Ein modifiziertes Modell für entzündliche Schmerzen zur Untersuchung der analgetischen Wirkung bei Mäusen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein modifiziertes entzündliches Schmerzmodell mit der beidseitigen Hinterpfoten-Carrageen-Injektion vor, um die analgetische Wirkung zu bewerten.

Zusammenfassung

Der Heizplattentest wird häufig verwendet, um die analgetische Wirkung auf entzündliche Schmerzen bei Mäusen zu bewerten. Ein häufig verwendetes Modell für entzündliche Schmerzen wurde mit einer intraplantaren Injektion von Carrageen in eine Hinterpfote induziert. Die Ergebnisse aus unserem Labor zeigten jedoch, dass Mäuse mit einer Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen ihre Pfoten hoben, um eine thermische Nozizeption während des Heizplattentests zu vermeiden. Aufgrund dieser Reaktion kann die bisherige Injektionsmethode die thermische Schmerzschwelle nicht genau widerspiegeln. Daher haben wir eine neue Methode untersucht, um dieses Problem zu vermeiden. In der vorliegenden Studie haben wir die vorherige Methode modifiziert, indem wir Carrageen in beide Hinterpfoten injiziert haben, um das Modell des entzündlichen Schmerzes zu etablieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Injektion von Carrageen in beide Hinterpfoten empfindlich und eine bessere Methode zur Induktion von entzündlichen Schmerzen war, wenn der Heizplattentest verwendet wurde, als eine Injektion mit einer Hinterpfote. Basierend auf diesen Erkenntnissen konzipierten wir weitere Experimente, in denen Mäuse mit Carrageen-Injektion von Carrageen sowohl in der Hinterpfote als auch in der Hinterpfote intragastrisch mit Celecoxib (30 mg/kg) behandelt wurden. Die Ergebnisse des Heizplattentests zeigten, dass Celecoxib die thermische Schmerzschwelle bei Mäusen mit beider Hinterpfoten-Injektion von Carrageen erhöhte, nicht jedoch bei Mäusen mit einer Hinterpfoten-Injektion von Carrageen. Zusammenfassend haben wir eine überlegene Methode entwickelt, um ein Modell für entzündliche Schmerzen zu induzieren, um die analgetische Wirkung zu bewerten.

Einleitung

Schmerzen sind weltweit ein Problem der öffentlichen Gesundheit. Sie wird durch schädliche thermische, mechanische oder chemische Stimulation ausgelöst. Es ist schwierig, Schmerzstudien am Menschen durchzuführen, da ethische Bedenken bestehen. Daher ist die Verwendung von Tierschmerzmodellen ein wichtiger Ansatz zum Verständnis von Schmerzmechanismen und zur Erforschung von Behandlungen¹. Der Heizplattentest wird häufig zur Beurteilung der thermischen Nozizeption und Hyperalgesie^{verwendet 2}. Derzeit wird das für den Heizplattentest verwendete Modell des entzündlichen Schmerzes mit einer intraplantaren Injektion von Carrageen in eine Hinterpfote induziert. Um beispielsweise die antinozizeptive Wirkung von rotigotinbeladenen Mikrosphären zu untersuchen, wurde ein Tiermodell für entzündliche Schmerzen durch eine Injektion mit einer Hinterpfote^{hergestellt 3}. Um die Auswirkungen von Catechol-o-Methyltransferase-Hemmern auf die thermische Nozizeption bei Mäusen zu bewerten, wurde Carrageen in die Plantarregion der rechten Hinterpfote^{verabreicht 4}. Um die analgetische Rolle des Extrakts aus Posidonia oceanica (L.) Delile zu untersuchen, wurde ein entzündliches Schmerzmodell bei Mäusen durch intraplantare Injektion von Carrageen in die rechte Hinterpfote^{hergestellt 5}. Die Ergebnisse aus unserem Labor zeigten jedoch, dass eine Maus mit der Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen ihre Pfote hob, um eine thermische Nozizeption zu vermeiden, die die Reaktion des Tieres auf einen thermischen Reiz im Heizplattentest ungenau verlängerte. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass das entzündliche Schmerzmodell mit der Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen die thermische Schmerzschwelle nicht genau widerspiegeln konnte. Daher optimierten wir die Methode, indem wir Carrageen in beide Hinterpfoten injizierten, um ein modifiziertes entzündliches Schmerzmodell zu etablieren.

Die Mäuse, denen Carrageen in beide Hinterpfoten injiziert wurde, hatten keine Möglichkeit, den thermischen Reiz für beide Hinterpfoten gleichzeitig zu vermeiden. Die Schmerzschwelle wurde definiert als die Zeit, von der Maus auf die Herdplatte gelegt wird, bis die Maus eine der beiden Hinterpfoten leckt. Die Ergebnisse bestätigten, dass das modifizierte Modell des entzündlichen Schmerzes besser geeignet ist, die nozizeptive Temperaturschwelle zu bewerten. Dies kann die Wirksamkeit des Heizplattentests für die Forschung und Entwicklung von Analgetika verbessern.

Protokoll

Das Versuchsprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Yantai University (Nr. YTDX20220425). Die Verfahren folgten den Richtlinien der National Institutes of Health für die Verwendung von Labortieren.

1. Tiere

1. Verwenden Sie für die Versuche weibliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g.
2. Lassen Sie die Tiere 3 Tage lang an die Umgebung des Versuchsraums gewöhnen, bevor Sie mit den Versuchen beginnen.
3. Halten Sie den Versuchsraum mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus aufrecht und geben Sie den Mäusen freien Zugang zu Wasser und Futter.

2. Zubereitung der Carrageen-Lösung

1. Wiegen Sie 0,1 g Carrageen. Geben Sie 10 ml sterilisierte normale Kochsalzlösung in ein Röhrchen.
2. 0,1 g Carrageen in das Röhrchen geben und das Röhrchen 30 s lang wirbeln.
3. Sammeln Sie die 1% sterilisierte Carrageen-Lösung.
4. Bereiten Sie die Carrageen-Lösung vor den Experimenten vor.

3. Intraplantare Injektion von Carrageen

1. Verwenden Sie eine Spritze (0,05 ml, 29 G x 1/2 Zoll, 0,33 mm × 12,7 mm), um die 1%ige Carrageen-Lösung zu injizieren.
2. Schütteln Sie die Carrageen-Lösung, bevor Sie sie in die Spritze ziehen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blase in der Spritze befindet.
3. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle (Hinterpfote) mit 75%igem Alkohol.
4. Injizieren Sie 30 μl ^6,7 % ige Carrageenlösung subkutan in die Plantaroberfläche der Hinterpfote. Für die Mäuse der Kontrollgruppe injizieren Sie 30 μl normale Kochsalzlösung.
   1. Führen Sie die Nadel diagonal nach oben in den Hinterpfoten-Fußballen ein. Halten Sie die Stabilität der Spritze aufrecht.
   2. Ziehen Sie die Spritze nach der Injektion langsam zurück und drücken Sie 2 s lang auf die Injektionsstelle, um ein Auslaufen zu verhindern.

4. Prüfung der Heizplatte

1. Führen Sie den Heizplattentest 3 Stunden nach der intraplantaren Injektion durch.
2. Reinigen und desinfizieren Sie die Oberfläche der Heizplatte.
3. Starten Sie die Heizplatte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Temperaturmodus . Klicken Sie auf KONSTANT , um die Temperatur auf 55 ± 0,2 °C einzustellen.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten und dann auf REACH. Nehmen Sie eine Maus aus dem Unterkunftscontainer. Fassen Sie vorsichtig seinen Stamm. Platzieren Sie die Maus in der Mitte der Kochplatte. Klicken Sie auf START.
5. Beobachten und notieren Sie die Zeit, in der die linke Hinterpfote (bei Mäusen mit einer Hinterpfoteninjektion) oder die Hinterpfote (bei Mäusen mit beider Hinterpfoteninjektion) als Reaktion auf die Wärmestimulation geleckt wird. Drücken Sie das Pedal der Heizplatte, um die Uhrzeit auf dem Bildschirm der Heizplatte anzuzeigen. Definieren Sie die Schmerzschwelle als die Zeit vom Platzieren der Maus auf der Herdplatte bis zum Lecken der Hinterpfote.
6. Stellen Sie einen Grenzwert von 60 s für den Heizplattentest ^4,8,9 ein. Notieren Sie eine Schmerzschwelle von 60 s, wenn der Grenzwert erreicht ist.
   HINWEIS: Reinigen Sie die Heizplatte mit 75 % Alkohol, bevor Sie die nächste Maus einsetzen, um eine mögliche Verzerrung aufgrund von Restgerüchen der vorherigen Maus zu vermeiden.

5. Herstellung von 1,5 mg/ml Celecoxib-Suspension

1. Nehmen Sie 1 Kapsel mit 200 mg Celecoxib ein. Holen Sie sich den Inhalt der Kapsel und mahlen Sie sie zu einem Pulver.
2. Fügen Sie 0,5 % Natriumcarboxymethylcellulose hinzu. Das endgültige Volumen beträgt 13,3 ml. Dies ist die Suspendierung von Celecoxib.
3. Nehmen Sie 1 ml der Suspension Celecoxib ein. Fügen Sie 9,0 ml 0,5 % Natriumcarboxymethylcellulose hinzu, um 1,5 mg/ml Celecoxib-Suspension zu erhalten.
4. Verabreichen Sie den Mäusen intragastrisch 0,2 ml/10 g der Celecoxib-Suspension.
   HINWEIS: Wählen Sie eine Sondennadel mit einer Länge von 4,0-4,5 cm für Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g.

6. Evaluierung des modifizierten Modells für entzündliche Schmerzen

1. Teilen Sie weibliche ICR-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen ein: Kontroll-, Modell- und Celecoxib-Gruppen.
2. Injizieren Sie 30 μl 1%ige Carrageenlösung subkutan in die Plantaroberfläche der Hinterpfote (einzelne Hinterpfote oder beide Hinterpfote). Für die Mäuse der Kontrollgruppe injizieren Sie 30 μl normale Kochsalzlösung.
3. Nach der Injektion von Carrageen oder normaler Kochsalzlösung führen Sie die Behandlung sofort durch. Celecoxib wird den Mäusen in der Celecoxib-Gruppe intragastrisch in einer Dosis von 30 mg/kg verabreicht. Bei den Mäusen in der Kontroll- und Modellgruppe wird intragastrisch 0,5 % Natriumcarboxymethylcellulose verabreicht.
4. Der Heizplattentest (Abschnitt 2) ist 3 Stunden nach der Injektion von Carrageen durchzuführen.

7. Statistische Methoden

1. Präsentieren Sie die Versuchsergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung. Führen Sie einen Normalverteilungstest mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf statistische Güte der Anpassung durch.
2. Analysieren Sie den Vergleich zwischen den beiden Gruppen mit einem ungepaarten t-Test. Führen Sie mehrere Gruppenvergleiche mit einer unidirektionalen Varianzanalyse durch, gefolgt vom Dunnett-Test. Betrachten Sie den Wert von p < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Die Schmerzschwelle in entzündlichen Schmerzmodellen
Die Schmerzschwelle des entzündlichen Schmerzmodells mit Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen lag bei 32,23 ± 11,11 s, während die Schmerzschwelle der Kontrollgruppe bei 27,73 ± 7,08 s lag. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die Schmerzschwelle des Ein-Hinterpfoten-Injektionsmodells keine signifikante Reduktion (p > 0,05, Abbildung 1A). Die Schmerzschwelle des entzündlichen Schmerzmodells mit beider Hinterpfoten-Injektion von Carrageen lag bei 21,84 ± 5,63 s, während die Schmerzschwelle der Kontrollgruppe bei 28,21 ± 8,61 s lag. Im Vergleich zur Kontrollgruppe sank die Schmerzschwelle des Injektionsmodells mit beiden Hinterpfoten signifikant (p < 0,05, Abbildung 1B).

Die analgetische Wirkung von Celecoxib in verschiedenen entzündlichen Schmerzmodellen
Im entzündlichen Schmerzmodell mit einer Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen zeigte die Schmerzschwelle der Celecoxib-Gruppe (27,01 ± 10,98 s) im Vergleich zur Modellgruppe (29,77 ± 13,97 s, p > 0,05) keinen signifikanten Anstieg. In Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen zeigte die Schmerzschwelle der Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (30,94 ± 14,54 s) keine signifikante Reduktion, was darauf hindeutet, dass die Injektion von Carrageen mit einer Hinterpfote kein entzündliches Schmerzmodell induzierte (Abbildung 2A). Im entzündlichen Schmerzmodell mit beidseitiger Hinterpfoteninjektion von Carrageen sank die Schmerzschwelle der Modellgruppe (15,61 ± 4,85 s) im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant (23,55 ± 3,96 s, p < 0,05). Im Vergleich zur Modellgruppe war die Schmerzschwelle der Celecoxib-Gruppe (20,29 ± 3,10 s) signifikant gesenkt (Abbildung 2B).

Abbildung 1: Die Schmerzschwellen in entzündlichen Schmerzmodellen. (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 15). (A) Die Schmerzschwelle des entzündlichen Schmerzmodells mit der Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen. (B) Die Schmerzschwelle des entzündlichen Schmerzmodells mit Injektion von Carrageen in beide Hinterpfoten, (^#P<0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die analgetische Wirkung von Celecoxib in verschiedenen entzündlichen Schmerzmodellen (Mittlere ± Standardabweichung, n = 14). (A) Die analgetische Wirkung von Celecoxib im entzündlichen Schmerzmodell mit der Injektion von Carrageen in eine Hinterpfote. (B) Die analgetische Wirkung von Celecoxib im entzündlichen Schmerzmodell mit Injektion von Carrageen in beide Hinterpfoten, ( ^#P<0,05, *P<0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Schmerz ist eine Schutzreaktion, die durch Gewebeschäden oder Verletzungen ausgelöst wird. Sie wirkt sich aber auch negativ auf die Lebensqualität^{aus 10}. Daher bleiben die Entwicklung wirksamer Analgetika und die Erforschung von Schmerzmechanismen aktive Forschungsbereiche. Die Methoden zur Beurteilung von Schmerzen spielen eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Schmerzmitteln. Die Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen ist eine klassische Methode für den Heizplattentest. Das modifizierte Modell, das durch die Injektion von Carrageen in beide Hinterpfoten induziert wird, bietet eine zuverlässige Möglichkeit, die Wirksamkeit potenzieller Therapeutika zur Schmerzlinderung zu untersuchen.

In der vorliegenden Studie fanden wir heraus, dass Mäuse mit der Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen keine Abnahme der Schmerzschwelle zeigten. In anderen Studien führte diese Methode jedoch zu einer signifikanten Senkung der Schmerzschwelle im Heizplattentest^11,12. Die Diskrepanz in den Ergebnissen zwischen den vorherigen Studien und dieser Studie kann durch die verschiedenen Tierarten erklärt werden, die in den Versuchen verwendet wurden 13,14,15,16. Eine andere mögliche Erklärung ist, dass wir beobachtet haben, dass die Mäuse mit der Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen oft die injizierte Pfote anhoben oder leicht auf die Platte traten, um dem thermischen Reiz auszuweichen. Zur Beurteilung der Schmerzschwelle muss die typische nozizeptive Reaktion des Leckens oder Schüttelns der injizierten Pfote beobachtet werden. Wir erhielten somit ein negatives Ergebnis, was darauf hindeutet, dass die Schmerzschwelle des Modells mit der Ein-Hinterpfoten-Injektion von Carrageen nicht signifikant abnahm. Mäuse, denen Carrageen in beide Hinterpfoten injiziert wurde, waren nicht in der Lage, den thermischen Reiz zu vermeiden, indem sie die Pfote anhoben oder leicht auf die Platte traten. Die Schmerzschwelle wurde als Lecken oder Schütteln einer der Hinterpfoten angesehen, was die tatsächliche nozizeptive Reaktion der Mäuse widerspiegelt.

Um die Überlegenheit des modifizierten entzündlichen Schmerzmodells zu verifizieren, wurden Mäuse mit einer Hinterpfote oder beiden Hinterpfoten-Injektionen von Carrageen mit intragastrischer Verabreichung von Celecoxib behandelt. In Übereinstimmung mit der Hypothese dieser Studie übte Celecoxib im modifizierten entzündlichen Schmerzmodell eine analgetische Wirkung aus, zeigte jedoch im Modell mit einer Hinterpfoteninjektion von Carrageen keine Effekte. Dieser Befund zeigte, dass das modifizierte Modell für entzündliche Schmerzen zuverlässig für das Screening potenzieller Analgetika ist.

Es gibt Einschränkungen in dieser Studie. Viele verschiedene Mausstämme wurden in Heizplattentests verwendet. Verschiedene Mausstämme können unterschiedlich auf thermische Reize reagieren. Im vorliegenden Experiment wurden nur ICR-Mäuse verwendet, um die Hypothese zu testen. Daher muss noch festgestellt werden, ob das modifizierte Verfahren die Schmerzschwellen bei den anderen Mausstämmen im Heizplattentest genau und konsistent erkennt. Darüber hinaus haben wir kein Pilotexperiment zur Bewertung der Schmerzschwelle der Mäuse konzipiert und somit keine Tiere mit einer hohen Schmerzschwelle ausgeschlossen. Diese Einschränkung kann jedoch auch als Vorteil des vorliegenden modifizierten Verfahrens angesehen werden. Es vereinfacht nicht nur den Prozess des Analgetikum-Tests, sondern spiegelt auch die Bandbreite der Reaktionen von Mäusen im Heizplattentest wider. Darüber hinaus hilft die Messung des Volumens der Hinterpfoten, die Induktion einer Entzündung zu bestätigen und die analgetische Wirkung von nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAIDs) zu verifizieren. Unsere Erfahrung hat jedoch gezeigt, dass es nicht einfach ist, das Volumen der Pfote von Mäusen zu messen. Die Pfote der Maus ist zu klein, um einen exakten Wert zu erhalten. Daher war die vorliegende Studie nicht darauf ausgelegt, die Veränderung des Volumens der Pfote nach einer Entzündung zu untersuchen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das entzündliche Schmerzmodell mit beidseitiger Hinterpfoteninjektion von Carrageen nach den oben skizzierten Schritten die zuverlässige Bestimmung der thermo-nozizeptiven Schwellenwerte von Mäusen ermöglicht. Darüber hinaus wurde bei Gabe von Schmerzmitteln statistisch eine Erhöhung der Schmerzschwelle festgestellt. Das modifizierte Modell für entzündliche Schmerzen ist nützlich für das Screening potenzieller Analgetika. Darüber hinaus kann diese Methode für die schmerzbiologische Forschung, die Entwicklung neuer Medikamente und die klinische Behandlung sowie für neue Ideen und Lösungen für die Schmerztherapie eingesetzt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AL204 elektronische Waage	Yuheng Battery Co., Ltd	YH-400A
Carboxymethylcellulose	Tianjin Chemical Co., Ltd
Carrageen	Sigma, MO, USA	29H0715
Celecoxib	Pfizer Inc.
Kochplatte	UGO Ltd. Co., Italien	PB-200
ICR weibliche Mäuse	Jinan Pengyue  Co., Ltd.
Kelun	Pharmaceutical Co., Ltd