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Konstruktion eines orthotopen Xenotransplantatmodells für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, der das Fortschreiten der Krankheit nachahmt und die Wirkstoffaktivität vorhersagt

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DOI:

10.3791/66787

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10. Mai 2024

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1Thomas J. Long School of Pharmacy, University of the Pacific

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein orthotopes Modell für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) vorgestellt, das auf der intrapulmonalen Inokulation von multizellulären Sphäroiden von fluoreszierenden A549-iRFP-Zellen basiert. Das Modell rekapituliert klinische NSCLC-Stadien und spricht auf Cisplatin an, entsprechend der dynamischen In-vivo-Überwachung der langwelligen Fluoreszenz.

Zusammenfassung

Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist eine hochgradig tödliche Erkrankung mit einer komplexen und heterogenen Tumormikroumgebung. Derzeit rekapitulieren gängige Tiermodelle, die auf der subkutanen Inokulation von Krebszellsuspensionen basieren, die Tumormikroumgebung bei NSCLC nicht. Darin beschreiben wir ein murines orthotopes Lungenkrebs-Xenotransplantatmodell, das die intrapulmonale Inokulation von dreidimensionalen multizellulären Sphäroiden (MCS) verwendet. Konkret wurden fluoreszierende humane NSCLC-Zellen (A549-iRFP) 3 Wochen lang in 96-Well-Mikrotiterplatten mit geringer Bindung mit Kollagen kultiviert, um MCS zu bilden, die dann interkostal in die linke Lunge von athymischen Nacktmäusen inokuliert wurden, um das orthotope Lungenkrebsmodell zu etablieren.

Im Vergleich zur ursprünglichen A549-Zelllinie reagierte die MCS der A549-iRFP-Zelllinie ähnlich auf Krebsmedikamente. Das langwellige Fluoreszenzsignal der A549-iRFP-Zellen korrelierte stark mit gängigen Markern des Krebszellwachstums, einschließlich des Sphäroidvolumens, der Zellviabilität und des zellulären Proteinspiegels, und ermöglichte so eine dynamische Überwachung des Krebswachstums in vivo durch Fluoreszenzbildgebung. Nach der Inokulation in Mäuse durchlief das A549-iRFP MCS-Xenotransplantat zuverlässig Phasen, die den klinischen Stadien des NSCLC sehr ähnlich waren, einschließlich der Expansion des Primärtumors, des Auftretens benachbarter Sekundärtumoren und der Metastasen von Krebszellen in die kontralaterale rechte Lunge und entfernte Organe. Darüber hinaus reagierte das Modell auf das Benchmark-Medikament gegen Lungenkrebs, Cisplatin, mit der erwarteten Toxizität und einem langsameren Fortschreiten des Krebses. Daher würde dieses murine orthotope Xenotransplantatmodell von NSCLC als Plattform dienen, um das Fortschreiten der Krankheit zu rekapitulieren und die Entwicklung potenzieller Krebsmedikamente zu erleichtern.

Einleitung

Unter allen onkologischen Erkrankungen verursacht Lungenkrebs nicht nur den höchsten Lebensverlust, sondern fordert auch die zweithöchste Anzahl neuer Patienten pro Jahr in den USA1. Diese verheerende Malignität stellt ein großes Hindernis im modernen Gesundheitswesen dar und erfordert ein tieferes Verständnis ihrer komplizierten Biologie und wirksamere therapeutische Modalitäten2. Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) macht 85 % des Lungenkrebses aus und neigt dazu, sich zu soliden Tumoren zu entwickeln3. Eine der größten Herausforderungen bei Lungenkrebs ist die dynamische und heterogene Tumormikroumgebung, die das Fortschreiten des Krebses und das Ansprechen auf therapeutische Eingriffe tiefgreifend beeinflusst 4,5,6. Ein tieferes Verständnis des Zusammenspiels zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung in verschiedenen Stadien des NSCLC erfordert verfeinerte pathologische Modelle, die die histologischen Merkmale des NSCLC-Verlaufs rekapitulieren.

In dieser Hinsicht erweisen sich orthotope Tiermodelle als vielversprechender Weg für die NSCLC-Forschung. Im Gegensatz zu den üblicherweise verwendeten subkutanen Xenotransplantatmodellen7 weisen orthotope Modelle Krebszellen auf, die direkt in das Ursprungsorgan inokuliert werden. Bei Lungenkrebs bedeutet dies, Krebszellen direkt in das Lungengewebe zu implantieren 8,9. Folglich ahmen orthotope Modelle des Lungenkrebses die native Tumormikroumgebung, einschließlich der benachbarten Gewebe, Gefäße und Immunkomponenten, besser nach und verbessern so ihre physiologische und klinische Relevanz.

Dreidimensionale multizelluläre Sphäroide (MCS) stellen einen weiteren vielversprechenden Ansatz dar, um Merkmale der Tumorumgebung zu rekapitulieren. Die meisten Krebsarten zeichnen sich durch ihre komplexe Tumormikroumgebung aus, einschließlich der verschiedenen Zell-Zell-Interaktionen, der extrazellulären Matrix und der Gradienten in Sauerstoff und Nährstoffen10,11. Herkömmlichen 2D-Zellkulturen fehlt die räumliche und strukturelle Komplexität, um diese tumorspezifischen Merkmale zu rekapitulieren12. Im Gegensatz dazu weisen MCS geeigneter Größe eine heterogene Struktur mit einem hypoxischen und nekrotischen Kern auf, der nicht nur die intratumorale Mikroumgebung, sondern auch die physiologische Barriere gegen das Eindringen von Medikamenten rekapituliert, was ein wichtiger Mechanismus der Arzneimittelresistenz in der Krebstherapie ist 13,14,15.

Unter Ausnutzung sowohl der orthotopen Tiermodelle als auch der MCS-Kultivierungstechniken wurden MCS an immungeschwächte Mäuse geimpft, um erfolgreich orthotope Modelle von Brustkrebs und Prostatakrebs zu konstruieren 16,17. Darin berichten wir über die detaillierte Methodik zur Konstruktion und Charakterisierung eines murinen orthotopen Xenotransplantatmodells für Lungenkrebs. Bei dieser Methode wird die intrapulmonale Inokulation von 3D-MCS verwendet, das aus fluoreszierenden menschlichen Lungenkrebszellen (A549-iRFP) gewonnen wird18. Dieses Modell bietet eine außergewöhnliche Möglichkeit, das Fortschreiten von Lungenkrebs in vivo in Stadien zu beobachten, die eng mit den vier klinischen Stadien des NSCLC übereinstimmen. Darüber hinaus sprach der Xenotransplantatkrebs dieses Modells auf das klinisch etablierte Antilungenkrebsmedikament Cisplatin an.

Protokoll

Die Tierstudie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of the Pacific durchgeführt (Tierprotokolle 19R10 und 22R10). Für die vorliegende Studie wurden acht männliche athyme Nacktmäuse im Alter von 5-6 Wochen mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet, die mit der referenzierten Nagetierdiät gezüchtet und unter pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten wurden. Käfige, Einstreu und Trinkwasser wurden autoklaviert und regelmäßig gewechselt. Ein Schema der Tumorinokulation bei Mäusen ist in Abbildung 1 dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Etablierung einer dreidimensionalen MCS von A549-iRFP-Zellen

  1. Inkubieren Sie A549-iRFP-Zellen (humanes Lungenadenokarzinom) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C und züchten Sie sie in einem vollständigen Wachstumsmedium DMEM, das 10 % fötales Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 μg/ml Puromycin enthält.
  2. A549-iRFP-Zellen werden in 96-Well-Mikrotiterplatten mit extrem geringer Bindung und rundem Boden bei einer Aussaatdichte von 4.000 Zellen/Well mit 100 μl vollständigem Wachstumsmedium, ergänzt mit 0,3 % Kollagen, gesät.
  3. Zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatten bei 300 × g für 7 min bei 4 °C, um die MCS-Bildung zu erleichtern. Untersuchen Sie die MCS-Morphologie unter einem Mikroskop, um die Zellaggregation nach der Zentrifugation sicherzustellen.
  4. Geben Sie nach 48 h 100 μl vollständiges Wachstumsmedium in jede Vertiefung, um ein Gesamtvolumen von 200 μl Wachstumsmedium pro Vertiefung zu erreichen.
  5. Ersetzen Sie jeden zweiten Tag 100 μl Wachstumsmedium in jeder Vertiefung durch frisches, vollständiges Wachstumsmedium.

2. Charakterisierung des A549-iRFP MCS

  1. Beobachten und abbilden Sie die MCS-Morphologie mit einem Mikroskop und schätzen Sie das MCS-Volumen durch Simulation mit der referenzierten Software von MATLAB auf der Grundlage der Phasenkontrastmikroskopbilder.
    1. Öffnen Sie ein MCS-Image in der ImageJ-Software.
    2. Verwenden Sie die Freihandauswahl, um die Kante des MCS auszuwählen und sie dem ROI-Manager hinzuzufügen.
    3. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Maske erstellen.
    4. Klicken Sie auf Bearbeiten | Invertieren.
    5. Klicken Sie auf Datei | Speichern unter | Tiff.
    6. Öffnen Sie die ReViSP-Software.
    7. Öffnen Sie das gespeicherte TIFF-Bild, indem Sie auf Durchsuchen klicken.
    8. Klicken Sie auf Start , um die MCS-Simulation abzuschließen.
  2. Messen Sie das iRFP-Fluoreszenzsignal mit dem Infrarot-Bildgebungssystem am 700-nm-Kanal und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal mit Hilfe von Software (z. B. Image Studio).
    1. Öffnen Sie die Image Studio-Software.
    2. Wählen Sie auf der Registerkarte Kanäle 700 und Intensität = 5 aus.
    3. Wählen Sie auf der Registerkarte "Scansteuerung " die Option "84 μm", "Mittel", "0,0 mm" und "Bild spiegeln" aus. Behalten Sie alles andere als Standard bei.
    4. Klicken Sie auf Start , um den Scanvorgang zu starten.
  3. Bewerten und quantifizieren Sie die Zellviabilität mit dem 3D-Zellviabilitätsassay gemäß dem Herstellerprotokoll.
  4. Bewerten und quantifizieren Sie zelluläre Proteine mit dem BCA-Assay gemäß dem Herstellerprotokoll.

3. MCS-Selektion für die Tumorinokulation

HINWEIS: Nachdem MCS in sphäroide Mikroplatten ausgesät und 2-3 Wochen lang mit regelmäßigem Austausch des Wachstumsmediums gezüchtet wurden, wählen Sie MCS mit den folgenden geeigneten Eigenschaften für die Tumorinokulation aus.

  1. Betrachten Sie die MCS-Morphologie unter dem Mikroskop und wählen Sie MCS mit einer runden Form mit insgesamt glatten Kanten, aber mit 5-10 rauen Knospen (Pfeile in Abbildung 2F) und einem Durchmesser im Bereich von 700-800 μm.
  2. Messen Sie die iRFP-Fluoreszenz (siehe Schritt 2.2) und wählen Sie den MCS aus, dessen Fluoreszenzsignale innerhalb einer Standardabweichung vom Durchschnitt liegen.

4. Intrapulmonale MCS-Inokulation

HINWEIS: Verwenden Sie 70%iges Isopropylalkoholspray, um die Operationsstation und die Werkzeuge zu reinigen, bevor Sie die Tiere anfassen.

  1. Anästhesie jeder Maus mit einer IP-Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 12 mg/kg Xylazin; Kneifen Sie die Füße der Maus mit einer Pinzette zusammen, um eine vollständige Betäubung zu gewährleisten.
  2. Injizieren Sie 10 μl Buprenorphinhydrochlorid (0,3 mg/ml) subkutan, um die Schmerzen zu lindern.
  3. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
  4. Bringen Sie die Maus in eine dorsale Haltung und sichern Sie die Gliedmaßen mit Bändern in einer Streckposition.
  5. Sterilisieren Sie die hintere Haut mit Jod- und Alkoholtupferstäbchen.
  6. Schneiden Sie einen 0,5-1 cm langen Schnitt mit einer chirurgischen Schere auf der linken Rückseite (Abbildung 1B). Trennen Sie das Muskel- und Fettgewebe vorsichtig mit einer Pinzette, bis die Brustwand und die Lungenbewegung sichtbar sind.
  7. Übertragen Sie ein ausgewähltes MCS von einer Mikroplatte mit einer Pipette in eine Petrischale aus Glas, die eiskaltes PBS enthält.
  8. Befestigen Sie eine 20-g-Nadel an einer 100-μl-Glasspritze, kühlen Sie sie auf Eis vor und ziehen Sie 20 μl einer vorgekühlten Mischung aus PBS und Matrigel (1:1 v/v).
  9. Verwenden Sie die Spritze, um schnell ein MCS aus der Petrischale in einer minimalen Menge PBS-Matrigel-Mischung zu aspirieren, wobei Sie das MCS im Metallteil der Nadel belassen.
    HINWEIS: Halten Sie die Spritze und den Kolben fest im Griff, um zu verhindern, dass das MCS aus der Nadel rutscht.
  10. Führen Sie die Nadel vorsichtig vertikal zwischen zwei Rippenknochen bis zu einer Tiefe von ~3 mm ein und injizieren Sie langsam die gesamte 20 μl PBS- und Matrigel-Mischung, die das MCS enthält.
    HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige Krafteinwirkung während des Einführens, um Schäden an Lunge, Gefäßen oder Herz zu vermeiden.
  11. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und tragen Sie eine dreifache antibiotische Salbe auf die Wunde auf.
  12. Versiegeln Sie den Schnitt mit chirurgischen Klammern, die nach 2 Wochen entfernt werden sollen.
    HINWEIS: Naschen Sie den Schnitt nicht, da die Nahtlinien die Fluoreszenzbildgebung beeinträchtigen können. Die nackten Mäuse sind in der Lage, nach der Operation auf natürliche Weise zu heilen.
  13. Legen Sie das Tier auf ein Infrarot-Wärmekissen und decken Sie es mit Labortüchern ab, um die Körpertemperatur zu halten. Überwachen Sie das Tier mindestens 30-60 Minuten lang, bis es aufwacht und sich richtig bewegt.
  14. Injizieren Sie in den ersten 48 Stunden 3x täglich 10 μl Buprenorphinhydrochlorid (0,3 mg/ml) subkutan, um die Schmerzen zu lindern.

5. Postoperative Überwachung

  1. Messen Sie das Körpergewicht alle 3-4 Tage.
  2. Messen Sie das iRFP-Fluoreszenzsignal des Tumor-Xenotransplantats alle 3-4 Tage auf einem Kleintier-Bildgebungssystem im 700-nm-Kanal in vier Haltungen: links, rechts, dorsal und ventral, während die Mäuse durch Isofluran-Inhalation (Flussrate: 1,5-2 l/min Sauerstoff mit 1,5 % Isofluran) über 2-3 Minuten unter Narkose gehalten werden.
  3. Quantifizieren Sie die Netto-Fluoreszenzintensität des Xenotransplantat-Krebses in vivo mit Hilfe von Software (z. B. Image Studio).
    1. Verwenden Sie ein festes Rechteck (A1, 200 x 125 Pixel) als Probenahmefenster für den Brustbereich der Mäuse.
    2. Mit der Freihandfunktion können Sie die Form der Mäuse innerhalb des Rechtecks (A1) nachzeichnen und die Fluoreszenzintensität (F1) im Bereich A1 messen.
    3. Verwenden Sie ein weiteres kleineres Rechteck (A2, 25 x 40 Pixel), um die Hintergrundfluoreszenz (F2) der Mäuse im Oberschenkelbereich zu messen.
    4. Verwenden Sie Gleichung (1), um die Netto-Fluoreszenzintensität des Xenotransplantat-Krebses bei jeder Maus zu berechnen:
      figure-protocol-1(1)

Ergebnisse

Charakterisierung von A549-iRFP MCS
A549-iRFP MCS wurden erfolgreich in sphäroiden Mikrotiterplatten mit Hilfe von Kollagen und Zentrifugation kultiviert. Als MCS nach 1 Woche einen Durchmesser von etwa 500 μm erreichte, wurden sowohl A549 als auch A549-iRFP MCS 3 Tage lang einer Vielzahl von Krebsmedikamenten und -formulierungen ausgesetzt und dann für weitere 4 Tage in einem arzneimittelfreien Wachstumsmedium gehalten. Das A549-iRFP MCS zeigte ein Reaktionsmuster, das dem der A549-Elternzellen sehr ähnlich war. A549 und A549-iRFP MCS zeigten ähnliche Dosis-Wirkungs-Kurven und IC50-Werte wie Cisplatin, eines der Erstlinienmedikamente gegen Lungenkrebs (Abbildung 2A). Die Viabilität von A549 und A549-iRFP MCS wurde in ähnlichem Maße durch andere Krebsmedikamente oder -formulierungen gehemmt (Abbildung 2B).

Die A549-iRFP MCS wurden über einen Zeitraum von bis zu 6 Wochen anhand der iRFP-Fluoreszenz, der Zellviabilität und der zellulären Proteinspiegel überwacht. Das Volumen der MCS wurde durch Softwaresimulation auf der Grundlage der Phasenkontrastmikroskopbilder geschätzt, und die simulierte Morphologie wies ähnliche Formen auf wie diejenigen, die durch Mikroskop und Fluoreszenzsignal abgebildet wurden (Abbildung 2C). Die Zellviabilität von A549-iRFP MCS wurde mittels 3D-Zellviabilitätsassay quantifiziert und der Assay mit MCS verschiedener Größen von 350 bis 950 μm Durchmesser validiert. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen verschiedenen Volumenverhältnissen zwischen dem MCS-haltigen Wachstumsmedium und dem Assay-Reagenz sowie zwischen verschiedenen Schüttelzeiten von 5 Minuten und 10 Minuten beobachtet. (Ergänzende Abbildung S1). Alle vier Biomarker nahmen mit der Zeit zu, mit größeren Schwankungen zu späteren Zeitpunkten (Abbildung 2D). Die iRFP-Fluoreszenz zeigte starke Korrelationen mit den anderen drei traditionelleren quantitativen Messungen von MCS: Volumen (Pearson r = 0,9307, p < 0,0001), Zellviabilität (Pearson r = 0,7666, p < 0,0001) und zelluläres Protein (Pearson r = 0,7317, p < 0,0001) (Abbildung 2E).

Tumorprogression bei Mäusen
Nach 2-3-wöchigem Wachstum wurde A549-iRFP MCS mit entsprechenden Eigenschaften, einschließlich Morphologie, MCS-Durchmesser, angemessen rauen Kanten und Fluoreszenzsignal (für detaillierte Parameter siehe Protokollabschnitt 3), für die Tumorinokulation ausgewählt. Nach der Tumorinokulationsoperation wurde das Körpergewicht der tumortragenden Mäuse alle 3 Tage gemessen und als Veränderungsverhältnis im Vergleich zum Gewicht am Tag 0 direkt vor der Operation dargestellt. Das Körpergewicht der Maus nahm nach der Operation leicht ab und erholte sich innerhalb von 1 Woche schnell. Ohne Behandlung nahm das Körpergewicht allmählich bis ~Tag 40 zu, nahm aber in der folgenden Woche drastisch ab (~15%), was zur Euthanasie (dreifache Überdosierung von Anästhetika: 80 mg/kg Ketamin und 12 mg/kg Xylazin über IP-Injektion) von Mäusen gemäß den IACUC-Richtlinien führte (Abbildung 3A). Tumortragende Mäuse wurden alle 3 Tage in vier Haltungen abgebildet: links, dorsal, rechts und ventral. Unter diesen wurden die linke (wo der Tumor geimpft wird) und die ventrale (wo beide Seiten der Lunge zu beobachten sind) als Schlüsselhaltungen für die Quantifizierung der Netto-Fluoreszenzintensität gemäß Gleichung (1) ausgewählt (Abbildung 3B,C). Die Netto-Fluoreszenzintensität beider Haltungen zeigte einen ähnlichen Trend der Tumorprogression, wobei die Fluoreszenz von der ventralen Seite etwas langsamer wuchs als von der linken Seite.

Das MCS-Xenotransplantat in diesem orthotopen Modell durchlief unterschiedliche Phasen, die die vier klinischen Stadien des NSCLC widerspiegeln (Abbildung 3D)18,19,20. Um den 8. Tag nach der MCS-Inokulation trat in der linken Lunge eine konzentrierte Fluoreszenz auf, was auf die Etablierung eines lokalisierten Tumors im Einklang mit NSCLC im Stadium 1 im klinischen Umfeld hindeutet. Etwa am 11. Tag intensivierte sich die Fluoreszenz deutlich und/oder verteilte sich über mehrere Stellen in der linken Lunge, was auf das Vorhandensein von Tumoren hinweist, die dem NSCLC im Stadium 2 ähneln. Später, etwa am 18. Tag, wurden erhöhte Fluoreszenzsignale von der ventralen Seite beobachtet, was auf eine Progression des Xenotransplantats im Stadium 3 hindeutet. Darüber hinaus zeigten anatomische Untersuchungen und ex vivo-Bildgebung ein Tumorwachstum auf der Oberfläche des Herzens, ein wesentliches Kennzeichen des NSCLC im Stadium 3. Etwa am 27. Tag nach der MCS-Inokulation trat auf beiden Seiten der Lunge eine perfundierte Fluoreszenz auf, und die Anatomie des offenen Brustkorbs zeigte ein perfundiertes Tumorwachstum im Herzen, in der Luftröhre und in den wichtigsten Blutgefäßen, was auf eine Krebsmetastasierung ähnlich dem NSCLC im Stadium 4 hinweist.

Reaktion tumortragender Mäuse auf Cisplatin
An diesem orthotopen Lungenkrebs-Mausmodell wurde eine Pilotstudie zur Wirksamkeit durchgeführt. Zehn Tage nach der Tumorinokulation wurden 5 mg/kg Cisplatin oder normale Kochsalzlösung über die Schwanzvene von tumortragenden Mäusen injiziert, eine Injektion pro Woche, insgesamt zwei Injektionen. Die ventralen Bilder von tumortragenden Mäusen sind in Abbildung 4A dargestellt. Das Körpergewicht und die Tumorfluoreszenz wurden alle 3-4 Tage überwacht. Im Vergleich zur normalen Kochsalzlösung verloren die Mäuse in der Cisplatin-Gruppe nach jeder Cisplatin-Injektion signifikant an Körpergewicht, erholten sich aber in den Wochen nach der Cisplatin-Behandlung (Abbildung 4B). Die Netto-Fluoreszenzintensität in der Cisplatin-Gruppe zeigte einen langsameren Anstiegstrend als in der Kochsalzgruppe (Abbildung 4C). Am Ende des in vivo Fluoreszenzmonitorings wurden die Tiere getötet und ihre Lungen präpariert und mittels Fluoreszenz abgebildet. Nach Normalisierung durch das Gesamtgewebeprotein wurde bestätigt, dass die Fluoreszenzintensität der Lunge, die von Mäusen der Cisplatin-Gruppe präpariert wurde, niedriger war als die der normalen Kochsalzlösungsgruppe. (Abbildung 4E). In der ventralen Fluoreszenzbildgebung (Abbildung 4A) zeigen die Bilder in den roten Rechtecken das erste Mal, dass die Tumorfluoreszenz sowohl in der linken als auch in der rechten Lunge sichtbar gemacht wurde, was ein Schlüsselindikator für die Tumormetastasierung im Stadium IV des NSCLC ist. Cisplatin, eines der Erstlinienmedikamente gegen Lungenkrebs, verlangsamte die Tumormetastasierung von der linken Lunge zur rechten Lunge (Abbildung 4D).

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Abbildung 1: Flussdiagramm der Studie. (A) Aussaat von A549-iRFP-Zellen in sphäroide Mikrotiterplatten, um MCS mit Hilfe von Kollagen und Zentrifugation zu bilden. (B) Intrapulmonale Inokulation von A549-iRFP MCS mit geeigneten Merkmalen in die linke Lunge einer Maus, um das orthotope Lungenkrebs-Xenotransplantatmodell zu konstruieren, das die vier Stadien von Lungenkrebs im klinischen Umfeld nachahmt. Die weiße Spritze mit einer MCS zeigt die Tumorimpfung an, während die beiden roten Spritzen eine medikamentöse Behandlung anzeigen, die über die Schwanzvene verabreicht wird. Abkürzung: MCS = multizelluläres Sphäroid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Charakterisierung von A549-iRFP MCS. (A) Dosis-Wirkungs-Kurven von A549-iRPF MCS und A549 MCS zu Cisplatin nach 3-tägiger Exposition und 4-tägigem medikamentenfreiem Wachstum (Mittlere ± SD, N = 3-4). (B) Zellviabilität von A549-iRFP MCS nach 3-tägiger Exposition gegenüber Krebsbehandlungen (Cisplatin, Paclitaxel oder zwei selbst entwickelte Arzneimittelformulierungen) und 4-tägigem arzneimittelfreiem Wachstum (Mittlere ± SD, N = 3-4). (C) Morphologische Untersuchungen des repräsentativen A549-iRFP MCS nach 1-6 Wochen Kultivierung mittels Kontrastphasenmikroskopie (C1, Maßstabsbalken = 500 μm), Fluoreszenzkonfokalmikroskopie (C2) und Softwaresimulation (C3). (D) Dynamische Änderung der iRFP-Fluoreszenz, des Volumens, der Zellviabilität und des zellulären Proteins von A549-iRFP MCS über 1-6 Wochen (N = 10 für iRFP-Fluoreszenz und -Volumen; N = 5 für Zellviabilität und zelluläres Protein). (E) Korrelation der iRFP-Fluoreszenz von A549-iRFP MCS mit den anderen drei traditionellen Wachstumsmessungen (Volumen, Zellviabilität und zelluläres Protein) über 1-6 Wochen (N = 60). (F) Ein Beispiel für A549-iRFP MCS mit geeigneten Eigenschaften für die Tumorinokulation (Maßstabsbalken = 500 μm). Abkürzung: MCS = multizelluläres Sphäroid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Tumorprogression im orthotopen Mausmodell des NSCLC. (A) Veränderung des Körpergewichts von Mäusen nach Tumorinokulation (Mittelwert ± SEM, N = 5). (B) Dynamische Änderung der Netto-Fluoreszenzintensität bei tumortragenden Mäusen basierend auf der linken Bildgebung (N = 5). (C) Dynamische Änderung der Netto-Fluoreszenzintensität bei tumortragenden Mäusen basierend auf ventraler Bildgebung (N = 5). (D) Krebsprogression, die die vier klinischen Stadien von NSCLC nachahmt. Bildgebung auf der linken Seite, Bildgebung auf der ventralen Seite, anatomische Beobachtung (gelbe Pfeile zeigen Tumore in der Lunge und auf der Herzoberfläche) und Ex-vivo-Bildgebung von repräsentativen tumortragenden Mäusen in vier Stadien. Diese Abbildung stammt von Huang et al.18. Abkürzung: NSCLC = nicht-kleinzelliger Lungenkrebs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Die Reaktion tumortragender Mäuse auf Cisplatin. (A) Ventralseitige Bildgebung von tumortragenden Mäusen nach Behandlung mit Kochsalzlösung oder Cisplatin (Bilder in roten Rechtecken zeigen, wann die Tumorfluoreszenz sowohl in der linken als auch in der rechten Lunge zum ersten Mal sichtbar gemacht werden kann). (B) Veränderung des Körpergewichts von tumortragenden Mäusen nach Kochsalz- oder Cisplatinbehandlungen (Mittelwert ± SEM, N = 3-4). (C) Dynamische Änderung der Netto-Fluoreszenzintensität bei tumortragenden Mäusen nach Kochsalzlösung oder Cisplatin-Behandlung basierend auf ventraler Bildgebung (Mittelwert ± SEM, N = 3-4). (D) Prozentsatz der Mäuse, die Tumorfluoreszenz sowohl in der linken als auch in der rechten Lunge zeigten. (E) Normalisierte Fluoreszenzintensität von Lungen, die von Mäusen präpariert wurden, die am Ende der in vivo Fluoreszenzbildgebung getötet wurden (Mittelwert ± REM, N = 3-4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: 3D-Zellviabilitätsassay auf A549-iRFP MCS mit verschiedenen Durchmessern. (A) ~350 μm; (B) ~550 μm; (C) ~750 μm; (D) ~950 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Konstruktion von A549-iRFP MCS ist ein unkompliziertes und hochgradig reproduzierbares Laborverfahren und kann auf die MCS-Bildung für mehrere Zelllinien übertragen werden. Das mit Hilfe von Zentrifugation und Kollagen erzeugte MCS weist innerhalb von 3-4 Tagen eine integralere und solidere, tumorähnliche Struktur auf. Diese Methode gewährleistet die Bildung robuster Sphäroide, die ihre integrale Struktur über längere Zeiträume beibehalten, typischerweise 2-3 Wochen oder sogar länger, bis kleine Knospen zu schlüpfen beginnen. Durch den Einsatz von Zentrifugation und Kollagen haben wir die Bildung von MCS standardisiert und ihre Konsistenz und Zuverlässigkeit in unserem experimentellen Modell sichergestellt. Dieser Ansatz verbessert die Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse und minimiert die Variabilität in der Kinetik des Tumorwachstums, wodurch eine robustere Plattform für die Untersuchung der Tumorbiologie und therapeutischer Interventionen geschaffen wird.

Im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Monolayer-Zellkulturen kann die 3D-MCS über einen viel längeren Zeitraum wachsen, in dieser Studie mindestens 6 Wochen. Um das Wachstum und Fortschreiten der Krebserkrankung zu überwachen, ist eine dynamische, quantitative Langzeitmessung von großem Nutzen. Viele bestehende 3D-MCS-Assays sind während der Messungen destruktiv, was ihren Nutzen für Langzeitauswertungen einschränkt. Die zerstörungsfreie Natur der Messung der iRFP-Fluoreszenzsignale ermöglicht eine kontinuierliche und langfristige Überwachung des Krebszellwachstums in 3D-MCS. Diese Funktion ist besonders wertvoll, um die Auswirkungen einer chronischen Exposition gegenüber Krebsmitteln zu beurteilen und die dynamische Entwicklung von Krebszellen im Laufe der Zeit zu erfassen. Die iRFP-Fluoreszenzsignale, die vom A549-iRFP 3D MCS emittiert wurden, zeigten eine starke Korrelation mit herkömmlichen quantitativen Messungen des Sphäroidwachstums, einschließlich des Sphäroidvolumens, der Zellviabilität und des zellulären Proteingehalts. Dies unterstreicht die Zuverlässigkeit der Fluoreszenzsignale als Proxy für die Beurteilung des Wachstums von Krebszellen bei MCS. Die lange Wellenlänge der iRFP-Fluoreszenzsignale ermöglicht die Quantifizierung des Krebswachstums und des Fortschreitens bei Kleintieren, was für die präklinische Entwicklung von Krebsmedikamenten von entscheidender Bedeutung ist.

Um die Konsistenz dieses orthotopen NSCLC-Modells zu gewährleisten, muss MCS für die intrapulmonale Inokulation sorgfältig ausgewählt werden. Eine ähnliche Größe und Fluoreszenzintensität des MCS ist erforderlich, um Schwankungen zu minimieren. Die Inokulation eines größeren MCS führt tendenziell zu einer größeren Variation in der Tumorprogression. Darüber hinaus spielt die Kontrolle der Rauheit der MCS-Oberfläche eine entscheidende Rolle bei der Reduzierung der Variation. Während einige MCS ihre glatten Kanten behielten, als sie größer wurden, zeigten andere mit zunehmendem Wachstum rauere Kanten. In unseren Händen führte das integrale, solide-tumorähnliche MCS nach 2-3 Wochen Wachstum in Zellkultur mit 5-10 Knospen an den Rändern zu einem gleichmäßigeren Tumorwachstum bei Mäusen, während solche ohne raue Kanten oder solche mit gelockerten Strukturen und zu vielen Knospen nach der Inokulation vielfältigere Muster des Tumorwachstums zeigten.

Während des Prozesses des MCS-Transfers ist es wichtig, die 20 G Nadel mit großer Sorgfalt zu behandeln. MCS sollte in der Fase oder im Metallteil der Nadel aufbewahrt werden, um mögliche Schäden zu begrenzen. Die Wahl der Nadelgröße wurde bewusst getroffen, um ein Gleichgewicht zwischen der Sicherstellung der Lebensfähigkeit des MCS während der Inokulation und der Minimierung der potenziellen Schädigung der Mauslunge zu finden. Größere Nadelgrößen könnten möglicherweise das Gewebe der Maus schädigen. Wenn MCS in der Nadel stecken bleibt oder wenn in den ersten Tagen nach der Inokulation mehrere fluoreszierende Punkte beobachtet werden, kann dies darauf hindeuten, dass das inokulierte MCS während der Inokulation beschädigt wurde. Mäuse, die diese Merkmale aufwiesen, wurden aus weiteren Studien ausgeschlossen und als erfolglos geimpft.

Die multizellulären Sphäroide (MCS) wurden aufgrund anatomischer Überlegungen in die linke Lunge und nicht in die rechte Lunge geimpft. Die linke Lunge besteht aus zwei übereinander gestapelten Lappen, die im Vergleich zur rechten Lunge, bei der drei nebeneinander angeordnete Lappen angeordnet sind, einen konsistenteren und zugänglicheren Zielbereich bieten. Auf diese Weise ermöglicht die linke Lunge eine äußerst zuverlässige Inokulation in einem bestimmten Bereich, nämlich dem oberen linken Lappen, was dazu beiträgt, Variationen bei der Entstehung und Progression des Tumors zu reduzieren.

Neben der iRFP-Fluoreszenz des Thorax dient das Körpergewicht der tumortragenden Mäuse als wichtiger bestätigender Indikator für die Tumorlast. Als der Xenotransplantat-Krebs nach der MCS-Impfung fortschreitet, zeigten die Mäuse zunächst normales Verhalten, einschließlich Essen, Trinken und Aktivitäten im Wachzustand, bis etwa zum 40. Tag, als die schwere Tumorlast, die durch eine starke iRFP-Fluoreszenz des Brustkorbs gezeigt wurde, zu einem spürbaren Abfall des Körpergewichts und dem Verlust des normalen Verhaltens führte. Nach humanen Richtlinien wurden die Tiere bei einem Körpergewichtsverlust von 15-20% eingeschläfert. Während der Zeitpunkt des Gewichtsverlusts von Generation zu Charge variierte, stimmt er mit dem Verlust des normalen Tierverhaltens überein und kann daher auch als zuverlässiger Indikator für die Tiergesundheit verwendet werden.

Die Krebsprogression im orthotopen Modell des NSCLC wurde primär durch links- und ventrale Fluoreszenzbildgebung überwacht, die ein konsistentes und stetiges Tumorwachstum nach MCS-Inokulation zeigte. Die Fluoreszenz von der ventralen Seite zeigte einen langsameren Anstieg als von der linken Seite, wahrscheinlich aufgrund von (1) der Injektionstiefe und (2) dem Vorhandensein von orthotopen und subkutanen Tumoren in fortgeschrittenen Krebsstadien. Konkret wurde das MCS durch die Rippenknochen in den Thorax inokuliert, der es auf der dorsalen Oberfläche der linken Lunge ablagerte, so dass eine Verzögerung von der Entwicklung des MCS zur ventralen Oberfläche der linken Lunge erforderlich war, um abgebildet zu werden. Mit zunehmendem Wachstum des Tumors dehnte er sich gelegentlich auf die innere Oberfläche der Brustwand aus und brachte ihn so näher an den Fluoreszenzscanner, um höhere Signale für die linksseitige Bildgebung zu liefern. Daher stellte die Fluoreszenzbildgebung auf der ventralen Seite den Tumor in der Lunge genauer dar, brauchte aber in der Regel länger, um den Tumor zu erkennen. Am Ende der in vivo Fluoreszenzbildgebung wurden die Tiere getötet und einer offenen Thoraxdissektion und einer ex vivo Bildgebung unterzogen, die nicht nur die Etablierung des orthotopen Tumors aus der MCS-Inokulation bestätigte, sondern auch mehrere anatomische Merkmale aufwies, die die vier klinischen Stadien des NSCLC beim Menschen rekapitulierten.

In der Pilot-Wirksamkeitsstudie bestätigte die starke Korrelation zwischen der ex vivo-Bildgebung der Lunge und der in vivo-Bildgebung tumortragender Mäuse die Zuverlässigkeit der dynamischen in vivo Fluoreszenzbildgebungsmethodik. Das orthotope Modell des NSCLC sprach zuverlässig auf Krebsbehandlungen an, sowohl durch das langsamere Tumorwachstum als Schlüsselindikator für die therapeutische Wirksamkeit als auch durch den Verlust des Körpergewichts als Schlüsselindikator für die Toxizität des Arzneimittels. Solche Reaktionen zeigten, dass das Modell ein wertvolles Werkzeug für die präklinische Bewertung und Entwicklung von Krebsmedikamentenkandidaten ist. Die Metastasierung, ein Kennzeichen von Lungenkrebs, wurde im Modell originalgetreu rekapituliert und vor allem durch das Krebsmedikament Cisplatin zuverlässig verhindert. In dieser Pilotstudie wurde mit nur zwei Injektionen von Cisplatin ein langsameres Tumorwachstum beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine signifikantere Antikrebswirkung von Cisplatin aus einem klinisch relevanteren Regime von vier wöchentlichen Dosen resultieren würde.

Das orthotope Modell des NSCLC in diesem Bericht weist mehrere wichtige Vorteile gegenüber einer Reihe gängiger Tiermodelle für Lungenkrebs auf. Im Vergleich zu den subkutanen Xenotransplantatmodellen des Lungenkarzinoms bietet dieses Modell eine relevantere Gewebemikroumgebung um die Tumoren herum; Im Vergleich zum gentechnisch veränderten Mausmodell bietet dieses Modell bequemere experimentelle Verfahren und eine reproduzierbarere Tumorprogression und das Überleben der Tiere. Einen umfassenden Vergleich zwischen diesem Modell und anderen Modellen von Lungenkrebs finden Sie in unserer Vorgängerpublikation18. Ähnlich wie bei anderen Xenotransplantat-Tiermodellen ist eine Einschränkung dieses Modells das Fehlen eines vollständigen Immunsystems, das ein wichtiger Bestandteil von Krebserkrankungen beim Menschen ist. Zusätzlich entwickeln die inokulierten MCS in diesem Modell gelegentlich den primären Xenotransplantattumor auf der Innenfläche der Brustwand. Daher sollten experimentelle Verfahren zur einfachen Erkennung und Minimierung solcher Entwicklungen in zukünftige Studien einbezogen werden, um dieses Modell zu verbessern. Darüber hinaus werden Studien mit beiden Geschlechtern durchgeführt, um ein umfassenderes Verständnis der Tumorbiologie und des Therapieansprechens bei NSCLC zu erlangen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das murine orthotope Lungenkrebs-Xenotransplantatmodell dieses Berichts ein bahnbrechendes und robustes Instrument für die Rekapitulation des Lungenkrebsverlaufs und für die Bewertung von Krebsbehandlungen darstellt. Dieses Modell birgt ein immenses Potenzial, um unser Verständnis der NSCLC-Pathologie zu verbessern und die entsprechenden therapeutischen Interventionen zu entwickeln.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch SAAG- und SEED-Stipendien der University of the Pacific unterstützt. Wir danken Dr. William Chan für die Gewährung des Zugangs zum Odyssey Infrared Imaging 205 System und Dr. John Livesey für den Zugang zum SpectraMax iD3 Plattenleser. Wir danken Dr. Melanie Felmlee für die fachliche Beratung zu den Tierprotokollen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 &Mikro; L GlasspritzeHamiltonPart/REF #80601
20 G NadelThermo Fisher Scientific Inc.14 826D
96-Well-Sphäroid-Mikroplatte mit extrem geringer BindungCorning15-100-173
A549-iRFPImanis Life Sciences CL082-STAN
AIN-93M Ernährung für reife Nagetiere Forschung Diäten, Inc.
Athymic Nude MouseCharles River Laboratories, Inc.Stammcode: 490; homozygot
BCAPierce23227
Buprenorphin HydrochloridPatterson VeterinaryNDC-Nummer: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9683
KollagenGibcoA1064401 
DMEMCorningMT10013CV
Fötales Rinderserum (FBS)Cytiva HyCloneSH3039603
ImageJOpen-Source-Tool (https://imagej.net/ij/)N/A
Image Studio LI-CORVersion 5.2
IsofluranPatterson VeterinärNDC-Nummer: 17033-0091-25
KetaminPatterson VeterinärNDC-Nummer: 50989-0161-06
Mikroskop KeyenceModellnummer: BZ-X710
MatrigelCorningCB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System LI-CORModellnummer: 9140
PBSCorningMT21040CV
Pearl Trilogy Bildgebungssystem für Kleintiere LI-CORModellnummer: 9430
Penicillin-Streptomycin CorningMT30002CI
PuromycinThermo Fisher Scientific Inc.
ReViSP-Software von MATLAB Open-Source-Tool auf Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)N/A
Surgical Clips--AutoClip SystemFine Science Tools12020-00
XylazinPatterson VeterinärmedizinNDC-Nummer: 61133-6017-01
D10012MAAJ67236XF

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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