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Methodenartikel

Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

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DOI:

10.3791/66752

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26. April 2024

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1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die aktuelle Studie zeigt Protokolle zur Bewertung der frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen und zur Manipulation der Genexpression in diesen Zellen.

Zusammenfassung

Follikuläre T-Helferzellen (TFH) werden als eigenständige CD4+ T-Zelllinie wahrgenommen, die verwandte B-Zellen bei der Produktion von hochaffinen Antikörpern unterstützt und so eine langfristige humorale Immunität aufbaut. Während einer akuten Virusinfektion wird das Schicksal virusspezifischerT-FH-Zellen in der frühen Infektionsphase bestimmt, und Untersuchungen der früh differenziertenT-FH-Zellen sind entscheidend für das Verständnis der T-Zell-abhängigen humoralen Immunität und die Optimierung des Impfstoffdesigns. In der Studie haben wir unter Verwendung eines Mausmodells für eine akute Infektion mit dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) und der TCR-transgenen SMARTA (SM)-Maus mit CD4+ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-AbGP66-77 erkennen, Verfahren beschrieben, um auf der Grundlage von Durchflusszytometrie-Färbungen auf das frühe Schicksal von virusspezifischenT-FH-Zellen zuzugreifen. Darüber hinaus werden durch die Ausnutzung der retroviralen Transduktion von SM CD4+ T-Zellen auch Methoden zur Manipulation der Genexpression in früh differenzierten virusspezifischenT-FH-Zellen bereitgestellt. Daher werden diese Methoden bei Studien helfen, die den Mechanismus untersuchen, der der frühen Bindung von virusspezifischenT-FH-Zellen zugrunde liegt.

Einleitung

Wenn naive CD4+ T-Zellen auf unterschiedliche Krankheitserreger oder Bedrohungen treffen, passen sie ihre Immunantworten an, indem sie sich in verschiedene T-Helfer-Zell-Untergruppen (TH) mit spezialisierten Funktionen differenzieren1. Im Szenario einer akuten Virusinfektion differenziert sich ein großer Teil der naiven CD4+ T-Zellen zu follikulären Helfer-T (TFH)-Zellen, die den B-Zellen helfen 2,3. Im Unterschied zu anderen CD4+ TH Zell-Untergruppen (z. B. TH1, TH2, TH9 und TH17 Zellen) exprimieren TFH-Zellen eine beträchtliche Menge an CXCR5, dem Chemokinrezeptor für das B-Zell-Homing-Chemokin CXCL13, das es TFH-Zellen ermöglicht, in B-Zellfollikel zu wandern. In den B-Zell-Follikeln unterstützenT-FH-Zellen verwandte B-Zellen bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von Keimzentrumsreaktionen und ermöglichen so eine schnelle Produktion von Antikörpern mit hoher Affinität und ein humorales Langzeitgedächtnis 2,3.

Nach einer akuten Virusinfektion erfolgt die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen innerhalb von 72 h 4,5 und wird durch den transkriptionellen Repressor B-Zell-Lymphom-6 (Bcl-6)5,6,7,8 gesteuert, der als "Master-Regulator" fungiert und über das Schicksal vonT-FH-Zellen entscheidet. Ein Mangel an Bcl-6 stumpft die Differenzierung derT-FH-Zellen stark ab, während die ektopische Bcl-6-Expression die Bindung der T-FH-Zellen an das Schicksal derT-FH-Zellen erheblich fördert. Zusätzlich zu Bcl-6 sind mehrere Moleküle an der Instruktion des frühen Schicksals derT-FH-Zellen beteiligt. Die Transkriptionsfaktoren TCF-1 und LEF-1 initiieren die Differenzierung derT-FH-Zellen über die Induktion von Bcl-6 9,10,11. Die Hemmung von Blimp1 sowohl durch Bcl-6 als auch durch TCF-1 ist für die frühe Bindung vonT-FH-Zellen erforderlich11,12. STAT1 und STAT3 werden auch für die frühe Differenzierung vonT-FH-Zellen benötigt13. Darüber hinaus tragen epigenetische Modifikationen durch die Histon-Methyltransferase EZH214,15 und die m6A-Methyltransferase METTL316 dazu bei, die Transkriptionsprogramme derT-FH-Zellen (insbesondere Bcl6 und Tcf7) zu stabilisieren und damit das frühe Schicksal derT-FH-Zellen zu unterstützen. Während Fortschritte, einschließlich der oben genannten Moleküle und anderer, die an anderer Stellezusammengefasst sind 3, beim Verständnis der transkriptionellen und epigenetischen Regulation des frühen Schicksals vonT-FH-Zellen gemacht wurden, müssen bisher unbekannte Moleküle noch gelernt werden.

Im Mausmodell der akuten lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV)-Infektion durchlaufen adoptiv übertragene kongene TCR-transgene SMARTA (SM) CD4+ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-AbGP66-77 erkennen, während der Virusinfektion entweder eineT-FH- oder eineT-H1-Zelldifferenzierung. Dieses TFH/TH1-Bifurkationsdifferenzierungsmuster unterstützt die Weiterentwicklung des SM/akuten LCMV-Infektionsmodells bei der Untersuchung der Biologie virusspezifischer TFH-Zellen. In der Tat ist das SM/akute LCMV-Infektionsmodell in derT-FH-Zellforschung weit verbreitet und hat eine entscheidende Rolle bei bahnbrechenden Entdeckungen in derT-FH-Zellbiologie gespielt. Dies beinhaltet die Identifizierung des bereits erwähnten Bcl-6 als liniendefinierenden Transkriptionsfaktor derT-FH-Zellen 5,6 sowie anderer wichtiger transkriptioneller Faktoren (z. B. Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 und Itch19), die die Differenzierungvon T-FH-Zellen steuern, posttranskriptionelle Regulierungen ( z.B. METTL316 und miR-17~9220) der T-FH-Zelldifferenzierung, des T-FH-Zellgedächtnisses und der Plastizität21,22 und rationaler Impfstrategien, die auf T-FH-Zellen abzielen (z. B. Selen23).

Die vorliegende Studie beschreibt reproduzierbare Methoden für den Zugang zur frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen , einschließlich (1) der Etablierung eines akuten LCMV-infizierten SM-Chimären-Mausmodells, das für den Zugang zu früh differenziertenT-FH-Zellen geeignet ist, (2) der Durchführung von Durchflusszytometrie-Färbungen von Molekülen, die mit frühdifferenziertenT-FH-Zellen verwandt sind, und (3) der Durchführung retroviraler vektorbasierter Genmanipulation in SM CD4+ T-Zellen. Diese Methoden werden für Studien nützlich sein, die die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen untersuchen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach Verfahren durchgeführt, die von den Institutional Animal Care and Use Committees der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt wurden. Die folgenden Mausstämme wurden in der vorliegenden Studie verwendet: C57BL/6J (B6) Maus (beide Geschlechter), im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25-30 g; CD45.1+SM TCR-transgene Maus (B6 CD45.1 × SM TCR transgen), beide Geschlechter, im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25-30 g; und CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR-transgene Maus (B6 CD45.1 × SM TCR-transgene × CXCR5-GFP Knock-in), beide Geschlechter, im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25-30 g. Die transgenen Spezies wurden in Anlehnung an einen zuvor veröffentlichten Berichtgeneriert 24. Die Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien, Puffern und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Ernte von CD45.1+ SM CD4+ T-Zellen für den adoptiven Transfer

  1. Euthanasieren Sie (gemäß institutionell zugelassenen Protokollen) die erforderliche Anzahl von CD45.1+ TCR-transgenen SM-Mäusen im Alter von 6 bis 8 Wochen24. Machen Sie einen 1-Zoll-Schnitt links von der Peritonealwand der euthanasierten Mäuse mit einer chirurgischen Schere, präparieren Sie die Milz vom Peritoneum und reißen Sie das Bindegewebe hinter der Milzauf 25,26.
  2. Legen Sie jede Milz in ein 70-μm-Zellsieb in einer Petrischale (60 mm × 15 mm) und mahlen Sie die Milz mit 3 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) unter Verwendung eines 1-ml-Spritzenkolbens.
    HINWEIS: Verwenden Sie die runde Seite des Spritzenkolbens, um die Milz zu schleifen, bis nur noch Bindegewebe übrig ist.
  3. Geben Sie 6 ml RPMI + 2 % FBS (RPMI 2 %) in jede Schale, um 3 ml Erythrozyten-Lysepuffer zu verdünnen. Pipettieren Sie die Zellsuspensionen in ein konisches 15-ml-Röhrchen aus der Schale. Spülen Sie das Gericht mit zusätzlichen 3 ml 2 % RPMI aus und geben Sie es in dasselbe konische Röhrchen.
  4. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Resuspendieren Sie die Zellen mit einem Isolationspuffer und stellen Sie die Zelldichte auf ~1 × 108 Zellen pro ml ein. Lege das Rohr auf Eis.
  5. Bereiten Sie einen 1x biotinylierten Antikörpercocktail gegen CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c und Ter119 in Isolationspuffer für die Anreicherung von CD4+ T-Zellen vor.
    HINWEIS: Biotinylierte Antikörper in den Isolationspuffer in der angegebenen Verdünnung geben, wie in der Materialtabelle angegeben. Das Volumen des Antikörpercocktails ist das Volumen des Isolationspuffers in Schritt 1.4 gleich zu halten.
  6. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen.
  7. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit dem angegebenen 1x biotinylierten Antikörpercocktail im konischen Röhrchen.
  8. Legen Sie das konische Rohr für 30 min bei 45 U/min in einem Shaker auf Eis.
  9. Während der Inkubation mit biotinylierten Antikörpern ist die erforderliche Menge an Streptavidin-beschichteten Kügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers herzustellen.
    HINWEIS: Die Gesamtsplenozyten einer naiven Maus benötigen 200 μl Streptavidin-beschichtete Kügelchen.
  10. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 800 x g mit 8-10 mL Isolationspuffer für 5 min bei 4 °C gewaschen und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male.
  11. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit vorbereiteten Streptavidin-beschichteten Kügelchen.
  12. Legen Sie das Rohr für 40 min bei 45 U/min in einen Shaker auf Eis.
  13. Legen Sie dann das Rohr für 3-4 Minuten auf einen Magnetständer, bis alle Perlen auf der magnetischen Seite zusammengefügt sind.
  14. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig und geben Sie ihn in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
  15. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen.
    HINWEIS: Es gibt andere kommerzielle Kits für die CD4+ T-Zell-Anreicherung, die als Ersatz für das in den Schritten 1.5-1.15 beschriebene Verfahren zur Anreicherung von CD4+ T-Zellen verwendet werden können.
  16. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2-3 mL mit 2 % RPMI. Aspirieren Sie 50 μl Zellsuspension für die durchflusszytometrische Analyse der Effizienz der CD4+ T-Zellanreicherung (CD4 und Vα2) und der Zellviabilität.
  17. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit RPMI und stellen Sie die Zelldichte auf 1 ×10 7 CD4+Vα2+ SM-Zellen pro ml ein. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und fahren Sie im nächsten Schritt mit dem adoptiven Zelltransfer fort.

2. Etablierung des akuten LCMV-infizierten SM-Chimären-Mausmodells für den Zugang zu früh differenzierten SM TFH-Zellen

  1. Erwärmen Sie die 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6-Empfängermäuse mit einer Infrarotlampe, um die Schwanzvene für die intravenöse Injektion zu erweitern.
  2. 100 μl der in Schritt 1.17 hergestellten Zellsuspension mit 1 ×10 6 SM-Zellen mit einer Insulinspritze aspirieren.
    HINWEIS: Das Injektionsvolumen sollte von jedem Forscher geändert werden und sollte das nach institutionellen und lokalen Gesetzen zulässige maximale Injektionsvolumen nicht überschreiten.
  3. Halten Sie die Mäuse mit einem Mausfixateur an Ort und Stelle, richten Sie den Schwanz aus und wischen Sie den Schwanz mit einem Wattebausch mit 75% Ethanol ab, um die Schwanzvene sichtbar zu machen.
  4. Führen Sie die Insulinspritzennadel in die Schwanzvene ein und injizieren Sie die Zellsuspensionen sanft und langsam. Lassen Sie die Empfängermäuse dann über Nacht ruhen.
  5. Am folgenden Tag wird der LCMV-Armstrong-Virusbestand mit RPMI-Medium verdünnt, um eine Endkonzentration von 1 × 107 plaquebildenden Einheiten/ml zu erreichen.
  6. Injizieren Sie 100 μl verdünnte LCMV-Armstrong-Lösung (enthält 1 × 106 plaquebildende Einheiten) in die Schwanzvene der Empfängermäuse.
    HINWEIS: Jeder Forscher sollte vorsichtig sein, ob der empfohlene infektiöse Titer nach institutionellem und lokalem Recht zulässig ist.

3. Durchflusszytometrische Färbungen von frühdifferenzierten SM TFH-Zellen

  1. Die Mäuse (gemäß institutionell anerkannten Protokollen) aus Schritt 2.6 am Tag 3 nach der Infektion töten und Lymphozyten aus der Milz wie in Schritt 1 beschrieben verarbeiten. Stellen Sie die Zelldichte auf ca. 2 × 107 Zellen pro ml ein.
  2. Laden Sie 50 μl Zellsuspensionen (~1 × 106 Zellen) auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und füllen Sie sie mit 150 μl Färbepuffer pro Vertiefung auf. Den Teller auf Eis legen.
  3. Bereiten Sie den gereinigten Ratten-Anti-Maus-CXCR5-Antikörpercocktail (d. h. CXCR5-Primärantikörper) in einer Verdünnung von 1:50 in 50 μl T-FH-Zellfärbepuffer für jede Probe in einem Röhrchen zu. Das Röhrchen gründlich vortexen und bei 15.000 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Partikel zu aggregieren. Halten Sie die Tube auf Eis.
  4. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 800 × g für 1 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand durch Dekantieren, wirbeln Sie die Platte kurz vor und fügen Sie 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung hinzu.
  5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 und resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μl des CXCR5-Primärantikörpers pro Well. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 1 h auf Eis inkubieren.
  6. Bereiten Sie den biotinylierten Ziegen-Anti-Ratten-Antikörper-Cocktail (d. h. CXCR5-Sekundärantikörper) in einer Verdünnung von 1:200 in 50 μl T-FH-Zellfärbepuffer für jede Probe in einem neuen Röhrchen vor. Wirbeln Sie das Röhrchen vor und zentrifugieren Sie es bei 15.000 × g für 3 min bei 4 °C, um die Partikel zu aggregieren. Halten Sie die Tube auf Eis.
  7. Die Platte wird 1 min lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren verworfen, die Platte kurz vortexen und 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung zugegeben.
  8. Wiederholen Sie Schritt 3.7 zweimal und halten Sie die Platte auf Eis.
  9. Geben Sie 50 μl CXCR5-Sekundärantikörper pro Vertiefung in die Platte. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten auf Eis inkubieren.
  10. Bereiten Sie fluoreszenzkonjugiertes Streptavidin (d. h. CXCR5-Tertiärantikörper) in einer Verdünnung von 1:200 in 50 μl T-FH-Zellfärbepuffer für jede Probe vor. In der Zwischenzeit fügen Sie weitere Antikörper gegen Oberflächenmarker (z. B. CD45.1, CD4, PD-1, CD25 und andere interessierte Moleküle) und die Färbung toter Zellen zusammen mit dem CXCR5-Tertiärantikörper hinzu.
  11. Wirbeln Sie das Röhrchen vor und zentrifugieren Sie es bei 15.000 × g für 3 min bei 4 °C, um die Partikel zu aggregieren. Halten Sie die Tube auf Eis.
  12. Die Platte wird 1 min lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren verworfen, die Platte kurz vortexen und 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung zugegeben.
  13. Wiederholen Sie Schritt 3.12 zweimal und halten Sie die Platte auf Eis.
  14. Geben Sie 50 μl CXCR5-Tertiärantikörpercocktail pro Vertiefung auf die Platte. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
  15. Bereiten Sie 200 μl Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer für jede Vertiefung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  16. Die Platte wird 1 min lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren verworfen, die Platte kurz vortexen und 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung zugegeben.
  17. Wiederholen Sie Schritt 3.16 zweimal und lassen Sie die Platte im Dunkeln auf Eis.
  18. Geben Sie 200 μl Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten lang (im Dunkeln) bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Bereiten Sie den Permeabilisierungspuffer (1x) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  19. Bereiten Sie den Antikörpercocktail gegen transkriptionelle Faktoren, einschließlich Bcl-6, TCF-1, T-bet und andere interessierte Moleküle, in 50 μl Permeabilisierungspuffer (1x) für jede Vertiefung in einem neuen Röhrchen vor.
  20. Das Röhrchen vortexen und bei 15.000 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Partikel zu aggregieren.
  21. Die Platte wird 1 Minute lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren verworfen, die Platte kurz vortexen und 50 μl Transkriptionsfaktor-Antikörper-Cocktail pro Vertiefung zugegeben. Gut mischen und 30 min im Dunkeln auf Eis inkubieren.
  22. Die Platte bei 800 × g 1 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen, die Platte kurz durch Dekantieren vortexen und 200 μl Permeabilisierungspuffer (1x) pro Vertiefung hinzufügen.
  23. Wiederholen Sie Schritt 3.22.
  24. Geben Sie 200 μl Färbepuffer in jede Vertiefung, zentrifugieren Sie die Platte bei 800 × g für 1 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren und wirbeln Sie die Platte kurz ein.
  25. Resuspendieren Sie das Zellpellet in jeder Vertiefung mit 200 μl Färbepuffer und überführen Sie die Zellen in Durchflusszytometrieröhrchen für die sofortige Durchflusszytometeranalyse.
    HINWEIS: Alternativ können die Proben innerhalb von 3 Tagen nachgewiesen werden, wenn 200 μl 2 % PFA in jedes Röhrchen gegeben und bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.

4. Retrovirus-Produktion

  1. Kultivieren Sie die 293T-Zellen (mit weniger als zehn Durchgängen) mit DMEM 10% Medium in einer 10-cm-Kulturschale für eine Dauer von 2-3 Durchgängen.
  2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, entsorgen Sie das alte Medium und waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS, gefolgt von einer kurzen Trypsinisierung von 293T-Zellen mit 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur für 1 min.
  3. Stoppen Sie den Verdauungsprozess, indem Sie die Zellen in 2 mL vorgewärmtem 10%igem DMEM-Medium resuspendieren, sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen und bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie das Kulturmedium mit 2 ml vorgewärmtem 10%igem DMEM-Medium auf und ab pipettieren.
  5. Quantifizieren Sie die Anzahl der Zellen und der Platte: 5 × 10,5 Zellen in 2,5 mL 10 % DMEM-Medium pro Well in einer 6-Well-Platte.
    HINWEIS: Schwenken Sie die Schale vorsichtig, damit sich die 293T-Zellen gleichmäßig auf der Platte verteilen können.
  6. Wenn die Konfluenz der 293T-Zellen 80 % übersteigt, bereiten Sie die Transfektionsreagenzien wie in den Schritten 4.7 bis 4.9 beschrieben vor.
  7. Geben Sie für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte 250 μl vorgewärmtes Opti-MEM-Medium in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie dann 3 μg Plasmid-DNA (davon 2 μg retroviraler Vektor und 1 μg pCL-Eco) in das Opti-MEM-Medium, gefolgt von einem sanften Auf- und Abpipettieren, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die retroviralen Vektoren, die in dieser Studie als Beispiele verwendet werden, sind MigR1 und modifizierte MigR1-Vektoren mit Bcl6-CDS-Region stromaufwärts von IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. Geben Sie anschließend 7,5 μl vorgewärmtes Transfektionsreagenz (kommerziell erhältlich) zu der Mischung und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
  9. Die Mischung 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Geben Sie die Mischung tropfenweise in verschiedene Bereiche der 293T-Zellkulturvertiefung und bewegen Sie das Kulturgefäß anschließend vorsichtig in einer Hin- und Her- und Seitwärtsbewegung, um eine gleichmäßige Verteilung der Mischung zu gewährleisten.
  11. Die 293T-Zellen werden 72 Stunden lang in einem 37 °C-Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert.
  12. Erkennen Sie den Tag des retroviralen Vektors als Proxy für die Transfektionswirksamkeit in den transfizierten 293T-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einer Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Zum Beispiel haben wir das GFP-Fluoreszenzsignal in einem signifikanten Teil der MigR1-Vektor-transfizierten 293T-Zellen bestätigt, was auf eine qualitativ hochwertige Transfektion hindeutet.
  13. Sammeln Sie das Zellkulturmedium und zentrifugieren Sie es bei 2.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um Zelltrümmer zu entfernen. Der resultierende Überstand sollte sorgfältig gesammelt und entweder für die Langzeitkonservierung bei -80 °C oder vorübergehend bei 4 °C gelagert werden.

5. In vivo Aktivierung, Retrovirus-Transduktion und adoptiver Transfer von SM CD4+ T-Zellen

  1. Injizieren Sie einer CD45.1+ SM-Maus (im Alter von 6 bis 8 Wochen) intravenös 200 μg LCMV GP61-77 Peptid11,14 in einem Volumen von 100 μl RPMI-Medium.
    HINWEIS: Das Injektionsvolumen sollte von jedem Forscher geändert werden und darf das maximale Injektionsvolumen nicht überschreiten, das von der Institution und den örtlichen Gesetzen zugelassen ist.
  2. Euthanasieren Sie die SM-Maus 16-18 h nach der Peptidinjektion (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Erwerben Sie die Milzzellen nach den oben genannten Verfahren in Schritt 1.
    HINWEIS: Alternativ kann das In-vitro-Anti-CD3/Anti-CD28-Stimulationsverfahren27,28 verwendet werden, um SM CD4+ T-Zellen anstelle der in vivo Peptidstimulation zu aktivieren, die in den Schritten 5.1 und 5.2 beschrieben ist.
  3. Suspendieren Sie die Splenozyten mit 2 % RPMI und stellen Sie die Zelldichte auf ca. 1 × 108 Zellen pro ml in einem konischen 15-ml-Röhrchen ein. Halten Sie die Tube auf Eis.
  4. Geben Sie 50 μl Zellsuspension in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und ergänzen Sie sie mit 150 μl Färbepuffer pro Well.
  5. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 800 × g für 1 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Dekantieren, wirbeln Sie die Platte kurz vor und fügen Sie 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung hinzu.
  6. Wiederholen Sie Schritt 5.5 und resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μl Oberflächenantikörper-Cocktail, einschließlich CD4, CD25 und CD69, um den Aktivierungsstatus von SM CD4+ T-Zellen zu ermitteln. Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
  7. Füllen Sie jede Vertiefung mit Färbepuffer auf 200 μl auf, gefolgt von einer Zentrifugation der Platte bei 800 × g für 1 Minute bei 4 °C. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen und die Platte kurz umwirbeln.
  8. Wiederholen Sie Schritt 5.7 zweimal.
  9. Die Zellen werden in 200 μl Färbepuffer resuspendiert und in ein Durchflusszytometrieröhrchen überführt.
  10. Analysieren Sie die fluoreszenzkonjugierten Antikörper-gefärbten Zellen mit einer Durchflusszytometrie, um den Aktivierungsstatus von SM CD4+ T-Zellen zu beurteilen.
    HINWEIS: Aktivierte SM CD4+ T-Zellen wiesen im Vergleich zu naiven Zellen eine hohe CD25- und CD69-Expression auf, was nachfolgende Transduktionsverfahren ermöglichte.
  11. 1 × 106 SM CD4+ T-Zellen (aus Schritt 5.3) pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte geben. Die Zellen bei 800 × g 3 min bei 4 °C herunterschleudern und dann das Medium vorsichtig durch Dekantieren entfernen.
  12. 1 ml Retrovirusmedium wie in Schritt 4.13 beschrieben und 8 μg Polybren in jede Vertiefung geben.
  13. Die Zellen werden bei 800 × g für 2 h bei 37 °C spin-transduziert.
  14. Verwerfen Sie das Retrovirusmedium vorsichtig durch Pipettieren und geben Sie 1 ml vorgewärmtes 10 % RPMI, ergänzt mit 10 ng/ml, rekombinantes murines IL-2 in jede Vertiefung.
  15. Inkubieren Sie die Zellen 48 h lang in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2.
  16. Die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen geben und die Zellen bei 800 × g für 6 min bei 4 °C abschleudern.
  17. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und resuspendieren Sie die Zellen mit einem geeigneten Volumen von 2 % RPMI, um eine Zelldichte von 1 × 108 Zellen pro ml in einem konischen 15-ml-Röhrchen zu erhalten. Halten Sie die Tube auf Eis.
  18. Geben Sie 50 μl Zellsuspension in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und ergänzen Sie sie mit 150 μl Färbepuffer pro Well.
  19. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 800 × g für 1 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Dekantieren, wirbeln Sie die Platte kurz vor und fügen Sie 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung hinzu.
  20. Wiederholen Sie Schritt 5.19 und resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μl Oberflächenantikörper-Cocktail, einschließlich CD4, Vα2 und Vektor-Tag-assoziiertem Antikörper. Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
  21. Füllen Sie jede Vertiefung mit Färbepuffer auf 200 μl auf, gefolgt von einer Zentrifugation der Platte bei 800 × g für 1 min. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen und die Platte kurz umwirbeln.
  22. Wiederholen Sie Schritt 5.21 zweimal.
  23. Die Zellen werden in 200 μl Färbepuffer resuspendiert und in ein Durchflusszytometrieröhrchen überführt.
  24. Analysieren Sie die fluoreszenzkonjugierten Antikörper-gefärbten Zellen mit Durchflusszytometrie, um die Transduktionseffizienz in SM CD4+ T-Zellen zu beurteilen.
    HINWEIS: Effizient transduzierte SM CD4+ T-Zellen zeigten in der Studie eine hohe Expression des Tags von Retroviren, wie z. B. GFP.
  25. Die Zellsuspensionen aus Schritt 5.17 bei 800 × g werden 5 min lang bei 4 ΰC zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit RPMI und stellen Sie die Zelldichte auf 1 ×10 7 CD4+Vα2+ SM-Zellen/ml ein.
  26. Übertragen Sie adoptiv eine Gesamtanzahl von 1 × 10 CD45.1+ SM CD4+ T-Zellen auf jede C57BL/6-Empfängermaus (6 bis 8 Wochen alt) durch eine intravenöse Injektion von 100 μl Zellsuspension in Schritt 5.25.
  27. Am nächsten Tag infizieren Sie C57BL/6-Empfängermäuse mit 1 × 106 plaquebildenden Einheiten LCMV Armstrong durch intravenöse Injektion.

6. Durchflusszytometrische Analyse von Retrovirus-transduzierten SM TFH-Zellen im frühen akuten LCMV-Infektionsstadium

  1. Erwerben Sie die Splenozyten von C57BL/6-Mäusen aus Schritt 5.25 am Tag 3 nach der Infektion.
  2. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Färbung von Oberflächenmarkern, einschließlich CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 und anderen interessierten Molekülen, in Splenozyten durch, wie in Schritt 3 beschrieben.
  3. Für den Nachweis von Transkriptionsfaktoren in SM CD4+ T-Zellen, die mit Retroviren transduziert wurden, die durch fluoreszierende Proteine markiert sind, geben Sie 200 μl 2 % PFA in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  4. Führen Sie eine Fixierung/Permeabilisierung, eine durchflusszytometrische Färbung der interessierten Transkriptionsfaktoren und eine durchflusszytometrische Analyse durch, wie in Schritt 3 beschrieben.

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Ergebnisse

Eigenschaften von früh differenzierten virusspezifischenT-FH-Zellen während einer akuten LCMV-Infektion
Um die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen zu untersuchen, wurden naive kongene SM CD4+ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-GP-Epitop I-AbGP66-77 erkennen, adoptiv in CD45.2+ C57BL/6-Empfänger übertragen. Am nächsten Tag wurden diese Empfänger intravenös mit einer hohen Dosierung des akut aufgelösten LCMV Armstrong ...

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Diskussion

Die Forschung auf dem Gebiet derT-FH-Zellen ist seit der Entdeckung der spezialisierten Funktion vonT-FH-Zellen bei der Unterstützung von B-Zellen hervorgehoben worden. Häufende Studien deuteten darauf hin, dass dieT-FH-Zelldifferenzierung ein mehrstufiger und multifaktorieller Prozess30 ist, wobei die Schicksalsbindung derT-FH-Zellen im frühen Stadium bestimmt wird5. Daher ist ein besseres Verständnis der Mechanismen, die frühdif...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32300785 bis X.C.), des China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (Nr. BX20230449 bis X.C.) und das National Science and Technology Major Project (Nr. 2021YFC2300602 bis L.Y.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4 % Paraformaldehyd-Fixlösung, 4 % PFABeyotimeP0099-500 ml
70 μ m ZellensiebMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 Anti-Maus TCR Vα 2 (Klon B20.1)Biolegend1278121:200 Verdünnung
Alexa Fluor 700 Anti-Maus CD45.1 (Klon A20)Biolegend1107241:200 Verdünnung
APC Anti-Maus CD25 (Klon PC61)Biolegend1019101:200 Verdünnung
B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) MausThe Jackson Laboratory 002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin Anti-Maus F4/80 Antikörper (Klon BM8)Biolegend1231061:200 Verdünnung
Biotin Ratte Anti-Maus CD11c (Klon N418)Biolegend1173041:200 Verdünnung
Biotin Ratte Anti-Maus CD19 (Klon 6D5)Biolegend1155041:200 Verdünnung
Biotin Ratte Anti-Maus CD8a (Klon 53-6.7)Biolegend1007041:200 Verdünnung
Biotin Ratte Anti-Maus NK-1.1 (Klon PK136)Biolegend1087041:200 Verdünnung
Biotin Ratte Anti-Maus TER-119/Erythroide Zellen (Klon TER-119)Biolegend1162041:200 Verdünnung
Rinderserumalbumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 Anti-T-bet (Klon 4B10)Biolegend6448161:100 Verdünnung
Brilliant Violet 605 Anti-Maus CD279 (PD-1) (Klon 29F.1A12)Biolegend1352201:200 Verdünnung
C57BL/6J (B6) MausThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP Knock-in-ReportermausIm Haus; Die CXCR5-GFP-Knock-in-Mauslinie wurde durch die Insertion eines IRES-GFP-Konstrukts nach dem offenen Leserahmen von Cxcr5 erzeugt.
DMEM 10 % MediumDMEM-Medium mit 10 % FBS
DMEM-MediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fötales Rinderserum, FBSSigmaF8318
FlowJo (Version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-SetInvitrogen00-5523-00Das Kit enthält drei Reagenzien: a. Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat (4X); b. Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel; c. Permeabilisierungspuffer.
Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Antikörper (H+L), BiotinylierterVektor LaboratorienBA-9400-1,51:200 Verdünnung
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
IsolationspufferFACS-Puffer mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA
LCMV GP61-77 Peptid (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinesisches Peptidunternehmen
LIVE/DEAD Fixierbares Nahinfrarot-Färbungskit für tote Zellen, für 633 oder 635 nm AnregungLife TechnologiesL101991:200 Verdünnung
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM MediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE Anti-Maus CD69 (Klon H1.2F3)Biolegend1045081:200 Verdünnung
PE Maus Anti-Bcl-6 (Klon K112-91)BD Biosciences5615221:50 Verdünnung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Gereinigte Ratte Anti-Maus CXCR5 (Klon 2G8)BD Biosciences5519611:50 Verdünnung
Ratte monoklonales PerCP Anti-Maus CD4 (Klon RM4-5)Biolegend1005381:200 Verdünnung
rekombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Lysepuffer für rote BlutkörperchenBeyotimeC3702-500 ml
RPMI 1640 MediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 Medium mit 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgene MausDie transgene Linie SM TCR in unserem Labor ist ein Geschenk von Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Darüber hinaus kann diese Mauslinie auch von The Jackson Laboratory (Fleck#: 030450) bezogen werden.
FärbepufferPBS mit 2 % FBS und 0,01 % NaN3
Streptavidin PE-Cyanin7eBioscience25-4317-821:200 Verdünnung
TCF1/TCF7 (C63D9) Kaninchen mAb (Alexa Fluor 488 Konjugat)Zellsignaltechnologie6444S1:400 Verdünnung
TFH-ZellfärbepufferFACS-Puffer mit 1 % BSA und 2 % Mausserum
TransIT-293 ReagenzMirus BioMIRUMIR2700

Referenzen

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