Generierung und funktionelle Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und funktionellen Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen vor. Dieses Protokoll stellt die Lentivirus-basierte Generierung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen und deren Charakterisierung vor, einschließlich der Validierung der Hypoxie-abhängigen CAR-Expression und der selektiven Zytotoxizität.

Abstract

Umfangreiche Studien haben das Versprechen der chimären Antigenrezeptor-T-ZELLTHERAPIE (CAR-T) bei der Behandlung hämatologischer Malignome bewiesen. Die Behandlung solider Tumore bleibt jedoch eine Herausforderung, wie die Sicherheitsbedenken zeigen, die entstehen, wenn CAR-T-Zellen normale Zellen angreifen, die die Zielantigene exprimieren. Forscher haben verschiedene Ansätze untersucht, um die Tumorselektivität der CAR-T-Zelltherapie zu verbessern. Eine repräsentative Strategie in diesem Sinne ist die Konstruktion von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen, die durch die Fusion einer sauerstoffabhängigen Abbaudomäne mit der CAR-Einheit konzipiert sind und so konzipiert sind, dass sie nur in einer hypoxischen Umgebung - der Tumormikroumgebung (TME) - eine hohe CAR-Expression erreichen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Erzeugung solcher CAR-T-Zellen und ihre funktionelle Charakterisierung vorgestellt, einschließlich Methoden zur Analyse der Veränderungen der CAR-Expression und der Abtötungskapazität als Reaktion auf unterschiedliche Sauerstoffgehalte, die von einer mobilen Inkubatorkammer festgelegt werden. Es wird erwartet, dass die konstruierten CAR-T-Zellen die CAR-Expression und Zytotoxizität auf sauerstoffempfindliche Weise nachweisen und damit ihre Fähigkeit unterstützen, zwischen hypoxischem TME und normoxischem Normalgewebe für eine selektive Aktivierung zu unterscheiden.

Introduction

Die Therapie mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR-T) hat einen bedeutenden Durchbruch in der Krebsbehandlung dargestellt. Seit der Zulassung der ersten CAR-T-Therapie zur Behandlung von fortgeschrittenem/resistentem Lymphom und akuter lymphatischer Leukämie durch die Food and Drug Administration (FDA) im Jahr 2017 ^{1,2,3 1,2,3} haben 10 CAR-T-Therapien, die auf CD19 oder das B-Zell-Reifungsantigen (BCMA) abzielen, weltweit die Zulassung erhalten⁴. Trotz umfangreicher Forschung bleibt es jedoch schwierig, die bemerkenswerte Wirksamkeit der CAR-T-Therapie bei der Behandlung hämatologischer Malignome zu replizieren 5,6,7,8.

Die immunsuppressive Tumormikroumgebung (TME) ist ein Hauptgrund für die schlechte Wirksamkeit von CAR-T bei soliden Tumoren. TME behindert die Aktivität und das Überleben von CAR-T-Zellen aufgrund von unzureichenden Nährstoffen, Hypoxie, einem sauren pH-Wert und der Ansammlung von Stoffwechselabfällen 9,10,11,12. Weitere Feindseligkeit kommt von infiltrierenden immunsuppressiven Zellen wie regulatorischen T-Zellen (Tregs), myeloischen Suppressorzellen (MDSCs) und tumorassoziierten Makrophagen (TAM), die neben Tumorzellen immunsuppressive Zytokine sezernieren, die eine zusätzliche Hemmung von CAR-T-Zellen verursachen, sobald sie in den Tumor eindringen^13,14.

Neben der unbefriedigenden therapeutischen Effizienz sind Sicherheitsaspekte eine weitere Achillesferse von CAR-T-Zellen im Umgang mit soliden Tumoren^15,16. Die Sicherheitsbedenken ergeben sich aus der Tatsache, dass keines der bisher identifizierten tumorspezifischen Antigene (TSA) streng auf Tumorzellen beschränkt ist. Mit anderen Worten, die tumorassoziierten Antigene (TAA), die als Ziel von CAR ausgewählt wurden, zeigen zwar eine höhere Expression in Tumorzellen, werden aber oft auch von normalem Gewebe exprimiert¹⁷. On-Target- und Off-Tumor-Effekte könnten daher durch die unerwartete Aktivierung von CAR-T-Zellen auftreten, wenn CAR normales Gewebe effizient erkennt, was zum Zytokinfreisetzungssyndrom (CRS), zum CAR-T-bedingten Enzephalopathie-Syndrom (CRES)¹⁸ und anderen unerwünschten Ergebnissen führt¹⁹.

Es wurden viele Strategien untersucht, um solche Effekte zu vermeiden, einschließlich der Verringerung der Affinität von CAR, damit CAR-T-Zellen Tumorzellen von normalen Zellen auf der Grundlage der Expressionsniveaus des Ziel-TAA unterscheiden können; Ausrüstung von CAR-T-Zellen mit einem Ausschalter, wie z. B. einem Selbstmordgen oder einem Eliminationsmarker, um ihre Eliminierung bei unerwarteter Aktivierung zu fördern; Aufteilung des CD3ζ und der co-stimulatorischen Signale in zwei CAR-Einheiten, deren gleichzeitiges Eingreifen folglich für eine effektive Aktivierung von CAR-T-Zellen erforderlich ist; unter Verwendung eines synthetischen Notch (synNotch)-basierten Schaltkreises, der die Aktivität von CAR-T-Zellen auf Zielzellen beschränkt, die zwei verschiedene TAAs koexprimieren; und die Entwicklung von CAR-T-Zellen zur Erreichung der TME-Empfindlichkeit durch Implementierung eines Mechanismus zur Abstimmung der CAR-Expression auf sich ändernde Umweltreize 20,21,22,23,24,25,26.

Ein wichtiger Aspekt bei der oben beschriebenen TME-Sensitivitätsoption ist der niedrige Sauerstoffgehalt in der TME aufgrund der schnellen Proliferation von Tumorzellen. Die Akkommodation von Tumorzellen an die Hypoxie hängt von der Aktivierung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1 (HIF-1) ab, einem heterodimeren Transkriptionsfaktor, der aus einer induzierbaren Untereinheit, HIF-1α, und einer konstitutiv exprimierten Untereinheit, HIF-1β²⁷, besteht. Unter normoxischen Bedingungen erfährt das HIF-1α-Protein eine Ubiquitinierung und einen schnellen proteasomalen Abbau, abhängig von seiner sauerstoffabhängigen Abbaudomäne (ODD)²⁸. Wenn die zelluläre Versorgung mit Sauerstoff begrenzt ist, wird HIF-1 stabilisiert und aktiviert die Transkription seiner nachgeschalteten Zielgene durch Bindung an Hypoxie-Response-Elemente (HREs)²⁹. Angesichts der Natur von ODD und HRE als sauerstoffempfindliche Elemente wurden sie untersucht, um die bedingte Expression von CARs innerhalb des hypoxischen TME³⁰ zu realisieren. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das sich auf Methoden zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen konzentriert, gefolgt von einer kurzen Beschreibung des CAR-Designs und der Präparationsverfahren dieser Zellen. Dieses Protokoll soll eine nützliche Richtlinie für die Ausnutzung von Hypoxie-responsivem CAR zur Erzeugung von CAR-T-Zellen mit eingeschränkter Off-Tumor-Toxizität liefern.

Protocol

In dieser Studie wurde HER2-BBz-ODD, ein Hypoxie-sensitives CAR, das auf HER2 abzielt (Gen-ID: 2064), mit seinem regulären Gegenstück HER2-BBz verglichen. Die Schaltpläne der beiden CARs sind in Abbildung 1A dargestellt, die zeigt, dass HER2-BBz-ODD von HER2-BBz abgeleitet wird, indem die ODD-Sequenz an den C-Terminus von CD3ξ angehängt wird. Die Konstruktion von lentiviralen Vektoren, die die beiden CARs exprimieren, und die Erzeugung des entsprechenden Lentivirus durch 293T-Zelltransfektion wurde bereits beschrieben³¹.

1. Erzeugung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen durch lentivirale Infektion

1. Kryokonservierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) des Menschen werden schnell bei 37 °C in einem Wasserbad aufgetaut. Übertragen Sie die aufgetauten PBMCs in ein 15-ml-Röhrchen mit 9 ml serumfreiem Lymphozyten-Kulturmedium, ergänzt mit 400 IE IL-2, 5 ng/ml IL-7 und 10 ng/ml IL-15 (humanes T-Zell-Wachstumsmedium, im Folgenden als TGM bezeichnet).
2. Nach der Entnahme eines Aliquots für die Zellzählung zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für 5 Minuten. Resuspendieren Sie die pelletierten PBMCs mit TGM bei einer Dichte von 4 × 10⁶ Zellen/ml und überführen Sie die Suspension in eine 6-Well-Platte.
3. Bereiten Sie anti-hCD3/hCD28-beschichtete Immunbeads vor.
   1. Übertragen Sie 100 μl Maus-IgG-Magnetkügelchen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und waschen Sie sie 2 Mal mit einem Magnetständer mit PBS.
   2. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 μl PBS und fügen Sie 0,2 μg Maus-Anti-Human-CD3-Antikörper und 2 μg Maus-Anti-Human-CD28-Antikörper hinzu. Die Mischung vorsichtig mit einer Pipette mischen und über Nacht bei 4 °C wiegen.
   3. Waschen Sie die Kügelchen 2 Mal mit einem Magnetständer mit PBS und suspendieren Sie sie in 100 μl PBS.
4. Geben Sie in Schritt 1.2 anti-hCD3/hCD28-beschichtete Immunobeads in einem Bead-to-Cell-Verhältnis von 1:1 auf die Platte. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C.
5. Nach 48 Stunden Inkubation wird die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, nachdem die Zellen vorsichtig mit einer Pipette gemischt wurden. Stellen Sie das Röhrchen für 3 Minuten auf einen Magnetständer und übertragen Sie dann den Überstand vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen, um Immunbeads von den PBMCs zu entfernen.
6. Nehmen Sie ein Aliquot für die Zellzählung und säen Sie dann die PBMCs in 5 × 10⁵ Zellen/Well in 300 μl TGM in eine flache 48-Well-Platte. Geben Sie 200 μl lentiviralen Stamm in die entsprechenden Vertiefungen und fügen Sie Protaminsulfat bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml hinzu.
7. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 × g bei 32 °C für 1,5 h und entfernen und entsorgen Sie vorsichtig 300 μl Überstand aus jeder Vertiefung mit einer Pipette. Geben Sie dann mit einer Pipette 1 ml frisches TGM hinzu und stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C.
8. Fügen Sie frisches TGM hinzu, um die Zelldichte alle 2-3 Tage auf 0,5-2 × 10⁶ Zellen/ml einzustellen. Beginnen Sie damit, die Zellen zuerst auf eine 12-Well-Platte und dann auf eine 6-Well-Platte zu übertragen. Fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen fort, bis die Gesamtzahl 6 × 10⁶ in einem Volumen von 4 ml erreicht.
   HINWEIS: Parallel dazu ist die CAR-Transduktion von Jurkat-T-Zellen nach den gleichen oben beschriebenen Verfahren durchzuführen, mit der Ausnahme, dass TGM durch RPMI1640 Medium ersetzt wird, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält.

2. Beurteilung der sauerstoffabhängigen CAR-Expression in CAR-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie

1. Die CAR-transduzierten T-Zellen aus Schritt 1.8 werden in zwei 12-Well-Platten mit einer Dichte von 2,5 × 10⁶ Zellen/Well in 2 ml TGM plattiert. Legen Sie eine Platte direkt in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C (normoxischer Zustand, da der Standardzustand für die Kultivierung von Zellen 21 % O₂ beträgt) und stellen Sie die andere Platte in eine mobile CO₂/O₂/N₂ -Inkubatorkammer mit dem auf 1 % voreingestellten O₂ -Gehalt (hypoxischer Zustand) und halten Sie die Kammer dann in einer befeuchteten 5 % CO₂/94 % N₂ -Inkubator bei 37 °C.
2. Alle 24 Stunden werden 5 × 10⁵ Zellen von den Platten unter hypoxischen oder normoxischen Bedingungen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen entnommen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 500 × g , entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren in 1 ml PBS. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche noch einmal.
3. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 50 μl FACS-Puffer (PBS ergänzt mit 2 % FBS) in jedem Röhrchen. 50 μl einer Verdünnung von 1:100 PE-konjugierten Anti-Flag-Antikörper (0,2 μg/ml) zugeben und durch Pipettieren gründlich mischen. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.
4. Geben Sie am Ende der Inkubation 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen. Durch Pipettieren gründlich mischen und dann 5 Minuten lang bei 500 × g zentrifugieren.
5. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und wiederholen Sie Schritt 2.4 noch einmal.
6. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer und überführen Sie dann die resultierende Zellsuspension in 5 ml-Durchflussröhrchen.
7. Führen Sie in Schritt 2.6 eine Durchflusszytometrie an der Zellsuspension durch, um die Oberflächen-CAR-Expression zu bestimmen. Nicht transfizierte T-Zellen als Negativkontrolle einschließen.
   1. Verwenden Sie die Gatter FSC/SSC und FSC-A/FSC-H, um lebende Einzelzellen zu screenen. Sammeln Sie 1 × 10⁴ Live-Einzelereignisse für jede Stichprobe. Gatet die Zellen, die positiv für EGFP sind (ein konstitutiver Marker, der im lentiviralen Vektor als Indikator für erfolgreich transduzierte T-Zellen verwendet wird) und dann die Zellen, die positiv für Phycoerythrin (PE) sind (CAR-exprimierende Zellen), um die PE-Positivität und die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) zu messen.

3. Analyse der Sauerstoffabhängigkeit der CAR-Expression in CAR-modifizierten Jurkat T-Zellen mittels Western Blot

1. Die CAR-transduzierten Jurkat T-Zellen aus Schnitt 1 werden in zwei 48-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Well (500 μl Kulturvolumen) in RPMI1640 Medium mit 10 % FBS plattiert.
2. Für eine Platte wird CoCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 0 μM, 50 μM oder 200 μM in die Versuchsvertiefungen gegeben. Stellen Sie die Platte dann in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C (normoxischer Zustand). Für die andere Platte fügen Sie kein CoCl₂ hinzu und stellen Sie sie in eine mobile CO₂/O₂/N 2-Inkubatorkammer mit dem auf 1 % (hypoxischer Zustand) voreingestellten O_2-Niveau, bevor Sie sie in denselben Inkubator umfüllen.
3. Nach 24 Stunden Inkubation werden die Zellsuspensionen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Röhrchen bei 500 × g 5 min zentrifugieren. Entfernen und verwerfen Sie die Überstände zuerst mit einer 1-ml-Pipette, dann mit einer 100-μl-Pipette und resuspendieren Sie die Zellpellets in 50 μl 1x SDS-PAGE-Probenpuffer.
4. Erhitzen Sie die Proben in einem kochenden Wasserbad für 10 min. Stellen Sie das Röhrchen sofort 30 s lang auf Eis und zentrifugieren Sie es dann 30 s lang bei 16.000 × g .
5. Laden Sie 30 μl der freigegebenen Proben in jeden Schlitz eines 10-Well-PAGE-Gels mit 10 % SDS mit einer Dicke von 1,5 mm. Lassen Sie das Gel 30 min lang bei 80 V laufen, erhöhen Sie dann die Spannung auf 100 V und lassen Sie es 1,5 h laufen.
6. Am Ende der Elektrophorese übertragen Sie Proteine aus dem Gel auf eine PVDF-Membran unter Verwendung der Standard-Nasstransfermethode, wobei der Strom und die Dauer auf 400 mA bzw. 1 h eingestellt sind.
7. Blockieren Sie die Membran in Blockierungspuffer (5 % Milch (w/v) in PBST (PBS+0,05 % Tween-20)) für 1 h bei Raumtemperatur. Schneiden Sie dann das Stück zwischen 30 kD und 40 kD für den Nachweis der GAPDH-Ladesteuerung und das Stück zwischen 50 kD und 70 k D für den Nachweis der CAR-Moleküle aus.
8. Inkubieren Sie die 30-40 kD- und 50-70 kD-Stücke mit einem Maus-Anti-GAPDH-Antikörper (1:2.000 Verdünnung) bzw. einem Maus-Anti-Flag-Antikörper (1:2.000 Verdünnung) in 3 ml Blockierungspuffer entweder bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder bei 4 °C über Nacht.
9. Waschen Sie die Membranen mit PBST bei Raumtemperatur auf einer Plattformwippe für 3 x 5 min.
10. Inkubieren Sie die Membranen mit HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpern (1:5.000 Verdünnung) in 3 ml Blockierungspuffer bei Raumtemperatur für 1 h; Anschließend die Bahn 5 x 10 min mit PBST waschen.
11. Entwickeln Sie die Membranen, indem Sie sie mit einem HRP-Substrat inkubieren, und visualisieren Sie dann die detektierten Proteinbanden mit einem lumineszierenden Bildanalysator.

4. In-vitro-Bewertung der Sauerstoffabhängigkeit der Zytotoxizität, die durch Hypoxie-empfindliche CAR-T-Zellen vermittelt wird

1. An Tag 0 säen 1 × 10⁴ Zielzellen (SKOV3-Luc-Zellen) pro Versuchsvertiefung in 200 μl DMEM mit 10 % FBS in zwei schwarzen 96-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden.
2. Entfernen Sie an Tag 1 vorsichtig 100 μl des Überstands von der Oberseite jeder Vertiefung. Fügen Sie CAR-T-Zellen oder nicht transduzierte T-Zellen in einem Effektor-Ziel-Verhältnis von 1:1, 2:1 und 4:1 in 100 μl DMEM-Medium mit 10 % FBS hinzu.
3. Eine Platte wird in einer 21 % O₂ -Atmosphäre und die andere in einer 1 % O₂ -Atmosphäre in einer beweglichen CO₂/O₂/N₂ -Inkubatorkammer aufgestellt, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
   HINWEIS: Wenn keine mobile CO₂/_{O 2}/N₂ -Inkubatorkammer verfügbar ist, kann die Zugabe von CoCl₂ zum Kulturmedium verwendet werden, um einen hypoxischen Zustand nachzuahmen.
4. Übertragen Sie an Tag 2, nach 24 Stunden Co-Kultivierung, vorsichtig den gesamten Überstand (ca. 150-200 μl) mit einer Pipette in eine neue 96-Well-Platte mit U-Boden. Für den späteren Zytokinnachweis bei -20 °C lagern, indem Sie die in Abschnitt 5 beschriebenen Verfahren befolgen.
5. Geben Sie 60 μl 1x passiven Lysepuffer in jede Versuchsvertiefung der schwarzen 96-Well-Platten mit flachem Boden aus Schritt 4.4. Legen Sie dann die Platten auf einen Schüttler und schütteln Sie sie 30 Minuten lang, um eine effiziente Zelllyse zu gewährleisten.
6. Geben Sie 60 μl Glühwürmchen-Luziferase-Substrat in jede Versuchsvertiefung und messen Sie die Luziferase-Aktivität sofort mit einem Mikroplatten-Reader.
7. Berechnen Sie die normalisierte Zytotoxizität (%) mit Hilfe von Gleichung (1):
   Normalisierte Zytotoxizität (%) = 100 - ×100 (1)

5. Nachweis der IL-2- und IFN-γ-Sekretion durch Hypoxie-empfindliche CAR-T-Zellen

1. Bereiten Sie an Tag 0 eine 1:250-Verdünnung des IL-2- oder IFN-γ-Capture-Antikörpers in Beschichtungspuffer vor. Geben Sie 100 μl des verdünnten Antikörpers in jede Vertiefung einer 96-Well-ELISA-Platte und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4 °C.
   HINWEIS: Der Beschichtungspuffer wird hergestellt, indem 7,13 g NaHCO₃ und 1,59 g Na₂CO₃ in 1 l destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 9,5 eingestellt wird.
2. Entfernen Sie an Tag 1 den unadsorbierten Capture-Antikörper, indem Sie die Platte kräftig auf den Kopf stellen und dann die Wells 3x mit 200 μl Wash Buffer (PBS mit 0,05 % Tween 20) waschen.
3. Geben Sie 200 μl Assay-Verdünnungsmittel (PBS mit 10 % FBS) in jede Vertiefung und inkubieren Sie es 1 h lang bei Raumtemperatur.
4. Entsorgen Sie die Lösung, indem Sie die Platte kräftig auf den Kopf stellen; Waschen Sie dann die Wells 3x mit 200 μL Wash Buffer.
5. Die gefrorenen Überstandsproben/-platten aus Schritt 4.4 werden bei Raumtemperatur aufgetaut. Sobald die Proben und Standards vollständig aufgetaut sind, verdünnen Sie sie mit Assay Diluent. Geben Sie 100 μl verdünnte Proben oder Standards in jede Vertiefung der beschichteten ELISA-Platte und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Für den IL-2-Nachweis wird eine 10-fache Verdünnung empfohlen, während für den IFN-γ-Nachweis eine 50-fache Verdünnung bevorzugt wird.
6. Entfernen Sie die Proben und Standards, indem Sie die Platte kräftig auf den Kopf stellen, und waschen Sie die Wells dann 5x mit 200 μl Wash Buffer pro Well.
7. Bereiten Sie eine funktionierende Nachweislösung her, indem Sie den IL-2-Nachweisantikörper oder den IFN-γ-Nachweisantikörper/Streptavidin-HRP (SAv-HRP) im Verhältnis 1:250 im Assay-Verdünnungsmittel verdünnen. Geben Sie 100 μl der Arbeitsdetektionslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
8. Entsorgen Sie die Lösung und waschen Sie die Vertiefungen 7x mit 200 μl Waschpuffer.
9. Geben Sie 100 μl Substratreagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
10. Geben Sie 50 μl Stopplösung (1 M H₂SO₄) in jede Vertiefung. Lesen Sie sofort die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader ab.

Results

Die Fusion der ODD-Domäne von HIF-1α mit der CAR-Einheit stellt eine primäre Strategie zur Erzeugung eines Hypoxie-sensitiven CAR dar. Das in dieser Studie analysierte Hypoxie-sensitive HER2-targeting-CAR mit der Bezeichnung HER2-BBz-ODD wurde unter Verwendung dieser Strategie konstruiert, indem die ODD-Sequenz in sein konventionelles HER2-BBz integriert wurde (Abbildung 1A). In dieser Studie nutzten wir die lentivirale Transduktion zur Expression von HER2-BBz-ODD CAR oder HER2-BBz CAR und untersuchten anschließend ihre Sauerstoffsensitivität in zwei Zelltypen: humane PBMCs und Jurkat T-Zellen.

Die erste Untersuchung befasst sich mit der Expression von CAR unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu normoxischen Bedingungen, die sowohl in CAR-transduzierten PBMC-abgeleiteten T-Zellen mittels Durchflusszytometrie als auch in CAR-transduzierten Jurkat T-Zellen durch Western Blot durchgeführt wurde. Im Setting von CAR-transduzierten PBMC-abgeleiteten T-Zellen beobachteten wir, dass HER2-BBz-ODD CAR eine signifikant höhere Expression unter 1% O₂ als unter 21% O₂ aufwies, sowohl in Bezug auf den Prozentsatz der CAR-positiven Zellen als auch auf die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) (Abbildung 1B). Die Immunblotting-Analyse von CAR-transduzierten Jurkat-T-Zellen bestätigte auch die Hypoxie-abhängige Induktion von HER2-BBz-ODD.

Es ist erwähnenswert, dass in diesem Zusammenhang der hypoxische Zustand bequem nachgeahmt werden kann, indem dem Kulturmedium CoCl₂, ein chemischer Induktor der Hypoxie, zugesetzt wird. Wie in Abbildung 1C dargestellt, zeigten unsere Immunblotting-Ergebnisse, dass die Exposition bei 50 oder 200 μM CoCl₂ die Wirkung der Exposition bei 1 % O₂ rekapitulierte, was die Expression des HER2-BBz-ODD CAR, aber nicht die des HER2-BBz CAR deutlich induzierte. Die funktionelle Charakterisierung von Hypoxie-sensitiven CAR wurde mit PBMC-abgeleiteten CAR-T-Zellen durchgeführt. In der Studie wurde eine Glühwürmchen-Luciferase-tragende SKOV-3-Zelllinie als Zielzelllinie verwendet. Dieser Aufbau ermöglichte es uns, die zielzellassoziierte Luciferase-Aktivität als Proxy für die Beurteilung der Zytotoxizität zu messen, die durch co-kultivierte CAR-T-Zellen vermittelt wird.

Wie in Abbildung 1D gezeigt, zeigten die Messungen, dass die HER2-BBz CAR-T-Zellen Zielzellen effektiv abtöten, unabhängig davon, ob die Atmosphäre normoxisch oder hypoxisch war. Im Gegensatz dazu zeigten die HER2-BBz-ODD CAR-T-Zellen unter normoxischen Bedingungen für alle drei untersuchten E:T-Verhältnisse eine signifikant schwächere Zytotoxizität. Ihre Zytotoxizität war jedoch signifikant erhöht, wenn sie hypoxischen Bedingungen ausgesetzt wurden. Die Überstandsspiegel von IL-2 und IFN-γ wurden ebenfalls per ELISA gemessen, nachdem CAR-T-Zellen 24 Stunden lang mit Zielzellen co-kultiviert wurden. Für beide Zytokine wurde eine höhere Sekretion unter 1 % O₂ im Vergleich zu 21 % O₂ für HER2-BBz-ODD CAR-T-Zellen beobachtet, was mit den Zytotoxizitätsdaten übereinstimmt. Im Gegensatz dazu zeigten HER2-BBz CAR-T-Zellen eine geringere Sekretion der beiden Zytokine unter 1% O₂ im Vergleich zu 21% O₂, was auf einen nachteiligen Einfluss von Hypoxie auf die zelluläre Aktivität hinweist (Abbildung 1E). Zusammengenommen bestätigten diese Ergebnisse überzeugend die Hypoxie-sensitive Natur von HER2-BBz-ODD CAR.

Abbildung 1: Aufbau und Charakterisierung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen. (A) Schematische Darstellung des Designs eines Hypoxie-sensitiven CAR, HER2-BBz-ODD, und seines konventionellen Gegenstücks, HER2-BBz. Beide CARs bestehen aus einem N-terminalen CD8α-Signalpeptid, einem FLAG-Tag, einem humanen HER2-gerichteten scFv, einer CD8-Scharnier- und Transmembrandomäne sowie einem intrazellulären Teil, der aus einer kostimulatorischen Domäne von 4-1BB, einer CD3ξ-Signaldomäne, einem IRES und einem EGFP besteht. HER2-BBz-ODD unterscheidet sich von HER2-BBz durch die Fusion einer ODD-Domäne mit dem C-Terminus der CD3ξ-Signaldomäne, was seine hypoxische Expression ermöglicht, indem es seinen Ubiquitin-abhängigen Abbau unter normoxischen Bedingungen fördert. (B,C) Untersuchungen der sauerstoffabhängigen Expression von HER2-BBz-ODD CAR. (B) Eine Bewertung wurde mit humanen PBMC-abgeleiteten CAR-T-Zellen durchgeführt, nachdem sie 24, 48 oder 72 Stunden lang unter 1 % oder 21 %_O2 mittels Durchflusszytometrie kultiviert worden waren. (C) Die andere Bewertung bezog sich auf CAR-transduzierte Jurkat-T-Zellen, bei denen Zelllysate 24 Stunden nach Kultivierung unter 21 %_O2, 50 oder 200 μM CoCl₂ oder 1 %_O2 geerntet und mittels Western Blotting auf CAR-Expression analysiert wurden, wobei HER2-BBz CAR-transduzierte Zellen als Kontrolle einbezogen wurden. (D,E) In vitro Zytotoxizität und Zytokinsekretion von CAR-T-Zellen unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen. (D) CAR-T-Zellen wurden mit Glühwürmchen-Luziferase-exprimierenden SKOV3-Zellen bei indizierten E:T-Verhältnissen unter 1 % bzw. 21 %_O2 co-kultiviert. Nach 24 Stunden Co-Kultivierung wurde die Tötungseffizienz der Zielzellen bestimmt, indem die Veränderung der zellassoziierten Glühwürmchen-Luziferase-Aktivität im Vergleich zu nicht transduzierten T-Zellen gemessen wurde. (E) Die Überstände wurden für den Nachweis von sezerniertem IL-2 und IFN-γ gesammelt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (n = 3 gesunde Spender) (****p < 0,0001) dargestellt. Abkürzungen: scFv = einkettige Fragmentvariable; CAR = chimärer Antigenrezeptor. Die Panels C und D sind von Liao et ^al.31 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Sicherheitsbedenken sind wichtige Aspekte, die angegangen werden müssen, damit eine CAR-T-Zelltherapie in den klinischen Einsatz übergehen kann. Die Nutzung der einzigartigen Eigenschaften von Tumorzellen oder der TME ist zu einer primären Forschungsrichtung geworden, die sich auf die Entwicklung von CAR-T-Zellen konzentriert, die selektiv auf Tumorgewebe abzielen. Das Design eines Hypoxie-sensitiven CAR-T ist eine attraktive Strategie in diese Richtung, wobei mehrere Ansätze untersucht werden, einschließlich des in dieser Studie vorgestellten - die Fusion der CAR-Einheit mit der natürlich vorkommenden Hypoxie-empfindlichen ODD-Proteindomäne. Ein alternativer Ansatz besteht darin, einen konstitutiven Promotor, der üblicherweise zur Steuerung der CAR-Expression verwendet wird, durch ein Hypoxie-Response-Element (HRE) zu ersetzen, das sich in früheren Studien als vielversprechend erwiesen hat. Es wird angenommen, dass die Kombination von HRE- und ODD-Elementen (Wildtyp- oder Engineering-Versionen, die eine engere Kontrolle der Expression bieten) ein optimales Design für ein Hypoxie-induzierbares CAR darstellt.

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren zur Erzeugung und Validierung von Hypoxie-empfindlichen CAR-T-Zellen. Die Umsetzung dieses Protokolls beinhaltet mehrere wichtige Überlegungen. Eine Hauptüberlegung ist die Schaffung hypoxischer Bedingungen. Zwischen den beiden Ansätzen wurde die Zugabe von CoCl₂ zum Kulturmedium in früheren Hypoxie-bezogenen Studien vor allem dank ihrer Bequemlichkeit verwendet^32,33. Es ist jedoch unmöglich, den Grad der Hypoxie zu messen, der mit diesem Ansatz nachgeahmt wird. Im Gegensatz dazu ist die Verwendung einer mobilen CO₂/O₂/N₂ -Inkubationskammer insofern vorteilhaft, als dass die O₂ -Spiegel präzise eingestellt werden können und sich somit für eine Feinanalyse der Hypoxie-Empfindlichkeit von CAR-T-Zellen eignet. In dieser Hinsicht variiert der Hypoxiespiegel innerhalb von Tumoren zwischen verschiedenen Arten solider Tumoren und verschiedenen Perioden der Tumorprogression³⁴, während nur 1% O₂ im Protokoll beispielhaft dargestellt wird. Für Forscher ist es optimal, den Sauerstoffgehalt entsprechend dem tatsächlichen Bedarf anzupassen. Wenn die CoCl_2-Methode der einzige verfügbare Ansatz ist, empfehlen wir, eine Reihe von CoCl_{2-Konzentrationen} in den Assay aufzunehmen, um verschiedene Sauerstoffgehalte zu simulieren.

Die Wahl einer geeigneten Methode zur Untersuchung der Hypoxie-abhängigen CAR-Expression ist ein weiterer wichtiger Aspekt. Während die Immunblotting-Analyse von CAR-transduzierten Jurkat T-Zellen eine bequeme Option bei der Optimierung von CAR-Konstrukten ist, dient die Analyse des Einflusses des Sauerstoffgehalts auf die Oberflächen-CAR-Expression in CAR-transduzierten humanen PBMCs durch Durchflusszytometrie als ultimative Validierung. Es ist optimal, die Dynamik der CAR-Expression als Reaktion auf den Übergang von hypoxischen zu normoxischen Bedingungen zu untersuchen, wie wir es zuvor mit einer verbesserten Version der hypoxieempfindlichen CAR, nämlich HiTA-CAR³⁵, getan haben. Dies würde eine weitere Hypoxie-beschränkte CAR-Expression demonstrieren.

Für die funktionelle Verifizierung von Hypoxie-empfindlichen CAR-T-Zellen beinhaltet der im Protokoll beschriebene Zytotoxizitätsassay die Verwendung von Glühwürmchen-Luciferase-tragenden Zielzellen. Dieser reporterbasierte Assay kann durch andere Methoden zur Bewertung der Abtötung ersetzt werden, wie z. B. die CCK8-Methode und die Echtzeit-Zellanalysemethode (RTCA), bei der nicht modifizierte Tumorzellen verwendet werden können. Die RTCA-Analyse ist auch vorteilhaft für die Messung der Echtzeit-Tötungskinetik von CAR-T-Zellen. Zur Messung der spezifischen Zytotoxizität, die durch CAR-T-Zellen verursacht wird, sollten nicht transduzierte PBMC als Kontrolle einbezogen werden. Eine hohe Transduktionseffizienz von PBMCs ist wünschenswert, um Bedenken zu vermeiden, dass Unterschiede in der nachgewiesenen Zytotoxizität zwischen Versuchs- und Kontrollgruppen durch unspezifische Abtötung entstehen, die durch unterschiedliche Mengen an Effektorzellen vermittelt wird.

Es gibt mehrere Einschränkungen in diesem Protokoll. Hypoxische Bedingungen können die Lebensfähigkeit sowohl der Zielzellen als auch der T-Zellen beeinträchtigen^36,37, was die Befürchtung aufkommen lässt, dass ein Zelltod, der nicht mit der CAR-T-Zell-vermittelten Zytotoxizität zusammenhängt, die Interpretation der Assay-Ergebnisse verwirren könnte. Es wird empfohlen, sicherzustellen, dass sowohl CAR-T-Zellen als auch Zielzellen unmittelbar vor dem Assay eine ausgezeichnete Lebensfähigkeit aufweisen, um solche Bedenken zu vermeiden oder zu minimieren. Es sollte auch beachtet werden, dass die In-vitro-Validierung keine Garantie für eine erfolgreiche In-vivo-Translation ist. In-vivo-Untersuchungen sind immer erforderlich, um zu bestätigen, ob der Hypoxie-sensitive CAR-T-Kandidat es vermeiden könnte, auf normales Gewebe abzuzielen, das das Zielantigen exprimiert

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Zentrifugenröhrchen	QSP	509-GRD-Q	Überstände und Zellen cellection Protokoll Schritt 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Zellkultur Protokoll Schritt 4
10 ml Pipette	Yueyibio	YB-25H	Pipettieren Protokoll Schritt 1
10xTRIS-Glycin-SDS Elektrophoresepuffer	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
15 mL Zentrifugenröhrchen	Thermo Scientific	339650	Überstände und Zellen cellection Protokoll Schritt 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Zellkultur Protokoll Schritt 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer	Takara	9173	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
6-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden	Thermo Scientific	140675	T-Zellen culture Protokoll Schritt 1
96-Wells schwarze Gewebekulturplatten mit flachem Boden	Greiner	655090	Zytotoxizitätsassay Protokoll Schritt 4
96-Well-ELISA-Platten	Corning	3590	ELISA Protokoll Schritt 5
96-Well-Plattenschüttler	QILINBEIER	MH-2	Shake Protokoll Schritt 4
96-Well-U-Boden-Gewebekulturplatten	ThermoScientific	268200	Überstände cellection Protokoll Schritt 4,5
Anti-FLAG-Antikörper	Sigma	F1804-50UG	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
Kohlendioxid-Inkubator	Thermo Scientific	360	Zellkultur Protokoll Schritt 1,2,3,4
Zellzählplatte	Hausser scientific	1492	Zellzählung Protokoll Schritt 1,3,4
CELLection Pan Maus IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Maus IgG magnetische Kügelchen Protokoll Schritt 1
Zentrifuge	Thermo Scientific	75002432	Zellkultur Protokoll Schritt 1,3,4
Chemilumineszenz-Gel-Bildgebungssystem	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
Kobaltchloridlösung (0,5 M)	Bioleaper	BR4000203	Hypoxischer Zustand Protokoll Schritt 2,3,4
DMEM	Corning	10-103- CV	Zellkultur Protokoll Schritt 4
Elektronische Waage	Sartorius	PRACTUM612-1CN	weigh Protokoll Schritt 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Zellkultur Protokoll Schritt 3,4
GAPDH Maus mAb	ABklonal	AC002	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
Gelelektrophoresegerät	BIO-RAD	1645070	Immunoblotting -Protokoll Schritt 3
GloMax-Mikrotiterplatten-Reader	Promega	GM3000	Luciferase-Aktivitätsmessung -Protokoll Schritt 4
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting -Protokoll Schritt 3
Hochgeschwindigkeits-Mikrogefrierzentrifuge	eppendorf	5810  R	Zellkultur Protokoll Schritt 1
Humane IFN-& gamma; ELISA Set	BD	555142	ELISA Protokoll Schritt 5 Artikel: Rekombinante humane IFN-& gamma; Lyophilisierter Standard, Nachweis Antikörper Biotin Anti-Human IFN-& gamma; , Capture Antikörper gereinigtes Anti-Human-IFN-& Gamma;, Enzymreagenz Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (SAv-HRP)
Humanes IL-2 ELISA-Set	BD	555190	ELISA Protokoll Schritt 5 Artikel: Rekombinanter humaner IL-2 lyophilisierter Standard, Nachweis-Antikörper Biotin Anti-Human-IL-2, Capture Antikörper gereinigtes Anti-Human-IL-2, Enzymreagenz Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (SAv-HRP)
IL-15	Forschung & Forschung D-Systeme	P40933	T-Zellen culture Protokoll Schritt 1
IL-21	Novoprotein	GMP-CC45 T-Zellen	culture Protokoll Schritt 1
IL-7	R& D systems	P13232	T-Zellen culture Protokoll Schritt 1
Inverses	Mikroskop Olympus	CKX41	Zellkultur Protokoll Schritt 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat construction Protokoll Schritt 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Durchflusszytometrie Protokoll Schritt 2
Luciferase Assay System	Promega	E1501	Luciferase Reporter Assay Protokoll Schritt 4 Artikel: Passiver Lysepuffer, Glühwürmchen-Luciferase-Substrat
Mikroplatten-Reader	BioTek	HTX	ELISA Protokoll Schritt 5
mobiles CO2/O2/N2 Inkubator Kammer	China Innovation Instrument Co., GmbH.	Smartor118	Hypoxischer Zustand Protokoll Schritt 2, 3, 4
Maus Anti-Hexa Histidin Tag	Sigma	SAB2702218	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
NcmBlot Rapid Transfer Puffer	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Immunoblotting -Protokoll Schritt 3 Artikel: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagenz (A), NcmECL Ultra stabilisiertes Peroxid-Reagenz (B) & nbsp;
NovoNectin-beschichtete 48-Well-Flachplatten	Novoprotein	GMP-CH38	CAR-T-Zellen Aufbau Protokoll Schritt 1
OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) Tablettensatz	Sigma	P9187	Substratreagenz Protokoll Schritt 5 Artikel: OPD-Tablette (Silberfolie), Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Tablette (Goldfolie)
PE-konjugiertes Anti-DYKDDDDK	Biolegend	637310	Durchflusszytometrie Protokoll Schritt 2
Protaminsulfat	Sigma	P3369-1OG	Lentivirus-Infektion Protokoll Schritt 1
Proteinmarker 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
Gereinigte NA/LE Maus Anti-Human-CD3	BD	566685	T-Zellen Kultur Protokoll Schritt 1
Aufgereinigte NA/LE Maus Anti-Human-CD28	BD	555725	T-Zellen Kultur Protokoll Schritt 1
PVDF-Membran	Millipore	168627	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Zellkultur Protokoll Schritt 3
Magermilchpulver	Yeasen	S9129060	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
SKOV3-Luc		ATCC HTB-77	Zytotoxizitätstest Protokoll Schritt 4
Trypsin-EDTA	NCM biotech	C125C1	Zellkultur Protokoll Schritt 4
Tween 20	Sinopharm	30189328	Immunoblotting Protokoll Schritt 3
Wasserbad	keelrein	NB014467	Heating Protokoll Schritt 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	Serumfreies Lymphozytenkulturmedium Protokoll Schritt 1