Optimierung der Methode des Verschlusses der Arteria cerebralis longa für eine vollständige Reperfusion

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für Forscher dar, um den Verschluss der mittleren Hirnarterie an Mäusen mit der modifizierten Longa-Methode der Arteria carotis externa durchzuführen. Die in diesem Artikel vorgestellten Modifikationen zielen darauf ab, die Genauigkeit des Verschlusses der mittleren Hirnarterie zu erhöhen und eine vollständige Reperfusion zu gewährleisten.

Zusammenfassung

Das Modell des Verschlusses der mittleren Hirnarterie dient als primäres Tiermodell für die Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls. Obwohl sie seit über drei Jahrzehnten in der Forschung eingesetzt wird, ist ihre Standardisierung nach wie vor unzureichend. Das Verfahren, das überwiegend an Ratten und Mäusen durchgeführt wird, stellt aufgrund der kleineren und zerbrechlicheren Natur der Mäuse eine Herausforderung dar. Im Gegensatz zur Koizumi-Methode der Arteria carotis communis ist die Arteria carotis externa das einzige Modell für einen intraluminalen Filamentschlag, das eine vollständige Reperfusion nach einer Ischämie gewährleistet. Dieser Aspekt ist von entscheidender Bedeutung für Studien, die Reperfusionsphänomene untersuchen. Die in diesem Artikel gezeigten chirurgischen Modifikationen gewährleisten einen kontinuierlichen Blutfluss aus der Arteria carotis communis während der ischämischen Phase und nach Beginn der Reperfusion. Das Ziel dieser Modifikationen ist es, die mittlere Hirnarterie selektiv zu verschließen, indem die Durchblutung in den Ästen proximal der mittleren Hirnarterie während der Ischämieperiode ununterbrochen bleibt. Darüber hinaus ist der Beginn der Reperfusion plötzlich und kann präzise gesteuert werden, wodurch die endovaskuläre Thrombektomie in der Humanmedizin genauer modelliert werden kann. Unser Ziel mit diesem umfassenden Videoartikel ist es, die Ausbildung neuer Chirurgen zu erleichtern und die Standardisierung chirurgischer Verfahren innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu fördern.

Einleitung

Der Schlaganfall ist die zweithäufigste Todesursache und die dritthäufigste Todesursache und die dritthäufigste Todesursache und Invalidität^{zusammen 1}. Der Schlaganfall kann ischämisch oder hämorrhagisch sein, wobei der ischämische Schlaganfall in der klinischen Praxis deutlich häufiger vorkommt. Ein ischämischer Schlaganfall entsteht durch eine Blockade in einer Arterie, die das Hirngewebe mit Blut versorgt, was zu Ischämie, Zelltod und Entzündungen führt. Seit dem Aufkommen von Reperfusionstherapien wie Thrombolyse und mechanischer Thrombektomie wurden große Fortschritte in der Behandlung des Schlaganfalls erzielt. Alle Reperfusionstherapien bergen jedoch das Risiko, den Zustand des Patienten zu verschlimmern, indem sie eine sogenannte Reperfusionsschädigung verursachen². Der genaue Mechanismus der Reperfusionsverletzung ist noch unklar, und es liegt in den präklinischen Studien, mögliche Ursachen und vorbeugende Maßnahmen zu identifizieren. Zu diesem Zweck ist die Entwicklung eines geeigneten Tiermodells für Reperfusionsschäden nach ischämischem Schlaganfall von entscheidender Bedeutung.

Der Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) ist das am häufigsten verwendete Tiermodell zur Untersuchung eines ischämischen Schlaganfalls. Sie wird überwiegend bei Nagetieren durchgeführt und hat viele verschiedene Varianten, die bisher in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben wurden ^3,4. Die beiden Haupttypen, Koizumi und Longa, die als Varianten der Arteria carotis communis (CCA) und der Arteria carotis externa (ECA) bekannt sind, unterscheiden sich technisch durch die Arteriotomiestelle für die Filamentinsertion ^5,6. In unserem kürzlich erschienenen Artikel "Durch In-vivo-Monitoring der vaskulären Perfusion" haben wir gezeigt, dass nur die Longa-Methode wirklich als Hirnischämie/Reperfusionsmodell angesehen werden kann⁷. Bei diesem Verfahren wird das Filament in die ECA eingeführt, durch die ICA geschoben und an der Verzweigungsstelle der mittleren Hirnarterie (MCA) befestigt, um eine Ischämie des Hirngewebes zu induzieren. Nach einer vorgegebenen Periode der Ischämie ermöglicht der Rückzug des Filaments eine Reperfusion, die eine vorübergehende Hirnischämie simuliert. Nach dem Ausbruch des Schlaganfalls ist die primäre Ergebnisvariable, die in der Forschung verwendet wird, meist das Volumen der infarktierten Läsion, das entweder mit Hilfe der Ex-vivo-Histologie oder mit in vivo-Hirnscans gemessen werden kann. Die Herausforderungen bei MCAO-Modellen drehen sich um die geringe Reproduzierbarkeit, die auf varianzen zwischen Varianten, Betreibern und Probanden zurückzuführen ist, wobei letztere eine erhebliche Einschränkung in der präklinischen Schlaganfallforschung darstellen⁴.

Darüber hinaus sind die Infarktregionen, die auf MCAO bei Nagetieren folgen, im Verhältnis zur Größe des Nagetiergehirns massiv. Darüber hinaus werden hippocampusale hintere Regionen des Gehirns häufig in das Infarktvolumen rekrutiert, obwohl diese Regionen in erster Linie vom Blutfluss aus der hinteren Hirnarterie (PCA) und nicht von MCA⁸ abhängig sind. Wie bei den in der Literatur beschriebenen Koizumi- und Longa-Methoden wird das CCA während der Ischämie-Periode aufgrund der unvollständigen Durchgängigkeit des Willis-Kreises bei Mäusen ligiert gehalten, was zu einer Ischämiseinduktion in einer viel breiteren Region als beabsichtigt führt ^5,6,9. Selbst bei Methoden, bei denen die CCA nach der Ischämie-Periode wieder geöffnet oder repariert wird, führen die üblichen 30-60 Minuten Ischämie zu einer irreversiblen Gewebeverletzung in Nicht-MCA-Regionen¹⁰. Darüber hinaus haben frühere Untersuchungen entgegen den Erwartungen gezeigt, dass die Länge der Silikonbeschichtung eines Filaments keinen Einfluss auf die Läsionsgröße¹¹ hat. Die Wahl der Siliziumbeschichtungslänge des Filaments wurde jedoch nur bei Modellen mit ligiertem CCA während der Okklusionsphase berücksichtigt.

Das Ziel dieser Methode war es, die Longa MCAO-Methode bei Mäusen zu modifizieren, um einen ununterbrochenen Blutfluss aus dem CCA während der Ischämieperiode zu ermöglichen, wodurch die Selektivität von MCAO erhöht und eine vollständige Reperfusion der Infarktregion nach dem Eingriff sichergestellt wird. Diese Modifikationen würden Längsschnittstudien zur Erforschung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei Mäusen sehr zugute kommen, indem sie die Sterblichkeitsrate senken und die Varianz zwischen den Probanden verringern.

Protokoll

Der Umgang mit Tieren und die Verfahren wurden von der Ethik-Lizenzierungskommission der Medizinischen Fakultät der Universität Zagreb und der Ethikkommission zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere des Landwirtschaftsministeriums der Republik Kroatien genehmigt. Die Versuchsverfahren wurden gemäß dem kroatischen Tierschutzgesetz (NN 102/17, 32/19), den Änderungen des Tierschutzgesetzes (NN 37/13) und den Richtlinien zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere (NN 55/13) durchgeführt, die mit dem Europäischen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Richtlinie 2010/63/EU) übereinstimmen.

1. Vorbereitung des Tieres und des Operationsfeldes

1. Setzen Sie das Tier in eine Knock-out-Box und leiten Sie eine Anästhesie mit 5 Vol.-% Isofluran in einem Sauerstoff-Stickstoff-Gemisch (Verhältnis 1:2) ein.
2. Nachdem Sie den Bewusstseinszustand und die Atemfrequenz des Tieres visuell überprüft haben, bringen Sie es zu einer Laborwaage und wiegen Sie es.
3. Überprüfen Sie den Reflex, indem Sie die interdigitale Haut einer unteren Extremität einklemmen, um die richtige Anästhesietiefe zu gewährleisten.
4. Positionieren Sie das Tier auf dem beheizten Operationstisch und bringen Sie seine Nase in die Anästhesiemaske. Stellen Sie die anfängliche Temperatur des Operationstisches auf 36 °C ein und stellen Sie sie so ein, dass die Körpertemperatur des Tieres bei 37 °C bleibt (gemessen über eine Rektumsonde, die in späteren Schritten eingeführt wird). Bei allen weiteren Schritten ist der Volumenanteil von Isofluran so einzustellen, dass die Atemfrequenz des Tieres bei 100 Atemzügen/min bleibt.
   HINWEIS: Alle Oberflächen und Materialien, die in direktem Kontakt mit dem Tier stehen, müssen vor dem Eingriff gründlich desinfiziert werden.
5. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um sie vor Austrocknung und Isoflurangas zu schützen.
6. Drehen Sie das Tier auf den Rücken und strecken Sie seinen Hals, indem Sie ein kleines Kissen aus chirurgischem Klebeband darunter legen.
7. Befestigen Sie die Gliedmaßen des Tieres mit chirurgischem Klebeband. Achten Sie darauf, die Vordergliedmaßen nicht zu stark zu strecken, um nicht versehentlich eine Luxation des Schultergelenks zu verursachen.
8. Schmieren Sie die Rektumsonde mit Vaseline und führen Sie sie zur kontinuierlichen Messung der Körpertemperatur in das Rektum ein. Befestigen Sie die Sonde zusammen mit dem Schwanz mit chirurgischem Klebeband.
9. Wenden Sie eine präoperative Injektion von Kochsalzlösung und Buprenorphin (0,5 mg/kg) intraperitoneal an, um das Tier während des Eingriffs gut mit Feuchtigkeit zu versorgen und unter Analgesie zu halten.
10. Rasieren Sie das Fell des Tieres im Halsbereich mit einer kabellosen Tierschermaschine. Sammeln Sie das gesamte rasierte Fell mit Stücken chirurgischem Klebeband. Rasieren Sie die Region zusätzlich mit einem Rasierer, um sie völlig fellfrei zu machen.
11. Wählen Sie ein MCAO-Filament basierend auf dem Gewicht und/oder Alter des gemessenen Tieres. Hole es aus dem Behälter und lege es in eine Petrischale an einer sichtbaren Stelle. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf den Silikonteil des Filaments, um es sauber und staubfrei zu halten.
    HINWEIS: Die Dicke der Silikonbeschichtung des Filaments sollte bei einer 12-16 Wochen alten Maus gemäß den offiziellen Empfehlungen des Herstellers gewählt werden. Zusätzlich sollte die Länge der Silikonbeschichtung im Vorfeld sorgfältig geplant werden, abhängig von der Größe der zu verschließenden Bewässerungsfläche (siehe Diskussion).
12. Legen Sie ein sauberes OP-Abdecktuch über den Operationstisch.
13. Tragen Sie einen Tropfen Betadin auf die rasierte Haut des Tieres auf. Reiben Sie das Desinfektionsmittel mit einem Wattestäbchen kreisförmig von innen nach außen in die Haut ein. Machen Sie danach dasselbe mit einem mit Ethanol getränkten Wattestäbchen. Wiederholen Sie diesen Schritt bei jeder Wiederholung 3 Mal mit einem frischen Paar steriler Wattestäbchen.
14. Tragen Sie einen Tupfer Lidocain-Gel auf die desinfizierte Region der zukünftigen Inzisionsstelle auf, um eine lokale Wundanalgesie zu erzielen.

2. Ischämie-Induktionschirurgie

1. Machen Sie mit einem Skalpell einen ersten Schnitt auf der desinfizierten Haut. Halten Sie die Anzahl der Hautschnitte auf ein Minimum, um die Heilung der Operationswunde zu erleichtern.
   HINWEIS: Alle Instrumente müssen zuvor sterilisiert worden sein. Der Leser sollte sich auf die institutionellen Richtlinien für die Verwendung von sterilen oder chirurgischen Handschuhen beziehen.
2. Reißen Sie mit einer Pinzette vom Typ 7 und 5 die oberflächliche Faszie weg und lösen Sie die Speicheldrüsen vom darunter liegenden Gewebe.
   HINWEIS: Bewegen Sie sich immer mit geschlossener Pinzette vor und strecken Sie sie aus, während Sie sich wegbewegen, um das Gewebe wegzudrücken. Auf diese Weise können anatomische Räume mit minimalem Gewebetrauma durchquert werden.
3. Platzieren Sie den Drahtaufroller in seiner Ausgangsposition und stellen Sie sicher, dass die Speicheldrüsen die nachfolgenden Schritte nicht stören.
4. Entfernen Sie die tiefe Halsfaszie mit einer Typ-7-Pinzette und lösen Sie die Sternocleidomastoideus-Muskeln aus der Halsschlagaderregion, um den Retraktor neu zu positionieren.
5. Positionieren Sie den Retraktor so, dass er unter die Sternocleidomastoideusmuskeln greift, um den Zugang zur Halsschlagader zu ermöglichen.
6. Sezieren Sie den Musculus omohyoideus, um einen klaren visuellen und einfacheren Zugang zur Halsschlagader zu ermöglichen.
7. Befreien Sie die Halsschlagader und ihre Äste von der Halsschlagader und dem Vagusnerv, die in der Halsschlagaderfaszie zusammengehalten werden.
   HINWEIS: Diese Faszie muss vorsichtig entfernt werden, um eine Verletzung des Vagusnervs oder signifikante Blutungen zu vermeiden.
   1. Kneifen Sie die Halsschlagaderfaszie auf der lateralen Seite der Halsschlagader-Triade zusammen und ziehen Sie sie vorsichtig seitlich, um die Arterie, den Nerv, die Vene und alle umliegenden Blutgefäßäste visuell zu identifizieren.
   2. Trennen Sie die CCA beim seitlichen Ziehen an der Faszie mit einer Typ-5-Pinzette vom angrenzenden Nerv und der Vene bis zur Verzweigungsstelle und der oberen Schilddrüsenvene, die die CCA kreuzt.
   3. Trennen Sie den unteren Teil des CCA mit einer gebogenen Pinzette vom Typ 7 vollständig vom darunter liegenden Gewebe und der Faszie und stellen Sie sicher, dass er für die Klemmung in zukünftigen Schritten bereit ist.
   4. Gehen Sie kranial im Bereich oberhalb des CCA-Verzweigungspunktes vor und reißen Sie die Halsschlagaderfaszie mit zwei Pinzetten auf.
   5. Ziehen Sie in ähnlicher Weise das lose Ende der Halsschlagaderfaszie medial und lateral, um die ECA und die Arteria carotis interna (ICA) präzise von der Faszie bzw. dem umgebenden Gewebe zu lösen.
   6. Befreien Sie die ECA und ICA mit einer gebogenen Typ-7-Pinzette vom darunter liegenden Gewebe.
8. Nachdem Sie die CCA mit ihren beiden jeweiligen Ästen sorgfältig vorbereitet haben, heben Sie die ECA mit einer gebogenen Pinzette vom Typ 7 an und klemmen Sie sie mit einer selbstschließenden Pinzette vom Typ N0 fest.
9. Senken Sie die Selbstschlusszange Typ N0 vorsichtig auf den OP-Tisch ab.
   HINWEIS: Um den Klemmpunkt des ECA neu zu positionieren, ist es manchmal notwendig, den Griff leicht zu lösen und den ECA-Verzweigungspunkt nach kaudal zu schieben. An dieser Stelle ist darauf zu achten, dass mehr als 1 mm ECA zwischen der ECA-Klemmung und dem Abzweigpunkt verbleibt.
10. Nachdem der ECA mit einer Pinzette vom Typ N0 festgeklemmt und festgehalten ist, führen Sie zwei geflochtene Seidenfäden hinter den ECA ein.
    HINWEIS: Der Schädelfaden bildet den Ligaturknoten und muss kranial von der Klemmstelle aus platziert werden.
11. Binden Sie den Schädelfaden vollständig fest, da er dauerhaft ist, und schneiden Sie den überschüssigen Faden mit einer Schere ab.
12. Binden Sie den Schwanzfaden zu einem losen Sicherungsknoten zusammen.
    HINWEIS: Es muss in der Nähe des ECA-Verzweigungspunkts platziert und locker gehalten werden, damit das MCAO-Filament hindurchpasst.
13. Klemmen Sie den CCA und den ICA mit Hilfe von Gefäßmikroclips zu, um Blutungen nach der Arteriotomie zu vermeiden.
    HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass der an der CCA angebrachte Mikroclip einen ausreichend starken Griff hat, da es sich bei der CCA um eine pulsierende Hochdurchsatzarterie handelt, deren Nichtbeachtung in den späteren Schritten zu starken Blutungen und zum Tod des Tieres führen kann.
14. Führen Sie mit einer Mikrofederschere eine kleine Arteriotomie direkt unter der ECA-Klemmstelle durch.
    HINWEIS: Die Arteriotomie muss groß genug sein, damit der Silikonteil des Filaments hineinpasst, aber nicht größer als die Hälfte des ECA-Umfangs, um die von der Typ-N0-Pinzette gehaltene Spannung nicht zu beeinträchtigen.
15. Führen Sie das Filament in einem Winkel, der dem der ECA entspricht, in proximaler Richtung zur CCA in die Arteriotomiestelle ein, indem Sie durch den losen Sicherungsknoten an der Verzweigungsstelle der ECA gehen und mit dem Filament in das Lumen der CCA einstechen.
16. Ziehe den Sicherungsknoten um den Silikonteil des Filaments fest.
    HINWEIS: An dieser Stelle ist große Vorsicht geboten, da das Filament dazu neigt, nach der Hälfte des letzten Manövers aus dem ECA zu rutschen, und es ist sehr schwierig, es an dieser Stelle wieder einzusetzen.
17. Öffnen Sie vorsichtig den ICA-Mikroclip und entfernen Sie ihn.
18. Nachdem das Filament teilweise in ECA eingeführt und gesichert ist, führen Sie eine vollständige Arteriotomie durch, bei der sich der ECA-Stumpf mit dem MCAO-Filament im Inneren löst. Lassen Sie an dieser Stelle die Selbstschlusszange Typ N0 los und entfernen Sie sie.
19. Drücken Sie mit einer Pinzette vom Typ 5 den ECA-Stumpf fest zusammen und heben Sie ihn leicht an. Während Sie sich mit einer weiteren Pinzette an dem teilweise eingeführten Filament festhalten, senken Sie den ECA-Stumpf ab und ziehen Sie vorsichtig, um das innere Ende des Filaments in Richtung ICA auszurichten. Kneifen Sie niemals den Silikonteil des Filaments ein.
20. Mit einer Pinzette, die das Filament festhält, schieben Sie das Filament langsam durch den ICA in Richtung des Willenskreises.
    HINWEIS: Der erste Verzweigungspunkt des ICA ist auch der einzige, an dem der Bediener den gewünschten MCA-Verzweigungspunkt übersehen kann. Daher ist ein leichter seitlicher Vorschubwinkel notwendig, um das Filament zum MCA-Verzweigungspunkt zu führen. Mit dem leichten lateralen Vorschubwinkel krümmt sich das Filament von der Arteria pterygopalatina (PPA) weg und erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass das vorstoßende Ende in den Willis-Kreis eintritt (Abbildung 1).

Abbildung 1: Eine Illustration des Vorschubs des Filaments des Verschlusses der mittleren Hirnarterie über den Verzweigungspunkt der Arteria pterygopalatine hinaus. Der richtige Filamentvorschub (links) wird erreicht, indem das MCAO-Filament so ausgerichtet wird, dass es gegen die Seitenwand des ICA anliegt und sich vom PPA-Verzweigungspunkt weg krümmt. Andernfalls (auf der rechten Seite) kann das Filament in das PPA gelangen und keinen Hub verursachen. Im letzteren Fall kann das Filament nicht so weit vordringen, wie es sollte, und der Chirurg sollte das Filament zurückziehen, bis sein Ende am ICA-Verzweigungspunkt sichtbar wird, und beginnen, das Filament wieder vorzuschieben. Grün gefärbte Arterien stellen die hinteren kommunizierenden Arterien (PcomA) dar, die bei Mäusen meist nicht offen sind. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

21. Schieben Sie das MCAO-Filament langsam durch den Kreis von Willis, bis ein plötzlicher Anstieg des Widerstands zu spüren ist.
    HINWEIS: An dieser Stelle ist es wichtig, die verbleibende Länge des Filaments zu beobachten. Das Filament sollte bei einer erwachsenen Maus mühelos mindestens 7 mm vom ICA-Verzweigungspunkt entfernt verlaufen.
22. Ziehen Sie den Sicherungsknoten fest, um sicherzustellen, dass das Filament während der Ischämie nicht verschoben wird.
23. Entfernen Sie den CCA-Clip und notieren Sie sich die Uhrzeit.
    HINWEIS: Dies markiert den Beginn des Beginns der Ischämie.
24. Packen Sie das lose Ende des MCAO-Filaments in die Rille zwischen dem Karotisdreieck und dem ipsilateralen M. sternocleidomastoideus, damit es nicht aus der Operationswunde herausragt.
25. Entfernen Sie den Drahtaufroller und bringen Sie die Ränder der Operationswunde näher aneinander. Lassen Sie die Operationsstelle einige Sekunden ruhen, damit das Gewebe in seine anatomische Position zurückkehrt.
26. Verschließen Sie die Operationswunde mit Klebeband-Wundverschlüssen, um eine schnellere Wiedereröffnung der Wunde nach der Ischämie-Periode zu ermöglichen.
    HINWEIS: Wenn ein Forscher das Tier während der Ischämiephase erwachen lassen möchte, wird empfohlen, die Wunde zu nähen, um ein vorzeitiges Wiederöffnen der Wunde zu verhindern.

3. Ischämie-Periode

1. Validieren Sie den Erfolg der Operation mit Hilfe der MRT oder einer anderen quantitativen Perfusionsmessmethode.
   HINWEIS: Im Falle einer MRT-Untersuchung sollte die perfusionsgewichtete Bildgebung (PWI) eine kritische Ischämie im weiten MCA-Bereich zeigen, und die diffusionsgewichtete Bildgebung (DWI) sollte die Stelle des reduzierten scheinbaren Diffusionskoeffizienten (ADC) aufgrund eines Zellödems skizzieren.
2. Setzen Sie das Tier bis zum Ende der Ischämieperiode in einen sauberen Käfig.

4. Operation zur Entnahme des Filaments

1. Etwa 5 Minuten vor Ablauf der vorgesehenen Ischämiezeit positionieren Sie das Tier und befestigen es wieder auf dem Operationstisch.
2. Entfernen Sie die Klebeband-Wundverschlüsse und öffnen Sie die chirurgische Wunde mit dem Drahtaufroller wieder.
3. Befreien Sie das lose Ende des MCAO-Filaments vom umgebenden Gewebe und den Enden des Sicherungsknotenfadens.
4. Mit einer Pinzette vom Typ N0 kneifen und ziehen Sie ventral an der Kante des ECA-Stumpfes, um ihn zu spannen. Senken Sie die Quetschzange vorsichtig nach unten, ähnlich wie beim ersten chirurgischen Eingriff.
   HINWEIS: Der Bediener muss es vermeiden, den Sicherungsknoten einzuklemmen, da sich der Knoten sonst nicht lösen lässt.
5. Klemmen Sie den CCA wieder mit einem mikrovaskulären Clip fest.
6. Lockern Sie mit einer Pinzette vom Typ 5 den Sicherungsknoten, um das Herausziehen des Filaments zu ermöglichen.
   HINWEIS: Der beste Weg, um mit dem Lösen des Knotens zu beginnen, besteht darin, ihn so lange einzuklemmen, bis er sich in einzelne Teile trennt, und dann die Fadenenden in Richtung Knoten zu schieben.
7. Ziehe das MCAO-Filament langsam heraus, bis das Silikonteil aus dem ECA-Stumpf herauszuragen beginnt. Ziehe den Sicherungsknoten leicht fest, um die vollständige Filamententnahme vorzubereiten.
8. Wenn Sie sich in der Nähe des Silikonendes des Filaments befinden, ziehen Sie den Sicherungsknoten so fest, dass er das MCAO-Filament herausgedrückt und den ECA-Stumpf mit einem einzigen Handgriff schließt. Ziehe den Knoten vollständig fest, nachdem das Filament herausgerutscht ist.
9. Öffnen und entfernen Sie die Quetschzange zusammen mit dem CCA-Clip.
   HINWEIS: Dies markiert das Ende der Ischämie-Periode und den Beginn des Reperfusionsprozesses.
10. Entfernen Sie den Drahtaufroller und führen Sie die Ränder der Operationswunde wieder zusammen.
11. Nähen Sie die Operationswunde von der Peripherie aus und schließen Sie die Wunde vollständig, ohne dass darunter liegendes Gewebe sichtbar ist.
    HINWEIS: Die Anzahl der erforderlichen Nähte hängt von der Größe der Operationswunde ab.
12. Reinigen und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Reinigungsalkoholtüchern.

5. Nachsorge

1. Setzen Sie das Tier in einen sauberen Käfig und lassen Sie es spontan aus der Narkose erwachen.
2. Legen Sie das pelletierte Futter auf den Boden des Käfigs, um es leichter erreichen zu können. Die Futterpellets mit Trinkwasser einweichen. Füllen Sie eine kleine Petrischalen mit Trinkwasser und bringen Sie es ebenfalls auf den Boden des Käfigs.
3. In den nächsten 48 h injizieren Sie alle 24 h 0,25 ml Kochsalzlösung mit Buprenorphin (0,5 mg/kg) intraperitoneal.

Ergebnisse

Intraoperative oder postoperative MRT-Scans, insbesondere perfusionsgewichtete Bildgebung (PWI) und/oder diffusionsgewichtete Bildgebung (DWI) (Abbildung 2), können einen endgültigen Nachweis für ein erfolgreiches Verfahren erbringen. Die intraoperative PWI zeigt eine kritische Ischämie in der ipsilateralen MCA-Region, was bestätigt, dass die Filamentplatzierung zu einem vollständigen Verschluss führte. Die postoperative PWI eines erfolgreichen Eingriffs zeigt eine Hyperperfusion am Läsionskern sowie ein gewisses Maß an Reperfusion an den Grenzen der MCA-Region. Intraoperative DWI-Läsionen entsprechen den beobachteten ischämischen Regionen auf dem intraoperativen PWI. Postoperative DWI-Läsionen zeigen eine Schrumpfung zum Kern der ischämischen Läsion hin, begleitet von einer signifikanten Abnahme des scheinbaren Diffusionskoeffizienten der Läsion, wodurch sie dunkler ist als die intraoperativen DWI-Läsionen und das umgebende reperfundierte Hirngewebe. Anatomische Standard-T2-Scans, sowohl intraoperativ als auch postoperativ, zeigen in der Regel nichts Bemerkenswertes, es sei denn, es kommt zu einer filamentinduzierten Blutung

(Abbildung 3). In solchen Fällen zeigen PWI- und DWI-Scans eine unvollständige oder keine Ischämie.

Der Reperfusionsprozess folgt in den nächsten 48 Stunden und wurde anhand von MRT-Scans bestätigt, die am zweiten Tag nach dem Eingriff durchgeführt wurden (Abbildung 2, CBF am Tag 2). PWI-Scans zeigen eine vollständige Reperfusion in der Läsionsstelle mit leichter Hyperperfusion im Läsionskern. DWI-Scans zeigen mehrere Regionen mit verringerten scheinbaren Diffusionskoeffizienten aufgrund der Bildung von Hirnödemen. Anatomische T2-Scans zeigen hyperintense Regionen von Ödemen, die MCA-Regionen umgeben, ohne Beteiligung von Nicht-MCA-Regionen wie dem Hippocampus.

Beim Aufwachen zeigt das Tier deutliche Anzeichen eines akuten Schlaganfalls. Häufige Verhaltenssymptome sind ein erhöhter Muskeltonus an der Seite der Läsion, der dazu führt, dass das Tier seinen Oberkörper in diese Richtung beugt. Auch das Kreisen und Drehen in ipsilateraler Richtung sind deutliche Anzeichen für einen akuten Schlaganfall. Die Gangataxie deutet oft auf eine Beteiligung des Hippocampus am ischämischen Läsionsvolumen hin. Diesem Symptom kann es jedoch in der hyperakuten Phase aufgrund von Nebenwirkungen der Isofluran-Anästhesie an Spezifität mangeln. In den folgenden Tagen sollte das Tier eine ipsilaterale Beugung der vorderen Gliedmaßen und eine Verschlechterung seines Haltungsstatus entwickeln, begleitet von einem fehlenden Schnurrhaarreflex. Die Sterblichkeitsrate erreicht ihren Höhepunkt etwa 3 Tage nach dem Eingriff aufgrund eines Hirnödems. Die chronische Phase beginnt, nachdem sich das Hirnödem abzubilden beginnt. Während dieser Zeit kann das Tier mit Harnverhalt vorstellbar sein. Aus diesem Grund ist es wichtig, das Tier auf Blasensteifheit sowie eine feste Kappe am Harnröhrenausgang zu untersuchen. Meistens kann dieses Problem gelöst werden, indem die Blase sanft massiert wird, um das Wasserlassen zu erleichtern. Anzeichen einer Gewichtswiederherstellung treten in der Regel innerhalb der ersten 7 Tage nach dem Schlaganfall auf.

Abbildung 2: Repräsentatives Beispiel für eine erfolgreiche MCAO mit vollständiger Reperfusion, die mit MRT-Scans bestätigt wurde. CBF, ADC und T2w stehen für zerebrale Blutflusskarten, Karten des scheinbaren Diffusionskoeffizienten und T2-gewichtete anatomische Scans. IntraOP, postoperativ und D02 bezeichnen 3 verschiedene Zeitpunkte der Bildgebung nach Beginn der Ischämie, nach Beginn der Reperfusion bzw. am zweiten Tag nach MCAO. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative MRT-Scans einer filamentinduzierten Blutung während des MCAO-Verfahrens. CBF, ADC und T2w stehen für zerebrale Blutflusskarten, Karten des scheinbaren Diffusionskoeffizienten und T2-gewichtete anatomische Scans. IntraOP, postOP und D02 bezeichnen 3 verschiedene Zeitpunkte der Bildgebung: nach Beginn der Ischämie, nach Beginn der Reperfusion bzw. am zweiten Tag nach MCAO. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Eine Illustration der korrekten Filamentplatzierung am mittleren Hirnarterienast. In den meisten Fällen setzt sich der Silikonteil des Filaments (weiß gefärbt) im proximalen Teil der vorderen Hirnarterie (ACA) etwa 2 mm weiter als der MCA-Verzweigungspunkt fest. Normalerweise ist die ACA-Gehirnregion bei Mäusen nicht betroffen, da sich ACA mit der kontralateralen zu einem singulären Azygos ACA verbindet. Betroffene Arterien sind grau dargestellt. Auf der linken Seite wird CCA während der Ischämie-Periode offen gelassen und versorgt so alle ICA-Äste mit Blut bis hin zum MCA, das mit dem Silikonteil des Filaments verschlossen ist. Auf der rechten Seite ist das Filament identisch positioniert, mit der Ausnahme, dass die CCA-Ligatur während der Ischämieperiode beibehalten wird. Da PcomA (grün gefärbt) in den meisten Fällen nicht patentierbar ist, umhüllt der Schlaganfall bei Beibehaltung der CCA-Ligatur den Großteil der ipsilateralen Hemisphäre nichtselektiv über MCA, AchA, VTA, HTA und PCA. In diesen Fällen können auch Anzeichen eines akuten Augeninfarkts (Leukokorien und Anisokorien) aufgrund einer blockierten PPA beobachtet werden. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

MCAO ist ein sehr anspruchsvolles Verfahren für den Bediener und ein lähmendes Verfahren für das Tier. Aus diesem Grund ist es für Forscher von größter Bedeutung, über ein Standardverfahren zu verfügen, das die Schwere des Schlaganfalls minimiert, Verfahrensfehler reduziert und das Wohlbefinden des Tieres nach dem Eingriff verbessert. Dieses MCAO-Protokoll hebt einige der wichtigsten Aspekte hervor, die bei der Durchführung dieses Verfahrens an einer Maus zu berücksichtigen sind.

Die Wahl des MCAO-Filaments beeinflusst die Größe und Lokalisation der induzierten Schlaganfallläsion und ist daher ein kritischer Schritt in diesem Verfahren¹¹. Silikonbeschichtete Filamente, wie sie von Doccol entwickelt wurden, haben einen großen Sprung bei der Senkung der Inzidenz von filamentinduzierten Blutungen gemacht¹². Silikonbeschichtete Filamente gibt es jedoch in einer Vielzahl von Größen und Längen, was für neue Forscher eine Herausforderung darstellt, geeignete Filamente für MCAO bei Versuchstieren auszuwählen. Während Filamenthersteller in der Regel Richtlinien für die Auswahl des richtigen Filamentdurchmessers für ein bestimmtes Tiergewicht bereitstellen, wird die Länge der Silikonbeschichtung als persönliche Präferenz des Bedieners angesehen und sollte nur auf der Grundlage der Fähigkeiten des Bedieners ausgewählt werden. In dieser Arbeit plädieren wir für die Minimierung der Silikonlänge, um sicherzustellen, dass die induzierte Schlaganfallläsion nur den MCA-Spülbereich umfasst, wodurch die Reproduzierbarkeit verbessert wird. Abbildung 4 zeigt, dass die hintere Hirnarterie (PCA), der erste intrakranielle ICA-Ast, die hinteren Regionen des Gehirns, einschließlich Teile des Hippocampus, versorgt. Neuere Mikro-CT-Studien an Mäusen haben drei weitere kleinere Äste identifiziert, die von ICA vor dem Verzweigungspunkt der MCA^{ausgehen 13}. Die empfindliche und variable Arteria hypothalamicus (HTA), die Arteria tegmentalis ventralis (VTA) und die Arteria choroideus anterior (AChA) tragen in ihrer Verzweigungsreihenfolge signifikant zur Variabilität innerhalb und innerhalb der Probanden bei⁸. Darüber hinaus haben Mikro-CT-Studien gezeigt, dass bei Mäusen der durchschnittliche Abstand von MCA- und PCA-Verzweigungspunkten etwa 1,7 mm beträgt, was deutlich kürzer ist als die Länge der Silikonbeschichtung der meisten hergestellten Filamente¹⁴. Da die einzige Rückmeldung, die ein Bediener beim Vorschieben des Filaments erhält, ein plötzlicher Anstieg des Widerstands ist, wenn das Filament den MCA-Verzweigungspunkt erreicht, ist es die nachlaufende Länge der Silikonbeschichtung des Filaments, die eine Ischämie für das MCA und, abhängig von der Länge der Silikonbeschichtung, für AChA, VTA, HTA und sogar PCA induziert. Einführung einer Variabilität im Gegensatz zum beabsichtigten MCAO-Modell. Um die Reproduzierbarkeit und das postoperative Wohlbefinden der Tiere zu erhalten, sollte daher ausschließlich der MCA-Verschluss angestrebt werden. Doccol bietet MCAO-Filamente mit Silikonbeschichtungen von 1 bis 2 mm an, aber unsere Erfahrung zeigt, dass die Verwendung von 1-2 mm Beschichtungen oft zu einem Scheinbetrieb führt, ohne einen Hub zu verursachen. Intraoperative MRT-Scans zeigten, dass das Filament bis zu 2 mm über den MCA-Verzweigungspunkt hinaus in die vordere Hirnarterie (ACA) vordringt, bevor es dem Bediener eine kritische resistive Rückmeldung gibt. Aus diesem Grund empfehlen wir dringend die Verwendung von Silikonbeschichtungen mit einer Länge von 2 bis 3 mm, die die Beteiligung des Hippocampus an Schlaganfallläsionen im Vergleich zu längeren Silikonbeschichtungen auf MCAO-Filamenten reduzieren.

Der zweite kritische Schritt in diesem Verfahren ist die korrekte Platzierung des MCAO-Filaments, um einen vollständigen Verschluss des MCA zu erreichen. Das versehentliche Eindringen in den ersten ICA-Ast, die Arteria pterygopalatinin (PPA), ist ein häufiges Problem für den Bediener, da es kaum Rückmeldungen gibt, dass das MCAO-Filament während seiner Vorschub eine falsche Abzweigung genommen hat. Aus diesem Grund empfehlen wir einen leichten seitlichen Vorschiebewinkel, so dass sich die siliziumbeschichtete Spitze des Filaments vom Verzweigungspunkt des PPA weg wölbt und es wahrscheinlicher ist, dass es in den intrakraniellen Teil des ICA eintritt. (Abbildung 1) Wie im Protokollabschnitt erwähnt, ist es wichtig, die Länge des nachlaufenden Filaments zu beobachten, um festzustellen, ob die Platzierung des Filaments angemessen ist. In einem Fall, in dem das Filament nicht mindestens 7 mm vom ICA-Verzweigungspunkt eingeführt werden kann, sollte der Bediener das Filament zurückziehen und den Vorgang wiederholen. Jede unnötige Kraft, die während des Einführens des Filaments ausgeübt wird, kann zu einer Blutung und einem fehlgeschlagenen Eingriff führen. Zu diesem Zweck kann eine kontinuierliche Laser-Doppler-Perfusionsmessung verwendet werden, um die korrekte Filamentplatzierung zu bestätigen.

Die Sicherstellung eines ungehinderten Blutflusses aus dem CCA während der ischämischen Periode ist ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll. Im Gegensatz zu den meisten Abbildungen, die einen vollständigen Willis-Kreis bei einer Maus darstellen, haben Studien gezeigt, dass die hintere kommunizierende Arterie (PcomA) bei Mäusen meist nicht bilateral offen ist und die ipsilaterale Seite des Willis-Kreises nicht zuverlässig versorgen kann, wenn die CCA während der Ischämie-Periode geschlossen bleibt^15,16. Selbst wenn ein Forscher in diesen Fällen die richtige Länge der Silikonbeschichtung des Filaments sorgfältig auswählt, umhüllt der Hub je nach PcomA-Durchgängigkeit die gesamte Hemisphäre oder nur den MCA-Bereich, was zu der unberücksichtigten Varianz der Strichgrößen führt. Aus diesem Grund haben wir das Verfahren dahingehend geändert, dass es den Anweisungsschritt umfasst, bei dem der Bediener den CCA-Clip direkt nach dem Setzen des okkludierenden MCAO-Filaments entfernt. Diese Modifikationen könnten die Präzision und Reproduzierbarkeit der Operation erhöhen und gleichzeitig die Heterogenität der Ergebnisse verringern. Eine Standardisierung der Methoden würde die Erfolgsquote und Vergleichbarkeit sowie das translative Potenzial der Ergebnisse weiter verbessern¹⁷.

Die größte Einschränkung der vorgeschlagenen Technik ist die Tatsache, dass ECA nach dem Eingriff ligiert bleibt, was den Status des Tieres während der Genesung möglicherweise verschlechtern kann¹⁸. Bisher waren wir mit unseren Bemühungen, den EuRH zu reparieren und gleichzeitig die Erfolgsquote des Verfahrens hoch genug zu halten, erfolglos. Dies bleibt ein potenzieller Punkt für zukünftige Verbesserungen der Methode. Darüber hinaus ist es eine Herausforderung, die Zeit, in der das CCA geklemmt bleibt, zu minimieren, aber es ist wichtig, die Rekrutierung von Nicht-MCA-Regionen bei einem Schlaganfall zu verhindern. Da dies eine Quelle für die Varianz zwischen und innerhalb des Bedieners sein könnte, ist es ratsam, die Dauer der CCA-Klemmung zu messen, was es den Forschern möglicherweise ermöglicht, zumindest einen Bruchteil der beobachteten Gesamtvarianz bei den Hubgrößen statistisch zu berücksichtigen. Auf der anderen Seite spielen die Fähigkeiten und Erfahrungen des Bedieners eine entscheidende Rolle bei der Verkürzung der Zeit der CCA-Ligatur und der Gesamtdauer des Eingriffs¹¹.

Die vorgestellte Methode ist insofern von Bedeutung, als sie es den Forschern ermöglicht, das MCA selektiv zu okkludieren und so den Beginn der Reperfusion plötzlich und hochgradig kontrollierbar zu machen. Die Methode ahmt die endovaskuläre Thrombektomie und ihre anschließende Reperfusionsverletzung genauer nach als derzeit verfügbare Methoden und liefert Details für ein reproduzierbares und klinisch relevantes Modell für Ischämie/Reperfusionsschäden bei Tieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Betadine Hautlösung 10g/100ml	Alkaloid Skopje N	/A
Geflochtene Seidennaht	Fine Science Tools	18020-60
Dafilon-Naht 5/0 DS16	B. Braun	C0936154
Dolokain 20 mg/g Gel	Jadran-Galenski Laboratorij	N/A
Dumont #5 Pinzette	Fine Science Tools	11251-20	2 Stück
Dumont #7 Pinzette	Fine Science Tools	11271-30
Dumont N0 selbstschließende Pinzette	Fine Science Tools	11480-11
Durapore OP-Band 1,25cm x 9,1m	3M	7100057169
Durapore OP-Band 2,5cm x 9,1m	3M	7100057168
Externes Thermostat	Petnap	1012536
Halsey Nadelhalter	Fine Science Tools	12500-12
Heißperlensterilisator	Fine Science Tools	18000-50
Irisschere	Fine Science Tools	14060-10
Isofluran USP	Piramal Intensivpflege	N/A
Laser Doppler Monitor	Moor	MOORVMS-LDF2
Metall Haustier Heizkissen	Petnap
Micro Vannas Federschere	Fine Science Tools	15000-00
Mini-colibri Retraktor	Fine Science Tools	17000-01
Recugel Augensalbe	Bausch& Lomb	N/A
S& T B-1 Mikroklemme für Gefäß	Fine Science Tools	00396-01	2 Stück
S& T Mikroklemmzange Anlegen	Fine Science Tools	00071-14
Schwartz Mikro-Serrefines	Fine Science Tools	18052-01
Stemi DV4 Spot-Stereomikroskop	Zeiss	000000-1018-453
Steri-Strip Verstärkte Klebehautverschlüsse 3 mm x 75 mm	3M	7100236545
Gerade Gewebezange	Fine Science Tools	11023-10
SZX Standarm	Olympus	SZ2-STS
Tec III 300 Serie kalibrierter Vaporizer	Vertrieb und Service Inc.	N/A
Universalstativ Typ 2	Olympus	SZ2-STU2
VetFlo Sechskanal-Anästhesiestativ	Kent Scientific	VetFlo-1225	Modifiziert für O2/N2-Mischen