Methodenartikel

Verwendung menschlicher Darmorganoide zum Verständnis des Dünndarmepithels auf der Ebene der Transkription einzelner Zellen

1.8K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/66749

⸱

28. Juni 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll kombiniert die Technologie der menschlichen Darmorganoide mit der Transkriptomanalyse einzelner Zellen, um einen wichtigen Einblick in die bisher unerforschte Darmbiologie zu erhalten.

Zusammenfassung

Die Einzelzell-Transkriptomik hat unser Verständnis der Zellbiologie des menschlichen Körpers revolutioniert. Modernste humane Dünndarm-Organoidkulturen liefern ex vivo Modellsysteme, die die Lücke zwischen Tiermodellen und klinischen Studien schließen. Die Anwendung der Einzelzell-Transkriptomik auf humane Darmorganoide (HIO)-Modelle enthüllt bisher unerkannte Zellbiologie, Biochemie und Physiologie des Magen-Darm-Trakts. Die fortschrittlichen Einzelzell-Transkriptomik-Plattformen verwenden mikrofluidische Partitionierung und Barcoded, um cDNA-Bibliotheken zu generieren. Diese barcodierten cDNAs können von Next-Generation-Sequencing-Plattformen einfach sequenziert und von verschiedenen Visualisierungstools zur Erstellung von Karten verwendet werden. Hier beschreiben wir Methoden zur Kultivierung und Unterscheidung von humanen Dünndarm-HIOs in verschiedenen Formaten und Verfahren zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus diesen Formaten, die für den Einsatz in Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen geeignet sind. Diese Protokolle und Verfahren erleichtern die Verwendung von Dünndarm-HIOs, um ein besseres Verständnis der zellulären Reaktion des menschlichen Darmepithels auf transkriptioneller Ebene im Kontext einer Vielzahl unterschiedlicher Umgebungen zu erhalten.

Einleitung

Das Dünndarmepithel besteht aus zwei unterschiedlichen Zonen: der Krypta, in der sich die Darmstammzelle (ISC) befindet, und den Zotten, die aus differenzierten Zellen der sekretorischen und absorptiven Linie bestehen. Zu dieser Komplexität kommt die regionale Spezifität des Epithels hinzu, die einzigartige funktionelle Eigenschaften zwischen den Regionen des Dünndarms bietet. In Pionierarbeit wurden Kulturbedingungen geschaffen, in denen sowohl die menschliche Dünndarmkrypta als auch die Zottenzonen ex vivo aus chirurgischem Gewebe oder Gewebebiopsien erzeugt werden können1. Diese Kulturen schließen die Lücke zwischen Tierversuchen und klinischen Studien und enthüllen bisher unerkannte Zellbiologie, Biochemie und Physiologie des Magen-Darm-Trakts. Die HIOs werden als sphärische 3D-Strukturen unter Verwendung eines Mediums mit Wachstumsfaktoren vermehrt, die die Lebensfähigkeit von Stammzellen fördern, und extrazellulären Stützmatrizen. Diese Bedingungen führen zu einem kryptenartigen HIO-Modell, das hauptsächlich aus Vorläuferzellen und Stammzellen besteht. Die Entfernung der Wachstumsfaktoren fördert die ISC-Differenzierung (zottenähnliches Modell) und die Produktion reifer Darmepithelzellen (Kelch, enteroendokrine, Büschel, Enterozyten) in geeigneten Verhältnissen zusammen mit Zellproliferation und -differenzierung, Polarisation, Barriereintegrität, regionalen spezifischen Merkmalen und angemessenen physiologischen Reaktionen2. HIO-Kulturen sind genetisch stabil und können in ihrem kryptenartigen Zustand unbegrenzt vermehrt werden. Der einfache Zugang zur apikalen Oberfläche dieser Kulturen wird durch Kulturbedingungen ermöglicht, die das Wachstum in einem Monolayer-Format ermöglichen3. HIOs ermöglichen es auch, die individuelle Variabilität des Wirts wie Genetik, Alter, Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit und Krankheitsstatus in biologische Analysen einzubeziehen. Analytische und funktionelle Bewertungsinstrumente sind identisch mit denen, die in Ansätzen verwendet werden, die sich auf transformierte Zelllinien konzentrieren, und umfassen eine Vielzahl molekularer Techniken wie Durchflusszytometrie, Mikroskopie, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik.

Die Einzelzell-Transkriptomik revolutioniert unser Verständnis der Biologie und Physiologie des Dünndarms, indem sie Einblicke in die individuellen Beiträge jedes Zelltyps zu einem biologischen Prozess bietet. Pionierarbeit mit dieser Technologie hat eine Landschaft der Zelltypen geschaffen, die im nativen menschlichen Darm vorkommen 4,5,6. Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen ermöglichen die Erforschung der Transkriptionslandschaft einzelner Zellen, so dass die Zellheterogenität in den Vordergrund der wissenschaftlichen Erforschung rückt. In einigen Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen werden mikrofluidische Partitionierung und Barcoding verwendet, um cDNA-Bibliotheken aus zellulären polyadenylierten mRNAs zu generieren, die aus bis zu 10.000 Zellen pro Probe gewonnen werden. Auf dieser Plattform bilden Tröpfchen, die einzelne Zellen, barcodierte Oligonukleotide, reverse Transkriptionsreagenzien und Öl enthalten, ein Reaktionsvesikel, das dazu führt, dass alle cDNAs einer einzelnen Zelle denselben Barcode haben. Die barcodierten cDNAs können dann mittels Next Generation Sequencing effizient sequenziert werden. Die generierten Daten können durch Software und Visualisierungstools verarbeitet werden, die die Barcode-Sequenzen in Visualisierungskarten und Transkriptionsprofile einzelner Zellen umwandeln. Zellpopulationen können anhand öffentlich zugänglicher Datenbanken des menschlichen Dünndarmepithels identifiziert werden 4,5,6. Obwohl viele Studien diese Plattform genutzt haben, um Darmorganoide von Mäusen auf Einzelzellebene zu untersuchen, hinkt die Analyse der einzelzellulären Transkriptionsreaktionen von HIOs 7,8,9,10,11,12 hinterher.

Hier stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus Dünndarm-HIOs für die Verarbeitung auf Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen zur Verfügung (Abbildung 1). Wir stellen Kultivierungs- und Differenzierungsrichtlinien sowie Medienkomponenten zur Verfügung, die für die epitheliale Differenzierung optimiert wurden. Wir skizzieren Zellrückgewinnungsmethoden für drei verschiedene Kulturformate: dreidimensionale (3D) und Monolayer-Kulturen entweder auf Kunststoff- oder auf Membranzellkultureinsätzen. Wir stellen Beispiel-Clustering-Daten zur Verfügung, die mit Open-Source-Software gewonnen wurden, um differentiell exprimierte Gene in jedem Cluster abzuleiten.

Protokoll

Die hier verwendeten Organoidlinien wurden aus dem Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core gewonnen. Um zunächst Organoidlinien zu etablieren, wurden Spendergewebeproben gewaschen und enzymatisch verdaut, um die Darmkrypten freizusetzen. Krypten wurden in eine Basalmembran eingebettet und in einem Medium kultiviert. Das Institutional Review Board am Baylor College of Medicine genehmigte das Studienprotokoll zur Gewinnung von Gewebeproben, aus denen Organoidlinien etabliert wurden, und es wurde die Einverständniserklärung aller Spender eingeholt, Organoidlinien aus dem gespendeten Gewebe zu etablieren.

1. Passage von 3D-HIOs zur Expansion zur Differenzierung

  1. Entfernen und entsorgen Sie das Medium aus den Vertiefungen von Organoiden, die in 24-Well-Platten (um die feste Basalmembran herum) mit einer P1000-Pipette gezüchtet wurden. Geben Sie 300 μl 0,05 % Trypsin-EDTA in die Vertiefung und brechen Sie die Organoide mechanisch auf, indem Sie mit einer P1000-Pipette 5x auf und ab pipettieren.
  2. Platte bei 37 °C 4 Min. inkubieren. Geben Sie 500 μl vollständiges Medium ohne Wachstumsfaktoren (CMGF-Medium) mit 10 % FBS in jede Vertiefung (Tabelle 1). Verwenden Sie eine P1000-Pipette und eine Pipette aus CMGF-Medium und HIO-Mischung, 10x hin und her in der Vertiefung. Übertragen Sie das gesamte Volumen in ein 15-ml-Röhrchen. Kombinieren Sie den Durchgang aus mehreren Vertiefungen in dasselbe 15-ml-Röhrchen. Kombinieren Sie nicht mehr als 10 Vertiefungen pro Röhrchen.
  3. Die Zellen werden bei 4 °C mit einer Ausschwingrotorzentrifuge bei 100 x g für 5 min heruntergeschleudert. Entferne das gesamte Medium und behalte das Pellet am Boden des Rohrs. Halten Sie die Tube auf Eis.
  4. Berechnen Sie die Menge an Basalmembran, die für die Anzahl der HIO-Platten benötigt wird, und resuspendieren Sie das HIO-Granulat in 30 μl/Vertiefung der Basalmembran mit kalten P200-Pipettenspitzen. Pipettieren Sie die HIO-Basalmembranmischung als Tröpfchen mit kalten P200-Pipettenspitzen in die Mitte einer 24-Well-Platte.
  5. Schieben Sie die Platte in einen 37 °C heißen Inkubator. Lassen Sie die Basalmembran 5-10 Minuten lang erstarren, dann fügen Sie 500 μl vollständiges Medium bei Raumtemperatur hinzu, das WNT, R-Spondin, Noggin, EGF und ROCK-Inhibitor (WRNE+Y; Tabelle 1) in jede Vertiefung und in einem 37 °C heißen Inkubator kultivieren. Aktualisieren Sie die Kultur mit WRNE+Y jeden zweiten Tag für 7 Tage.
    HINWEIS: Ein gesundes HIO hat eine zystische Form mit einem glänzenden knospenden Epithel (Abbildung 2). Zellen in der Mitte der Zyste können nicht sichtbar gemacht werden. Ein ungesundes HIO sieht stumpf aus und hat ein dickes Epithel mit einer festen Mitte. Das wichtigste Merkmal ist die glänzende Optik.

2. HIO-Differenzierung: 3D-Format

  1. Verwenden Sie eine Vertiefung mit 3D-HIOs für 3 Vertiefungen mit 3D-differenzierten HIOs 1 Woche nach der Kultivierung.
  2. Entfernen von Medien aus Vertiefungen. Dispergieren Sie Basalmembran und HIOs mit einer P1000-Pipette und fügen Sie kalte 500 μl CMGF- pro Vertiefung hinzu und pipetieren Sie mindestens 5x auf und ab. Die HIOs werden bei 4 °C mit einer Ausschwingzentrifuge bei 100 x g für 5 min heruntergeschleudert. Entfernen Sie das gesamte Medium und halten Sie das Pellet am Boden des Rohrs.
  3. Fügen Sie 30 μl Basalmembran pro Vertiefung mit HIOs hinzu, die plattiert werden. Pipettieren Sie den 30-μl-Tropfen der Basalmembran mit HIOs in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Bei 37 °C 10 min inkubieren. Fügen Sie 500 μl WRNE+Y/Diff (50/50) Medien hinzu.
  4. Schalten Sie das Medium nach 24 Stunden für weitere 3 Tage auf Differenzierungsmedium um und erneuern Sie das Medium jeden zweiten Tag. Bereiten Sie 3 Wells pro Probe für den Pool vor, um die technische Variabilität zu reduzieren.

3. HIO-Differenzierung: Monolayer-Format

  1. Die Membranzellkultureinsätze oder Vertiefungen einer 96-Well-Platte werden mit 100 μl/Vertiefung humanem Plazentakollagen IV (1 mg/ml in 100 mM Essigsäure) bestrichen, verdünnt in kaltem H2O (1:30). Bei 37 °C mindestens 1,5 h oder maximal über Nacht inkubieren. Für den Einsatz von Membranzellkulturen steriles H2O in den Plattenraum geben, um die Platte zu befeuchten; für 96-Well-Platten steriles H2O in die unbenutzten Wells geben.
  2. Sammeln Sie 3D-HIOs, die 7 Tage lang in WRNE kultiviert wurden, indem Sie das Medium entfernen und die Basalmembran und die Zellen durch Zugabe von 500 μl/Well kaltem 0,5 mM EDTA (0,5 M EDTA verdünnt 1:1000 in sterilem PBS) zurückgewinnen. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um Organoide und Lösung 5x auf und ab zu pipettieren und in ein 15-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Poolen Sie nicht mehr als 10 Vertiefungen mit Organoiden pro Röhrchen. 5 min bei 300 x g in einem schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: Um 3 Vertiefungen auf einer 96-Well-Platte vorzubereiten, verwenden Sie 1 Vertiefung 3D-HIOs. Um 1 Membranzellkultureinsatz vorzubereiten, verwenden Sie 1 Vertiefung mit 3D-HIOs (die Aussaatdichte einzelner Zellen beträgt ca. 1-2 x 105 Zellen/Well für eine 96-Well-Platte, 2,5-3 x 105 Zellen/Well für den Einsatz von Membranzellkulturen).
  3. Entfernen Sie 500 μl des Mediums und lassen Sie das Pellet am Boden des Rohrs. Dissoziieren Sie die HIOs durch Zugabe von 500 μl 0,05 % Trypsin/0,5 mM EDTA und inkubieren Sie sie für 4-5 min bei 37 °C. Pipettieren Sie mit einem P1000 ~50x kräftig auf und ab. Vermeiden Sie Blasenbildung, indem Sie gegen die Seite des Röhrchens pipettieren.
  4. Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie 1 ml CMGF- mit 10% FBS hinzufügen. Filtern Sie große Klumpen unverdauter Zellen heraus, indem Sie ein 40-μm-Zellsieb mit 1 ml CMGF benetzen, das 10 % FBS enthält, und die Zellen oben auf das Zellsieb geben. Nutzen Sie die Schwerkraft, um die Zellen durch das Sieb passieren zu lassen, und entsorgen Sie das Zellsieb mit den Zellklumpen.
  5. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 400 x g in einem schwingenden Schaufelrotor bei Raumtemperatur.
  6. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem kollagenbeschichteten Membranzellkultureinsatz oder von der 96-Well-Platte. Resuspendieren Sie das HIO-Pellet in 100 μl/Vertiefung WRNE mit 10 μM Y-27632 und pipettieren Sie es dann in das obere Kompartiment des Membranzellkultureinsatzes oder in die 96-Well-Platte. Für den Einsatz einer Membranzellkultur geben Sie 600 μl WRNE mit 10 μM Y-27632 in das untere Fach der Vertiefung.
  7. Entfernen Sie das Medium nach 24 h sowohl aus dem oberen als auch aus dem unteren Teil des Membranzellkultureinsatzes oder von der 96-Well-Platte und ersetzen Sie es für 5 Tage durch Differenzierungsmedium. Bereiten Sie 3 Wells pro Probe für den Pool vor, um die technische Variabilität zu reduzieren.

4. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus differenzierten 3D-HIOs für die Einzelzell-Transkriptomik

  1. Legen Sie das enzymatische Zellverdauungsreagenz bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator, um es aufzutauen und 30 Minuten vor Beginn des 3D-HIO-Aufschlusses zu erwärmen. Überprüfen Sie die HIOs mit einem Hellfeldmikroskop bei 10x, um die Zellgesundheit sicherzustellen.
  2. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und geben Sie 500 μl Kaltzellen-Rückgewinnungslösung in die Vertiefungen. Pipettieren Sie einige Male auf und ab, um die Zellen mit einer P1000-Pipette und Standard-Pipettenspitzen von der Basalmembran zu befreien. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Verwendung von Replikat-Wells gewährleistet eine ausreichende Zellzahl und reduziert die Variation von Well zu Well. Kombinieren Sie die Vertiefungen nicht vor Schritt 4.7 unten.
  3. Inkubieren Sie die Zellröhrchen 10 Minuten lang auf Eis und pipetieren Sie alle 5 Minuten auf und ab. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 3 min bei 400 x g bei 4 °C gesammelt.
  4. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Rohr und achten Sie darauf, das Küvettenpellet nicht zu beschädigen. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl vorgewärmtem enzymatischem Zellverdauungsreagenz. Pipettieren Sie mit einem P1000 mindestens 10x auf und ab.
  5. Inkubieren Sie die HIOs für 30 min bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator. Pipettieren Sie alle 10 Minuten das gesamte Volumen 10x mit einer P1000-Pipette, um die Dissoziation der Zellen zu unterstützen. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen in die Zellsuspension.
  6. Pelletieren Sie die Zellen für 3 min bei 400 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Differenzierungsmedium und lagern Sie sie auf Eis.
    HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt müssen die HIOs immer auf Eis gehalten werden.
  7. Pipettieren Sie die Zellen 50x schnell mit einem P1000 auf und ab, um sicherzustellen, dass HIOs in einzelne Zellen dissoziiert werden. Achten Sie darauf, dass Sie bei diesem Schritt keine Luftblasen einführen, da dies zu Zellverlust führt.
  8. Filtrieren Sie das gesamte Volumen durch ein 70-μm-Spitzensieb mit einer P1000-Pipettenspitze. Verwenden Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um das Eluat zu sammeln.
    HINWEIS: Die Filterspitze verstopft nicht, wenn die Aufschlusszeit ausreicht. Verwenden Sie mehrere Filterspitzen, wenn der Filter verstopft ist. Drücken Sie die Lautstärke nicht durch den Filter.
  9. Wiederholen Sie Schritt 4.8 mit einem 40 μm Sieb. Lagern Sie die Proben auf Eis.
  10. Zählen Sie lebensfähige Einzelzellen in einer Zellzählkammer unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses, indem Sie 5 μl 0,4 % Trypanblau zu 5 μl Zellsuspension hinzufügen. Verdünnen Sie die Probe nach Bedarf auf 1000 Zellen/μl. Wenn die Zelldichte weniger als 1000 Zellen/μl beträgt, die Zellen 2 Minuten lang bei 400 x g bei 4 °C auffüllen, das Originalmedium entfernen und in Zellkulturmedien resuspendieren. Dieses Protokoll ergibt typischerweise 5 x 105-1 x 106 Zellen.
    HINWEIS: Die Herstellung einer hochwertigen Suspension (90 % lebensfähig und 90 % Einzelzellen) ist für qualitativ hochwertige Einzelzelldaten unerlässlich. Die Erfahrung zeigt jedoch, dass in Fällen, in denen eine Behandlung, wie z. B. eine Infektion oder die Anwendung kleiner Moleküle, die Lebensfähigkeit beeinträchtigt, eine Lebensfähigkeit von nur 75 % akzeptiert werden kann.
  11. Bereiten Sie DNA-Bibliotheken für Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen gemäß den Protokollen des Herstellers vor. Verarbeiten Sie die Daten gemäß den Best-Practice-Protokollen für die scRNAseq-Datenanalyse13,14.

5. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus HIOs, die auf Membranzellkultureinsatz differenziert wurden

  1. Das enzymatische Zellverdauungsreagenz bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator geben, um es 30 Minuten vor Beginn des Aufschlusses der HIO-Membranzellkultureinlage aufzutauen und zu erwärmen. Das vorgewärmte enzymatische Zellaufschlussreagenz wird in 200 μl Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt, 1 Röhrchen pro Membran-Zellkultureinsatz. Bewahren Sie die Röhrchen bis zur Verwendung im 37 °C heißen Inkubator auf.
  2. Bereiten Sie PBS-EDTA vor, indem Sie 5 μl 0,5 M EDTA zu 5 mL PBS hinzufügen. Aliquotieren Sie 500 μl PBS-EDTA in eine 24-Well-Platte, 1 Well pro Membran-Zellkultureinsatz.
  3. Waschen Sie die Zellen mit PBS-EDTA: Übertragen Sie die Membranzellkultureinsätze aus den Vertiefungen mit den Wachstumsmedien in die Vertiefungen mit PBS-EDTA. Entfernen Sie das Zellkulturmedium von der apikalen Seite und ersetzen Sie es durch 100 μl PBS-EDTA. Achten Sie darauf, die Zellschicht nicht zu stören.
  4. Verwerfen Sie sofort das PBS-EDTA, das der apikalen Seite der Membranzellkultureinsätze zugesetzt wurde. Nehmen Sie den Membranzellkultureinsatz aus der Vertiefung, tupfen Sie ihn ab, indem Sie den Rand vorsichtig mit einem Papiertuch berühren, und drehen Sie ihn dann auf der Tischplatte um. Entferne die Membran mit einer scharfen Skalpellklinge vom Einsatz, indem du den Innenumfang der Membran umschneidest. Arbeiten Sie schnell, um ein Austrocknen zu verhindern.
  5. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Membran in das vorgewärmte 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, das mit enzymatischem Zellverdauungsreagenz gefüllt ist, und stellen Sie sicher, dass die Membran vollständig eingetaucht ist. Wiederholen Sie den Vorgang für alle weiteren Membranzellkultureinsätze.
    HINWEIS: Eine Erhöhung des Volumens des enzymatischen Zellverdauungsreagenzes auf 500 μl kann bei der Dissoziation dichter Monoschichten helfen.
  6. Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie Röhrchen mit Membranen bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator inkubieren. Mischen Sie, indem Sie das gesamte Volumen vorsichtig 5x mit einer 200-μl-Pipette alle 10 Minuten für insgesamt 30 Minuten pipettieren. Vermeiden Sie Blasen und Saugen der Membran, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
  7. Übertragen Sie alle 10 Minuten ein kleines Aliquot von Zellen (1-2 μl) auf einen Objektträger, um die Dissoziation zu beurteilen, indem Sie den Prozentsatz der einzelnen Zellen qualitativ beurteilen. Je nach HIO-Typ kann es mit zusätzlichem Pipettieren bis zu 50 Minuten dauern, um 80 % bis 90 % Einzelzellen zu erreichen. Kratzen Sie die Membran während der Mischschritte vorsichtig mit einer Pipettenspitze ab, um die Dissoziation zu fördern, insbesondere bei schwer zu dissoziierenden Zellen, jedoch kann das Schaben die Lebensfähigkeit beeinträchtigen.
  8. Kombinieren Sie 3 Replikat-Wells pro Bedingung in einem einzigen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (insgesamt 600 μl). 400 μl Zellkulturmedium (diff) + 10 μM ROCKi (1 ml Gesamtvolumen) zugeben. Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
    HINWEIS: Die Verwendung von Replikat-Wells gewährleistet eine ausreichende Zellzahl und reduziert die Variation von Well zu Well. In diesem Schritt sollten die Bohrlöcher gepoolt werden.
  9. Filtern Sie das gesamte Volumen durch ein 70-μm-Spitzensieb mit einer 1-ml-Pipettenspitze. Sammeln Sie den Durchfluss in einem frischen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Filterspitze verstopft nicht, wenn die Aufschlusszeit ausreicht. Verwenden Sie mehrere Filterspitzen, wenn der Filter verstopft ist. Drücken Sie die Lautstärke nicht durch.
  10. Wiederholen Sie Schritt 5.9 mit einem 40 μm Sieb. Lagern Sie die Proben auf Eis.
  11. Zählen Sie lebensfähige Einzelzellen in einer Zellzählkammer unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses, indem Sie 5 μl 0,4 % Trypanblau zu 5 μl Zellsuspension hinzufügen. Verdünnen Sie die Probe nach Bedarf auf 1000 Zellen/μl. Wenn die Zelldichte weniger als 1000 Zellen/μl beträgt, 2 min bei 400 x g bei 4 °C drehen, um die Zellen zu pelletieren, das ursprüngliche Medium zu entfernen und in WRNE+Y bei der gewünschten Zelldichte zu resuspendieren. Dieses Protokoll ergibt typischerweise 4 x 105 - 6 x 105 Zellen.
    HINWEIS: Die Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Suspension (90 % lebensfähige und 90 % Einzelzellen) ist für qualitativ hochwertige Einzelzelldaten unerlässlich. Die Erfahrung zeigt jedoch, dass in Fällen, in denen eine Behandlung, wie z. B. eine Infektion oder die Anwendung kleiner Moleküle, die Lebensfähigkeit beeinträchtigt, eine Lebensfähigkeit von nur 75 % akzeptiert werden kann.
  12. Bereiten Sie DNA-Bibliotheken für die Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen gemäß den Protokollen des Herstellers vor. Verarbeiten Sie die Daten gemäß den Best-Practice-Protokollen für die scRNAseq-Datenanalyse13,14.

6. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus HIOs, die als 96-Well-Monoschichten differenziert werden

  1. Das enzymatische Zellverdauungsreagenz bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator geben, um es 30 Minuten vor Beginn des Monolayer-HIO-Aufschlusses aufzutauen und zu erwärmen.
  2. Bereiten Sie PBS-EDTA vor, indem Sie 5 μl 0,5 M EDTA zu 5 mL PBS hinzufügen. Entsorgen Sie das Zellkulturmedium von der 96-Well-Platte und ersetzen Sie es durch 100 μl PBS-EDTA. Achten Sie darauf, die Zellschicht nicht zu stören.
  3. Dissoziieren Sie die Zellen: Entsorgen Sie das PBS-EDTA und geben Sie 100 μl warmes enzymatisches Zellverdauungsreagenz in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in einen 5% CO2 -Inkubator und mischen Sie, indem Sie das gesamte Volumen vorsichtig 5x mit einer 200 μl Pipettenspitze alle 10 min für 20-30 min pipettieren. Vermeiden Sie Blasen, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
    HINWEIS: Eine Erhöhung des Volumens des enzymatischen Zellverdauungsreagenzes auf 500 μl kann bei der Dissoziation dichter Monoschichten helfen.
  4. Übertragen Sie alle 10 Minuten ein kleines Aliquot von Zellen (1-2 μl) auf einen Objektträger, um die Dissoziation zu beurteilen. Je nach HIO-Typ kann es bis zu 50 Minuten dauern, bis 80 % bis 90 % Einzelzellen erreicht sind. Kratzen Sie die Platte während der Mischschritte vorsichtig mit einer Pipettenspitze ab, um die Dissoziation zu fördern, insbesondere bei schwer zu dissoziierenden Zellen; Das Scraping kann sich jedoch auf die Rentabilität auswirken.
  5. Kombinieren Sie 3 Replikat-Wells pro Bedingung in einem einzigen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (insgesamt 300 μl). Fügen Sie 700 μl Zellkulturmedium (diff) + 10 μM ROCKi (1 ml Gesamtvolumen) hinzu. Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
    HINWEIS: Die Verwendung von replizierten gewachsenen Wells gewährleistet eine ausreichende Zellzahl und reduziert die Variation von Well zu Well.
  6. Filtern Sie das gesamte Volumen durch ein 70-μm-Spitzensieb mit einer 1-ml-Pipettenspitze. Sammeln Sie den Durchfluss in einem frischen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Filterspitze verstopft nicht, wenn die Verdauungszeit des enzymatischen Zellverdau-Reagenzes ausreichend ist. Verwenden Sie mehrere Filterspitzen, wenn der Filter verstopft ist. Drücken Sie die Lautstärke nicht durch.
  7. Schritt 6.6 mit einem 40 μm Sieb wiederholen. Lagern Sie die Proben auf Eis.
  8. Zählen Sie lebensfähige Einzelzellen in einer Zellzählkammer unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses, indem Sie 5 μl 0,4 % Trypanblau zu 5 μl Zellsuspension hinzufügen. Nach Bedarf auf 1000 Zellen/μl verdünnen. Wenn die Zelldichte weniger als 1000 Zellen/μl beträgt, drehen Sie 2 Minuten bei 400 x g 4 °C, um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie das ursprüngliche Medium und resuspendieren Sie es in Zellkulturmedien + ROCKi bei der gewünschten Zelldichte. Dieses Protokoll ergibt typischerweise 2 x 105 - 6 x 105 Zellen.
    HINWEIS: Die Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Suspension (90 % lebensfähige und 90 % Einzelzellen) ist für qualitativ hochwertige Einzelzelldaten unerlässlich. Die Erfahrung zeigt jedoch, dass in Fällen, in denen eine Behandlung, wie z. B. eine Infektion oder die Anwendung kleiner Moleküle, die Lebensfähigkeit beeinträchtigt, eine Lebensfähigkeit von nur 75 % akzeptiert werden kann.
  9. Bereiten Sie DNA-Bibliotheken gemäß den Protokollen des Herstellers der Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattform vor. Verarbeiten Sie die Daten gemäß den Best-Practice-Protokollen für die scRNAseq-Datenanalyse13,14.

Ergebnisse

Einzelzellsuspensionen wurden aus 2-3 Vertiefungen mit Membranzellkulturinsert, Monolayern und 3D-HIOs gepoolt, um eine ausreichende Zellausbeute zu gewährleisten und die Variation von Well zu Well zu reduzieren. Einzelzellbibliotheken wurden unter Verwendung von Reagenzien erstellt, die spezifisch für die Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattform sind. und sequenziert mit gepaarten End-Reads auf einer Next-Generation-Sequencing-Plattform, 30.000 Reads/Zelle. Die Reads wurden mit Hilfe von Analysewerkzeugen für die Einzelzellgenomik kartiert, gezählt und analysiert. Minderwertige Zellen mit mehr als 20 % mitochondrialen Lesevorgängen oder weniger als 200 gezählten Genen wurden von der Analyse ausgeschlossen. Um die Qualität der Zellen zu beurteilen, haben wir die Anzahl der Gene, UMIs und prozentualen mitochondrialen Lesevorgänge pro Zelle aufgetragen (Abbildung 3); Hochwertige Zellen enthalten etwa 3500 Gene, 15.000 UMIs und 10 % mitochondriale Reads. Nach der Filterung erhielten wir je nach HIO-Wachstumsformat 4000 bis 9500 Einzelzellen. Unüberwachtes Clustering und UMAP-Dimensionsreduktion identifizierten unterschiedliche Cluster, die erwartete Zelltypen repräsentieren, einschließlich absorbierender Enterozyten und sekretorischer Zellen (Abbildung 4).

figure-results-1
Abbildung 1: Überblick über die Protokollschritte. Schaltpläne, die die wichtigsten Schritte bei der Beschichtung von HIOs in verschiedenen Formaten für den Arbeitsablauf von Einzelzelldaten beschreiben. Dieses Bild wurde mit Biorender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Hellfeldbilder. HIOs, die für die Verarbeitung bereit waren, wurden mit einem Hellfeldmikroskop bei 5-facher Vergrößerung abgebildet. Links: 3D-Organoide; Mitte, 96-Well-Platte; Richtig, Transwell. Maßstabsstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Qualitätskontrolle der Daten. Beispielmetriken von analysierten Einzelzellen, die aus jejunalen HIOs isoliert wurden, die als Monoschichten auf 96-Well-Platten gezüchtet wurden. Violin-Diagramme zeigen die Anzahl der Gene (nFeature_RNA), UMIs (nCount_RNA) und prozentualen mitochondrialen Lesevorgänge (percent.mt) pro Zelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: UMAPs von analysierten Einzelzellen. (A) Insgesamt wurden 9952 Einzelzellen aus differenzierten jejunalen HIOs isoliert, die in 96-Well-Platten gezüchtet wurden. (B) Insgesamt wurden 5623 Einzelzellen aus differenzierten jejunalen HIOs isoliert, die auf Membranzellkulturinsertionen gezüchtet wurden. (C) Insgesamt wurden 4402 Einzelzellen aus differenzierten ilealen 3D-HIOs isoliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

WRNE WachstumsmediumDifferenzierungsmedium
BestandteilVolumenEndkonzentrationWRNE-Medium ohne L-WRN-konditioniertes Medium, Nicotinamid und SB202190
*Y-27632 (5 mM) optional200 μL10 μM
A 83-01 (500 μM)100 μL500 nM
Erweitertes DMEM/F1245 mL
Nr. B272 mL
EGF (50 μg/ml)100 μL50 ng/ml
Gastrin (10 μM)100 μL10 nm
GlutaMax (100-fach)1 mL
HEPES 1 M1 mL
L-WRN Con- Medien50 mL~50%
N21 mL
N-Acetylcystein (500 mM)100 μL500 μM
Nicotinamid 1 M1 mLca. 10 mM
SB202190 (10 mM)100 μL10 μM
Gesamtvolumen100 mL
CMGF - Mittel
Erweitertes DMEM/F12500 mL
Glutamax5 mL100-mal
1 M Hepes5 mL

Tabelle 1: Zusammensetzung der verschiedenen verwendeten Medien.

Diskussion

Mit Hilfe von Einzelzellgenomik-Plattformen können komplexe biologische Systeme, wie z. B. aus Gewebe gewonnene HIO-Kulturen, die das Darmepithel modellieren, so aufgebrochen werden, dass individuelle zelluläre Beiträge zur biologischen Gesamtreaktion erzielt werden 4,5,6. Auch zelluläre Heterogenität und seltene Zellpopulationen können identifiziert und abgefragt werden. Der zelluläre Input muss optimiert werden, um den Output mit einzelzellulären transkriptomikbasierten Plattformen zu maximieren. Hier beschreiben wir Protokolle, die sehr brauchbare und qualitativ hochwertige Einzelzellsuspensionen liefern, die die Wahrscheinlichkeit erhöhen, nachgelagerte qualitativ hochwertige Transkriptomdaten zu erhalten. Die Vertrautheit mit dem Protokoll ist von größter Bedeutung, und es wird empfohlen, mehrere Übungsläufe durchzuführen, bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahren. Es wird empfohlen, dass vor der Verwendung der Zellen für die Bibliotheksvorbereitung reproduzierbare Einzelzellsuspensionen erzielt werden. Die Geschwindigkeit, mit der das Protokoll umgesetzt wird, ist von größter Bedeutung, da die Geschwindigkeit direkt proportional zu den Durchführbarkeitsergebnissen ist. Aus diesem Grund wird empfohlen, die Anzahl der gleichzeitig gehandhabten Proben zu begrenzen. Es wird empfohlen, sich mit der Entität in Verbindung zu setzen, die die Bibliotheken vor dem Initiieren dieser Protokolle vorbereitet, um Unterstützung bei der Problembehandlung zu erhalten.

Die Lebensfähigkeit von HIOs beeinflusst direkt die DNA-Bibliothek, die zur Sequenzierung gesendet wird. Die Zellviabilität des HIO hängt von mehreren Schritten bei der Herstellung der Einzelzellsuspension ab, einschließlich Dissoziation, Zentrifugation, Puffer, Pipettieren und Zählgenauigkeit. Das Ziel der Vorbereitung der HIOs für die Plattform ist es, die Aufrechterhaltung der Zellviabilität mit der Probenqualität in Einklang zu bringen. Entscheidend für die Erzielung qualitativ hochwertiger Daten ist die Minimierung von zellulären Aggregaten, toten Zellen, nicht-zellulären Nukleinsäuren und biochemischen Inhibitoren der reversen Transkription. Sterbende Zellen erhöhen das Nukleinsäurerauschen und tragen zur Zellverklumpung bei, was zu Daten- und Plattformfehlern führt 7,8,9,10,11,12. Das Filtern mit einer geeigneten Filtergröße kann dazu beitragen, große Aggregate zu entfernen und die Datenqualität zu verbessern.

Mehrere Faktoren müssen berücksichtigt werden, um den HIO-Zelltod bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen zu minimieren. Es ist notwendig, mindestens 80 % lebensfähige Zellen zu erhalten, und >90 % Lebensfähigkeit ist noch wünschenswerter. Proben mit einer hohen Anzahl nicht lebensfähiger Zellen können durch Strategien zur Entfernung abgestorbener Zellen, wie z. B. säulenbasierte Mikrokügelchen, verbessert werden, obwohl diese aufgrund von Verlusten während der Handhabung mehr Ausgangszellen und größere Probenvolumina erfordern. HIOs reagieren besonders empfindlich auf Puffer und erleiden den Zelltod, wenn sie in bestimmten Puffern zu lange bei RT verbleiben. Organoide Medien führen zu einem geringsten Zellverlust und einer geringsten Aggregatbildung. Pipettieren kann auch die Lebensfähigkeit von HIOs während der Dissoziation beeinträchtigen. Reguläre Bohrungsspitzen können Organoide scheren und so helfen, in einzellige Suspensionen zu dissoziieren. Ein zu schnelles Pipettieren mit einer regulären Bohrungsspitze kann jedoch zu einer Schädigung der HIO-Zellen durch die Scherkräfte führen. Langsames Pipettieren mit Spitzen mit breiter Öffnung minimiert die Belastung der HIO-Zellen und verbessert die Anzahl der lebensfähigen Zellen flussabwärts erheblich. Zentrifugieren, Waschen und Resuspendieren sind weitere Faktoren, die die Qualität von HIO-Einzelzellsuspensionen beeinflussen können. Die schwingende Becherzentrifugation führt zu einer schonenderen Pelletierung der HIO-Zellen, was zu einer geringeren Anzahl toter Zellen führt und gleichzeitig den Zellverlust minimiert. Schließlich ist die Zählgenauigkeit zur Bestimmung der Konzentration unerlässlich, um sicherzustellen, dass die maximale Anzahl von Zellen die Plattform für die Bibliothekssynthese erreicht. Die Beachtung dieser Details führt zu einer Minimierung der Belastung der HIO-Zellen während des Isolationsprozesses und gewährleistet die höchste Wahrscheinlichkeit einer Datenrückgabe nach der Verarbeitung.

Obwohl die Einzelzell-Transkriptomik ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um biologische Profile und Reaktionen auf Einzelzellebene zu analysieren 4,5,6, gibt es mehrere Einschränkungen, die bei der Anwendung der Technologie zur Analyse menschlicher Darmorganoidkulturen berücksichtigt werden müssen. Erstens kann es aufgrund der technischen Variabilität, die während der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung eingeführt wird, oder aufgrund von Batch-Effekten, die sich aus der Probenvorbereitung ergeben, zu erheblichen transkriptionellen Variationen kommen. Darüber hinaus kann die Sequenzierung zu einer Abdeckungsverzerrung führen, wenn die Sequenzierungstiefe über Gene oder Zellen hinweg ungleichmäßig ist. Dies führt zu Herausforderungen beim Nachweis niedrig exprimierter Gene oder bei der Identifizierung seltener Zellpopulationen. Zweitens kann die Identifizierung von Zelltypen aufgrund der zellulären und transkriptionellen Heterogenität der Organoidkulturen und eines weniger differenzierten zellulären Profils im Vergleich zum nativen Darmepithel schwierig sein. Die Kopplung von transkriptionellen Reaktionen an funktionelle Phänotypen ist ebenfalls eine Herausforderung und erfordert eine zusätzliche Validierung mit anderen Ansätzen oder Assays. Drittens beinhaltet dieser Ansatz keine Berücksichtigung des räumlichen Kontexts oder der zeitlichen Dynamik der Zellen. Das Dissoziationsverfahren beseitigt die Möglichkeit, Zell-Zell-Interaktionen aus den Transkriptionsdaten abzuleiten. Es liefert nur eine einzige Momentaufnahme des zellulären Zustands und kein biologisches Kontinuum. Schließlich können transkriptionelle Ansätze für Einzelzellen kostspielig sein und spezielle Computerwerkzeuge und bioinformatisches Know-how erfordern. Dieser Ansatz ist jedoch nach wie vor ein dominierendes Werkzeug auf dem neuesten Stand der Technik, um die zelluläre Heterogenität zu verstehen und neue Zelltypen zu identifizieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren danken den Zuschüssen U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 und NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 nM
0,05 % Trypsin-EDTAInvitrogen25300054
0,4 % TrypanblauMillipore-SigmaT8154
0,5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
24 Well Nunclon Delta-Oberflächen-GewebekulturschaleThermo Scientific142475
40 & micro; m ZellensiebFalcon352340
40 µ m Flowmi SpitzensiebSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 µ m Flowmi SpitzensiebSP Bel-Art LabwareH13680-0070
96-Well-PlatteCorning3595
A-83-01Tocris2939500
nM AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 ErgänzungInvitrogen17504-0441X
Chrom Next GEM Einzelzelle 3' GEM, Bibliothek & Gel Bead Kit v3.110x GenomicsPN-1000128
Kollagen IVSigma-AldrichC5533-5MG33 µ g/mL
Corning Zellrückgewinnungslösung VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN konditioniertes MediumATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, phenolfreiCorning356231
Maus rekombinante EGFInvitrogenPMG804350 ng/ml
N2 SupplementInvitrogen17502-0481X
N-AcetylcysteinSigma-AldrichA9165-5G500 µ M
NicotinamidSigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 µ M
TranswellCorning3413
Y27632Stammzelltechnologien7230810 & Mikro; M

Referenzen

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
  3. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  4. Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
  5. Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
  6. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  7. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).
  8. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
  9. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
  10. Beumer, J., et al. BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states. Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).
  11. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
  12. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Einzelzell TranskriptomikOrganoidkulturZelldissoziationtranskriptionelle Profilierungmikrofluidische PartitionierungNext Generation SequencingZelltypidentifizierungHellfeldmikroskopie

Verwandte Artikel