolierten Maus-pECs, gefärbt mit CD31 (unten rechts). (F) Prozentsatz lebender Zellen, quantifiziert mittels Durchflusszytometrie. (G) Immunfluoreszenz der CD31-Expression (grün) mit DAPI-Gegenfärbung (blau) und endogenem TdTomato-Fluoreszenzreporter (rot). Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Immunfluoreszenzmikroskopie CD31/CD144/DAPI, UMAP-Genexpressionsanalyse von Cdh5, Pecam1.
Abbildung 5: CD31- und CD144-Spezifität in der Bauchspeicheldrüse der Maus. (A) Immunfluoreszenz der Bauchspeicheldrüse der Maus mit CD31 (Magenta) und CD144 (Cyan), mit DAPI-Gegenfärbung. Bild, das mit einem 10-fach-Objektiv unter einem inversen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurde. Maßstabsleiste = 100 μm. Gestrichelte Linien markieren den Inselbereich. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP), die die Expression von Cdh5 und Pecam1 in den Insel-ECs von C57BL6-Mäusen zeigt, die mit scRNA-seq (GSE128565)37 nachgewiesen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

EnzymGebrauchenTemperatur und ZeitReferenz
Kollagenase IEinzelzelldissoziation, EC-Anreicherung der gesamten Bauchspeicheldrüse37 °C, 20 minDieses Protokoll
Kollagenase IVInselisolierung und nicht-enzymatische Dissoziation37 °C, 20 min46
Kollagenase + TrypsinUntersuchung duktaler Zellen in der Bauchspeicheldrüse der Maus37 °C, 30 min47
Kollagenase BEinzellige Suspension der Bauchspeicheldrüse37 °C, 30 min48
Kollagenase NBIIsolierung von Inselzellen37 °C, 30 min49
Kollagenase PAcinar lebensfähige Suspension37 °C, 15 min45
Kollagenase XIIsolierung von Inselzellen37 °C, 15 min35
DispaseEinzellige Suspension37 °C, 45 min24
LiberaseEinzellige Suspension37 °C, 10 min25, 48
TrypsinEinzelzelldissoziation, ganze Bauchspeicheldrüse4 °C, O/N28

Tabelle 1: Zusammenfassung verschiedener Protokolle, die zur Verarbeitung von Pankreasproben der Maus verwendet werden.

Diskussion

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung und Isolierung der pECs vor. Ähnlich wie frühere EC-Isolierungsprotokolle aus anderen Geweben oder Organen besteht dieses Protokoll aus drei Hauptprozessen, nämlich der physikalischen Dissoziation, dem enzymatischen Verdau und der Antikörper-basierten EC-Anreicherung. Um den einzigartigen Herausforderungen bei der Verarbeitung der Bauchspeicheldrüse gerecht zu werden, haben wir mehrere wichtige Anpassungen und kritische Schritte in unser Protokoll aufgenommen: 1) einen sanften einstufigen Kollagenase-Verdau mit kurzer Inkubationszeit, 2) eine Supplementierung mit einer höheren Konzentration an DNase und einem Trypsin-Inhibitor, um die DNA-Kontamination und den endogenen Enzymverdau zu minimieren, was die Antikörperbindung beeinträchtigen und somit die EC-Anreicherung und -Lebensfähigkeit verringern kann, und 3) die Zellzählung nach dem Verdauungsschritt, um die Art und Weise anzupassen. Der Probe wird viel Antikörper zugesetzt, um die EC-Anreicherung zu optimieren. Im Zuge der Optimierung dieses Protokolls testeten wir andere Enzyme, die in früheren Studien verwendet wurden, z. B. Trypsin28, Kollagenase Typ IV31 und andere Verdauungstemperaturen, z. B. 4 °C, sowie unterschiedliche Inkubationszeiten (Tabelle 1). Wir fanden Kollagenase Typ I, 20 min, bei 37 °C die optimale Bedingung für die pEC-Isolierung der Maus und haben diese hier verwendet. Während die Zugabe eines Antikoagulans während der Perfusion die allgemeine Zellviabilität verbessern kann, kann ein typisches Antikoagulationsmittel, z. B. EDTA oder Heparin, die Aktivität bestimmter Enzyme beeinträchtigen, z. B. Kollagenase für die Zelldissoziation und reverse Transkriptase, die in der qPCR verwendet werden. Um die unerwartete/unerwünschte Wirkung dieser Antikoagulanzien zu verhindern, wird PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) zur Perfusion verwendet.

Wir konzentrierten uns auf die Entwicklung eines Protokolls für die Anreicherung der EC-Population aus ganzen Pankreasen der Maus, das sowohl Intra-Insel-ECs als auch ECs in den exokrinen Geweben umfasst, was zu einer höheren Ausbeute führt. Im aktuellen Protokoll haben wir 3 Tiere während des Dissoziationsschritts zusammengepoolt und im Durchschnitt eine einzellige Suspension mit etwa 2,0 x 106 lebensfähigen Zellen erreicht. Wir haben auch Proben aus einer einzelnen Bauchspeicheldrüse der Maus getestet, so dass etwa 750.000 Zellen gewonnen werden können. Es ist erwähnenswert, dass bei der Umstellung auf die Verarbeitung eines einzelnen Tieres weniger Dissoziationslösung (3 ml Dissoziation pro Bauchspeicheldrüse) verwendet werden sollte. Ein entscheidender Schritt im Protokoll besteht darin, das restliche Fett, das an der Bauchspeicheldrüse haftet, vollständig zu kürzen und zu entfernen (Abbildung 3B). Eine Kontamination des Fettgewebes in der Kollagenaseverdauung wird den Dissoziationsschritt der Pankreas-Einzelzelldissoziation beeinträchtigen und die Lebensfähigkeit der Zellen in den nachfolgenden Anreicherungsschrittenverringern 38. Darüber hinaus haben wir zur Anreicherung von pECs einen Pan-EC-Oberflächenmarker, PECAM1/CD31, verwendet. Mit Hilfe von PECAM1/CD31-Antikörpern konnten wir die EC-Fraktionen signifikant anreichern, was durch die Genexpressionsanalyse nachgewiesen wurde. Bei der Entwicklung dieses Protokolls haben wir auch den Nutzen des CD144-Antikörpers getestet, der auch häufig zur Isolierung vonECs 13 verwendet wird. Wir waren jedoch nicht in der Lage, pECs anzureichern (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise zeigte die Immunfluoreszenzfärbung, dass CD31 in allen ECs im Pankreasgewebe exprimiert wird, während CD144-Antikörper nur Intra-Insel-ECs zu färben scheinen (Abbildung 5A). Darüber hinaus analysierten wir öffentlich zugängliche einzelzellige RNA-seq-Daten von Inselzellen, die aus C57BL/6-Mäusen (GSE128565)37 isoliert wurden, und fanden heraus, dass etwa 50% der Insel-ECs sowohl Cdh5 (VE-Cad) als auch Pecam1 exprimieren, der Rest der Insel-ECs jedoch nur Cdh5 oder Pecam1 exprimiert (Abbildung 5B). Daher spekulieren wir, dass CD31-Antikörper besser für die pEC-Isolierung geeignet sind und der Nutzen von CD144-Antikörpern für diesen Zweck zukünftige Untersuchungen rechtfertigt. Darüber hinaus gibt es kommerziell erhältliche Anti-CD31-Konjugationen mit magnetischen Kügelchen, die den zweistufigen Antikörperbindungsschritt auf einen einzigen Schritt vereinfachen können.

Wie gezeigt, führten wir qPCR, Immunblotting, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzfärbung durch, um die isolierte EC-Fraktion zu validieren. Es ist denkbar, dass diese Fraktionen anderen Assays, wie z.B. (sc)RNA-seq und Massenspektrometrie, unterzogen werden können. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass wir nicht in der Lage waren, eine robuste Subkultur zu erreichen und funktionelle Assays durchzuführen. Angesichts der Tatsache, dass sich die Subkultur isolierter Maus-ECs als Herausforderung erwiesen hat, ist dies ein Bereich, der zukünftige Bemühungen rechtfertigt. Eine Möglichkeit, dies zu beheben, könnte die Einführung des großen T-Antigens sein, das zur Immortalisierung von Primärzellen verwendet wurde39.

Die jüngsten Fortschritte und die Anwendung der scRNA-Sequenzierung haben ein hochauflösendes Profiling von Pankreaszellen40 und insbesondere von Inselzellen41 ermöglicht. Die meisten der bestehenden Studien konzentrierten sich jedoch auf endokrine Zellpopulationen und verwendeten Gewebedissoziationsprotokolle, die ECs nicht effizient zurückhalten. Infolgedessen sind die EC-Fraktionen oft knapp und machen nur 3%-5% in der gesamten gefangenen Zellpopulation aus 42,43,44. Ein kürzlich veröffentlichtes Protokoll verwendet einen zweistufigen enzymatischen Verdau und eine Deaktivierung sowie einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierschritt und gewinnt ECs bei 12 % der gesamten Pankreaszellpopulation45. Ergänzend zu diesem Protokoll bietet unser Protokoll einen vereinfachten Arbeitsablauf, der kostengünstiger und technisch weniger anspruchsvoll sein kann, wenn ECs im Mittelpunkt der Studie stehen. Obwohl dieses Protokoll nur an der Bauchspeicheldrüse der Maus getestet wurde, kann es hochskaliert und angepasst werden, um ECs aus anderen Organismen, einschließlich der menschlichen Bauchspeicheldrüse, zu isolieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Brian Armstrong von der City of Hope und Mindy Rodriguez von der University of California, Riverside, für ihre technische Unterstützung. Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse des NIH (R01 HL145170 an ZBC), der Ella Fitzgerald Foundation (an ZBC), City of Hope (Arthur Riggs Diabetes Metabolism and Research Institute Innovation Award) und des California Institute of Regenerative Medicine Grant EDU4-12772 (an AT) finanziert. Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsarbeiten umfassten Arbeiten im Bereich Lichtmikroskopie und digitale Bildgebung, die vom National Cancer Institute der NIH unter der Preisnummer P30CA033572 unterstützt wurden. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit BioRender erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL eppendorfUSA Scientific1615-5500
10 cm SchaleGenesee Scientific25-202
25G NadelnBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher 
6-Well-PlatteGreiner Bio-One07-000-208
70 µ m SiebFisher22-363-548
Anti-CD31-BiotinMiltenyi BiotechREA784
Rinderserum Albumin Hitzeschock behandeltFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
ZentrifugeEppendorf
Kollagen Typ 1, aus KalbslederSigma Aldrich& nbsp;C9791Attachment-Reagenz im Protokoll
Kollagenase Typ 1 Worthington BioLS004197
Countess Automatischer ZellzählerThermo Fisher 
DAPIThermo Fisher D1306
Myco Instrumentation6008TR-10
DNAse I Roche260913 
D-PBS (Ca2+,Mg2+)Thermo Fisher 
EthanolFisherBP2818-4
Fötales RinderserumFisher10437028
InkubatorGehalten bei 37 > C 5% CO2
LS SäulenMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand mit dem QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech130-042-303
Medium 199Sigma Aldrich M2520-10X
Mikrokügelchen Anti-BiotinMiltenyi Biotech130-090-485
MikroskopLeicaZur Beurteilung der Zellmorphologie
Molekulares WasserCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbitalschüttler Eppendorf
PECAM1 (CD31) AntikörperAbcamab56299Immunfluoreszenz
PECAM1 (CD31) AntikörperR& D SystemsAF3628
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X) (kein Ca2+, kein Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 VorwärtsmausIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese Maus IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward Maus IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse MausIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse Maus IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 VorwärtsmausIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 VorwärtsmausIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 RückwärtsmausIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher AM9780
RNasefreies WasserTakaraRR036B
Sterile 12" lange PinzetteF.S.T91100-16
Sterile FeinzangeF.S.T11050-10
Sterile FeinschereF.S.T14061-11
Gewebekulturschalen 2cmGenesee Scientific25-260
TRIzol ReagenzFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
Trypsin-InhibitorRoche10109886001
Tween-20
VE-Cadherin-AntikörperAbcamab33168Immunfluoreszenz-Wasserbad
14282300Immunfluoreszenz-Einweg-Sicherheitsskalpelle14080055

Referenzen

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