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Methodenartikel

Beurteilung der Insulinclearance bei Mäusen mittels In-situ-Leberperfusion

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DOI:

10.3791/66730

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13. Dezember 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Endocrinology and Metabolism, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die hepatische Insulinclearance ist entscheidend für die Regulierung der Glukosehomöostase. Dieser Artikel beschreibt ein benutzerfreundliches hepatisches Perfusionsverfahren zur direkten Bewertung der hepatischen Insulinclearance-Rate in situ bei Mäusen.

Zusammenfassung

Die hepatische Insulinclearance ist für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase unerlässlich und steht in engem Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Diabetes. Eine genaue Messung der Insulinclearance ist entscheidend für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen dieser Erkrankungen. Dieses Protokoll stellt ein unkompliziertes und benutzerfreundliches Verfahren zur Leberperfusion bei Mäusen dar, das speziell für die direkte Bewertung der hepatischen Insulinclearance-Rate entwickelt wurde. Die Methode beinhaltet eine präzise Kanülierung der Pfortader und der suprahepatischen unteren Hohlvene, um ein in situ Perfusionssystem zu schaffen, das physiologische Bedingungen nachahmt. Das Protokoll führt die Forscher durch jede Phase des Eingriffs, von der chirurgischen Vorbereitung über die Einrichtung des Perfusionssystems bis hin zur Probenentnahme und -analyse. Es gibt eine detaillierte Anleitung, zusammen mit repräsentativen Ergebnissen und wichtigen Tipps zur Optimierung des Verfahrens. Ein Video-Tutorial begleitet das schriftliche Protokoll mit visuell detaillierten Anweisungen und Illustrationen, was es zu einem zugänglichen und umfassenden Nachschlagewerk für Wissenschaftler macht, die die molekularen Mechanismen hinter dem hepatischen Insulinstoffwechsel und der Insulinclearance erforschen.

Einleitung

Die Entdeckung des Insulins ist zu einem der Meilensteine des letzten Jahrhunderts geworden. Über die Regulation der Insulinsynthese, der Insulinsekretion und ihrer physiologischen Funktionen in Stoffwechselgeweben ist viel bekannt. Der Insulinabbau und seine Regulationsmechanismen wurden jedoch weniger in den Fokus gerückt. Unter dem Insulinstoffwechsel versteht man das Zusammenspiel zwischen der Funktion der Betazelle, der Insulinresistenz (IR) bzw. -sensitivität und der Insulinclearance. Neben der Insulinsekretion spielt die hepatische Insulinclearance eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des homöostatischen Insulinspiegels, der für das Erreichen des peripheren Zielgewebes und die Erleichterung der richtigen Insulinwirkung erforderlich ist1. Mehrere Studien haben eine gestörte Insulinclearance als entscheidenden Faktor für die Pathogenese der Hyperinsulinämie beim metabolischen Syndrom sowie bei anderen Erkrankungen wie Typ-2-Diabetes 2,3, nichtalkoholischer Steatohepatitis4 und polyzystischem Ovarialsyndrom5 identifiziert. Daher kann Hyperinsulinämie als Folge einer verminderten Clearance eine Rolle bei der Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen spielen. Strategien, die die Insulinclearance verbessern, haben das Potenzial, die ungünstigen Auswirkungen der Hyperinsulinämie bei diesen Personen umzukehren.

Insulin hat ein einzigartiges Verteilungsmuster. Die Höhe des zirkulierenden Plasmainsulins hängt vom Gleichgewicht zwischen Insulinsekretion und -entfernung ab. Die Bauchspeicheldrüse schüttet pulsierend Insulin in die Pfortader aus und leitet es zu den Hepatozyten. Als erstes Organ, das mit einer Insulinsekretion konfrontiert ist, baut die Leber während ihrer ersten Passage den Großteil des Insulins ab und macht 60 % bis 70 % des Gesamtinsulinsaus 6. Das verbleibende Insulin verlässt die Leber durch die Lebervene und gelangt in den systemischen Kreislauf, wo es teilweise von peripheren Geweben (hauptsächlich Muskeln, Fettgewebe und Nieren) verwertet wird, bevor es von der Leber während seines zweiten Durchgangs durch die Leberarterie weiter extrahiert wird7.

Die genaue Messung der Insulinclearance ist entscheidend. Die direkte Messung der hepatischen Insulinclearance in Humanstudien ist eine Herausforderung, da die Entnahme von Blutproben aus den Pfortadern und Lebervenen schwierig ist. Sowohl direkte als auch indirekte Methoden werden verwendet, um die Insulinclearance bei Menschen und Tiermodellen abzuschätzen. Es werden ungefähr drei Strategien angewendet, um die Insulinclearance indirekt zu messen. Bei den in der klinischen Praxis am häufigsten verwendeten Assessments handelt es sich um Methoden, die auf dem molaren Verhältnis von C-Peptidzu Insulin basieren 8. Dieser Ansatz beruht auf der äquimolaren Sekretion beider Peptide und dem Fehlen einer C-Peptid-Extraktion durch die Leber9. Die zweite Gruppe von Methoden beruht auf der mathematischen Analyse der Plasmazerfallskurven von Insulin nach einer bekannten und spezifischen Eintragung des Hormons in den Blutkreislauf 2,10,11. Die dritte Methode basiert auf der Tatsache, dass die Infusion von Insulin mit einer konstanten Rate zu stabilen Hormonspiegeln im Blut führt, wobei die Entfernungsrate der Verabreichungsrate entspricht12. Diese indirekten Methoden spiegeln in erster Linie die gesamte Insulinclearance im Körper wider. Da die Leber der primäre Ort der Insulinclearance ist und eine entscheidende Rolle in diesem Prozess spielt, ist es wichtig, die hepatische Insulinclearance direkt zu bewerten.

Frühere Studien haben die hepatische Insulinextraktion bei gesunden Hunden direkt gemessen13,14. In Studien wurde auch ein isoliertes perfundiertes Rattenlebermodell verwendet, um die Insulinextraktion aus der Leber zu beurteilen15,16. Aufgrund der hohen Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen dienen Mäuse als wertvolle Modelle für die Untersuchung molekularer Signalwege. In einigen Studien17 wurde die Leberperfusion verwendet, um die hepatische Insulinclearance in einem Mausmodell direkt zu beurteilen. In diesen Studien wird ein Perfusat, das Humaninsulin enthält, in die Pfortader infundiert und aus der unteren Hohlvene entnommen. Der Anteil des von der Leber aufgenommenen Insulins zeigt ihre Clearance an. Die Leberperfusionstechnik hält die Leber unter nahezu physiologischen Bedingungen, indem ein warmes, sauerstoffreiches und mit Nährstoffen angereichertes Perfusat durch das Lebergefäßsystem zirkuliert. Es gibt jedoch nicht genügend praktische Anleitungen und wichtige Tipps, um diese Technik voranzutreiben und zu verbreiten.

Während die hepatische Insulinclearance zunehmend Aufmerksamkeit erfährt, bleibt ihre Rolle bei Erkrankungen sowie ihre molekularen Mechanismen unklar18. Daher sind fortschrittliche Techniken im Bereich der wissenschaftlichen Forschung dringend erforderlich. Dieses Protokoll legt ein detailliertes modifiziertes Leberperfusionsverfahren bei Mäusen zur Beurteilung der hepatischen Insulinclearance fest. Darüber hinaus kann diese Methode auch verwendet werden, um die Auswirkungen von Medikamenten auf die Leber zu untersuchen, einschließlich des First-Pass-Effekts, der Wirkstofftransportprozesse und verschiedener anderer Aspekte.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der Nanjing Medical University (IACUC-2105018) genehmigt und folgte den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee. Alle C57BL/6N-Mäuse wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Sechs Wochen alte Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in eine Chow-Diät-Gruppe (CD) und eine Gruppe mit fettreicher Diät (HFD) eingeteilt. Die HFD-Gruppe erhielt eine 60% fettreiche Diät und setzte diese Diät bis zum Alter von 10 Wochen fort. Das durchschnittliche Körpergewicht betrug 28,55 g ± 1,2 g für die HFD-Gruppe und 24,3 g ± 0,48 g für die Kontrollgruppe. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung

  1. Führen Sie die erforderliche Sterilisation von chirurgischen Instrumenten und Verbrauchsmaterialien durch Autoklavieren durch.
  2. Legen Sie die chirurgischen Instrumente, die 6-0-Seidennaht, den sterilen kleinen Baumwollapplikator, die Natriumchlorid-Injektion (500 ml), die Wattestäbchen und die Schwämme entsprechend auf den Operationstisch.
  3. Bereiten Sie 30 ml heparinisierte Kochsalzlösung mit einer Endkonzentration von 200 IE/ml vor.
  4. Bereiten Sie zwei Silikonschläuche mit einem Innendurchmesser von 0,31 mm und einem Außendurchmesser von 0,64 mm vor; Einer mit einer Länge von 4 cm für die Verwendung als Pfortaderkatheter und der andere mit einer Länge von 10 cm für den Katheter der unteren Hohlvene.
  5. Bereiten Sie den Krebs-Henseleit (KRBH) Perfusionspuffer vor, der 5,0 mmol/l Glukose und 0,25 % BSA enthält.
  6. Bereiten Sie den Krebs-Henseleit (KRBH) Perfusionspuffer vor, der 5,0 mmol/l Glukose, 0,25 % BSA und 4,0 ng/ml Humaninsulin enthält.
  7. Richten Sie das Leberperfusionssystem ein. Abbildung 1 zeigt die Hauptkomponenten des Leberperfusionssystems.

2. Chirurgische Katheterisierung

  1. Bereiten Sie die Anästhesiemischung vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
    1. Verdünnen Sie Zoletil 50 (250 mg/5 ml) 10-mal mit 0,9% iger Natriumchloridlösung.
    2. Verdünnen Sie Xylazinhydrochlorid (200 mg/2 ml) 10-mal mit 0,9% iger Natriumchloridlösung.
    3. Mischen Sie die 0,5%ige Zoletil 50 Lösung mit der 1% igen Xylazinhydrochloridlösung im Verhältnis 1:1.
  2. Betäuben Sie die Mäuse.
    1. Überprüfen und notieren Sie das Körpergewicht der Maus. Verabreichen Sie das Anästhesiegemisch durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis von 5 ml/kg Körpergewicht (2,5 mg/ml Zoletil 50; 5 mg/ml Xylazinhydrochlorid). Der Beginn der Anästhesie erfolgt typischerweise innerhalb von 5-10 Minuten nach der Injektion, was durch den Verlust des Aufrichtreflexes und eine verminderte Reaktion auf äußere Reize angezeigt wird.
    2. Übertragen Sie die Maus auf den Operationstisch. Sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Verabreichen Sie 2,5 U/g Heparin intraperitoneal, um eine Heparinisierung zu erreichen.
    3. Schneiden Sie das Fell auf der Bauchhaut mit einem Elektrorasierer ab und desinfizieren Sie den Bereich mit einer Povidon-Jod-Lösung.
  3. Führen Sie eine Pfortaderkatheterisierung durch.
    1. Machen Sie einen 4 cm langen Schnitt vom Unterbauch in Richtung des Processus xiphoideus entlang der Mittelbauchlinie. Schneiden Sie das Bauchfell vorsichtig mit einer Schere auf, um eine Beschädigung der viszeralen Organe zu vermeiden. Führen Sie den Abdominal-Retraktor der Maus ein, um das Operationsfeld freizulegen.
    2. Bewegen Sie den Darm nach rechts, um die Pfortader, die rechte Niere und die untere Hohlvene freizulegen (Abbildung 2A). Klemmen Sie mit einer Arterienzange die Hohlvene am oberen Rand der Niere ein.
    3. Isolieren Sie die Pfortader (Abbildung 2A) und ligieren Sie das distale Ende mit einer 6-0-Seidennaht. Binden Sie eine weitere Naht locker an das proximale Ende des freiliegenden Gefäßes.
    4. Machen Sie mit einer Federschere einen Schnitt in der Nähe des ligierten Endes und führen Sie den Katheter ein. Schieben Sie den Katheter durch den Schnitt bis zur Höhe der Pfortadergabelung.
    5. Befestigen Sie beide Ligaturen um den Katheter und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Probenahme, indem Sie das freie Ende des Katheters mit einer Probenahmespritze verbinden. Bündig mit heparinisierter Kochsalzlösung und klemmen Sie den Katheter ein (Abbildung 2C).
    6. Entfernen Sie die Traktionsvorrichtung und setzen Sie den Darm zurück. Decken Sie den Operationsbereich mit kochsalzgetränkter steriler Gaze oder Watte ab.
  4. Führen Sie eine suprahepatische Katheterisierung der unteren Hohlvene durch.
    1. Machen Sie einen Schnitt entlang des Brustbeins aus dem Xiphoidfortsatz und legen Sie das Brustbein frei.
    2. Schneiden Sie das Brustbein vertikal auf und durchschneiden Sie das Zwerchfell entlang des Rippenrandes, um die Brusthöhle freizulegen.
    3. Legen Sie die suprahepatische untere Hohlvene frei und isolieren Sie sie (Abbildung 2B). Ligattieren Sie das distale Ende vorsichtig mit einer 6-0 Seidennaht. Binden Sie locker eine weitere Naht an das proximale Ende des Gefäßes.
    4. Machen Sie mit einer Federschere einen Schnitt direkt unterhalb des ligierten Endes und legen Sie einen 10 cm langen Katheter ein. Schieben Sie den Katheter vor, bis sich die Spitze des Katheters in der Nähe der Leber befindet, und binden Sie beide Ligaturen fest. Bestätigen Sie die ordnungsgemäße Probenahme und klemmen Sie das freie Ende des Katheters ein (Abbildung 2D).
    5. Spülen Sie den Operationsbereich mit Kochsalzlösung ab. Decken Sie die Oberfläche mit mit Kochsalzlösung getränkter steriler Gaze ab.

3. Durchblutung der Leber

  1. Euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Anästhetikum und Thorakotomie in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren, um sicherzustellen, dass alle Eingriffe so durchgeführt werden, dass das Leiden minimiert wird.
  2. Richten Sie das Leberperfusionssystem ein, das einen Oxygenator, ein Temperaturmodulationsgerät, eine Infusionspumpe und Infusionsschläuche umfasst, wie in Abbildung 1 gezeigt.
  3. Stellen Sie einen kontinuierlichen Gasfluss von 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid zum Oxygenator bereit.
  4. Schalten Sie das Wasserbad ein und wärmen Sie die Orgelkammer auf 37 °C vor.
  5. Bereiten Sie den KRBH-Perfusionspuffer mit und ohne Insulin vor. Grundieren Sie das Schlauchsystem mit dem Perfusionspuffer, der in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert wird.
    HINWEIS: Der KRBH ist frei von BSA und Glukose. Der KRBH-Perfusionspuffer ohne Humaninsulin enthält 5,0 mmol/l Glukose und 0,25 % BSA, während der KRBH-Perfusionspuffer mit Humaninsulin 5,0 mmol/l Glukose, 0,25 % BSA und 4,0 ng/ml Humaninsulin enthält.
  6. Stellen Sie die Maus in einen Behälter mit einer Umgebungstemperatur von ca. 37 °C. Verwenden Sie ein Wärmekissen, um die Körpertemperatur auf 37 °C zu halten.
  7. Den KRBH-Puffer wird durch den Pfortaderkatheter infundiert. Stellen Sie die Infusionsrate über eine Minipumpe auf 0,2 mL/min ein.
  8. Beobachten Sie, dass die Leber innerhalb von Sekunden blass wird, was darauf hinweist, dass der Perfusionspuffer durch die Leber fließt. Um weitere verbleibende Blutzellen in der Leber auszuspülen, unterbrechen Sie die Infusion für 1 Minute zu den Zeitpunkten 4 und 8 Minuten und beginnen Sie mit dem Zeitpunkt zu Beginn der Perfusion.
  9. Perfundieren Sie die Leber mit KRBH-Puffer für insgesamt 10 Minuten (ohne die beiden 1-minütigen Pausen), die der Gleichgewichtsperiode entsprechen. Entnehmen Sie die Basalprobe aus dem Katheter der unteren Hohlvene.
  10. Perfundieren Sie die Leber für weitere 30 Minuten mit der gleichen mit Insulin angereicherten Lösung (4,0 ng/ml Humaninsulin).
  11. Entnehmen Sie alle 2 Minuten alle Proben aus der unteren Hohlvene.
  12. Notieren Sie das Lebergewicht nach der Perfusion. Entnehmen Sie Leberproben aus verschiedenen Lappen, frieren Sie sie sofort in flüssigem Stickstoff ein und überführen Sie sie dann zur Lagerung auf -80 °C.
  13. Zentrifugieren Sie alle gesammelten Perfusionsproben bei ~1.000 x g für 10 min bei 4 °C. Die Überstände auffangen und zur Lagerung auf -80 °C umfüllen.
    HINWEIS: Die Insulinkonzentration in Perfusionsproben wird mit ELISA-Kits (Human Insulin Enzyme-linked Immunosorbent Assay) gemessen.
  14. Stellen Sie nach dem Verfahren sicher, dass alle biologischen Abfälle gemäß den Sicherheitsvorschriften entsorgt werden.

4. Datenanalyse

  1. Präsentieren Sie die Daten in XY-Diagrammen, die die Insulinkonzentration im Laufe der Zeit zeigen.
  2. Berechnen Sie die durchschnittliche hepatische Insulinclearance-Rate (HICRAVE) mit der folgenden Formel:
    HICRAVE = (1−Cf/Ci) × 100%
    wobei Ci = anfängliche Insulinkonzentration des Infusionspuffers, Cf = endgültige durchschnittliche Insulinkonzentration in den letzten 10 Minuten aus der suprahepatischen unteren Hohlvene.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren für die Leberinfusion zur direkten Berechnung der hepatischen Insulinclearance. Dieses Modell ist zuverlässig und reproduzierbar. Ein Beispiel für die Ergebnisse eines Experiments ist in Abbildung 3 dargestellt. Nach einer 10-minütigen Äquilibrierungsphase wurde KRBH-Puffer, der mit 4,0 ng/ml Humaninsulin supplementiert wurde, 30 Minuten lang durch die Pfortader perfundiert. In Abständen von 2 Minuten wurde Perfusionsflüssigkeit aus dem Katheter in d...

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Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
Die oben beschriebenen chirurgischen Eingriffe sollten mit sanfter Sorgfalt durchgeführt werden, um Läsionen in der Leber zu vermeiden. Darüber hinaus macht die fragile Struktur der Lebervenengefäßwand sie anfällig für Punktionen und nachfolgende Blutungen, wenn sie während der Kanülierung nicht vorsichtig behandelt wird. In diesem Protokoll werden weichere Silikonschläuche verwendet, um die Schädigung der Blutgefäße zu minimieren. Es w...

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82200948, 82270921, 82170882) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
60% fettreiche ErnährungResearch Diets, USAD12492
Alanin-Aminotransferase-Assay-KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC009-2-1
Wasserfreie GlukoseSangon Biotech50-99-7500 g
Aspartat-Aminotransferase-Assay-KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC010-2-1
Rinderserum AlbuminGeminiBio700-107PFettsäurefreies
Contour TS BlutzuckermessgerätBayerPH220800019
Contour TS BlutzuckerteststreifenBayerDP38M3F05A
Heparin-Natrium Changzhou Qian Hong Bio-PharmaH3202208812500 U/2 mL
HumaninsulinNovo NordiskS20191007300 U/3 mL
Humaninsulin Immunoassay KitEzassay BiotechnologyHM200
KRBH Puffer (Zucker, BSA-frei)coolaberSL65501500 mL
MembranoxygenatorXi'an Xijing Medical Appliance5
Mikroskopische SchereShanghai JinzhongYBC020
Micro-serrefine KlemmeNingbo Medical Needle180709
Mikrochirurgie PinzetteShanghai JinzhongWA3010, WA3020
NadelfilterN-bulivLG05-133-2
Povidon-Jod-LösungShanghai likang Desinfektionsmittel Hi-Tech20231016J
Pumpe 11 EliteHarvard ApparatPC5  70-4500
RetraktorGlobalebio (Beijing) TechnologieGEKK-10mm10 mm
Silikonschlauchwissenschaftliche Rohstoffe#BB518-120,31 mm & mal 0,64 mm
SilikonschlauchFisher Scientific#11-189-15AID 0,5 mm
Natriumchlorid-InjektionsschlauchBaxterS24020234,5 g/500 mL
Chirurgisches SeidennahtYangzhou Huanyu Medical Equipment6-0
TemperaturmodulationXi'an Xijing Medical Appliance6
Thermostatisches WasserbadJiaxing Junsi ElectronicsHIH-1220 V 50 HZ
Drei-Wege-GelenkYISAIAQTCY1.6ID 0,4 mm
Xylazinhydrochlorid-InjektionShengXin20240106200 mg/2mL
Zoletil 50VirbacWK001250 mg/5 ml

Referenzen

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