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Methodenartikel

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelee-Proteins und ihren abgeleiteten Exosomen/kleinen extrazellulären Vesikeln

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DOI:

10.3791/66778

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11. November 2025

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Nabelschnurgewebe ist eine reichhaltige, leicht verfügbare, nicht-invasive Quelle für mesenchymale Stammzellen (MSCs). In diesem Protokoll werden detaillierte Schritte für die Isolierung und Charakterisierung von humanen Wharton-Gelee-MSCs (WJ-MSCs) bereitgestellt, gefolgt von einem einfachen kurzen Protokoll zur Isolierung ihrer abgeleiteten Exosomen oder kleinen extrazellulären Vesikel.

Zusammenfassung

Im Bereich der regenerativen Medizin haben mesenchymale Stammzellen (MSCs) besondere Aufmerksamkeit erregt. MSCs aus dem Nabelschnurgewebe (UC), das als Wharton-Gelee bezeichnet wird, haben sich in einer Vielzahl von Anwendungen besonders gut etabliert. Im Vergleich zu anderen MSC-Quellen bieten die Gelee-MSCs (WJ-MSCs) von Wharton eine Reihe von Vorteilen und sind von UC isoliert, das in der Regel als medizinischer Abfall entsorgt wird. WJ-MSCs werfen daher keine ethischen Fragen auf, die mit denen in Bezug auf embryonale Stammzellen vergleichbar sind. Eine einfache und reproduzierbare Explantattechnik wurde verwendet, um WJ-MSCs aus UC-Gewebe zu isolieren. Innerhalb von fünf bis zehn Tagen nach der Isolierung treten die WJ-MSCs als adhärente Zellen mit einer fibroblastischen Form hervor. Nach der Isolierung erreichen die Zellen in 14-18 Tagen eine Konfluenz von etwa 80 %. Im Anschluss daran wurden in Passage 3 die isolierten WJ-MSCs vollständig charakterisiert, indem sie dazu veranlasst wurden, sich entlang der adipogenen, osteogenen und chondrogenen mesenchymalen Linien zu differenzieren. Zusätzlich wurde die Immunphänotypisierung für negative Cluster of Differentiation (CD)-Oberflächenmarker, einschließlich CD34, CD14 und HLA-DR, sowie für charakteristische MSC-Oberflächenmarker wie CD105, CD90, CD73 und CD44 getestet. Darüber hinaus wurde das Fällungsreagenz in einem einfachen Ansatz verwendet, um Exosomen/kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) aus dem konditionierten Medium dieser WJ-MSCs zu isolieren. Nach der Isolierung wurden die Exosomen/sEVs unter einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet, und die Partikelgrößenanalyse wurde verwendet, um ihre durchschnittliche Größe zu berechnen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass WJ-MSCs eine leicht verfügbare, nicht-invasive, erneuerbare Versorgung mit Stammzellen bieten, die als Fabriken zur Herstellung von Exosomen/sEVs verwendet werden können. Diese WJ-MSCs und ihre abgeleiteten Exosomen/sEVs können in einer Vielzahl von therapeutischen und nachgelagerten Forschungsanwendungen eingesetzt werden.

Einleitung

Noch vor wenigen Jahren ging man davon aus, dass Stammzellen in der Medizin führend sind 1,2. Die ethischen Bedenken hinsichtlich embryonaler Stammzellen (ESCs) waren jedoch ein großes Hindernis, das einen raschen Fortschritt auf diesem Gebiet behinderte3. Dies weckte großes Interesse an der Erforschung alternativer erneuerbarer Quellen für Stammzellen, insbesondere solcher, die postnatal aus der Nabelschnur (UC) isoliert werden können4. Das UC verbindet sich auf natürliche Weise mit der Plazenta und dem Fötus im Inneren einer schwangeren Mutter. Die angeborene Rolle des UC besteht darin, den wachsenden Fötus mit einer kontinuierlichen und ausreichenden Blutversorgung durch die Blutgefäße zu ernähren und den Schutz dieser Gefäße zu gewährleisten, indem eine mögliche Torsion, Kompression oder Knickung des Fötus während seiner Bewegung vermieden wird5. Anatomisch besteht das humane UC aus zwei Arterien und einer Vene, die in ein mukoides Bindegewebe eingebettet und von einer äußeren Schicht aus Amnionepithel6 umschlossen sind. Die UC-Matrix, also das mukoide Bindegewebe, das die drei Nabelgefäße umschließt, ist als "Wharton-Gelee" (WJ) bekannt und besteht hauptsächlich aus Proteoglykanen und Kollagen7.

In jüngster Zeit haben mesenchymale Stammzellen (MSCs) viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da sie eine wirksame neuartige therapeutische Modalität für eine Vielzahl von Anwendungen in der regenerativen Medizin darstellen 7,8,9,10,11,12. Das Faszinierendste an MSCs ist ihre einfache Isolierung sowie die nachgewiesenen immunmodulatorischen Aktivitäten und Multipotenz 13,14,15. Weitere überlegene Vorteile von MSCs im Allgemeinen und von WJ im Besonderen sind die Tatsache, dass sich im Gegensatz zu ESCs keine Teratome bei der Transplantation manifestieren und dass sie ihre Stammheitseigenschaft auch nach mehreren Zellpassagen beibehalten16,17. Daher wird heute angenommen, dass MSCs tatsächlich revolutionäre therapeutische Interventionen für verschiedene Krankheiten bieten könnten 8,18,19. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass die International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) im Jahr 2006 spezifische Mindestkriterien für die korrekte Charakterisierung von MSCs definierthat 20. Erstens sollten MSCs, wenn sie unter Standardkulturbedingungen angebaut/kultiviert werden, kunststoffhaftend sein. Zweitens müssen MSCs einige charakteristische Cluster von Differenzierungsoberflächenmarkern (CD) wie CD90, CD105 und CD73 exprimieren und dürfen keine Expression anderer wie CD14, CD34 und CD45 zeigen. Drittens müssen sich MSCs in vitro in osteogene, adipogene und chondrogene Linien differenzieren 20. Bis heute wurden MSCs aus mehreren Quellen isoliert, darunter adulte Gewebe wie Knochenmark (BM), Fettgewebe21 sowie fetale/perinatale Quellen wie Plazenta, UC-Blut (UCB) und UC-Matrix 22,23. Bemerkenswert ist, dass beim Vergleich der Erfolgsrate bei der Entnahme von MSCs berichtet wurde, dass sie fast 100 % aus WJ-Gewebe erreicht, verglichen mit nur etwa 6 % aus UCB 24,25. Obwohl UCB in der Tat eine reichhaltige Quelle für hämatopoetische Stammzellen ist, wird es auch als gute Quelle für MSCs angesehen, jedoch deutlich niedriger als WJ 26,27,28.

WJ-MSCs sind im Vergleich zu anderen Arten von MSCs außergewöhnlich, da sie zwar echte (typische) MSCs sind, die ähnliche Eigenschaften wie ihre adulten Gegenstücke besitzen, aber auch die Expression verschiedener Pluripotenz-/ESC-Marker besitzen17,29. Dementsprechend wird angenommen, dass WJ-MSCs irgendwo zwischen adulten und embryonalen Stammzellen liegen17. Interessanterweise wurde festgestellt, dass WJ-MSCs sowohl humane MSC- als auch ES-Marker exprimieren und in der Lage sind, die Stammzellen für mehrere Passagen aufrechtzuerhalten16. Glücklicherweise bilden sie bei der Transplantation keine Teratome17. Dies kann durch ihr einzigartiges transkriptomisches Profil im Vergleich zu ESCs sowie anderen MSCs verdeutlichtwerden 29,30. WJ-MSCs bieten verschiedene Vorteile gegenüber adulten MSCs und sogar gegenüber anderen Arten von Stammzellen im Allgemeinen. Ihre Isolationsmittel sind über das UC, das routinemäßig bei der Geburt entsorgt wird und daher als medizinischer Abfall gilt, leicht verfügbar. Daher haben WJ-MSCs im Gegensatz zu ESCs keine ethischen Bedenken und werden im Gegensatz zu BM-MSCs durch eine invasive Technik isoliert31. Darüber hinaus fehlt bei WJ-MSCs, wie bei anderen MSC-Typen, die Expression von humanem Leukozyten-Antigen-D-verwandt (HLA-DR), und es wurde insbesondere festgestellt, dass sie humanes Leukozyten-Antigen-G (HLA-G) exprimieren, was ihnen ein zusätzliches Immunprivileg verleiht32. Dies deutet darauf hin, dass WJ-MSCs eine immunsuppressive Rolle spielen, die das simuliert, was normalerweise an der Schnittstelle zwischen Fötus und Mutter in vivo passiert 33,34,35. Schließlich haben WJ-MSCs, wie ihre von UCB isolierten Analoga, ein großes Potenzial für das Banking36. Angesichts all dieser Vorteile werden WJ-MSCs als neuer goldener Standard für MSC-basierte Therapien befürwortet30.

Interessanterweise haben viele Forschungsarbeiten gezeigt, dass MSCs ihre therapeutische Wirkung hauptsächlich über die parakrine Signalübertragung zeigen. In vielen Fällen wurde berichtet, dass solche Effekte als Reaktion auf Exosomen/kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) auftreten, die von MSCs sezerniertwerden 37. Exosomen/sEVs sind als bioaktive Vesikel von Nanogröße bekannt, die aus dem Endomembransystem der Zelle gewonnen werden. Sie fungieren als Shuttles, die spezifische Ladungen von Proteinen, mRNA sowie nicht-kodierenden RNAs wie microRNAs und langen nicht-kodierenden RNAs (LncRNAs) als Flaschenpost transportieren38. Infolgedessen können sie die Empfängerzellen umprogrammieren und werden als "Signalosomen" bezeichnet, die wesentliche zelluläre Funktionen manipulieren39. MSCs-abgeleitete Exosomen/sEVs haben ihre Überlegenheit gegenüber MSCs-Therapien als mögliche zellfreie Alternative unter Beweis gestellt. Ähnlich wie ihre Eltern-MSCs wurde festgestellt, dass Exosomen/sEVs bei verschiedenen Krankheiten therapeutische Effekte und Zellregeneration hervorrufen. Im Gegensatz zu ihren Elternzellen können sie jedoch biologische Barrieren leichter überwinden. Darüber hinaus sind sie frei von kritischen Sicherheitsbedenken; Sie bergen kein Risiko für Immunabstoßung oder langfristige Tumorbildung40. Darüber hinaus können Exosomen/sEVs für gentherapeutische Anwendungen als Mittel eines Wirkstoffabgabesystems eingesetzt werden, da sie von Natur aus für die Übertragung genetischer Informationen ausgestattet sind41. Somit haben Exosomen/sEVs in der Tat aufregende neue Wege für neuartige therapeutische Interventionen bei verschiedenen Krankheiten eröffnet 42,43,44.

In diesem Protokoll wird ein gründliches, schrittweises explantatbasiertes Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von WJ-MSCs aus UC-Gewebe vorgestellt. Daran schließt sich ein kurzes Protokoll für die Isolierung von Exosomen/sEVs aus konditionierten Medien dieser WJ-MSCs an.

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Protokoll

Alle Experimente und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt und von den Ethikkommissionen sowohl der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams Universität, Kairo, Ägypten (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) als auch der Fakultät für Pharmazie der British University in Ägypten, Kairo, Ägypten (CL-2309) genehmigt. Die UCs wurden nach Einholung der unterschriebenen Einverständniserklärung der Eltern eingeholt.

1. Isolierung von WJ-MSC aus der menschlichen Nabelschnur

  1. Geben Sie ca. 30-40 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einen Behälter (versiegelter Auffangbeutel) zum Auffangen der Nabelschnur (UC) (ca. 15 cm lang) unmittelbar nach der Geburt. Bewahren Sie das gesammelte Restkraut auf Eis auf und verarbeiten Sie es innerhalb von maximal 4-5 h nach der Entnahme.
    HINWEIS: Die Probe kann nach 4-5 h nicht verarbeitet werden, da dies die Ausbeute des MSCs stark verringert. Stellen Sie sicher, dass das PBS und der Behälter steril sind.
  2. Bereiten Sie einen vollständigen Nährboden für WJ-MSCs vor, der aus Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM) mit niedrigem Glukosegehalt besteht, ergänzt durch 10 % fötales Kälberserum (FBS), 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 0,25 μg/ml Amphotericin B.
  3. Geben Sie 3 ml vollständiges Medium pro Vertiefung in 6-Well-Platten und legen Sie dann die 6-Well-Platten mit dem Medium in einen CO2 -Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist, um es zu erwärmen und vorzubereiten.
  4. Bereiten Sie in der Biosicherheitswerkbank acht 10 cm große Zellkulturschalen vor, die jeweils mit 10 ml sterilem PBS gefüllt sind.
  5. Übertragen Sie das UC vorsichtig mit einer sterilisierten Pinzette aus dem versiegelten Plastikbeutel in die erste Petrischale, die PBS enthält, um das Blut auszuwaschen (wiederholen Sie diesen Schritt, bis das gesamte Blut aus der Probe ausgewaschen ist).
  6. Sprühen Sie 70%iges Ethanol auf einen sterilen Tupfer und wischen Sie damit den UC 30 s lang ab.
  7. Übertragen Sie das UC in eine neue Petrischale, die mit sterilem PBS gefüllt ist, um Ethanolreste zu entfernen.
  8. Übertragen Sie das UC in eine andere Petrischale, die zuvor mit sterilem PBS gefüllt ist, und schneiden Sie das UC mit einer sterilen Schere in kleinere Stücke (jeweils ca. 3 cm). Schieben Sie dann diese 3 cm langen Stücke in eine andere Petrischale mit frischem, sterilem PBS, um zu vermeiden, dass während des Schneidvorgangs Blut freigesetzt wird.
    HINWEIS: Von diesem Zeitpunkt an müssen die UC-Stücke auf Eis gehalten werden, ebenso wie alle nachfolgenden Verarbeitungsschritte. Dies ist sehr wichtig, um die Freisetzung von gallertartigen Stoffen zu vermeiden und den Erfolg des Isolierungsverfahrens von WJ-MSCs aus dem UC-Gewebe sicherzustellen. Die Verarbeitung des gesammelten UC innerhalb von maximal 4-5 h ist entscheidend für den Erfolg des Isolationsprozesses. Früher wurde der UC innerhalb längerer Zeiträume nach der Entnahme verarbeitet, und leider zeigte das Verfahren keine erfolgreichen Ergebnisse (Daten nicht gezeigt).
  9. Beginnen Sie mit der Verarbeitung der UC-Stücke nacheinander (auf Eis) in einer Petrischale, die mit sterilem PBS gefüllt ist. Verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette, um Blutgefäße zu durchtrennen und das Wharton-Gelee-Gewebe (WJ) zu isolieren. Legen Sie dann die klaren WJ-Stücke in eine andere Petrischale, die mit sterilem PBS auf Eis gefüllt ist.
    HINWEIS: Bei der Isolierung von WJ-Gewebe aus dem UC-Stück wird der erste Schnitt auf der durchsichtigen Seite des UC-Stücks durchgeführt, weg von den Blutgefäßen, um ein Durchschneiden des Gefäßes zu vermeiden. Anschließend werden Blutgefäße geklemmt, umgeschnitten und weggezogen.
  10. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt an allen UC-Stücken, um klares WJ-Gewebe ohne Blutgefäße zu erhalten.
    HINWEIS: Wechseln Sie die PBS-Petrischale, falls erforderlich, während der Verarbeitung der UC-Stücke und der Entfernung der Blutgefäße, wenn die PBS-Lösung während der WJ-Gewebeisolierung blutig oder unklar wird.
  11. Waschen Sie die gesammelten WJ-Stücke mit PBS, indem Sie sie in eine frische 10-cm-Zellkulturschale geben, die mit sterilem PBS gefüllt ist.
  12. Schneiden Sie das gesammelte WJ-Gewebe mit einem sterilen, scharfen Skalpell und einer Pinzette in kleine 10 mm lange Stücke.
  13. WJ-Stücke in die zuvor vorbereiteten 6-Well-Platten in Schritt 1.3 übertragen. Legen Sie 5-6 WJ-Stücke pro Vertiefung und inkubieren Sie dann die 6-Well-Platten mit WJ-Gewebeexplantaten in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C im CO2 -Inkubator und lassen Sie sie 3 Tage lang ungestört.
  14. Am 4. Tag nach dem Platzieren der WJ-Gewebeexplantate fügen Sie vorsichtig 1 ml Medium pro Vertiefung hinzu und achten Sie darauf, die Explantate nicht zu stören.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Unterseite der Platte, an der die WJ-Teile befestigt sind, zu berühren oder zu zerkratzen.
  15. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt am 6. Tag nach dem Platzieren der WJ-Gewebeexplantate.
  16. Beginnen Sie am 8. Tag nach dem Platzieren der WJ-Gewebeexplantate (d. h. fast 1 Woche nach der Explantatplatzierung) mit dem Wechsel der Hälfte des Mediums pro Vertiefung jeden zweiten Tag bis zum 12. bis 14. Tag nach der Explantatplatzierung. Ersetzen Sie die Hälfte des Nährmediums aus jeder Vertiefung, indem Sie etwa 2,5 ml aus jeder Vertiefung entfernen und frische 2,5 ml vollständiges warmes Medium (37 °C) hinzufügen.
    HINWEIS: Ziehen Sie das Medium von der Oberfläche der Vertiefung ab und vermeiden Sie es, die Unterseite der Platte, an der die WJ-Stücke befestigt sind, zu berühren oder zu zerkratzen. Die WJ-MSCs erscheinen in der Regel innerhalb von 5-10 Tagen nach dem Platzieren der Explantate unter und um die WJ-Gewebeexplantate.
  17. Beobachten Sie die 6-Well-Platten routinemäßig unter einem inversen Mikroskop (10-fache Vergrößerung), und wenn sich die freigesetzten Zellen vermehren und ihre Konfluenz auf 50-60% zunimmt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn nicht, wiederholen Sie Schritt 1.16. wieder. Die WJ-Stücke schrumpfen im Laufe der Zeit erheblich.
  18. Entfernen Sie vorsichtig die WJ-Explantate, die am Boden der Vertiefungen befestigt sind, und entfernen Sie alle Medien. Die Entnahme von WJ-Explantatstücken erfolgt in der Regel am 12. bis 14. Tag nach dem ersten Platzieren.
    HINWEIS: Neigen Sie die Platten leicht in einem Winkel von 45°, während Sie das Medium entfernen, um sicherzustellen, dass alle Medien entfernt werden.
  19. Waschen Sie jede Füllung gut mit 2 ml PBS, schwenken Sie die Platte vorsichtig und entsorgen Sie dann PBS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
    HINWEIS: Geben Sie PBS vorsichtig an die Wand der Vertiefung und vermeiden Sie es, den Boden der Vertiefungen zu berühren, um sicherzustellen, dass die Zellen überhaupt nicht gestört werden.
  20. 2 mL warmes vollständiges Medium pro Vertiefung vorsichtig zugeben (Medien mit exakter Zusammensetzung wie in Schritt 1.2 beschrieben) und die 6-Well-Platten unter befeuchteten Bedingungen mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubieren.
  21. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage vollständig (2 ml vollständiges Medium pro Well), bis die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen.
  22. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, werden die Zellen mit Trypsin-EDTA in T25-Zellkulturflaschen geleitet (die Gesamtheit der Zellen, die aus einer 6-Well-Platte gewonnen werden, kann in einen T25-Kulturkolben überführt werden, wobei 8-9 ml vollständiges Medium pro T25-Flasche verwendet werden können). Diese WJ-MSCs werden als P1-Zellen bezeichnet.
    HINWEIS: Lassen Sie die Zellen nicht zu lange mit Trypsin-EDTA befallen, um toxische Wirkungen zu vermeiden. In der Regel reichen 3 Minuten für die Ablösung der Zellen aus. Verschiedene Lieferanten können Trypsin-EDTA mit variabler Potenz liefern. Dementsprechend muss dies bei der Angabe der Inkubationszeit berücksichtigt werden.
  23. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag. Sobald die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben, werden die Zellen mit Trypsin-EDTA in T75-Zellkulturflaschen überführt (die Gesamtheit der aus einem T25-Kulturkolben gewonnenen Zellen kann in einen T75-Kulturkolben überführt werden; es werden 15-18 ml vollständiges Medium pro T75-Flasche verwendet); diese WJ-MSCs werden als P2-Zellen bezeichnet.
  24. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag. Sobald die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben, lösen Sie die Zellen mit Trypsin-EDTA ab und säen Sie dann WJ-MSCs mit einer Dichte von etwa 0,75 x 106-1 x 106 Zellen pro T75-Kolben aus. Diese WJ-MSCs werden als P3-Zellen bezeichnet.
    HINWEIS:Verwenden Sie Zellen zwischen P3 und P5 für zukünftige Experimente, die in diesem Protokoll beschrieben werden.
  25. Kryokonservierung der isolierten WJ-MSC in flüssigem Stickstoff unter Verwendung von Kryokonservierungsmedien, die aus 80 % FBS, 10 % vollständigem Medium (wie in Schritt 1.2 beschrieben) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) bestehen.
    HINWEIS: Eine schematische Darstellung der gesamten Schritte für die Isolierung von WJ-MSCs ist in Abbildung 1 dargestellt.

2. Charakterisierung isolierter WJ-MSCs durch Immunphänotypisierung mittels durchflusszytometrischer Analyse auf verschiedene CD-Oberflächenmarker

  1. Trennen Sie die Zellen mit Trypsin-EDTA an Passage 4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und zählen Sie ihre Anzahl mit einem Hämozytometer.
    HINWEIS: Eine minimale Inkubationszeit (für 3 Minuten) während der Trypsinisierung ist entscheidend, um die Zellen erfolgreich zu lösen, ohne Schaden anzurichten. Eine längere Inkubation mit Trypsin-EDTA kann dazu führen, dass die Zelloberflächenmarker beschädigt und die Ergebnisse des Immunphänotypisierungsassays negativ beeinflusst werden.
  2. Inkubieren Sie etwa 100.000 Zellen (unter dunklen Bedingungen) für 20 Minuten bei 4 °C mit humanen monoklonalen Antikörpern, die entweder mit Phycoerythrin (PE) oder Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) markiert sind, wie folgt: Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE und Anti-HLA-DR FITC und verwenden Sie ungefärbte Zellen als Kontrollen
  3. Spülen Sie die Zellen mit PBS und resuspendieren Sie sie anschließend in 500 μl FACS-Puffer; Analyse mittels Durchflusszytometrie45.

3. Abschätzung des Differenzierungspotenzials von isolierten WJ-MSCs zu verschiedenen mesenchymalen Linien

  1. Adipogene Differenzierung
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem Proliferationsmedium (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Anschließend kultivieren Sie die Zellen bei einer Dichte von 3,7 x 104 Zellen/Well (0,5 mL Medium/Well) in einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Anschließend unter befeuchteten Bedingungen von 5 % CO2 bei 37 °C inkubieren. Als nächstes, als nächstes, jeden zweiten Tag, wechseln Sie das Medium, bis die Zellen fast 100% Konfluenz erreichen; Dies dauert in der Regel ca. 3-4 Tage.
    2. Entfernen Sie das Proliferationsmedium und ersetzen Sie es durch adipogene Differenzierungsmedien, um die Adipogenese zu induzieren. Ergänzen Sie das LG-DMEM-Medium mit 100 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Penicillin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und dem adipogenen Supplement, das im Kit zur funktionellen Identifizierung mesenchymaler Stammzellen enthalten ist. Wechseln Sie danach das Medium vorsichtig (0,5 ml/Well) alle 3 Tage und vermeiden Sie die Störung der Lipidvakuolen.
    3. Nach etwa 21 Tagen färben Sie die Lipidvakuolen mit einer mikroskopischen Untersuchung mit Oil Red, um die adipogene Differenzierung zu beurteilen.
    4. Bereiten Sie eine frische Stammlösung von Oil Red vor; Lösen Sie 30 mg Oil Red Fleck in 10 ml Isopropanol auf und ruhen Sie mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie dann eine Arbeitslösung vor, indem Sie 2 Teile doppelt destilliertes Wasser (ddH2O) mit 3 Teilen Stammlösung mischen, gut mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Anschließend wird mit einem 0,22- oder 0,45-μm-Filter gefiltert.
      HINWEIS: Für ein optimales Färbeergebnis bereiten Sie den Oil Red-Fleck frisch vor.
    5. Für eine erfolgreiche Dokumentation der adipogenen Differenzierung waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fixieren Sie sie 15 Minuten lang mit neutral gepuffertem 10% Formalin (0,75 ml/Well). Waschen Sie anschließend die Zellen zweimal mit PBS mit 1 ml/Vertiefung (bevor Sie das PBS nach jedem Waschen verwerfen, inkubieren Sie die Zellen etwa 5 Minuten lang).
      HINWEIS: Zellen, die in Proliferationsmedien aufbewahrt werden (beschrieben in Schritt 1.2), werden als nicht induzierte Kontrollzellen verwendet. Geben Sie neutral gepuffertes Formalin langsam an die Wände, nicht direkt an die Zellen, um Zellschäden zu vermeiden. Nach der letzten Wäsche mit PBS ist eine vollständige Aspiration von PBS entscheidend, bevor die Oil Red Fleckenarbeitslösung hinzugefügt wird, um eine ineffiziente Färbung zu vermeiden.
    6. Nach der letzten Wäsche färben Sie die Zellen (1 ml/Well) mit Oil Red Arbeitslösung und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei 37 °C. Entnehmen und verwerfen Sie anschließend die Fleckenlösung und spülen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS aus. Beobachten Sie dann unter dem Mikroskop die gefärbten Lipidtröpfchen.
  2. Osteogene Differenzierung
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem Proliferationsmedium (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Anschließend werden in einer 24-Well-Gewebekulturplatte 7,4 x 103 Zellen/Well ausgesät (0,5 mL Medium/Well) und 3 Tage lang unter feuchten Bedingungen bei 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert, um eine Konfluenz von fast 70 % zu erreichen.
    2. Bei einer Konfluenz von etwa 70 % sind die Proliferationsmedien durch Differenzierungsinduktionsmedien zu ersetzen, die das osteogene Supplement - im Kit zur funktionellen Identifizierung mesenchymaler Stammzellen enthalten - in LG-DMEM-Medien enthalten, ergänzt mit 10 % FBS, zusammen mit 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 0,25 μg/ml Amphotericin B.
    3. Tauschen Sie das Differenzierungsmedium alle 3 Tage aus und setzen Sie die osteogene Induktion etwa 21 Tage lang fort.
    4. Bereiten Sie eine Arbeitslösung für Alizarin Red S Fleck vor. Bringen Sie 9 ml ddH2O und lösen Sie 200 mg Alizarinrot S-Fleck darin auf und verwenden Sie dann Ammoniumhydroxid und HCl, um den pH-Wert auf 4,1-4,3 einzustellen. Anschließend wird das Volumen mit ddH2O auf 10 mL vervollständigt. Anschließend wird die Lösung mit einem Filter (0,22 oder 0,45 μm) filtriert, um eventuelle Ausfällungen zu entfernen.
    5. Spülen Sie die Zellen am Ende der Induktionsphase zweimal mit PBS und fixieren Sie sie dann mit neutral gepuffertem 10% Formalin (0,75 ml/Well) und lassen Sie sie 15 Minuten ruhen. Spülen Sie die Zellen anschließend zweimal mit PBS (1 ml/Well) und stellen Sie sicher, dass die Zellen bei jedem Spülen 5 Minuten lang inkubiert werden.
      HINWEIS: Zellen, die in Proliferationsmedien aufbewahrt werden (beschrieben in Schritt 1.2), werden als nicht induzierte Kontrollzellen verwendet.
    6. Die in Schritt 3.2.4 hergestellte 2%ige Alizarin-Rot-S-Arbeitslösung zu den fixierten Zellen aus dem vorhergehenden Schritt geben und etwa 45-60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
    7. Anschließend verwerfen Sie die Färbelösung und spülen Sie die Zellen zweimal mit ddH2O und dann einmal mit PBS, dann beurteilen Sie die erfolgreiche osteogene Differenzierung unter dem Mikroskop, indem Sie die gefärbte kalziumreiche extrazelluläre Matrix beobachten.
  3. Chondrogene Differenzierung
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem Proliferationsmedium (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Anschließend werden in einer 24-Well-Gewebekulturplatte 7,4 x 103 Zellen/Well ausgesät (0,5 mL Medium/Well hinzugefügt) und unter feuchten Bedingungen bei 5 % CO2 bei 37 °C für 3 Tage inkubiert, um eine Konfluenz von fast 90 % zu erreichen.
    2. Bei einer Konfluenz von etwa 90 % beginnen Sie mit der Induktion der chondrogenen Differenzierung unter Verwendung von serumfreiem DMEM/F12, das mit Insulin-Transferrin-Selen (ITS) ergänzt wird, und einem chondrogenen Supplement - das mit dem mesenchymalen Stammzell-Funktionsidentifikationskit geliefert wird - zusammen mit 0,25 μg/ml Amphotericin B, 100 μg/ml Penicillin, 2 mM L-Glutamin und 100 μg/ml Streptomycin46.
      HINWEIS: Das gesamte chondrogene Differenzierungsinduktionsmedium wird im Dunkeln bei 2-8 °C gehalten.
    3. Setzen Sie die chondrogene Differenzierungsinduktion für etwa 21 Tage fort; Wechseln Sie in der Zwischenzeit alle 3 Tage das Medium.
    4. Bereiten Sie die Alcianblau-Flecken-Arbeitslösung wie folgt vor: Bereiten Sie zunächst 3% Eisessig in ddH2O vor (fügen Sie 3 mL Eisessig hinzu und füllen Sie bis zu 100 mL mit ddH2O). Bereiten Sie dann eine Alcianblau-Beizlösung vor, indem Sie 20 mg zu 20 ml 3%iger Eissäurelösung hinzufügen, sie etwa 30 Minuten lang stehen lassen und anschließend mit einem 0,22 μm oder 0,45 μm Filter filtrieren, um Ausfällungen zu entfernen.
    5. Spülen Sie die Zellen am Ende der Induktionsphase zweimal mit PBS, fixieren Sie sie dann mit 10 % neutralem gepuffertem Formalin (0,75 ml/Well) und lassen Sie sie 15 Minuten ruhen. Waschen Sie die Zellen danach zweimal mit PBS (1 ml/Well). Stellen Sie sicher, dass die Zellen jedes Mal 5 Minuten lang inkubiert werden.
      HINWEIS: Zellen, die in Proliferationsmedien aufbewahrt werden (wie in Schritt 1.2 beschrieben), werden als nicht induzierte Kontrollzellen verwendet.
    6. Die fixierten Zellen werden in der 0,1%igen Alcianblau-präparierten Arbeitslösung für ca. 60 min bei 37 °C inkubiert. Spülen Sie die Zellen zweimal mit ddH2O und einmal mit PBS, um den restlichen Fleck zu entfernen. Beobachten Sie dann mit einer mikroskopischen Untersuchung die gefärbten sulfatierten Proteoglykane.

4. Isolierung von Exosomen/sEV aus konditionierten WJ-MSC-Medien

  1. Resuspendieren Sie WJ-MSCs in vollständigem Proliferationsmedium (wie in Schritt 1.2 beschrieben) und säen Sie 6-Well-Gewebekulturplatten mit diesen WJ-MSCs bei einer Dichte von 150.000 Zellen/Well (2 mL Media/Well) und inkubieren Sie sie bei 37 °C unter feuchten Bedingungen bei 5 % CO2.
  2. Bereiten Sie serumfreie (SF) Exosomen-Entnahmemedien wie folgt vor: Modifiziertes Eagle-Medium (LG-DMEM) von Dulbecco mit niedrigem Glukosegehalt, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B.
    HINWEIS: Das Exosomen-Sammelmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie das vollständige Proliferationsmedium (beschrieben in Schritt 1.2), jedoch ohne FBS.
  3. Befolgen Sie die 6-Well-Platten (vorbereitet in Schritt 4.1) und ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag mit dem Proliferationsmedium (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bis sie eine Konfluenz von etwa 75-80% erreichen.
  4. Wenn eine Konfluenz von 70 % erreicht ist, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS (1 ml/Well), fügen Sie dann serumfreies (SF) Exosomen-Sammelmedium (1,5 ml/Well) hinzu (beschrieben in Schritt 4.2) und inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 37 °C unter feuchten Bedingungen bei 5 % CO2.
  5. Nach 48 Stunden entnehmen Sie die konditionierten WJ-MSCs-Medien von den 6-Well-Gewebekulturplatten, die im vorherigen Schritt in 15-ml-Zentrifugationssammelröhrchen gelegt wurden. Anschließend werden die folgenden sequenziellen Zentrifugations- und Filtrationsschritte durchgeführt, um das gesammelte konditionierte Medium47 zu reinigen.
    HINWEIS: Unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussfarbstoffs, gefolgt von der Zählung der Zellen mit dem Hämozytometer, beurteilen Sie den Lebensfähigkeitsprozentsatz der Zellen, die ursprünglich zur Ableitung des gesammelten konditionierten Mediums verwendet wurden. Die lebensfähigen Zellen sollten idealerweise mehr als 90 % betragen. Lagern Sie anschließend das gesammelte Zellpellet bei -80 °C, falls es für zukünftige Untersuchungen benötigt wird.
    1. Das gesammelte konditionierte Medium wird bei 300 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um alle suspendierten Zellen zu entfernen. Sammeln Sie dann den Überstand und führen Sie den nächsten Zentrifugationsschritt für diesen gesammelten Überstand (konditioniertes Medium) durch.
    2. Das konditionierte Medium aus Schritt 4.5.1 bei 3000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um nekrotische Zellen sowie Zelltrümmer zu entfernen.
      HINWEIS: Die Zentrifugationsschritte werden vorzugsweise bei 4 °C durchgeführt, können aber auch bei Raumtemperatur mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt werden.
    3. Filtern Sie den aus dem vorherigen Schritt erhaltenen Überstand, indem Sie ihn durch einen 0,22-μm-Filter in ein neues 50-ml-Polypropylen-Sammelröhrchen leiten, um alle Zellreste und große EVs zu entfernen.
      HINWEIS: Die gefilterten konditionierten Medien können sofort für nachfolgende Schritte zur Isolierung von Exosomen/sEVs verwendet, im Kühlschrank bei 4 °C gelagert und nicht länger als 3 Tage verwendet werden, oder bei -80 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden, bis eine Isolierung von Exosomen/sEVs erforderlich ist. Es wird bevorzugt, dass die geklärten konditionierten Medien, die bei -80 °C gelagert werden, innerhalb einer maximalen Dauer von 1-3 Monaten verarbeitet werden. Je früher, desto besser.
  6. 7,5 ml geklärtes konditioniertes Medium (aus Schritt 4.5) werden in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und 1,5 ml Reagenz hinzugefügt. Geben Sie das Reagenz im Verhältnis 1:5 zum Medium hinzu (d. h. 1 ml Exoquick-TC-Fällungsreagenz pro 5 ml Medium). Drehen Sie anschließend das Rohr auf und ab und schnippen Sie es mehrmals, um sicherzustellen, dass das Fällungsreagenz richtig mit dem Medium vermischt wird.
    HINWEIS: Das Fällungsreagenz ist ein schweres, viskoses Reagenz. Dabei sollte das benötigte Volumen langsam und vorsichtig entnommen werden, um sicherzustellen, dass das vorgesehene Volumen vollständig übertragen wird.
  7. Lagern Sie das Röhrchen mit dem Medium mit dem Fällungsreagenz 4 °C in aufrechter stehender Position über Nacht für ca. 16 h (mindestens 12 h).
  8. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie das Medien-Reagenz-Gemisch bei 1500 x g für 30 min bei 4 °C. Nach der Zentrifugation erscheint das Pellet der Exosomen/sEVs als sehr kleines weißes oder beiges Pellet, das sich am Boden des Röhrchens abgesetzt hat.
    HINWEIS: Dieser Zentrifugationsschritt kann auch bei Raumtemperatur mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt werden. Falls das Exosom/sEVs-Pellet am Ende dieses Zentrifugationsschritts nicht sichtbar ist, kann eine zusätzliche Zentrifugationszeit bei 3000 x g für zusätzliche 20-30 min bei 4 °C hinzugefügt werden. Manchmal bleibt das Pellet der Exosomen/EVs auch nach der verlängerten Zentrifugationszeit unsichtbar, was bedeutet, dass eine kleine Menge an Exosomen/sEVs vorhanden ist. Fahren Sie in diesem Fall mit dem Protokoll fort, indem Sie die unteren 5-10 μl des Röhrchens belassen.
  9. Der Überstand wird aspiriert und das restliche Medien-/Fällungsreagenzgemisch bei 1500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Saugen Sie dann sehr vorsichtig die verbleibenden Flüssigkeitsspuren an, ohne das Pellet der gefällten Exosomen/sEVs zu stören.
  10. Suspendieren Sie das Exosomen-/sEVs-Pellet in 100-300 μl sterilem PBS, je nach Pelletgröße und Sichtbarkeit. Anschließend können diese Exosomen/sEVs entweder sofort verwertet oder in einem Ultratiefkühlschrank bei -80 °C für nachfolgende Experimente gelagert werden.
    HINWEIS: Wenn mit mehr als einem Zentrifugenröhrchen für dasselbe Medium begonnen wird (beschrieben in Schritt 4.9) und die Exosomen/sEVs-Pellets (in Schritt 4.10 erhalten) unsichtbar sind, können die von allen Exosomen/sEV-Pellets gesammelten Exosomen/sEVs mit etwa 100-300 μl sterilem PBS gepoolt werden, um sie alle zusammen gepoolt zu suspendieren.
  11. Quantifizieren Sie die gesammelten Exosomen/sEVs im Verhältnis zu ihrem Proteingehalt mit einem kommerziell erhältlichen Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinquantifizierungskit, wie vom Hersteller angegeben.
    HINWEIS: Eine schematische Darstellung aller Isolationsschritte von WJ-MSCs-abgeleiteten Exosomen/sEVs ist in Abbildung 2 dargestellt.

5. Bildgebung von isolierten Exosomen/sEVs mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

  1. Suspendieren Sie frisch isolierte Exosomen/sEVs in 100-300 μl sterilem PBS entsprechend der Pelletgröße und Sichtbarkeit (wie zuvor in Schritt 4.11 beschrieben).
    HINWEIS: Es wird viel bevorzugt, frisch isolierte anstelle von gefrorenen Exosomen/sEVs für die TEM-Bildgebung zu verwenden
  2. 20 μl der Suspension der Exosomen/sEVs auf ein kohlenstoffbeschichtetes Gitter pipettieren und 10 Minuten trocknen lassen.
  3. Fixieren Sie die platzierten Exosomen/sEVs mit Glutaraldehydlösung (2% in destilliertem Wasser) für ca. 15 min.
  4. Anschließend färben Sie die fixierten Exosomen/sEVs mit 2% Uranylacetat und lassen Sie sie ca. 3 Minuten im Dunkeln stehen, dann untersuchen Sie sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) (20000-fache Vergrößerung) unter Verwendung der Standard-TEM-Einstellungen.

6. Bestimmung der durchschnittlichen Größe von isolierten Exosomen/sEV mit Hilfe eines Partikelgrößenanalysators

  1. Verdünnen Sie frisch isolierte Exosomen/sEVs mit sterilem PBS pH 7,4 im Verhältnis 1:250.
  2. Messung der durchschnittlichen Partikelgrößenverteilung von isolierten Exosomen/sEVs mit einem Partikelgrößenanalysator bei 25 °C.

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Ergebnisse

Isolierung und Charakterisierung von WJ-MSCs

Wie in Abbildung 3 gezeigt, erschienen kleine fibroblastenähnliche Zellen zunächst innerhalb von 5-10 Tagen nach der Aussaat dieser Explantate unter und um das WJ-Explantatgewebe herum (Abbildung 3A). Diese freigesetzten WJ-MSCs vermehren sich weiter und erreichen in der Rege...

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Diskussion

In diesem Protokoll konnten wir detaillierte Schritte zur Isolierung von WJ-MSCs aus humanem UC-Gewebe und auch zur Isolierung ihrer abgeleiteten Exosomen/sEVs vorstellen. UC ist eine leicht zugängliche, unerschlossene nicht-invasive Quelle zur Gewinnung von MSCs, und es ist keine spezielle Ausrüstung für die Entnahme oder Verarbeitung erforderlich 11,15,30,32,48.

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Offenlegungen

Alle Co-Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt im Zusammenhang mit dieser Arbeit besteht.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise finanziert von der Ain Shams University - Strategic Plan Research Support Grant (2024/2025), Ägypten, und dem Nanotechnology Research Center (NTRC) - Access Award (2019/2020), The British University in Egypt (BUE), Kairo, Ägypten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, USAA5533
AmmoniakwasserFisher Scientific, Deutschland1336-21-6
Antikörper für den Menschen CD-105, FITCR& D systems Inc., MN, USAFAB10971F
Antikörper für menschliche CD-14, PEBeckman Coulter, USAIM0650U
Antikörper für menschliche CD-34, PEBeckman Coulter, USAIM1420
Antikörper für menschliche CD-44, PEBeckman Coulter, USAA32537
Antikörper für menschliche CD-73, PER& D systems Inc., MN, USAFAB5795P
Antikörper für den menschlichen CD-90, PER& D systems Inc., MN, USAFAB2067P
Antikörper für menschliche HLA-DR, FITCBeckman Coulter, USAIM1638U
Bicinconininsäure (BCA) Proteinquantifizierungs-KitThermofisher23227
Biosicherheitsschrank, laminare Strömung, MSC AdvantageThermowissenschaftlich, USA
CO2 Inkubator, Direct FormaThermowissenschaftlich, USA
KühlzentrifugeSigma, Deutschland
KühlzentrifugeEppendorf, Deutschland
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter, FL, USA
Dimethylsulfoxidid (DMSO)Fisher Scientific, DeutschlandBP231-100
DMEM – Low Glucose 1 g/LLonza, Schweiz12-707F
DMEM/F12 Lonza, Schweiz12-719F
DNAse/RNAse freies WasserGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Ethanol absolut, molekularbiologische QualitätSigma-Aldrich, Deutschland24103
ExoQuick-TCSystembiowissenschaften (SBI), USAEXOTC50A-1Ausscheidungsmittel
Fetales Rinderserum (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brasilien10270-106
Formaldehyd 37 %Fisher ScientificBP531-500
GletscheressigsäureSigma Aldrich, DeutschlandA38S-500
Glutaraldehydlösung SigmaG7776
Salzsäure (HCl)Fisher Scientific, DeutschlandA144-212
Invertiertes MikroskopOlympus, Japan
L-GlutaminGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Funktionelles Identifikationskit für mesenchymale Stammzellen;R& D systems Inc., MN, USASC006
Mikroplatten-LeserChromate, Awareness Technologies, USA
Oil Red StainSigma-Aldrich, USAO0625
Penicillin-Streptomycin-AmphotericinGibco Thermo Fisher, USA15240062
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x, ohne Ca/MgLonza, SchweizBE17-516F
Schüttelndes WasserbadDaihan Wisebath, Korea
Spritzenfilter, 0,2 MikronCorning, USA431224
TransmissionselektronenmikroskopJEM-1200EX II, Jeol, Deutschland
Trypan blau Gibco Thermo Fisher, USA15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1xLonza, SchweizCC-5012
Uranylacetatlösung (2 %)Elektronenmikroskopiewissenschaften, USA22400-2
UV-sichtbares SpektrophotometerShimadzu, Japan
WirbelSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, Vereinigtes Königreich  Partikelgrößenanalysator

Referenzen

  1. Zakrzewski, W., Dobrzyński, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 68(2019).
  2. Humes, H. D. Stem cells: the next therapeutic frontier. Trans Am Clin Climatol Assoc. 116, discussion 183-164 167-184 (2005).
  3. Sugarman, J. Ethical issues in stem cell research and treatment. Cell Res. 18 (1), S176(2008).
  4. Weiss, M., Troyer, D. Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev. 2 (2), 155-162 (2006).
  5. Kim, D., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  6. Ellis, H. Anatomy of fetal circulation. Anesth Intensive Care Med. 6 (3), 73(2005).
  7. Cook, H. J. Thomas Wharton's adenographia, first published in London in 1656. Med Hist. 42 (3), 411-412 (1998).
  8. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Handbook of Stem Cell Therapy. , Springer. Singapore. (2022).
  9. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: a meta-analysis study. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 484(2020).
  10. Nabil, M., Kassem, D. H., Ali, A. A., El-Mesallamy, H. O. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate cognitive impairment in Alzheimer's disease rat model: emerging role of SIRT1. BioFactors. 49 (6), 1121-1142 (2023).
  11. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  12. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles: a potential game changer for the COVID-19 crisis. Front Cell Dev Biol. 8, 587866(2020).
  13. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), 886(2019).
  14. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. J Cell Biochem. 123 (5), 906-920 (2022).
  15. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: achievements and challenges. Front Cell Dev Biol. 8, 16(2020).
  16. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2009).
  17. Troyer, D., Weiss, M. Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  18. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  19. Batsali, A., Kastrinaki, M., Papadaki, H., Pontikoglou, C. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications. Curr Stem Cell Res Ther. 8 (2), 144-155 (2013).
  20. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  21. Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells. JoVE. (186), e63348(2022).
  22. Da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P., Nardi, N. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119 (11), 2204-2213 (2006).
  23. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21 (2), 216-225 (2014).
  24. Shetty, P., Cooper, K., Viswanathan, C. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix, cord blood, and bone marrow mesenchymal stem cells. Asian J Transfus Sci. 4 (1), 14-24 (2010).
  25. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., Mesallamy, H. O. E. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regen Med. 10 (7), 841-855 (2015).
  26. Sibov, T. T., et al. Mesenchymal stem cells from umbilical cord blood: parameters for isolation, characterization and adipogenic differentiation. Cytotechnology. 64 (5), 511-521 (2012).
  27. Arutyunyan, I., Elchaninov, A., Makarov, A., Fatkhudinov, T. Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy. Stem Cells Int. 2016, 6901286(2016).
  28. Knudtzon, S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood. 43 (3), 357(1974).
  29. Fong, C., et al. Human Wharton's jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 7 (1), 1-16 (2011).
  30. El Omar, R., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell based therapies. Tissue Eng Part B Rev. 20, 523-544 (2014).
  31. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): a comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  32. La Rocca, G., et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 131 (2), 267-282 (2009).
  33. Moffett, A., Loke, Y. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal. Placenta. 25 (1), 1-8 (2003).
  34. Chao, K., Chao, K., Fu, Y., Liu, S. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 3 (1), e1451(2008).
  35. Tsai, P., et al. Transplantation of insulin-producing cells from umbilical cord mesenchymal stem cells for the treatment of streptozotocin-induced diabetic rats. J Biomed Sci. 19, 47(2012).
  36. Chatzistamatiou, T., et al. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood. Transfusion. 54 (12), 3108-3120 (2014).
  37. Newton, W. C., Kim, J. W., Luo, J. Z. Q., Luo, L. Stem cell-derived exosomes: a novel vector for tissue repair and diabetic therapy. J Mol Endocrinol. 59 (4), R155-R165 (2017).
  38. Wei, W., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising biological tool in nanomedicine. Front Pharmacol. 11, 590470(2021).
  39. Bjorge, I. M., Kim, S. Y., Mano, J. F., Kalionis, B., Chrzanowski, W. Extracellular vesicles, exosomes and shedding vesicles in regenerative medicine-a new paradigm for tissue repair. Biomater Sci. 6 (1), 60-78 (2018).
  40. Zhang, K., Cheng, K. Stem cell-derived exosome versus stem cell therapy. Nat Rev Bioeng. 1 (9), 608-609 (2023).
  41. Colao, I. L., Corteling, R., Bracewell, D., Wall, I. Manufacturing exosomes: a promising therapeutic platform. Trends Mol Med. 24 (3), 242-256 (2018).
  42. Zheng, W., et al. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun. 14 (1), 4734(2023).
  43. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  44. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  45. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of Flow Cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration. , Wiley-Blackwell. (2010).
  46. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 108(2016).
  47. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  48. Xu, Y., et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by a novel explantation technique can differentiate into functional endothelial cells and promote revascularization. Stem Cells Dev. 19 (10), 1511-1522 (2010).
  49. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  50. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  51. Hua, J., et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix: proliferation and multilineage differentiation as compared to mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Cell Biol Int. 38 (2), 198-210 (2013).
  52. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Curr Protoc Stem Cell Biol. 48 (1), e68(2019).
  53. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplant. 27 (1), 181-193 (2018).
  54. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  55. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell Tissue Res. 372 (1), 91-98 (2018).
  56. Börger, V., et al. Mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles and their potential as novel immunomodulatory therapeutic agents. Int J Mol Sci. 18 (7), 1450(2017).
  57. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  58. Kou, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool. Cell Death Dis. 13 (7), 580(2022).
  59. Huang, L., et al. Research advances of engineered exosomes as drug delivery carrier. ACS Omega. 8 (46), 43374-43387 (2023).
  60. Sun, Y., et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes for drug delivery. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 561(2021).
  61. Chopra, N., et al. Biophysical characterization and drug delivery potential of exosomes from human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. ACS Omega. 4 (8), 13143-13152 (2019).
  62. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2023).
  63. Kamei, N., et al. Comparative study of commercial protocols for high recovery of high-purity mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle isolation and their efficient labeling with fluorescent dyes. Nanomedicine. 35, 102396(2021).
  64. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, 31-45 (2015).
  65. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12184(2022).
  66. Manning, R. R., et al. Analysis of peptides using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4). J Pharm Sci. 110 (12), 3969-3972 (2021).
  67. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 131(2018).
  68. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells Int. 2020, 8898221(2020).
  69. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  71. Witwer, K. W., et al. Updating MISEV: evolving the minimal requirements for studies of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 10 (14), e12182(2021).

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