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Methodenartikel

Züchtung eines Mukoviszidose-relevanten polymikrobiellen Biofilms zur Untersuchung von Phänotypen in der Gemeinschaft

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DOI:

10.3791/66785

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19. April 2024

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein lungenrelevantes Polymikrobien-Biofilmmodell für Mukoviszidose (CF) mit vier Spezies, mit dem die Auswirkungen bakterieller Wechselwirkungen zwischen den Spezies untersucht werden können.

Zusammenfassung

Den meisten In-vitro-Modellen fehlt die Fähigkeit, bakterielle Phänotypen, die sich aus den komplexen Wechselwirkungen ergeben, die in realen Umgebungen beobachtet werden, vollständig zu untersuchen. Dies gilt insbesondere im Zusammenhang mit schwer zu behandelnden, chronischen und polymikrobiellen Biofilm-basierten Infektionen, die in den Atemwegen von Personen mit Mukoviszidose (CF), einer genetischen Multiorganerkrankung, nachgewiesen werden. Während mehrere Mikrobiomstudien die mikrobiellen Zusammensetzungen definiert haben, die in den Atemwegen von Menschen mit CF (pwCF) nachgewiesen wurden, haben bisher keine In-vitro-Modelle kritische CF-relevante Lungenmerkmale vollständig integriert. Daher besteht eine erhebliche Wissenslücke bei der Untersuchung der Mechanismen, die die Pathogenese von gemischten CF-Lungeninfektionen antreiben. Hier beschreiben wir ein kürzlich entwickeltes mikrobielles Gemeinschaftsmodell mit vier Spezies, darunter Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis und Prevotella melaninogenica , die unter CF-ähnlichen Bedingungen gezüchtet wurden. Durch die Nutzung dieses Systems wurden klinisch relevante Phänotypen wie die antimikrobielle Widerspenstigkeit verschiedener Krankheitserreger beobachtet und auf molekularer Ebene untersucht. Der Nutzen dieses In-vitro-Modells liegt in seinem standardisierten Arbeitsablauf, der die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen den Spezies im Zusammenhang mit chronischen CF-Lungeninfektionen erleichtern kann.

Einleitung

Strategien, die darauf abzielen, krankheitserregende Mikroben auszurotten, wie sie in den Atemwegen der Mukoviszidose (CF), einer genetischen Multiorganerkrankung, nachgewiesen wurden, scheitern oft1. Das heißt, das Vorhandensein von widerstandsfähigen biofilmartigen mikrobiellen Gemeinschaften, die in der schleimreichen CF-Lungenumgebung wachsen, kann chronische Infektionen verursachen, die sich über mehrere Jahrzehnte erstrecken2. Obwohl der Einsatz von antimikrobiellen Mitteln (Abx) und Modulatoren zu verbesserten Ergebnissen bei Patienten mit Mukoviszidose (pwCF) geführt hat, war der klinische Ansatz "ein Bug, eine Infektion", der typischerweise gegen kanonische CF-Erreger wie Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus eingesetzt wird, unwirksam bei der Lösung schwer zu behandelnder Infektionen, die in der Lunge dieser Personen festgestellt wurden 3,4. 5,6,7.

In den letzten zwei Jahrzehnten haben mehrere Studien unser Verständnis der chronischen CF-Lungenerkrankung verändert8. Das heißt, Berichte deuten darauf hin, dass Infektionen, die in den Atemwegen von pwCF nachgewiesen werden, nicht nur durch einen einzigen Erreger verursacht werden, sondern von Natur aus polymikrobiell sind8. Obwohl die Pathogenese von CF-Lungeninfektionen gemischter Spezies noch wenig verstanden ist, zeigen klinische Beweise, dass pwCF, die sowohl mit S. aureus als auch mit P. aeruginosa in ihren Atemwegen koinfiziert sind, die Lungenfunktion verschlechtert haben als Personen, die von einem dieser beiden Krankheitserreger besiedelt sind9.

Es wird angenommen, dass Wechselwirkungen zwischen CF-Erregern ein Grund dafür sind, dass polymikrobielle Biofilm-basierte Infektionen durch den Einsatz von CF-Therapeutika nicht ohne weiteres ausgerottet werden, was sich letztendlich auf die Patientenergebnisse auswirkt3. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass Wechselwirkungen zwischen Mikroben wie P. aeruginosa, S. aureus und anderen klinisch relevante Phänotypen wie die Abx-Reaktionsfähigkeit auf CF-Medikamente der Erstlinien, einschließlich Vancomycin und Tobramycin, beeinflussen können 6,10,11. Daher steht es noch aus, die derzeitigen Behandlungsstrategien zur Ausrottung von CF-Erregern im Zusammenhang mit Mischinfektionen zu überdenken.

Der Goldstandard bei der Behandlung von mikrobiellen CF-Lungeninfektionen beruht stark auf dem Einsatz von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests (AST) als Leitfaden für klinische Interventionen12. Die AST wird jedoch in der Regel unter Verwendung von bakteriellen Monokulturen durchgeführt, die in reichhaltigen und gut gemischten Kulturen gezüchtet werden, was nicht die mikrobiellen Wachstumsbedingungen widerspiegelt, die in den CF-Atemwegen nachgewiesen wurden 3,13. Angesichts der signifikanten Diskrepanz zwischen Patientenergebnissen und Behandlungserfolg befürworten klinische Berichte nun die Entwicklung neuartiger Ansätze, die kritische Merkmale der CF-Lunge integrieren12,14.

Nur wenige Studien haben CF-relevante bakterielle Multispezies-In-vitro-Systeme entwickelt, die mehr als zwei Erreger enthalten 15,16. Diese Modelle (1) spiegeln jedoch nicht vollständig die polymikrobielle und biofilmartige Natur der CF-Lunge wider und (2) verwenden keine Ernährungs- und Umweltbedingungen, die denen in den CF-Atemwegen entsprechen15,16. Durch die Auswertung großer von CF-Lungen abgeleiteter 16S rRNA-Gendatensätze und -berechnungen haben Jean-Pierre und Kollegen kürzlich ein In-vitro-Co-Kulturmodell entwickelt, das die oben genannten Merkmaleintegriert 10. Dieses System umfasst P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. und Prevotella spp., die unter CF-Atemwegs-ähnlichen Bedingungen gezüchtet und bis zu 14 Tage lang stabil sind. Die Autoren berichteten auch über ein gemeinschaftsspezifisches Wachstum von Prevotella spp. und mehrere Veränderungen in der Abx-Reaktionsfähigkeit dieser CF-Erreger durch Mechanismen, die noch identifiziert werden müssen10. Dieses handhabbare in vitro System bot auch die Möglichkeit, sich mit mechanistisch fokussierten Fragen im Zusammenhang mit der Abx-Widerspenstigkeit einer häufigen Variante von P. aeruginosa zu befassen, die häufig in den Atemwegen von pwCFnachgewiesen wurde 10. Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, der CF-Forschungsgemeinschaft einen standardisierten experimentellen Arbeitsablauf zur Verfügung zu stellen, um einen In-vitro-Biofilm zu züchten, der das Potenzial hat, weiter ausgebaut zu werden, um eine Reihe von CF-relevanten Fragen zu beantworten.

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Protokoll

Die Details zu allen Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von künstlichem Sputummedium

HINWEIS: In diesem Protokoll wird künstliches Sputummedium (ASM) definiert als das CF-relevante Medium, das von SCFM2 modifiziert wurde und zuvor von Turner und Kollegenveröffentlicht wurde 17. Im Folgenden finden Sie eine Beschreibung der Schritte zur Vorbereitung dieses Mediums. Siehe Materialtabelle zur Herstellung von Stammlösungen und Lagerbedingungen. Diese Version von ASM unterscheidet sich von Turner et al.,17 dadurch, dass die Pufferkapazität in der Originalversion keinen stabilen pH-Wert über die Zeit zulässt. Das heißt, die Fermentationsaktivität von Streptococcus spp. und Anaerobiern wie Prevotella spp. führt zu einer Versauerung des Wachstumsmediums (unveröffentlichte Beobachtungen). Daher wurde die Konzentration von 3-Morpholinopropan-1-sulfonsäure (MOPS) von 10 mM auf 100 mM angepasst.

HINWEIS: Die Herstellung einer 2x ASM Base (ASMb) Stammlösung erleichtert die Zugabe von Komponenten wie Mucin, Agar, Wasser usw., ohne die Endkonzentration der in ASM10,18 enthaltenen Moleküle zu beeinflussen. Der 2x ASMb kann vorab zubereitet und bei 4 °C bis zu zwei Wochen dunkel gelagert werden. Wenn das Medium gelb wird, verwerfen.

  1. Zur Zubereitung von 2x ASM-Grundstoff in einem sauberen Becherglas mit 400 mL diH2O unter Rühren folgendes zugeben:
    1. 6,50 mL von 0,2 M NaH2PO4 zugeben. H2O Schaft; 6,25 mL eines 0,2 M Na2HPO4 Stammes; 348 μl eines 1 M KNO3-Stoffes ; 1,084 mL eines 0,25 M K2SO4 Stammes.
    2. Fügen Sie 4,0 g synthetisches Hefe-Dropout ohne Tryptophan hinzu; 3,032 g NaCl; 20,92 g MOPS; 1,116 g KCl und 0,124 g NH4Cl.
    3. Fügen Sie 9,30 mL eines 1 M L-Milchsäurestocks hinzu; 2,70 mL eines 1,1 M Glukosestocks; 1,75 mL eines 1 M CaCl 2,2H 2O Vorrats; 1,20 mL eines 0,25 MN-Acetylglucosamin-Bestands und 1,00 mL eines 3,6 mM FeSO4,7H 2 O Stammes.
    4. 660 μl eines 0,1 M Tryptophan-Stammes zugeben; 606 μl eines 1 M MgCl2,6H 2O Stammes; 0,60 g Desoxyribonukleinsäure aus Heringsspermien; 400 μl eines 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)-Stammes von 250 mg/ml.
    5. Sobald alle Komponenten hinzugefügt wurden, stellen Sie den pH-Wert mit einem 5 M NaOH-Stamm auf 6,80 ein. Mit diH2O auf 500 mL auffüllen. Mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
  2. Zur Herstellung einer 10 mg/ml (2x) Muzinbrühe verwenden Sie eine saubere Glasflasche mit 250 ml diH2O und rühren Sie um:
    1. Fügen Sie 5,0 g Muzin aus dem Schweinemagen - Typ II hinzu. Die Suspension 10 min lang mischen. Vollständig auf 500 mL mit diH2O.
    2. Durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 min sterilisieren. Bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahren.
  3. Rekonstituieren Sie die ASM.
    HINWEIS: Dieser Schritt muss am Tag des Experiments durchgeführt werden.
    1. Mischen Sie ein Volumenverhältnis von 1:1 aus dem 2x ASMb-Stamm und dem 10 mg/mL Mucin-Stamm.
    2. Vor Gebrauch gründlich vortexen.

2. Vorbereitung von selektiven Medien für die polymikrobielle Gemeinschaft

HINWEIS: Nachfolgend sind die Mengen aufgeführt, die zur Vorbereitung eines Volumens von 1 l Medium erforderlich sind.

  1. Befolgen Sie zur Zubereitung von Mannitol-Salz-Agar (MSA) und Pseudomonas-Isolations-Agar (PIA) die Anweisungen des Herstellers.
  2. Um Prevotella Selective Agar (PSA) in einer sauberen Glasflasche zuzubereiten, fügen Sie Folgendes hinzu:
    1. 30,0 g tryptische Sojabrühe (TSB). 15,0 g Agar. 5,00 g Hefeextrakt. 0,50 g L-Cysteinhydrochlorid.
    2. 10,0 mL einer 0,5 mg/ml-Hämin-Brühe. 100 μl eines Menadion-Stammes von 10 mg/ml.
    3. 940 mL diH2O zugeben und umrühren. Durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 min sterilisieren.
    4. Nach dem Abkühlen (d. h. die Flasche kann mit bloßen Händen gehalten werden) unter Rühren 50,0 ml defribriertes Schafsblut hinzufügen. 2,00 ml einer Kanamycin-Brühe von 50 mg/ml. 150 μl einer 50 mg/ml-Vancomycin-Brühe. 500 μl einer 10 mg/ml-Polymixin-B-Brühe.
  3. Zur Zubereitung von Streptococcus Selective Agar (SSA) in einer sauberen Glasflasche fügen Sie Folgendes hinzu:
    1. 30,0 g TSB. 15,0 g Agar.
    2. 950 mL diH2O zugeben und umrühren. Durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 min sterilisieren.
    3. Nach dem Abkühlen (d. h. die Flasche kann mit bloßen Händen gehalten werden) unter Rühren 50,0 ml defribriertes Schafsblut hinzufügen. 1,00 ml einer 10 mg/ml Polymixin B-Brühe. 1,00 ml eines 10 mg/ml-Oxolinsäurestocks.
      HINWEIS: In Teller einfüllen und maximal 1 Monat bei 4 °C aufbewahren. Lassen Sie die Platten vor der Verwendung bis zu 24 h vorher bei Raumtemperatur trocknen, bevor sie geimpft werden. PSA wurde mit P. melaninogenica und Prevotella intermedia validiert. SSA wurde mit S. sanguinis und der Streptococcus milleri-Gruppe (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius und Streptococcus anginosus, bezeichnet als SMG) validiert. Es wird dringend empfohlen, diese selektiven Medien de novo zu validieren, wenn neue Stämme getestet werden sollen.

3. Vorbereitung und Wachstumsbedingungen für bakterielle flüssige Medien

  1. Um routinemäßig P . aeruginosa und S. aureus zu züchten, verwenden Sie ein steriles, reichhaltiges Medium (z. B. Lysogenbrühe (LB) oder TSB).
    1. Beginnen Sie mit der Flüssigkeit über Nacht, indem Sie eine einzelne Kolonie auswählen, die zuvor 20-24 Stunden lang bei 37 °C auf einer LB/TSB-Agarplatte gezüchtet wurde.
    2. Ziehen Sie die Brühenkulturen über Nacht bei 37 °C heran und schütteln Sie sie bei 250 U/min für 16-18 Stunden.
  2. Um Streptococcus spp. zu züchten, verwenden Sie sterile Todd Hewitt Bouillon, die mit 0,5 % Hefeextrakt (THB-YE) ergänzt wird.
    1. Starten Sie die Flüssigkultur über Nacht aus einem einzelnen Volk, das zuvor auf einer TSB-Agarplatte, ergänzt mit 5 % defibriertem Schafsblut (Blutagarplatte), für 24 h bei 37 °C + 5 % CO2 gezüchtet wurde.
    2. Ziehen Sie die THB-YE-Kulturen anaerob oder bei 37 °C + 5% CO2 über Nacht an, ohne sie 18-22 h lang zu schütteln.
  3. Für den Anbau von Prevotella spp. bereiten Sie 1 l Prevotella Wachstumsmedium (PGM) vor, indem Sie Folgendes in eine saubere Flasche geben:
    1. 30,0 g TSB. 5,00 g Hefeextrakt. 0,50 g L-Cysteinhydrochlorid. 10,0 ml eines 0,5 mg/ml-Häminstocks und 100 μl eines 10 mg/ml-Menadionstocks.
    2. 990 mL diH2O zugeben. Durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 min sterilisieren. Wickeln Sie die Flasche in Alufolie ein, um sie vor Licht zu schützen.
    3. Prevotella spp.-Kolonien werden auf einer Blutagarplatte gezüchtet, die anaerob bei 37 °C für 48 h inkubiert wird.
    4. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie mit PGM und wachsen Sie über Nacht ohne Schütteln bei 37 °C anaerob für 24 Stunden.
      HINWEIS: PGM kann bis zu zwei Wochen bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Es wird dringend empfohlen, vor der Verwendung Sterilitätstests an jedem Wachstumsmedium durchzuführen. Wenn keine anaerobe Kammer verwendet wird, kann es notwendig sein, über Nacht mit Flüssigkeit von Prevotella spp. aus einem Fleck von Kolonien zu beginnen.

4. Vorbereitung des Co-Kultur-Experiments

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt einen zusammengefassten experimentellen Arbeitsablauf. Der Aufbau des Experiments kann unter oxischen Bedingungen erfolgen, wenn die Vorbereitungszeit weniger als 1 h beträgt. Wenn zu erwarten ist, dass es länger dauert, wird dringend empfohlen, den Versuch in einer anaeroben Kammer (mit 10 % CO2, 10 % H2 und 80 % N2 Mischgas) durchzuführen. Anaerobe Gläser können auch zur Inkubation der Versuchsproben verwendet werden.

  1. Vorbereitung der Monokulturen und Co-Kulturen
    HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 10.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur durch. Mischen Sie für die Co-Kulturen die Bakterienproben kurz vor dem Beimpfen der 96-Well-Platten. In der Regel wird ein Volumen von 1 ml für P. aeruginosa - und S. aureus-Stämme aus den Übernachtkulturen entnommen. Bei Streptococcus spp. und Prevotella spp. können die Übernachtvolumina zwischen 2-4 ml variieren. Diese Volumina können je nach Anzahl der zu testenden Bedingungen angepasst werden.
    1. Führen Sie unter Verwendung der Bakterienflüssigkeit aus den Übernachtkulturen die folgenden Schritte durch:
      1. Bei P. aeruginosa - und S. aureus-Stämmen zweimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
      2. Bei Streptococcus spp. und Prevotella spp. einmal mit sterilem PBS waschen.
        HINWEIS: Verwenden Sie eine Pipette, um Überstände vorsichtig zu entsorgen, da die Pellets leicht verloren gehen können.
      3. Nach den Wäschen resuspendieren Sie jedes Pellet in 1 ml 1x wasserverdünntem ASMb.
      4. Nehmen Sie eine Verdünnung von 1:10 jeder Probe in sterilem PBS vor und messen Sie den OD600.
      5. Passen Sie alle Kulturen an einen OD600 von 0,2 in ASM an.
      6. Unter Verwendung der Suspensionen OD600 = 0,2 werden die Bakterienproben in ASM auf einen endgültigen OD600 von 0,01 (für jede Mikrobe) für die Monokulturen und Cokulturen verdünnt.
      7. 5 s lang gründlich vortexen.
        HINWEIS: Um beispielsweise insgesamt 1 ml P . aeruginosa Monokultur-ASM-Suspension bei OD600 = 0,01 herzustellen, fügen Sie 50 μl P. aeruginosa bei OD600 = 0,2 zu einem Volumen von 950 μl ASM hinzu. Für die Co-Kultur werden je 50 μl der Suspensionen von P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. und Prevotella spp. bei einem OD600 = 0,2 entnommen und auf 800 μl ASM gegeben.
      8. Geben Sie mit einer Pipette 100 μl der Monokultur- und Cokultursuspensionen in drei separate Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Kunststoffplatte mit flachem Boden.
      9. Die Platte (ohne Schütteln) 24 Stunden lang bei 37 °C unter anoxischen Bedingungen inkubieren.
        HINWEIS: Hier können auch andere Sauerstoffspannungen (z.B. Mikroxie, Normoxie) verwendet werden. Das Modell wurde jedoch unter anoxischen Bedingungen entwickelt und validiert. Bestätigen Sie die Anfangsinokula durch serielles Verdünnen der Mono- und Co-Kultur-Bakteriensuspensionen und Plattieren auf PIA, MSA, SSA und PSA wird dringend empfohlen. Die angestrebte Ausgangskonzentration für jede Bakterienart beträgt 1 × 107 KBE/ml (P. aeruginosa), 3,5 × 106 KBE/ml (S. aureus), 1,2 × 106 KBE/ml (Streptococcus spp.) und 4,6 × 106 KBE/ml (Prevotella spp.). Bakterielle Inokula kann auch modifiziert werden, wie von Jean-Pierre und Kollegenbeschrieben 10.
  2. Tauschen Sie das Medium nach der Biofilmbildung aus.
    1. Nach 24 Stunden Inkubation werden die nicht gebundenen (planktonen) Zellen durch Aspiration mit einer Mehrkanalpipette entfernt.
    2. Füllen Sie die vorgeformten Biofilme mit 100 μl frischem ASM oder der gewünschten Behandlung (z. B. Antibiotika, Metaboliten usw.) auf.
    3. Die Platte wird weitere 24 Stunden bei 37 °C unter anoxischen Bedingungen inkubiert.
      HINWEIS: Diese Schritte können aerob durchgeführt werden, wenn sie schnell ausgeführt werden (d. h. weniger als 1 Minute). Andernfalls verwenden Sie bitte eine anaerobe Kammer.

5. Entnahme und Beschichtung der Proben

  1. Nach den zusätzlichen 24 Stunden Inkubation aspirieren Sie die nicht gebundenen (planktonen) Zellen mit einer Mehrkanalpipette.
    HINWEIS: Die planktonische Fraktion kann aufbewahrt, seriell verdünnt und auf selektiven Medien plattiert oder verworfen werden.
  2. Waschen Sie die Biofilme zweimal vorsichtig mit 125 μl sterilem PBS und entsorgen Sie die Volumina.
  3. Fügen Sie 50 μl steriles PBS hinzu und lösen Sie die Biofilme, indem Sie die Zellen mit einem 96-poligen Replikator vorsichtig von der Platte abkratzen.
  4. Übertragen Sie die resuspendierten Biofilmzellen in Reihe A einer neuen sterilen 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Die 96-Well-Platte enthält steriles PBS in den Reihen B bis H.
  5. Führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der planktonischen (falls erforderlich) und Biofilmfraktionen durch.
  6. Platte 3-5 μl jeder Verdünnungsprobe auf PIA, MSA, SSA und PSA.
  7. Lassen Sie die Impfstellen trocknen.

6. Inkubation der selektiven Platten und Zählung der koloniebildenden Einheit (KBE)

  1. P. aeruginosa und S. aureus 18-20 h bei 37 °C inkubieren.
  2. Streptococcus spp. 24 h lang bei 37 °C unter anoxischen Bedingungen inkubieren.
  3. Prevotella spp. 48 h lang bei 37 °C unter anoxischen Bedingungen inkubieren.
  4. Zählen Sie nach der Inkubation die Kolonien (~10-35 pro Spot) und berechnen Sie die KBE pro ml.
  5. Plotten Sie die Daten mit einem Visualisierungstool.

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Ergebnisse

Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurden mehrere Phänotypen berichtet, darunter (1) eine Verringerung der Anzahl lebensfähiger Zellen von P. aeruginosa und S. aureus , wenn sie in gemischten Planktongemeinschaften im Vergleich zu Monokulturen gezüchtet wurden, (2) eine Zunahme des polymikrobiellen Wachstums von S. sanguinis-Zellen und (3) das Wachstum von P. melaninogenica in gemischten Gemeinschaften, wie zuvor von Jean-Pierre und Kollegen...

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Diskussion

Der Nutzen dieses klinisch informierten In-vitro-Co-Kultursystems liegt in seiner Fähigkeit, polymikrobiell spezifische bakterielle Funktionen zu erkennen. Das heißt, durch die Verwendung dieses Modells haben wir mikrobielle Phänotypen berichtet, die vom gemeinschaftsspezifischen Wachstum von Prevotella spp. (Abbildung 2) bis hin zu Veränderungen in der Anfälligkeit für CF Abx in der Frontlinie von P. aeruginosa, S. aureus...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Offenlegungen.

Danksagungen

Wir danken Dr. George A. O'Toole und Dr. Thomas H. Hampton für ihre bedeutende Rolle bei der Gestaltung und Entwicklung des in vitro polymikrobiellen Gemeinschaftsmodells. Wir danken Dr. Sophie Robitaille für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Cystic Fibrosis Foundation unterstützt, der an F.J-P JEAN21F0 wurde. Abbildung 1 des Manuskripts wurde mit BioRender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Bereiten Sie eine Brühe von 250 mg/ml in Chloroform direkt in der Flasche vor. Bei -20°C aufbewahren. Endkonzentration 200 μm; g/mL in 2x ASM-Basis.
3-Morpholinpropan-1-sulfonsäure (MOPS)SigmaM1254Endkonzentration 200 mM in 2X ASM-Base.
96-poliger ReplikatorFisher Scientific05-450-9können auch Einweg-Replikatoren verwendet werden. Katze #NC1567338.
96-Well-sterile Standardplatte mit DeckelFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2,5 L Rechteckiges GlasFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Bereiten Sie eine 1 M Brühe in Wasser vor und filtern Sie die Sterilisation mit einem 0,22 μm; m Filter. Endkonzentration 3,5 mM in 2x ASM-Base.
Destriniertes SchafsblutZur Vorbereitung von Wachstumsfugen für Streptococcus und Prevotella.
Desoxyribonukleinsäure aus HeringsspermaSigmaD7290Endkonzentration 1,2 mg/mL in 2x ASM-Base.
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA1449830Bereiten Sie eine 1 mg/ml-Brühe (3,6 mM) in Wasser vor und sterilisieren Sie den Filter mit einer Sättigung von 0,22 μm; m Filter. In Alufolie eingewickelt aufbewahren. Endkonzentration 0,0072 mM in 2x ASM Base.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3Als 20%ige Brühe (1,1 M) in Wasser zubereiten und im Autoklaven sterilisieren. Endkonzentration 6 mM in 2x ASM-Base.
HeminSigma51280100 mg Hemin in 2 mL 1 M NaOH auflösen und dann das Volumen mit Wasser auf 200 mL erhöhen. In einer bernsteinfarbenen Flasche oder einer normalen Flasche, die mit Alufolie umwickelt ist, bei 4 °C aufbewahren.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Bereiten Sie einen 0,25 M Vorrat in Wasser vor und filtern Sie die Sterilisation mit einem 0,22 μm m Filter. Endkonzentration 0,54 mM in 2x ASM-Base.
KanamycinBereiten Sie eine 50 mg/ml-Stammlösung in Wasser vor. Filter sterilisieren mit einem 0,22 μ m filtrieren und bei 4 °C lagern.
KClFisher ScientificP217-500Endkonzentration 30,0 mM in 2x ASM Base.
KNO3Fisher ScientificP263-500Bereiten Sie eine 1 M Brühe in Wasser vor und filtern Sie die Sterilisation mit einem 0,22 μm m Filter. Endkonzentration 0,70 mM in 2x ASM Base.
L-CysteinhydrochloridFisher ScientificAAA1038922
L-MilchsäureSigmaL1750Bereiten Sie einen 1 M Vorrat in Wasser vor und filtern Sie die Sterilisation mit einem 0,22 μm; m Filter. pH-Wert auf 7,0 einstellen. Endkonzentration 18,6 mM in 2x ASM Base.
L-TryptophanSigmaT0254Bereiten Sie ein 0,1 M Vormaterial in 0,2 M NaOH vor und sterilisieren Sie den Filter mit einem 0,22 μ; m Filter. Im Kühlschrank bei 4 Grad aufbewahren; C in Alufolie eingewickelt. Endkonzentration 0,132 mM in 2x ASM-Base.
Mannitol Salz AgarFisher ScientificB11407Zubereiten gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
MenadionSigmaM5625Bereiten Sie eine 10 mg/ml-Stammlösung vor, die in 96-100% Ethanol gelöst ist. Bei 4 Grad konservieren; C in Alufolie eingewickelt. Vor Gebrauch vortexen.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Bereiten Sie eine 1 M Brühe in Wasser vor und sterilisieren Sie sie mit einem Filter von 0,22 μm; m Filter. Endkonzentration 1,21 mM in 2x ASM-Base.
Mucin aus dem Schweinemagen - Typ II SigmaM2378Bereiten Sie eine Brühe von 10 mg/ml (2x) in Wasser vor und mischen Sie sie gründlich, bevor Sie sie autoklavieren. Bei 4 °C halten.
Na2HPO4FisherScientific S375-500Bereiten Sie einen 0,2 M Vorrat in Wasser vor und filtern Sie ihn mit einem 0,22 μm m Filter. Endkonzentration 2,5 mM in 2x ASM Base.
N-Acetylglucosamin SigmaA8625Bereiten Sie einen 0,25 M Vorrat in Wasser vor und filtern Sie ihn mit einem 0,22 μ; m Filter. Lagerbestand gekühlt bei 4 °C aufbewahren. Endkonzentration 0,6 mM in 2x ASM-Basis.
NaClFisherScientific S271-500Endkonzentration 103,7 mM in 2x ASM-Base.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500einer 0,2 M Vorratsbrühe in Wasser und Filtrieren Sterilisieren mit einem 0,22 μm; m Filter. Endkonzentration 2,6 mM in 2x ASM-Base.
NaOHFisher ScientificS318-500Bereiten Sie eine 5 M Stammlösung vor. Zur Einstellung des pH-Werts von 2x ASM Grundmaterial.
NH4ClFisher ScientificA661-500Endkonzentration 4,6 mM in 2x ASM Base.
OxolinsäureBereiten Sie eine 10 mg/ml-Stammlösung 0,5 M NaOH vor. Filter sterilisieren mit einem 0,22 μ m filtrieren und bei 4 °C lagern.
Polymixin BBereiten Sie eine Stammlösung von 10 mg/ml in Wasser vor. Filter sterilisieren mit einem 0,22 μ m filtrieren und bei 4 °C lagern.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Herstellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
Todd Hewitt BouillonFisher ScientificDF0492-17-6Zubereiten gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
Tryptische SojabrüheFisher ScientificDF0370-17-3Zubereiten gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
VancomycinBereiten Sie eine Stammlösung von 50 mg/ml in Wasser vor. Filter sterilisieren mit einem 0,22 μ m filtrieren und bei 4 °C lagern.
HefeextraktFisher ScientificB11929
Hefe Synthetisches Dropout ohne Tryptophan SigmaY1876Endkonzentration 8,0 mg/mL in 2x ASM Base.
Es Vorbereiten

Referenzen

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
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