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Methodenartikel

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

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DOI:

10.3791/66706

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1. November 2024

 ,  ,  ,  , 
1Neuromuscular Studies Lab (NeSt Lab), Institute of Anatomy, Histology, and Pathology, Faculty of Medicine, Universidad Austral de Chile, 2Faculty of Odontology and Rehabilitation Sciences, Universidad San Sebastian, 3Department of Cell Biology, Faculty of Biological Sciences, Universidad de Concepcion

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die periphere Synapse, die die Kontraktion der Skelettmuskelfasern steuert, um die koordinierte Bewegung vieler Organismen zu ermöglichen. Am NMJ kontaktiert ein präsynaptisches motorisches Axonterminal eine postsynaptische Muskeldomäne und wird von terminalen Schwann-Zellen bedeckt. Die Integrität und Funktion des NMJ ist unter verschiedenen Bedingungen beeinträchtigt, darunter Alterung, neuromuskuläre Erkrankungen und traumatische Verletzungen. Um den potenziellen Beitrag von Muskelproteinen zur Aufrechterhaltung und Regeneration von NMJ zu analysieren, wurde eine in vivo Gentransferstrategie mit der Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) nach mechanischer Nervenverletzung kombiniert. Frühere Ergebnisse zeigten, dass die erzwungene Expression von fluoreszierenden Kontrollproteinen die NMJ-Organisation oder die Neurotransmission nicht verändert. Dieses Verfahren zielt darauf ab, ein detailliertes Verfahren der in vivo Elektroporation des LAL-Muskels zu beschreiben, gefolgt von einer Durchtrennung oder Zerquetschung des spezifischen Astes des Gesichtsnervs, der die Hirnmuskulatur innerviert, was zu einer NMJ-Denervation bzw. Reinnervation führt. Die Kombination dieser experimentellen Strategien im bequemen LAL-Muskel stellt eine effiziente Methode dar, um den potentiellen Beitrag der Überexpression oder Stilllegung von Muskelproteinen im Rahmen der kurzfristigen NMJ-Reinnervation zu untersuchen.

Einleitung

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die periphere Synapse, die die Muskelkontraktion und indirekt die koordinierte Bewegung von Organismen steuert1. Es besteht aus einem präsynaptischen motorischen Axonterminal, einer postsynaptischen Muskeldomäne, die mit Acetylcholinrezeptoren (AChRs) angereichert ist, und nicht-myelinterminalen Schwann-Zellen, die das Axonterminal 2,3,4 abdecken. Bei NMJ-Denervation aufgrund einer traumatischen peripheren Nervenverletzung, einer Erkrankung oder eines pharmakologischen Eingriffs geht die kontraktile Muskelaktivität verloren 5,6. Da bestimmte permissive Mikroumgebungen eine rechtzeitige und effiziente funktionelle Wiederherstellung ermöglichen, ist die Suche nach Proteinen, die den Regenerationsprozess unterstützen könnten, eine ständige Notwendigkeit. Hier wurden zwei Verfahren kombiniert, um die mögliche Rolle der Manipulation der Muskelproteinexpression bei der kurzfristigen Regeneration des NMJ nach einer Nervenverletzung spezifisch zu bewerten.

Der Musculus levator auris longus (LAL), der sich auf der dorsalen Oberfläche des Schädels befindet, ist ein dünner und flacher Muskel, der die Bewegung der Ohrmuschel steuert. Der LAL-Muskel besteht aus rostralen und kaudalen Bändern, die jeweils zwei oder drei Schichten Muskelfasern enthalten 7,8. Der hintere aurikuläre Ast des Nervus facialis innerviert den LAL-Muskel und erzeugt ein gut beschriebenes Innervationsmuster, das aus fünf rostralen (R1-R5) und zwei kaudalen (C1-C2) Innervationsregionen besteht 8,9,10. Der LAL ist ein oberflächlich freiliegender und leicht zugänglicher Muskel, so dass seine Verwendung minimalinvasive Eingriffe erfordert. Dies ermöglicht die Visualisierung des NMJ mittels Echtzeitmikroskopie, die Verabreichung von Medikamenten sowie die Intervention kompletter Muskelpräparate sowohl in vivo als auch ex vivo11,12. Insgesamt machen diese Merkmale den LAL-Muskel zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung des Verhaltens und der Funktion von NMJ10,13.

Die In-vivo-Elektroporation ist eine Gentransfertechnik, die den Einbau exogener DNA in das Gewebe durch die vorübergehende Permeabilisierung der Zellmembranen und die Beweglichkeit der DNA innerhalb der Zellen ermöglicht, die beide nach Induktion eines elektrischen Feldes erzeugt werden14,15. Dieses Verfahren ist lokal und kann in jedem Stadium der Entwicklung des Tieres durchgeführt werden. Unter Berücksichtigung der einzigartigen Eigenschaften des LAL-Muskels stellt seine In-vivo-Elektroporation ein minimalinvasives, hocheffizientes und schnelles Verfahren16 dar, das es ermöglicht, eine robuste Proteinexpression zwei oder drei Tage nach der Elektroporation zu beobachten.

Das Verfahren der Gesichtsnervenquetschung wurde in der Forschung häufig eingesetzt, da es mehrere Vorteile bietet 5,17,18. Dieses Protokoll wurde zuvor modifiziert, um speziell auf den hinteren Ohrast des Gesichtsnervs abzuzielen, der die Schädelmuskulatur, einschließlich des LAL-Muskels, innerviert, um eine Gesichtslähmung zu vermeiden. Folglich benötigen Mäuse nach der Operation keine besondere Pflege (z. B. befeuchtende Augensalbe gegen den Verlust des Blinzelreflexes). Da die NMJ-Reinnervation am LAL-Muskel zwischen 7 und 9 Tagen nach der Verletzungbeginnt 6, ist sie ein gutes kurzfristiges Reinnervationsmodell im Vergleich zum häufig verwendeten Nervenquetschungsmodell des Ischiasnervs zur Denervation der Hintergliedmaßenmuskulatur, bei dem die Reinnervation etwa drei Wochen nach der Nervenverletzung stattfindet18.

Die Kombination von In-vivo-Elektroporation und Gesichtsnervenverletzung am LAL-Muskel wird es den Forschern ermöglichen, das Verhalten synaptischer Komponenten gegenüber der Modulation von Muskelproteinen zu verschiedenen Zeitpunkten der NMJ-Regeneration, einschließlich kurz- und langfristiger morphologischer Effekte 6,16, durch eine Vielzahl von Techniken, einschließlich immunhistochemischer, histologischer und funktioneller Assays, zu bewerten.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren sind von der Bioethikkommission der Universidad Austral de Chile, Chile (Protokoll Nr. 503/2023), genehmigt und folgen den von der Bioethikkommission der Nationalen Forschungs- und Entwicklungsagentur Chile (ANID) auferlegten Normen sowie den Richtlinien der Richtlinie des Europäischen Rates für die Pflege von Labortieren. In der vorliegenden Studie wurden adulte (3-6 Monate alte) CF-1-Mäuse beiderlei Geschlechts (30-45 g) verwendet. Die Euthanasie wurde durch eine Überdosis Inhalationsanästhetikum mit anschließender Entblutung erreicht. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. In vivo LAL-Muskelelektroporation

  1. Präparat
    1. Betäuben Sie die Maus vorsichtig in einer Induktionskammer aus Acryl unter Inhalation von 2,5 % Isofluoran mit 0,8 l/min Sauerstoff (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Halten Sie danach die Sedierung der Maus mit einer Nasenschlauchmaske aufrecht, die mit einem Inhalationsanästhesiegerät unter einem Präparierstereomikroskop verbunden ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Maus im Ruhezustand befindet, bevor Sie mit dem Vorgang beginnen. Testen Sie den Berührungsreflex der Maus, indem Sie einen Fuß vorsichtig mit einer Pinzette zusammendrücken (führen Sie diesen Schritt jedes Mal nach der Einleitung der Anästhesie durch).
    2. Desinfizieren Sie den zervikalen Bereich auf Höhe der sagittalen Naht des Schädels mit dem Antiseptikum Chlorhexidingluconat 2% und injizieren Sie subkutan 20 μl 2 mg/ml Hyaluronidase in PBS mit einer Hamilton-Spritze, um den Zugang des DNA-Plasmids zur Muskeloberfläche zu erleichtern.
    3. Schalten Sie den Isofluoranfluss aus und lassen Sie die Maus 1 Minute lang reinen Sauerstoff atmen.
    4. Wiegen Sie die Maus, um die geeignete Meloxicam-Dosis zu berechnen (siehe Schritt 1.3.2.).
    5. Setzen Sie das Tier in einen leeren Käfig (ohne Einstreu), um sich von der Narkose zu erholen.
    6. Bringen Sie das Tier für 30 min in die normale Haltungzurück 16.
  2. Ablauf der Operation
    1. Betäuben Sie die Maus durch Inhalation von 2,5 % Isofluoran mit einem Sauerstoffgemisch von 0,8 l/min (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen) und halten Sie sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs mit einem Inhalationsanästhesiegerät unter einem Präparierstereomikroskop sediert.
    2. Rasieren Sie den Halsbereich mit einer zweischneidigen Rasierklinge und desinfizieren Sie 3 Mal mit Chlorhexidin und 70% Ethanol.
    3. Machen Sie einen 8-mm-Schnitt über der sagittalen Naht des Schädels und legen Sie den LAL-Muskel frei, indem Sie das Fett und das Bindegewebe, das sich direkt unter der Haut befindet, mit einer Schere/Pinzette vorsichtig entfernen.
      HINWEIS: Der LAL-Muskel ist der oberflächlichste Muskel im Schädelbereich nach dem Hautschnitt. Es ist leicht an der Ausrichtung der Muskelfasern zu erkennen, die diagonal vom mittleren Schädel zu jeder Ohrmuschel verlaufen 8,16.
    4. Injizieren Sie mit einer Hamilton-Spritze 10 μl der kommerziell gewonnenen DNA (0,8-1 μg/μl) in PBS in die Faszie, die über den gesamten Muskel verteilt ist und eine Blase bildet.
    5. Platzieren Sie zwei Goldnadelelektroden im Abstand von 5 mm, parallel und über Muskelfasern, die die gesamte Länge des LAL-Muskels einnehmen (Abbildung 1A).
    6. Mit einem Elektroporator werden fünf Impulse von 100 V/cm mit einer Dauer von je 20 ms bei einer Frequenz von 1 Hz erzeugt.
    7. Wiederholen Sie den Vorgang im kontralateralen LAL-Muskel (Wiederholung der Schritte 1.2.4-1.2.6).
  3. Naht und Genesung
    1. Naht (5/0 Stammgröße, HR15 Nadel) der Haut mit resorbierbarem Polyglykolsäurefaden.
    2. Injizieren Sie das Analgetikum Meloxicam subkutan in Dosen von 1-2 mg/kg Gewicht, um die Schmerzen nach der Operation zu reduzieren.
    3. Schalten Sie den Isofluoranfluss aus und lassen Sie die Maus 1 Minute lang reinen Sauerstoff atmen.
    4. Setzen Sie das Tier in einen leeren Käfig (ohne Einstreu), um sich von der Narkose zu erholen.
    5. Bringen Sie das Tier in seine normale Haltung zurück und überwachen Sie es 2 Tage nach der Operation oder bis zu seiner Genesung. Überwachen Sie Schmerz- oder Stresssymptome und weisen Sie jedem der verschiedenen Parameter Bewertungen unter Berücksichtigung der zuvor beschriebenen humanen Endpunktkriterien zu19.
      HINWEIS: Positionieren Sie die Maus auf einem beheizten Pad, das mit einem chirurgischen Pad bedeckt ist, um zu verhindern, dass die Körpertemperatur während der Operation absinkt. Versuchen Sie, sich nicht länger als 30 Minuten für den chirurgischen Eingriff zu nehmen, um zu verhindern, dass die Maus aufgrund einer übermäßigen Anästhesie stirbt. Wenn das exprimierte Protein niedrige Fluoreszenzwerte aufweist, wird empfohlen, mit einem Tracer (z. B. tdTomato oder GFP) im Verhältnis 1:5 zu co-elektroporieren (Tracer: DNA von Interesse).

2. Denervierung durch Quetschnervverletzung

HINWEIS: Dieses Protokoll ist eine Modifikation eines zuvor beschriebenen Protokolls17. Führen Sie diesen Vorgang mit einem Abstand von mindestens 3 Tagen nach der Elektroporation durch. Je nach Fragestellung kann dieses Verfahren vor oder nach der Elektroporation durchgeführt werden.

  1. Anästhesie und Tierlagerung
    1. Führen Sie die Sedierung des Tieres in einer Induktionskammer aus Acryl unter Inhalation von 2,5 % Isofluoran mit 0,8 l/min Sauerstoff durch (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
    2. Wiegen Sie die Maus, um die Meloxicam-Dosis zu berechnen (siehe Schritt 2.3.2.).
    3. Halten Sie die Sedierung der Maus mit einer Nasenschlauchmaske aufrecht, die mit einem Inhalationsanästhesiegerät unter einem Präparierstereomikroskop verbunden ist.
    4. Positionieren Sie die Maus auf der linken Seite (um den rechten LAL-Muskel zu ennervieren). Klebe das rechte Ohr in Richtung Nase, um den hinteren Bereich der Ohrmuschel freizulegen.
  2. Ablauf der Operation
    1. Den hinteren Bereich der Ohrmuschel mit einer zweischneidigen Rasierklinge rasieren und 3-mal mit Chlorhexidin und 70% Ethanol desinfizieren.
    2. Lokalisieren Sie die Vena auricularis posterior und machen Sie mit einer Federschere einen Schnitt in der Haut in einem Abstand von ca. 5 mm in einem Abstand von ca. 5 mm. Vermeiden Sie das Durchtrennen von Blutgefäßen und/oder Muskelgewebe.
    3. Schneiden Sie das Fett und das Bindegewebe mit Pinzette und Schere ab. Finden Sie den Spinalnerv accessorius; Fahren Sie fort, bis Sie den Bauch des Digastricus-Muskels und den knorpeligen Gehörgang (halbtransparentes weißliches Gewebe) gefunden haben (Abbildung 2A).
    4. Lokalisieren Sie den Anfang der Verzweigung des Gesichtsnervs direkt unter dem Musculus digastricus.
    5. Folgen Sie dem hinteren Ohrast (dem dorsalen Ast des Nervus facialis) und entfernen Sie vorsichtig das ihn umgebende Bindegewebe, wobei Sie eine direkte Manipulation des Nervs sorgfältig vermeiden.
    6. Den hinteren Ohrast des Nervus facialis 30 s lang zerquetschen, dabei mit einer Pinzette mit einer um 45° abgewinkelten Spitze konstanten Druck auf den Nerv ausüben.
  3. Naht und Genesung
    1. Naht (5/0 Stammgröße, HR15 Nadel) der Haut mit resorbierbarem Polyglykolsäurefaden.
    2. Injizieren Sie das Analgetikum Meloxicam subkutan in Dosen von 1-2 mg/kg Gewicht, um die Schmerzen nach der Operation zu reduzieren.
    3. Entfernen Sie das Klebeband vom Ohr, schalten Sie den Isofluoranfluss aus und lassen Sie die Maus 1 Minute lang reinen Sauerstoff atmen.
    4. Setzen Sie das Tier in einen leeren Käfig (ohne Einstreu), um sich von der Narkose zu erholen.
    5. Setzen Sie die Maus wieder in ihr normales Gehäuse ein und überwachen Sie sie 2 Tage nach der Operation oder bis zu ihrer Genesung.
    6. Untersuchen Sie die Maus nach der Genesung auf Fehler in der Bewegung des betroffenen Ohrs als Zeichen einer effizienten Denervierung.
      HINWEIS: Bei Scheinkontrolltieren machen Sie einen Schnitt in die Haut, legen Sie den Gesichtsnerv frei, ohne ihn direkt zu berühren, und nähen Sie anschließend.

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Ergebnisse

Die hohe Fluoreszenzquantenausbeute des tdTomato-Proteins20 macht es zu einem geeigneten Tracer für die Effizienz der Elektroporation. Daher wurde die Expression des tdTomato-Proteins in LAL-Muskeln durch in vivo Elektroporation untersucht (Abbildung 1). Die LAL-Muskeln wurden 21 Tage nach der Elektroporation präpariert. Ganzpräparationen zeigen das dünne kaudale Band (cLAL, cyanfarbenes Polygon) des LAL-Muskels mit seinen zwei Innervationsregionen und das di...

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Diskussion

Die Kombination von in vivo Muskelelektroporation und Denervierung ist ein wertvoller experimenteller Ansatz zur Untersuchung einer regenerativen Nische am NMJ4. Da der LAL-Muskel oberflächlich exponiert ist, können diese kombinierten Verfahren ohne weiteres durch die Verabreichung von Sonden oder Medikamenten ergänzt werden, die die Proteinexpression oder -aktivität beeinflussen könnten12. Darüber hinaus könnte die Elektroporation...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken dem sehr kooperativen und anregenden Umfeld der NeSt Lab-Mitglieder für nützliche Diskussionen und Kommentare zu dieser Arbeit. Die Arbeit im NeSt Lab wird derzeit von FONDECYT 1221213 finanziert. Das Schema in Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#5/45 Dumont Pinzette Feine wissenschaftliche Werkzeuge 11251-35Vor Gebrauch sterilisieren
anti 2H3DSHBVerdünnung 1 : 300
anti S100 GebrauchsfertigDakoIR504Verdünnung 1 : 5
anti SV2DSHBVerdünnung 1 : 50
Chlorhexidingluconat 2%DifenPharma
Kaltlicht-Präparier-StereomikroskopMoticModell SMZ-171
DAPIInvitrogenD1306Verdünnt 1 : 100
Dumont #5SF PinzettenFeinwissenschaftliche Werkzeuge 11252-00Vor Gebrauch sterilisieren
Dumont Mini Pinzette – Stil 5Feinwissenschaftliche Werkzeuge 11200-14Vor Gebrauch sterilisieren
ECM 830 ElektroporatorBTX Harvard Apparatus
Gold Nadelelektroden Genetrodes, BTX45-011410 mm gerade
Hamilton-Spritze Hamilton80400
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
InhalationsanästhesiegerätSciVerma ScientificM3000 Table Top
IsofluranBaxter218-082
MäuseInstituto de Salud Publica - ChileErwachsene (3-6 Monate alt) CF-1 Mäuse beiderlei Geschlechts (30-45 g)
RasierklingenSchick
Naht Glicosorb 5/0TAGUMGS0812. JResorbierbarer Polyglykolsäurefaden
tdTomato-PlasmidAddgene54642tdTomato-Plasmid unter der Kontrolle des CMV-Promotors
Tramadolhydrochlorid 5% (Triamcol)Drag Pharma
Vannas FederschereFine Science Tools 91500-09Vor Gebrauch sterilisieren
WGA Alexa Fluor 488InvitrogenW7024Verdünnen
α-BTX Alexa Fluor 488 InvitrogenB13422Verdünnung 1 : 500

Referenzen

  1. Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  3. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions. Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
  4. Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse. Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).
  5. Kobayashi, J., et al. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).
  6. Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations. BMC Biol. 20 (1), 158(2022).
  7. Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
  8. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).
  9. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).
  10. Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
  11. Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J Vis Exp. (55), e3124(2011).
  12. Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses. Sci Rep. 11 (1), 17285(2021).
  13. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, Pt 4 1081-1101 (2012).
  14. Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage. Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).
  15. Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp. (32), e1520(2009).
  16. Ojeda, J., et al. The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse. Front Cell Neurosci. 14, 225(2020).
  17. Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. J Vis Exp. (96), e52382(2015).
  18. Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).
  19. Lloyd, M., Wolfensohn, S. Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints. Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).
  20. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  21. Perez, V., et al. The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147(2019).
  22. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).
  23. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  24. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biol. 6 (12), 160240(2016).
  25. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  26. Sakuma, M., et al. Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure. Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).
  27. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  28. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).
  29. Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
  30. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
  31. Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).
  32. Pérez-García, M. J., Burden, S. J. Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice. Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).
  33. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).

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