Nassanfasen von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck zur Rückmeldung der Nadelöffnung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Montage eines pneumatischen Systems zur Abgabe von Druckluft an eine Nadel während des Prozesses des Anfasens der Nadel. Das Protokoll beschreibt ferner den Anfasprozess zur Herstellung scharfer Mikroinjektionsnadeln und wie die relative Öffnungsgröße der Nadel gemessen wird.

Zusammenfassung

Mikroinjektionsnadeln sind ein wichtiges Werkzeug bei der Verabreichung von Reagenzien zur Genommodifikation, CRISPR-Komponenten (Guide-RNAs, Cas9-Protein und Donor-Template) und Komponenten des Transposon-Systems (Plasmide und Transposase-mRNA) in sich entwickelnde Insektenembryonen. Scharfe Mikroinjektionsnadeln sind bei der Verabreichung dieser Modifikationsmittel besonders wichtig, da sie dazu beitragen, Schäden am zu injizierenden Embryo zu minimieren und dadurch das Überleben dieser Embryonen im Vergleich zur Injektion mit nicht abgeschrägten Nadeln zu erhöhen. Darüber hinaus erzeugt das Abschrägen von Nadeln Nadeln, die von Nadel zu Nadel konsistenter sind, verglichen mit Nadeln, die durch zufälliges Brechen der Nadelspitze geöffnet werden, indem die Spitze gegen ein Objekt gestreift wird (Seite eines Deckglases, die Oberfläche des zu injizierenden Embryos usw.). Das Verfahren des Nassanfasens von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck, die der Nadel zugeführt wird, ermöglicht es der Person, die die Nadel anfas, zu wissen, wann die Nadel offen ist (Vorhandensein von Blasen) und gibt auch einen relativen Hinweis darauf, wie groß eine Nadelöffnung entstanden ist. Die relative Öffnungsgröße in der Nadel kann bestimmt werden, indem der an die Nadel abgegebene Luftdruck angepasst wird, bis ein Gleichgewicht erreicht ist und keine Blasen mehr aus der Nadelspitze fließen. Je niedriger der Druck ist, bei dem das Gleichgewicht erreicht wird, desto größer ist die Nadelstärke; Und umgekehrt gilt: Je höher der Druck, desto kleiner die Nadelstärke.

Einleitung

Die genetische Modifikation von Insekten ist ein Verfahren, das ursprünglich von Rubin und Spradling in Drosophila entwickelt wurde und im Laufe der Jahre modifiziert wurde, um genetische Veränderungen bei anderen Arten^{zu erzeugen 1}. Der Prozess beruht auf der präzisen Abgabe von Modifikationskomponenten, die in einem bestimmten Zeit- und Ortsfenster innerhalb des sich entwickelnden Embryos mikroinjiziert werden ^2,3,4. Scharfe Mikroinjektionsnadeln sind ein wichtiges Werkzeug im Prozess der genetischen Veränderung einiger Insekten, wie z. B. Mücken 4,5,6,7,8,9 und Sandmücken 10, während sie für andere Insekten wie Seidenraupen ¹¹ nicht so kritisch sind. Scharfe Nadeln sind oft ein Schlüsselfaktor für Erfolg und Misserfolg bei dem Versuch, ein gentechnisch verändertes Insekt zu erzeugen ^2,4. Typischerweise werden Mikrokapillarglasnadeln durch Erhitzen von Glas bis zu dem Punkt gezogen, an dem das Glas elastisch wird, wodurch die Kapillare in eine sich verjüngende Nadel mit geschlossener Spitze gezogen werden kann. Bevor die Nadel verwendet werden kann, muss sie so geöffnet werden, dass eine scharfe Spitze für die Injektion entsteht. Traditionell werden Nadeln geöffnet, indem man die Nadelspitze vorsichtig gegen etwas streicht (den Rand eines Objektträgers/Deckglases oder den Embryo usw.), das dazu führt, dass eine kleine Menge Glas von der Spitze abbricht, wodurch zufällig eine scharfe Spitze entsteht ^2,3. Ein etwas weniger zufälliges Verfahren ist das Trockenfasen, bei dem die Nadel schnell für kurze Zeit auf eine optisch flache, sich drehende Schleifplatte abgesenkt wird, wodurch eine kleine Menge Glas von der Nadelspitze abgerieben wird, wodurch eine scharfe Spitze entsteht. Das Trockenfasen ist etwas weniger zufällig als das Bürsten der Nadelspitze gegen etwas. Das im Folgenden beschriebene Protokoll geht noch einen Schritt weiter, indem es die abzuschrägende Nadel mit Druckluft versorgt und sie unter einer Flüssigkeitsschicht abschrägt, so dass Blasen sichtbar sind, sobald die Nadel geöffnet wurde. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung zuverlässig scharfer Mikroinjektionsnadeln. Das Anfasen unter einer Flüssigkeitsschicht ist eine Verbesserung gegenüber dem zufälligen Brechen der Nadel, wie oben beschrieben, und dem trockenen Anfasen, da der Benutzer eine Rückmeldung über den Anfasvorgang erhält, so dass die Person, die anfaselt, weiß, wann die Nadel offen ist und wie groß die Nadelöffnung relativ ist. Wenn die relative Öffnungsgröße der Nadelspitze bekannt ist, kann die Person, die die Nadel abschrägt, Nadeln mit unterschiedlichen Öffnungsgrößen herstellen. Verschiedene Nadelöffnungsgrößen haben unterschiedliche Vorteile; Zum Beispiel können größere Nadelöffnungen Injektionsmischungen mit hoher Viskosität aufnehmen, während kleinere Öffnungsnadeln den zu injizierenden Embryo weniger schädigen.

Die Luftzufuhr zur Nadel erfolgt über einen Regler und ein System von Urethanschläuchen, das auf einem modifizierten luftdruckgeregelten Einspritzsystem² basiert. Während die Nadel mit konstantem Druck mit Luft versorgt wird, wird die Nadel unter einer Flüssigkeitsschicht abgeschrägt. Der Anfasprozess besteht aus einem sich wiederholenden fünfstufigen Prozess: 1) Absenken der Nadel auf die Schleiffläche, 2) Abschrägen der Nadel für einen kurzen Zeitraum, 3) Anheben der Nadel von der Schleifplatte, während sie unter der Oberfläche der Flüssigkeitsschicht gehalten wird, 4) Stoppen der Drehung der Schleifplatte, um das Auftreten von Blasen zu überprüfen. Wenn keine Blasen vorhanden sind, werden die Schritte 1 bis 4 wiederholt, bis Blasen erscheinen. 5) Sobald Blasen vorhanden sind, kann der Luftdruck angepasst werden, um die relative Öffnungsgröße der Nadel zu bestimmen. Je geringer der Druck ist, der erforderlich ist, um die Blasenbildung zu stoppen, desto größer ist die Öffnung an der Nadelspitze.

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll, wie unten beschrieben, verwendet die abgeschrägte Sutter BV-10 Mikrokapillare. Dieses Protokoll kann jedoch für die Verwendung mit jedem Modell mit abgeschrägten Mikrokapillaren modifiziert werden.

1. Montage von Regler, Manometer und Luftzufuhrschlauch

1. Schneiden Sie einen Abschnitt des Urethanschlauchs für die Verbindung von der Luftzufuhr zur Basis des Reglers ab (R; Abschnitt 1, Abbildung 1). Die Länge dieses Abschnitts hängt vom Abstand zwischen der Luftzufuhr und dem Regler ab, der sich neben dem Anfaser befindet.
2. Schieben Sie eine Schlauchschelle auf den Urethanschlauch und schieben Sie dann einen Schlauchanschluss in das Ende des Schlauchs. Stellen Sie sicher, dass der Schlauchanschluss vollständig eingesteckt ist, indem Sie den Schlauchanschluss auf eine harte Oberfläche legen. Halten Sie den Schlauch nahe am Schlauchanschluss fest und drücken Sie den Schlauch fest in den Schlauch, bis der Schlauchanschluss vollständig eingesteckt ist. Zusammen bilden Schlauchschelle und Schlauchanschluss den Anschluss HC (Bild 1).
3. Schieben Sie die Schlauchschelle bis zum Ende des Schlauchs, wo der Schlauchanschluss eingeführt ist. Drehen Sie die Schlauchschelle über das eingesetzte Widerhakenende, so dass sie eine luftdichte Verbindung bildet.
4. Schrauben Sie den Schlauchanschluss von Hand in die Basis des Reglers (R) und ziehen Sie die Verbindung dann mit einem kleinen Schraubenschlüssel fest. Stellen Sie sicher, dass die Verbindung luftdicht, aber nicht zu fest ist.
5. Schrauben Sie in den seitlichen Anschluss des Reglers von Hand einen T-Verbinder (T) ein und verwenden Sie dann einen kleinen Schraubenschlüssel, um den Festzug abzuschließen.
6. Schneiden Sie ein kleines Stück Urethanschlauch (Abbildung 1, Abschnitt 2) mit einer Länge von ca. 3-5 cm ab. Setzen Sie zwei Schlauchschellen auf das Schlauchstück, stecken Sie dann einen Schlauchverbinder in jedes Ende des Schlauchs und beenden Sie die Anschlüsse (HC) wie in den Schritten 1.2-1.4 für jedes Ende des Schlauches beschrieben.
7. Schrauben Sie ein Ende des kurzen Schlauches in den Boden des Manometers und ziehen Sie es dann mit einem Schraubenschlüssel wie in Schritt 1.5 fest.
8. Schrauben Sie das andere Ende des kurzen Schlauches in einen der Anschlüsse am T-Stecker (T), der in Schritt 1.5 mit dem Regler verbunden ist.
9. Schneiden Sie einen Abschnitt des Urethanschlauchs (Abbildung 1, Abschnitt 3) für die Verbindung zwischen dem Atemregler und dem Nadelhalter (NH) ab. Die Größe dieses Abschnitts hängt von der Entfernung zwischen dem Anfaser und der Position des Reglers ab.
10. Setzen Sie eine Schlauchschelle auf das Schlauchstück und setzen Sie dann einen Schlauchanschluss ein, wie in den Schritten 1.2-1.4 beschrieben.
11. Platzieren Sie auf der anderen Seite dieses Schlauchabschnitts die Luer-Buchse (LC), die mit dem Nadelhalter (NH) geliefert wird.
12. Entfernen Sie die Halteklammer und die Nylonscheibe (Abbildung 2, f) vom Manipulator. Die Halteklammer und die Unterlegscheibe sind nur für die Aufnahme einer Glasmikrokapillare ausgelegt, sie sind nicht für das zusätzliche Gewicht eines Mikrokapillarhalters, einer Gewindestange und eines Luftzufuhrschlauchs ausgelegt.
13. Schneiden Sie ein rechteckiges Stück Gummipackblatt von 1,5 cm x 2 cm ab, um die Gewindestange in die Schutzblechklemme des Fahrrads einzuwickeln. Dies hilft dabei, die Gewindestange und den Nadelhalter sicherer in der Schutzblechklemme des Fahrrads zu halten. Öffnen Sie mit zwei Spitzzangen den Fahrradschutzblechclip, falten Sie das rechteckige Stück Gummipackblatt 3,5 cm von einem Ende der Stange entfernt über die Gewindestange, so dass es ein U über der Stange bildet. Stecken Sie die mit einer Gummifolie ummantelte Gewindestange in die geöffnete Fahrradschutzblechklemme und schließen Sie die Klemme mit der Zange um die Stange und die Gummiplatte. Montieren Sie die Fahrradklemme und die Gewindestangenbaugruppe an der Manipulatorschraube, ersetzen Sie die Halteschelle ohne die Nylonscheibe und ziehen Sie die Halteklammer fest, bis sie die Gewindestangenbaugruppe sicher hält.
14. Fädeln Sie den Nadelhalter auf die Gewindestange. Stellen Sie sicher, dass der Luer-Anschluss in einer Position endet, die den Urethanschlauch beim Anschließen nicht einklemmt (Abbildung 2, g).
15. Verbinden Sie die Luer-Buchse mit der Luer-Buchse (Abbildung 2, g) des Nadelhalters (Abbildung 2, d).
16. Verbinden Sie das freie Ende des Rohrs in Abbildung 1, Abschnitt 1 mit der Luftzufuhr (diese Verbindung variiert je nach verwendeter Luftzufuhr). Die Luftzufuhr sollte sauber, trocken und frei von Ölrückständen sein. Die Luftzufuhr kann aus einer Hausluftquelle oder einer Gasflasche erfolgen, entweder aus Druckluft oder Stickstoff.

2. Anfasen von Borosilikatnadeln

1. Ziehen Sie Mikroinjektionsnadeln mit Mikrokapillaren aus Borosilikatglas mit den folgenden Einstellungen am Instrument: Wärme: 305, Fil: 4, Vel: 70, Entf: 235, Pul: 160, mit einer Schleifenzeit von 12,24.
2. Die Schleifanordnung, bestehend aus der Schleifplatte und dem Sicherungsring mit Magneten¹², wird nach Herstellerangaben montiert.
   HINWEIS: Die Schleifplatte muss möglicherweise mit einem dünnen Streifen transparenter Folie umwickelt werden, um ein vorzeitiges Austreten von Photo-Flo (Netzmittel) aus der Schleifplatte zu verhindern. Dies ist nur dann erforderlich, wenn die Netzmittellösung vorzeitig in das Sockelöl austritt und der Mahlteller sich nicht mehr dreht. Das Netzmittel reduziert das Risiko von Trocknungsspuren auf den Glasnadeln nach dem Anfasen. Die Verwendung eines Netzmittels ist für den Anfasprozess nicht kritisch, und Wasser kann substituiert werden.
3. Geben Sie 10 Tropfen Sockelöl auf die optisch ebene Oberfläche des Sockels und setzen Sie die Schleifgarnitur darauf. Starten Sie die Schleifmontage.
4. Schalten Sie die Lichtquelle ein, um die Oberfläche zu beleuchten. Stellen Sie sicher, dass die Lichtquelle hinter der Fase positioniert ist und in einem Winkel von 45° zur Schleifplatte und Nadel scheint. Der Beleuchtungswinkel ist notwendig, damit ein Schatten der Nadel gut zu erkennen ist. Drehen Sie den Mikroskopkopf bei 90-facher Vergrößerung in Position. Stoppen Sie kurzzeitig das Drehen der Schleifplatte und fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche der Schleifplatte.
5. Geben Sie 1 % Netzmittel in den Docht, bis der Docht vollständig nass ist. Geben Sie 1 % Netzmittel auf die Oberfläche der Schleifplatte. Stellen Sie sicher, dass das Netzmittel die abrasive Oberfläche bedeckt, aber nicht auf den schwarzen Sicherungsring austritt.
6. Legen Sie den vornassen Docht während des Drehens auf die Oberfläche der Schleifplatte. Stellen Sie sicher, dass sich der Docht auf der linken Seite der Schleifplatte befindet (wenn Sie von oben nach unten schauen) und sich von 11 Uhr bis 6 Uhr erstreckt (mit der Platte als Zifferblatt). Stellen Sie sicher, dass der Docht nicht auf dem schwarzen Teil des Sicherungsrings sitzt.
7. Führen Sie eine Nadel in den Nadelhalter ein (Abbildung 2, d) und ziehen Sie den Sicherungsring fest, um die Nadel an Ort und Stelle zu halten. Öffnen Sie den Regler (Abbildung 1, R) und erhöhen Sie den Druck auf 24 psi.
8. Heben Sie den Nadelhalter an, indem Sie den Kurseinstellknopf drehen (Abbildung 2, a). Stellen Sie sicher, dass die Nadel hoch genug angehoben ist, dass sie höher als die Oberfläche der rotierenden Schleifplatte ist, und drehen Sie dann den gesamten Manipulator so, dass die Nadel über der rotierenden Schleifplatte in Position schwingt. Die abzuschrägende Nadel sollte so auf die rotierende Schleifplatte gelegt werden, dass sich die Drehung der Platte von der Nadelspitze weg bewegt (Abbildung 3A)
9. Von der Seite beobachtend, senken Sie die Nadel mit dem groben Einstellknopf (Abbildung 2, a) in Richtung der Schleifplattenoberfläche ab. Stoppen Sie, wenn die Nadel fast die Oberfläche der Flüssigkeit berührt.
10. Verwenden Sie den Zoom, um die Vergrößerung des Mikroskops zu verringern, und bewegen Sie das Mikroskop dann so, dass sich die Nadel in der Mitte des Sichtfelds befindet. Sobald Sie sich in der Mitte des Bildes befinden, erhöhen Sie die Vergrößerung und passen Sie die Position des Manipulators so an, dass die Nadelspitze in der Bildmitte bleibt. Sobald die maximale Vergrößerung erreicht ist, stoppen Sie die Schleifplatte und fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche der Schleifplatte, dann starten Sie sofort die Drehung der Platte, sobald die Oberfläche scharf gestellt ist. Die Nadel ist zu diesem Zeitpunkt möglicherweise nicht zu sehen.
11. Senken Sie die Nadel mit dem Grobeinstellknopf des Manipulators in Richtung der Schleifplatte ab. Im Sichtfeld sind ein Bild der Nadel und ein oder mehrere Schatten der Nadel zu sehen. Wenn sich die Nadel und der/die Schatten der Nadel fast berühren, wechseln Sie zum Feineinstellknopf des Manipulators und senken Sie die Nadel weiter, bis sich die Nadel und ihr(e) Schatten(e) zu berühren scheinen. Lesen Sie an dieser Stelle den Messschieber ab (Abbildung 2, c) und notieren Sie sich den Messwert. Die Oberfläche der Schleifplatte befindet sich bei oder unter diesem Messwert.
    HINWEIS: Es ist schwer zu erkennen, wann die Nadel die Oberfläche der rotierenden Schleifplatte berührt, so dass die Nadel die Schleifplatte zu diesem Zeitpunkt möglicherweise nicht berührt.
12. Lassen Sie die Nadel 5-10 s lang auf diesem Messwert des Messschiebers.
13. Heben Sie die Nadel mit dem Feineinstellknopf des Manipulators an und achten Sie darauf, dass sie unter der Oberfläche des Netzmittels bleibt. Stoppen Sie die Drehung der Schleifplatte für einige Sekunden und beobachten Sie, ob Blasen aus der Nadelspitze austreten. Wenn Blasen vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 2.15 fort. Wenn keine Blasen vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 2.14 fort.
14. Bewegen Sie die Nadel mit dem Feineinstellknopf des Manipulators zurück auf den Messschieber, bewegen Sie sie dann etwas tiefer und nehmen Sie einen neuen Messschieber vor, dann wiederholen Sie die Schritte 2.12-2.13.
15. Starten Sie die Schleifplatte erneut, um zu sehen, ob Blasenbildung zu beobachten ist, während sich die Platte dreht. Wenn während der Plattenrotation Anzeichen von Blasenbildung sichtbar sind, ist die Öffnung der Nadelspitze wahrscheinlich zu groß für empfindliche Mikroinjektionen von Embryonen, wie z. B. Injektionen von Mückenembryonen. Wenn die Blasenbildung während der Drehung der Schleifplatte nicht sichtbar ist, ist die Nadelöffnung ideal für den Einsatz bei Verfahren, die eine scharfe und kleine Öffnungsnadel erfordern.
16. Verwenden Sie den Kurseinstellknopf des Manipulators, um die Nadel über die Schleifplatte in eine Position zu bringen, die hoch genug über der Platte liegt, dass die Nadel nichts trifft, wenn der gesamte Manipulator gedreht wird, um die Nadel von der Schleifplatte und dem Mikroskop weg zu bewegen.
17. Sobald sich die Nadel in einer Position befindet, in der sie entfernt werden kann, ohne etwas zu treffen, senken Sie den Luftdruck auf Null, entfernen Sie die Nadel und legen Sie sie bis zum Gebrauch in eine Nadelaufbewahrungsbox (eine Petrischale mit entweder Doppelklebeband oder Modelliermasse, um die abgeschrägten Nadeln zu halten).

3. Bestimmung der relativen Öffnungsgröße der abgeschrägten Nadel

HINWEIS: Die Bestimmung der relativen Öffnungsgrößen der abgeschrägten Nadel erfolgt in Schritt 2.13. In den folgenden Schritten wird dieser Vorgang näher beschrieben.

1. Sobald in Schritt 2.13 Blasen beobachtet werden und sich die Schleifplatte nicht dreht, verringern Sie langsam den Luftdruck, indem Sie den Einstellknopf des Reglers (Abbildung 1, R) drehen, bis keine Blasen mehr aus der Nadelspitze fließen. Beachten Sie den Druck, bei dem die Blasen nicht mehr aus der Spitze fließen.
2. Erhöhen Sie den Luftdruck, bis wieder Blasen aus der Nadelspitze fließen. Je höher der Druck, desto kleiner die Öffnung der Nadel.
3. Fahren Sie fort, indem Sie die Nadel in eine Position bringen, in der sie sicher entfernt werden kann, Schritte 2.16-2.17.

Ergebnisse

Das oben beschriebene Verfahren erzeugt gleichbleibend scharfe Mikroinjektionsnadeln. Scharfe Nadeln zeichnen sich dadurch aus, dass sie in der Lage sind, weiche Chorion-Insektenembryonen, wie z. B. Mückenembryonen, mit wenig bis gar keinem Widerstand der Embryonalmembran einzuführen. Wenn Mückenembryonen zur genetischen Veränderung mikroinjiziert werden, ist die Embryonalmembran relativ elastisch. Wenn Sie eine stumpfe Nadel gegen die Embryonalmembran drücken, wird sie eingedrückt (Abbildung 4B). Wird die Nadel zurückgezogen, nimmt die Membran wieder ihre Form an. Mit genügend Druck reißt die stumpfe Nadel schließlich durch die Membran und das Embryoplasma tritt wahrscheinlich aus. Je schärfer die Nadel ist, desto weniger Einkerbungen entstehen, wenn die Nadel gegen die Embryonalmembran gedrückt wird (Abbildung 4E). Anstatt in die Membran zu reißen, schlüpft eine scharfe Nadel durch die Membran und fügt dem Embryo wenig bis gar keinen Schaden zu. Mit einer idealen Nadel gibt es fast keine Vertiefung der Embryonalmembran, wenn die Nadel in den Embryo gleitet.

Die University of Maryland Insect Transformation Facility (UM-ITF) ist eine Serviceeinrichtung, die gentechnisch veränderte Insekten für Kunden aus Wissenschaft und Industrie herstellt. Die Anlage verwendet abgeschrägte Nadeln für die Mikroinjektion von Mückenembryonen. Im Zeitraum zwischen Januar 2023 und Dezember 2023 injizierte die UM-ITF 12.795 Aedes-Embryonen in 56 Kundenprojekten (Tabelle 1). Durch die Verwendung von abgeschrägten Nadeln konnte die UM-ITF bei allen Projekten einen durchschnittlichen Spielraum von 31 % nach der Injektion aufrechterhalten (Tabelle 2). Darüber hinaus war das UM-ITF in der Lage, eine Injektionserfolgsrate von 96 % aufrechtzuerhalten, die durch die Nachbeobachtung nach dem Projekt mit den Kunden ermittelt wurde (Tabelle 2). Der Injektionserfolg ist ein Maß dafür, ob die injizierten Injektionsmaterialien (CRISPR-Guides, Cas9-Protein, Transposon-Vektor-Plasmide usw.) in die Embryonen des Projekts so eingebracht wurden, dass diese Materialien in der Lage waren, eine genetische Veränderung zu erzeugen. Mit anderen Worten, waren die Injektionen gut genug, um eine genetische Veränderung hervorzurufen, wenn die injizierten Komponenten ordnungsgemäß funktionierten. Es gibt viele Faktoren, die zum Erfolg eines genetischen Veränderungsprojekts beitragen, und qualitativ hochwertige Mikroinjektionen mit scharfen Nadeln sind ein Schlüsselfaktor für den Erfolg. Das Anfasen von Nadeln unter Verwendung des in dem obigen Protokoll beschriebenen Verfahrens ermöglicht es dem UM-ITF, qualitativ hochwertige scharfe Mikroinjektionsnadeln konsistent herzustellen, wodurch das UM-ITF gleichbleibend erfolgreiche Injektionen durchführen kann.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Komponenten des Luftsystems und des Anschlusses an die Mikrokapillare. Die Luft wird der Kapillarnadel durch ein System von Urethanschläuchen aus einer Luftzufuhr (entweder Hausluft oder Luftzylinder) zugeführt. Die Urethanschläuche sind über Schlauchverbindungen (HC), die aus einem Schlauchverbinder und einer Schlauchschelle bestehen, mit dem Regler (R) und dem Manometer verbunden. Der Schlauchanschluss wird in einen 10-32 Gewinde Innengewinde an der Basis des Reglers (R) und des Manometers eingeschraubt. Ein T-Anschluss (T) ist mit dem Regler (R) verbunden, um verschüttete Luft zwischen dem Manometer und dem Nadelhalter (NH) abzuleiten. Der Urethanschlauch wird über einen Luer-Anschluss (LC), der mit dem Nadelhalter (NH) geliefert wird, mit dem Nadelhalter verbunden. Der Anschluss an die Luftzufuhr variiert je nach verwendeter Luftversorgung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Manipulatorteile und Luftaufstellung. Teile des Manipulators: a. Grobeinstellknopf, b. Feineinstellknopf, c. Messschieber, d. WPI-Nadelhalter, e. Winkellehre, f. Halteklammer und Fahrradschutzblechclip, g. Luer-Adapter und Luer-Schlauchanschluss und h. Urethanschlauch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Platzierung der Nadel in Bezug auf die Drehung der Schleifplatte. (A) Richtige Platzierung der Nadel während des Anfasens. Die abzuschrägende Nadel sollte auf die rotierende Schleifplatte gelegt werden, die irgendwo senkrecht zur Drehung und in einer Linie mit der Drehung ausgerichtet ist, wobei sich die Drehung von der Nadelspitze weg bewegt. (B) Unsachgemäße Platzierung der Nadel. Durch die Drehung der Schleifplatte in dieser Ausrichtung drückt die Oberfläche der Schleifplatte auf die Nadelspitze und nicht unter und an der Spitze vorbei. In dieser Ausrichtung erfolgt die Abschrägung möglicherweise nicht glatt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich des Einstechens der Nadel mit unscharfen und scharfen Nadeln. (A-C) nicht scharfe Nadel und (D-F) scharfe Nadel. (A) und (D) wurden aufgenommen, bevor die Nadel den Embryo berührte; (B) und (E) befinden sich an der Stelle, kurz bevor die Nadel die Embryonalmembran durchsticht, und (C) und (F) befinden sich unmittelbar nach dem Nadelstich. Der weiße Pfeil in (B) zeigt an, dass sich die Embryonalmembran einkerbt, da größerer Druck ausgeübt werden muss, damit eine unscharfe Nadel durchstechen kann. Der schwarze Pfeil in (E) zeigt das Fehlen einer Vertiefung an, da das Nadelstechen aufgrund einer scharfen Nadel leicht ausgeführt werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: UM-ITF Aedes-Projekte von Januar 2023 bis Dezember 2023. Liste der UM-ITF Aedes-Mikroinjektionsprojekte mit der Anzahl der injizierten Embryonen für jedes Projekt, der Anzahl der Larven, die aus diesen injizierten Embryonen geschlüpft sind, und dem Prozentsatz der geschlüpften Larven pro injiziertem Embryo insgesamt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Ergebnisse des UM-ITF-Projekts Aedes. Die UM-ITF ist eine Serviceeinrichtung, die Mikroinjektionsdienstleistungen für die genetische Veränderung von Insekten anbietet. In der Tabelle ist die Anzahl der Aedes-Projekte aufgeführt, die von der ITF von Januar 2023 bis Dezember 2023 injiziert wurden. Die Anzahl der Kunden, die auf Projektnachverfolgungsanfragen geantwortet haben, bei denen die Antwort auf den Erfolg oder Misserfolg des Injektionsprojekts hinweist. Die Zahl der erfolgreichen Projekte, bei denen ein erfolgreiches Projekt ein Projekt war, bei dem die Injektionsmaterialien zu einem bestimmten Zeitpunkt und an einem Ort in den sich entwickelnden Embryo mikroinjiziert wurden, so dass die Injektionen in der Lage waren, eine genetische Veränderung hervorzurufen, und die Anzahl der Projekte, die aufgrund fehlender genetischer Veränderungen als nicht erfolgreich angesehen wurden. Die durchschnittliche Schlupfrate für Aedes-Mikroinjektionsprojekte im Zeitraum von Januar 2023 bis Dezember 2023. Die Projekterfolgsrate und die Rücklaufquote des Kunden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Die genetische Modifikation von Stechmücken beruht auf einer präzisen Mikroinjektion der Modifikationsmaterialien (Plasmide, Leit-RNAs oder Proteine) in Prä-Blastoderm-Embryonen 3,4,5,6,7,8. Entscheidend für diesen Prozess sind scharfe Nadeln, die den Embryo während der Injektion leicht durchstechen^{können 2,4}. Eine scharfe Nadel ist in der Lage, durch die Membran zu schlüpfen, die Modifikationsmaterialien abzugeben und aus dem Embryo entnommen zu werden, ohne dass nach der Mikroinjektion etwas vom Embryoplasma an der Injektionsstelle austritt (persönliche Beobachtung).

Mikroinjektionsnadeln werden beim ersten Ziehen geschlossen und müssen vor der Injektion geöffnet werden². Traditionell wurden Nadeln für die Mikroinjektion geöffnet, indem die Nadel vorsichtig gegen etwas wie den Rand des Deckglases oder des Objektträgers, der die Embryonen hält, gegen den Embryo selbst oder ein anderes Material gestreift^{wurde 2}. Das Öffnen der Nadel durch Bürsten gegen einen Gegenstand führt jedoch zu einem inkonsistenten Ergebnis (persönliche Beobachtung). Manchmal bricht die Nadel so, dass sie scharf wird, während die Nadel zu anderen Zeiten sehr stumpf wird, was, wie bereits erwähnt, die Embryonen, die injiziert werden, beschädigen kann, was dazu führt, dass sie nicht verändert werden oder im schlimmsten Fall den Embryo tötet. Alternativ können Nadeln auch geöffnet werden, indem die Nadel in einen Embryo eingeführt wird. Durch diesen Vorgang kann die Nadel aufgebrochen werden, so dass sie für die Injektion bereit ist. Es führt jedoch auch zu zufälligen Ergebnissen, die gelegentlich eine sehr scharfe Nadel erzeugen, aber häufiger die Nadel mit Embryomaterial verstopfen, bevor es für die Injektion verwendet werden kann. Obwohl das Anfasen von Nadeln zusätzliche Zeit und Mühe erfordert, erzeugt der Prozess gleichmäßigere scharfe Nadeln.

Die genetische Veränderung von Mücken ist ebenfalls ein zeitabhängiger Prozess, bei dem die Embryonen mikroinjiziert werden müssen, bevor der sich entwickelnde Embryo zellularisiert 4,5,6,7,8. Beim Öffnen von Nadeln durch Bürsten der Nadel gegen etwas oder durch Einführen der Nadel in einen Embryo wird die Zeit zum Öffnen und Finden einer scharfen Nadel genommen, wenn die Embryonen bereits für die Injektion vorbereitet sind und sich weiter entwickeln. Im besten Fall dauert das Öffnen einer Nadel und das Herstellen einer scharfen Nadel nur ein oder zwei Minuten, aber manchmal kann es lange genug dauern, bis die Eizellen, die für diese Injektionsrunde vorbereitet wurden, zu alt sind, wenn eine gute Nadel hergestellt wird. Der Vorteil des Abschrägens besteht darin, dass es im Voraus durchgeführt wird und die Nadeln sofort einsatzbereit sind, sobald die Embryonen für die Injektion vorbereitet sind, um sicherzustellen, dass sich die Embryonen im perfekten Entwicklungsstadium für die Injektion befinden.

Obwohl das obige Protokoll für die Sutter BV-10 Anfasmaschine entwickelt wurde und diese verwendet, kann das Protokoll für die Verwendung mit jeder Anfasmaschine modifiziert werden. Der Hauptfaktor ist, dass die Anfasfläche in der Lage sein muss, ein kleines Volumen an Flüssigkeit aufzunehmen, unter dem die Nadel abgeschrägt wird.

Das Anfasen von Mikroinjektionsnadeln, während eine Luftquelle Druckluft auf die Rückseite der Nadel liefert, hat zwei Vorteile. Erstens hilft der Luftdruck, konsistente Nadeln zu produzieren. Wenn der Anfasprozess bei gleichem zugeführten Luftdruck gestartet wird, werden gleichbleibend scharfe Nadeln hergestellt, und beim ersten Auftreten von Blasen wird das Anfasen gestoppt. Es ist wichtig, dass die Schleifplatte kurzzeitig gestoppt werden muss, um die anfängliche Blasenbildung zu beobachten, damit das Drehen der Schleifplatte die anfängliche Blasenbildung nicht verdeckt. Wenn Blasen nur sichtbar sind, wenn die Schleifplatte in Bewegung ist, kann die Öffnung der Nadel zu groß sein. Es ist wichtig, dass der Druck der zugeführten Luft bei jedem Start des Anfasens gleich ist, dass das Anfasen gestoppt wird, sobald die Blasen zu entweichen beginnen (sichtbar, wenn die Platte nicht in Bewegung ist) und dass die Blasen nicht sichtbar sind, wenn die Platte in Bewegung ist. Der zweite Vorteil besteht darin, dass nach dem Öffnen der Nadel Die Öffnungsgröße kann relativ gemessen werden, indem der Druck der zugeführten Luft verringert wird, bis keine Blasen mehr aus der Nadelspitze entweichen. Durch die Notierung des Drucks, bei dem die Blasen aufhören, aus der Spitze zu fließen, kann eine relative Öffnungsgröße abgeleitet werden. Je niedriger der Druck, bei dem die Blasen aufhören zu fließen, desto größer ist die Öffnung in der Nadelspitze, und je höher der Druck, desto kleiner ist die Öffnungsgröße der Spitze. Die Kenntnis der relativen Öffnungsgröße kann nützlich sein, wenn eine Injektionsmischung verwendet wird, die viskoser ist und daher die Injektionsnadel mit größerer Wahrscheinlichkeit verstopft. Die Verwendung dieser relativen Öffnungsgrößenmessung ermöglicht die Herstellung von Nadeln, die Injektionsmischungen mit höherer Viskosität liefern können. Natürlich gibt es einige Kompromisse, wenn man Nadeln mit größeren Öffnungsgrößen verwendet. Insbesondere kann es bei injizierten Embryonen wahrscheinlicher sein, dass sie nach der Injektion auslaufen, und die Überlebensraten für injizierte Embryonen können niedriger sein.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,0 mm Außendurchmesser Mikrokapillaren	World Precision Instruments
Beveler Sockelöl	Sutter Instruments	008
Fahrrad Schutzblechclip	VeloOrange	R-Clip 4er-Pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Galgenstativ Mikroskop	AmScope		AMScope 3,5X-90X Trinokular LED Galgenstativ Stereomikroskop oder äquivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamant-Schleifplatte	Sutter Instruments	104F	Diamant-Schleifplatte - extra fein (0,2 & Mikro; bis 1,0 & Mikro; Spitzengrößen)
Dichtung, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Wird zum Abdichten von Verbindungen an T  oder L-Anschlüssen verwendet, falls nicht bereits im Lieferumfang enthalten
Schlauchschelle	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-Packung
Schlauchanschluss	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Benötigen Sie 5 Schlauchanschlüsse
Mikroinjektionsnadelhalter	World Precision Instruments	MPH3-10	Nadelhalter für Mikrokapillaren mit 1 mm Außendurchmesser
P-2000	Sutter Instruments		Jeder Nadelabzieher
Photo-Flo 200 Lösung	B& H Foto, Video und Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	Netzmittel
Manometer	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi Gauge
Referenzdocht	Sutter Instruments	X050300
Referenzdochthalter	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mär	Benötigen Sie #10-32 Anschlüsse für Anschlüsse
Gummi Packungsblatt 6 inx 6 Zoll	Danco	Modell # 59849
T-Anschluss	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Gewindestange			Entweder eine Gewindestange oder eine Stange mit Gewindeende. Die Gewinde müssen 10-32 sein.
Urethan-Schlauch	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050