Bildgebung und Quantifizierung des hepatischen Gefäßsystems von Mäusen mittels ultraschnellem Doppler-Ultraschall

Zusammenfassung

Der ultraschnelle Dopplerultraschall (UFUS) mit hoher räumlicher Auflösung (100 μm) und Sensitivität stellt eine geeignete nichtinvasive Bildgebungsmodalität dar, um einen umfassenden qualitativen Überblick über das Lebergefäßsystem zu erhalten. UFUS erleichtert auch quantitative Messungen des Mikrovaskulatursystems und zielt darauf ab, unser Verständnis der Mechanismen von Gefäßerkrankungen zu verbessern.

Zusammenfassung

Die nicht-invasive In-vivo-Bildgebung des Gefäßsystems ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen bei Nagetieren. Um eine hochempfindliche Bildgebung der Mikrogefäße mit Hilfe von Doppler-Ultraschallverfahren zu erreichen, werden Bildgebungsmodalitäten bevorzugt, die das Konzept der ultraschnellen Bildgebung verwenden. Durch die Erhöhung der Bildrate des Ultraschallgeräts auf Tausende von Bildern pro Sekunde wird es möglich, die Empfindlichkeit des Blutflusses auf bis zu 2 mm/s zu verbessern und funktionelle Informationen über die Mikrozirkulation im Vergleich zu einer Empfindlichkeit von etwa 1 cm/s in herkömmlichen Doppler-Modi zu erhalten. Während die ultraschnelle Doppler-Ultraschall-Bildgebung (UFUS) in den Neurowissenschaften eingesetzt wurde, wo sie die Gehirnaktivität durch neurovaskuläre Kopplung erfassen kann, stellt sie bei der Darstellung des Gefäßsystems von Bauchorganen aufgrund größerer Bewegungen, die mit der Atmung verbunden sind, größere Herausforderungen dar. Die Leber, die anatomisch unter dem Zwerchfell positioniert ist, ist besonders anfällig für Bewegungen außerhalb der Ebene und oszillierende Atembewegungen. Diese Artefakte beeinträchtigen nicht nur die Doppler-Bildgebung, sondern erschweren auch die anatomische Analyse von Gefäßstrukturen und die Berechnung von Gefäßparametern. In dieser Arbeit präsentieren wir eine qualitative und quantitative bildgebende Analyse des Lebergefäßsystems bei Mäusen mittels UFUS. Wir identifizieren die wichtigsten anatomischen Gefäßstrukturen und stellen grafische Darstellungen der makroskopischen Anatomie der Leber zur Verfügung, die wir mit einer eingehenden anatomischen Beurteilung des hepatischen Gefäßsystems auf der Grundlage von Doppler-Messungen vergleichen. Darüber hinaus haben wir ein Quantifizierungsprotokoll für robuste Messungen des hepatischen Blutvolumens der Mikrogefäße im Zeitverlauf entwickelt. Um weitere Forschungen in Betracht zu ziehen, bietet die qualitative Gefäßanalyse einen umfassenden Überblick und schlägt eine standardisierte Terminologie für Forscher vor, die mit Mausmodellen für Lebererkrankungen arbeiten. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, Ultraschall als nicht-invasive ergänzende Methode anzuwenden, um Lebergefäßdefekte in vivo zu untersuchen und funktionelle mikrovaskuläre Veränderungen tief im Inneren des Organs zu messen, bevor Blutgefäßanomalien im Mikrometerbereich durch ex vivo-Färbung an Gewebeschnitten entschlüsselt werden.

Einleitung

Präklinische Mausmodelle werden häufig verwendet, um den Beginn und das Fortschreiten von mikrovaskulären Lebererkrankungen zu untersuchen ^1,2. Eine longitudinale Nachbeobachtung ist vorteilhaft, da in einem frühen Stadium der Erkrankung Veränderungen der Blutkapillaren auftreten, bevor Entzündungen und Fibrose auftreten, die im Laufe der Zeit zu einer Zirrhose führen können¹. Um den Krankheitsverlauf zu untersuchen, sind leistungsfähige bildgebende Verfahren unerlässlich, um die Funktion der Blutgefäße in vivo sichtbar zu machen und zu messen. Ultraschneller Doppler-Ultraschall (UFUS) stellt aufgrund seiner geringen Kosten, Portabilität, Einfachheit und Echtzeitfähigkeit, aber auch aufgrund seines nicht-invasiven und zeitsparenden Verfahrens eine geeignete Modalität^{dar 3}. Im Vergleich zum herkömmlichen Doppler-Ultraschall, der eine ähnliche räumliche Auflösung erreichen kann, aber auf große Blutflüsse beschränkt ist, ermöglicht UFUS die Detektion eines langsamen Blutflusses von 1 cm/s bis zu 2 mm/s, wodurch der Beitrag viel kleinerer Gefäße untersucht werden^{kann 4}. UFUS verbessert die Empfindlichkeit, die durch Planwellenübertragungen mit großem Sichtfeld in einer einzigen Insonifikation erreicht wird, um die Bildrate und damit die Anzahl der verfügbaren Ultraschallbilder zu erhöhen⁵. Die hohe Anzahl temporaler Proben verbessert die Auslöschung des vom Gewebe kommenden Signals und verbessert die Detektion der von den Blutstreuern reflektierten Echos, wodurch die Empfindlichkeit erhöht wird, ohne dass Kontrastmittel erforderlich sind⁶. Durch die Schätzung der Energie der Blutstreuerechos durch die Leistungsdopplerschätzung erhält man eine Größe, die proportional zum Blutvolumen in jedem Pixel ist, auch wenn die Blutgefäße zu klein sind, um im Bild aufgelöst zu werden⁷.

UFUS bietet eine günstige Kombination aus räumlicher und zeitlicher Auflösung und ist damit ein geeignetes Werkzeug für die qualitative Beurteilung der Gefäßarchitektur der Leber. Während die Bedienung eines Ultraschallgeräts relativ einfach ist, ist ein umfassendes Verständnis der Leberanatomie erforderlich, um durch das Lebergefäßsystem der verschiedenen Leberlappen bei Mäusen zu navigieren. Neuere Studien haben sich auf die Beschreibung der Mausleberanatomie und des hepatischen Gefäßbaums mittels 3D-Mikro-Computertomographie (μ-CT) ^{konzentriert8,9}. Obwohl einige der morphologischen Unterschiede zwischen der Leber von Mensch und Maus gut dokumentiert sind¹⁰, werden bei der Forschung an Nagetieren häufig anatomische Terminologien verwendet, die für den Menschen relevant sind, was zu einer gewissen Verwirrung im Zusammenhang mit vierbeinigen Tieren führt. Selbst anerkannte standardisierte Nomenklaturen, wie z. B. Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), fehlen ausreichende Informationen über konsistente Terminologien für hepatische Gefäßstrukturen von Nagetieren¹¹. Abgesehen von der Herausforderung schlecht dokumentierter anatomischer Strukturen bei Nagetieren ergeben sich noch größere Schwierigkeiten bei der Interpretation von Ultraschallanzeigen, insbesondere wenn ein reproduzierbarer Ansatz erwartet wird.

Die Gewinnung nicht-invasiver funktioneller Informationen über lebende Organe über verschiedene räumliche Skalen hinweg stellt eine Herausforderung für die in vivo-Bildgebung ^{dar 3}. High-End-Leberbildgebungsmodalitäten wie CT, Magnetresonanztomographie und Angiographie (MRT/MRA) oder konventionelle Dopplerbildgebung mit fokussierten Wellen sind für die Beurteilung des Krankheitsverlaufs unerlässlich, aber sie erfassen die meisten Blutflussdynamiken mit Ausnahme der photoakustischen Bildgebung^nicht 12,13,14. UFUS hat eine hohe Empfindlichkeit und kann einen langsamen Blutfluss in kleinen Gefäßen erkennen, die nicht auf einen Fluss von mehr als einem Zentimeter pro Sekunde beschränkt sind ^4,15. Vor kurzem haben wir ein maßgeschneidertes bildgebendes Verfahren auf Basis anatomischer Überlegungen mit UFUS entwickelt, das eine zuverlässige Messung des Leberblutvolumens in einem Mausmodell mit Gefäßausdehnung ermöglicht¹⁶.

In diesem Protokoll skizzieren wir das Verfahren zur nicht-invasiven UFUS-Bildgebung der Leber unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Ultraschallplattform, die ursprünglich für die funktionelle Bildgebung des Gehirns entwickelt wurde. Um den Prozess zu rationalisieren und die Informationsbeschaffung zu verbessern, bieten wir eine umfassende Darstellung der Mausleber mit anatomischer Nomenklatur und einer vollständigen Analysemethode an. Darüber hinaus bieten wir eine detaillierte Darstellung der erfassten Bildgebungswerte als Referenz an, die gemeinsame anatomische Strukturen und Orientierungspunkte anzeigt, um die vom Bediener abhängige Ebenenauswahl zu unterstützen. Darüber hinaus enthalten wir eine relevante Darstellung sowohl qualitativer als auch quantitativer Analysen des hepatischen Gefäßsystems.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß der europäischen Gesetzgebung (Richtlinie 2010/63/EU) und den Richtlinien der niederländischen Regierung durchgeführt und von der Tierethischen Kommission des Leiden University Medical Center genehmigt.

1. Vorbereitung der Maus für die UFUS-Bildgebung (Timing ~ 10 min)

1. Vorbereitung des Imaging-Setups
   1. Zentrifugieren Sie das Ultraschall-Transmissionsgel in 50 mL Röhrchen bei 100 x g für 3-5 min, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.
   2. Schalten Sie das Heizkissen ein und erwärmen Sie es auf 35 °C. Füllen Sie den 3D-gedruckten Wassertank mit entionisiertem Wasser.
      HINWEIS: Wasserblasen oder kleine Partikel im Wasser können die Dopplermessung stören.
2. Betäubung des Tieres
   1. Wiegen Sie das Tier. Es wurden männliche und weibliche Wurfgeschwister verwendet, die 8-16 Wochen alt sind und ein Körpergewicht von 19-32 g haben. Bereiten Sie eine Anästhesiemischung aus Ketamin mit einer Verabreichungsdosis von 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg in 0,9% NaCl vor. Bereiten Sie die Mischung jeden Tag steril und frisch zu, da die Mischung nicht stabil ist und an Wirksamkeit verlieren kann.
      HINWEIS: Das bevorzugte Körpergewicht des Tieres liegt zwischen 23 und 30 g.
   2. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle, d. h. den unteren rechten oder linken Quadranten des Bauches, mit Gaze und 70 % Ethanol. Injizieren Sie 10 μl/g Körpergewicht intraperitoneal (ip) mit einer 27-G-Nadel und einer 1-ml-Einwegspritze oder einer 30-G-Insulinspritze.
   3. Setzen Sie das Tier wieder in einen Käfig auf einem Heizkissen, ohne den Käfigdeckel zu schließen. Timer starten.
      HINWEIS: Die Tiefenanästhesie sollte ca. 40 Minuten dauern. Wenn eine längere Bildgebungssitzung gewünscht wird, erwägen Sie eine reversible Anästhesie, wie z. B. Mischungen aus Ketamin 60 mg/kg und Medetomidin 0,4 mg/kg in 0,9 % NaCl, gefolgt von einer Umkehrung mit subkutaner Injektion von Atipamezol 1 mg/kg. Die Injektionsanästhesie wird aufgrund des bildgebenden Aufbaus der Inhalationsanästhesie vorgezogen.
   4. Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie. Bestätigen Sie, ob die Anästhesie wirkt, indem Sie die Hinterpfoten nach ca. 5 Minuten vorsichtig zusammendrücken. Wenn das Tier immer noch reagiert, warten Sie weitere 2-3 Minuten, um eine vollständige Anästhesie zu erreichen.
   5. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um das Austrocknen der Hornhaut und ein Augentrauma zu verhindern, wenn das Tier tief schläft. Überprüfen Sie die Reflexe erneut und beginnen Sie die Prozedur erst, wenn das Tier keine Reaktion auf das Einklemmen zeigt.
3. Vorbereitung des Bildgebungsbereichs (Abbildung 1)
   1. Trimmen Sie den Bauch des Tieres vorsichtig mit einem Tierarzttrimmer, während er auf ein Heizkissen gelegt wird. Führen Sie das Trimmen sehr vorsichtig durch, ohne Kompression auf Brust oder Bauch auszuüben.
   2. Tragen Sie die Enthaarungscreme nicht länger als 2 Minuten auf.
      ACHTUNG: Verlängern Sie nicht die Inkubationszeit der Enthaarungscreme, da dies zu Hautentzündungen führen kann. Dies beeinträchtigt nicht nur die Bildqualität, sondern kann auch zu Beschwerden für das Tier führen.
   3. Enthaarungscreme mit einigen Papiertüchern entfernen und vorsichtig mit warmem Wasser reinigen.
4. Positionieren Sie das Tier und das bildgebende Setup für Dopplermessungen (Abbildung 2A).
   1. Positionieren Sie das Tier dorsal auf einem Heizkissen und sichern Sie die Pfoten vorsichtig mit Klebeband. Befeuchten Sie die Haut mit etwas warmem Wasser.
   2. Tragen Sie das zentrifugierte Ultraschall-Transmissionsgel mit einer 20-ml-Spritze direkt auf die rasierte Haut auf.
      HINWEIS: Luftblasen können die Doppler-Bildgebung beeinträchtigen und Artefakte verursachen.
   3. Platzieren Sie den 3D-gedruckten, mit Wasser gefüllten Wassertank über dem Tier. Stellen Sie sicher, dass die Höhe des Wassertanks für das Tier geeignet ist, etwa 1 mm darüber, und das Tier nicht quetscht.
   4. Prüfen Sie, ob sich zwischen dem Ultraschall-Übertragungsgel und dem Thermoplast Polymethylpenten (PMP) des Wassertanks Luft befindet.

2. Sondenbetrieb und Ebenenauswahl (Timing ~ 10 min)

1. Starten Sie die Software und erstellen Sie eine experimentelle Sitzung auf dem System. Starten Sie die Scan-Software.
   HINWEIS: Die Scansoftware ist in das System integriert.
2. Zentrieren Sie die Motoren, indem Sie im Popup-Fenster auf Ja klicken. Ein motorisiertes System wird verwendet, um die Sonde durch Scan-Software fernzusteuern. Durch das Zentrieren der Motoren bewegt sich die Sonde automatisch in drei Richtungen, d. h. vertikal, seitlich und gedreht. Stellen Sie sicher, dass keine Gegenstände die Flugbahn der Sonde behindern, um eine Beschädigung des Geräts zu vermeiden.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Motoren zu zentrieren. Andernfalls kann es zu Fehlfunktionen der Software kommen.
3. Erstellen Sie eine neue experimentelle Sitzung, indem Sie im Menü die Option Sitzung auswählen. Geben Sie die erforderlichen Informationen in das Sitzungsfenster ein, z. B. Projekt, Betreff, Sitzung, Benutzername, Kommentar und Tag. Klicken Sie auf Validieren.
   HINWEIS: Die Sitzung muss erstellt werden, bevor Bilddaten erfasst oder gespeichert werden. Sitzungsinformationen können während des Experiments geändert werden, aber denken Sie daran, dass dadurch auch das Ziel für das Speichern von Daten geändert wird.
4. Positionieren Sie die Sonde. Die lineare 15-MHz-Ultraschallsonde mit 128 Elementen ist über ein motorisiertes System mit dem System verbunden, das aus einem vierachsigen Motormodul besteht, dh drei translatorische und eine rotierende Bewegungsrichtung.
   1. Gehen Sie in das Menü Sonde bewegen und verwenden Sie das computergesteuerte Positioniersystem, um die Sonde in das Wasser im 3D-gedruckten Wassertank zu bewegen. Verwenden Sie die Steuertasten, die in der Sondenposition angezeigt werden, um die Motoren zu bewegen, und definieren Sie die Schritte in mm für die translatorische Bewegung (X, Y und Z) oder in ° für die Rotationsbewegung (R). Um Unfälle in Z-Richtung zu vermeiden, definieren Sie die Z-Grenze in Sicherheit.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Elemente der Sonde mit dem Wasser in Kontakt kommen. Vermeiden Sie es jedoch, die Sonde vollständig ins Wasser zu bringen, da dies das Gerät beschädigen kann. Wenn die Motoren die Position nicht erreichen können, wird die Warnung Außerhalb des Arbeitsbereichs angezeigt.
   2. Speichern Sie die Koordinaten als Referenzposition, indem Sie auf Start setzen klicken. Ändern Sie Verschiebungen und Rotationen nicht gleichzeitig, da R relativ zu X, Y und Z ist. Klicken Sie immer auf Start setzen , bevor Sie R ändern.
   3. Definieren Sie Bildgebungs- und Visualisierungsparameter. Gehen Sie zum Live-View-Menü und klicken Sie auf Play , um die gewünschte Ebene auszuwählen.
      ACHTUNG: Starten Sie nur eine Live-Ansicht oder eine Erfassung, wenn die Elemente der Ultraschallsonde von einem Medium umgeben sind, das der akustischen Impedanz entspricht, um die Lebensdauer des Geräts zu gewährleisten und eine Überhitzung zu vermeiden.
5. Wählen Sie die Bildgebungsparameter in der Voreinstellung.
   1. Laden Sie mit der Taste "Sequenz laden " eine ultraempfindliche Doppler-Ultraschallsequenz von 10 ms, z. B. 11 zusammengesetzte ebene Wellen (Winkel von -10° bis 10°) mit einer Bildspannung von 25 V und einer Doppler-Bildrate von 10 ms.
      HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, eine schnelle Dopplersequenz (z. B. 10 ms) zu verwenden, um die Atembewegungen des Organs während der Analyse abzubilden und zu filtern.
   2. Definieren Sie eine Bildtiefe zwischen 1 mm und 50 mm mit einer maximalen bebilderbaren Tiefe von 50 mm. Die Standardeinstellung ist eine Tiefe von 9 mm von 1 mm bis 10 mm, wobei die empfohlene Tiefe zwischen 2 mm und 12 mm liegt.
      HINWEIS: Abhängig von der Größe des Tieres und des Wassertanks kann die Bildtiefe an die spezifischen Bedürfnisse angepasst werden.
6. Wählen Sie Visualisierungsparameter aus.
   1. Wählen Sie Doppler , um das Gefäßsystem abzubilden.
      HINWEIS: Die Pixelintensität in A.U. stellt das Blutvolumen dar und sollte nur verglichen werden, wenn dieselbe Sonde und Sequenz verwendet wird.
   2. Wählen Sie Mittelwertbildung aus, um die zeitliche Mittelung anzuwenden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren.
      HINWEIS: Durch die zeitliche Mittelung der Bilder wird die Bildqualität erhöht, aber die Bildrate verringert. Je nach Zielsetzung sollte ein geeigneter Kompromiss eingegangen werden.
   3. Wählen Sie Bildkomprimierung: Logarithmisch (hoch), Quadratwurzel (mittel) oder Linear (niedrig). Alternativ können Sie den Kontrastbereich automatisch oder manuell mit Schiebereglern für hohe und niedrige Kontrastoptionen anpassen.
      HINWEIS: Die Daten werden von der Wahl der Bildkomprimierung nicht beeinflusst. Es wirkt sich nur auf die Anzeige der Echtzeit-Bildgebung aus.
   4. Wählen Sie die Farbkartenskala von Schwarz nach Weiß aus, indem Sie die Option Grau aktivieren, oder von rötlich-schwarz nach gelb, indem Sie Heiß aktivieren.
7. Auswahl der Ebene (Abbildung 2B)
   1. Wählen Sie die Bildgebungsebene auf anatomischen Orientierungspunkten aus. Wechseln Sie zwischen der Visualisierung des Doppler- und dem B-Modus, um sich mit der Anatomie der Leberlappen und des Gefäßsystems vertraut zu machen.
   2. Stoppen Sie die Live-Ansicht, indem Sie auf das Stopp-Symbol klicken.
   3. Gehen Sie zum Menü Sonde verschieben, um durch die Sonde zu navigieren, und wählen Sie eine Ebene aus, indem Sie auf Start setzen klicken, um die Koordinaten als Referenzposition zu speichern. Stellen Sie sicher, dass der Gefäßbaum gut definiert und sichtbar ist und so wenig wie möglich außerhalb der Ebene signalisiert wird.
   4. Gehen Sie zurück zum Menü Live-Ansicht und klicken Sie auf das Stopp-Symbol.

3. Doppler-Scan-Erfassung (Timing ~ 20 min)

1. Starten Sie eine Doppler-Erfassung mit einer Bildrate von 10 ms.
   1. Gehen Sie zum fUS 2D-Menü , um hämodynamische Variationen im Laufe der Zeit in einer bestimmten Position darzustellen (Abbildung 3). Um den Kontrast zu erhöhen, verabreichen Sie einen Bolus von 50 μl intravenös (iv) injizierte Mikrobläschen mit einer Konzentration von 2 x 10⁸ Mikrobläschen pro ml in die Schwanzvene.
   2. Legen Sie im Tippen auf "Voreinstellung" die Gesamtaufnahmedauer in Sekunden (30 s) fest. Wählen Sie einen kontinuierlichen Modus ohne Pause zwischen den Bildern, indem Sie die Zeit zwischen den Bildern auf 0 s einstellen.
   3. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die 2D-Aufnahme zu starten. Die Aufnahme kann durch Drücken der Stopp-Taste abgebrochen werden. Daten können verloren gehen, wenn die Erfassung vor Abschluss unterbrochen wird.
2. Visualisieren und adaptieren Sie die aufgenommene Aufnahme.
   1. Ändern Sie den Kontrast und die Farbzuordnung, falls gewünscht, indem Sie auf Visualisierung tippen. Spielen Sie die Aufnahme bei Bedarf erneut ab, indem Sie mit dem Schieberegler, der in der Funktion Zeit enthalten ist, durch die Frames scrollen.
3. Speichern Sie die Daten.
   1. Geben Sie einen Namen für die erfasste Aufzeichnung an, um die Datei im .scan-Format im Sitzungsordner zu speichern. Ein Pop-up-Fenster zum Speichern der Daten wird automatisch am Ende jeder Aufzeichnung vorgeschlagen. Die Daten werden automatisch gespeichert.
4. Starten Sie eine weitere Akquise, indem Sie auf die Registerkarte Preset klicken und den Vorgang ab Schritt 3.1.1 wiederholen.
5. Entfernen Sie das Imaging-Setup und kümmern Sie sich um das Tier.
   1. Gehen Sie zum Menü Sonde verschieben, um die Sonde vertikal außerhalb des 3D-gedruckten Wassertanks nach oben zu bewegen. Entfernen Sie das Setup und das Ultraschallgel und lösen Sie die Fixierung des Tieres.
   2. Euthanasieren Sie das Tier, wenn das Versuchsdesign den Endpunkt erreicht; Andernfalls fahren Sie mit den folgenden Schritten fort.
   3. Tragen Sie etwas Feuchtigkeitscreme auf die rasierte Hautpartie des Tieres auf, wenn Längsmessungen beabsichtigt sind.
   4. Setzen Sie das Tier zurück in den Käfig und lassen Sie es unter einer Wärmelampe aus der Narkose aufwachen, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Überwachen Sie das Tier, während es sich erholt.
   5. Setzen Sie das Tier wieder in den individuell belüfteten Käfigkorb, wenn es wieder normal läuft. Beenden Sie die Versuchstierversuche, bevor Sie den Datensatz analysieren.

4. Quantitative Analyse (Timing ~ 1 h)

1. Öffnen Sie das Analyseskript gui_analysis.m, das in der Zusatzdatei 1 verfügbar ist.
2. Wählen Sie den Scan aus und stellen Sie die quantitativen Parameter in den Einstellungen ein: 10 Regionen von Interesse (ROIs) mit einer Voxelgröße von 2 x 2. Wählen Sie 40 ms für jedes Bild, um die Doppler-Integration durchzuführen.
3. Zeichnen Sie die Gefäßperipherie des Organs; Die 10 ROIs werden automatisch zwischen gut sichtbaren Arterien vorpositioniert und können bei Bedarf manuell angepasst werden (Abbildung 4A). Schließen Sie das schwebende Dialogfeld, wenn Sie mit der Positionierung zufrieden sind. Stellen Sie eine stabile Erfassung sicher (Abbildung 4B) für eine robuste Blutvolumenberechnung und vermeiden Sie Erfassungen, die durch starke Bewegungsartefakte beeinträchtigt werden (Abbildung 4C).
4. Quantifizieren Sie das mittlere hepatische Blutvolumen in A.U. der insgesamt 10 ROIs, indem Sie automatisch den Mittelwert und die Standardabweichung der Quiet Frame-Werte innerhalb der 30-s-Aufzeichnung schätzen (Abbildung 4D).
   HINWEIS: Die Datentabelle mit den Intensitäten der ROIs kann direkt in eine Tabellenkalkulationsdatei kopiert und eingefügt werden.
5. Wiederholen Sie die Analyse für mindestens zwei weitere Ebenen, -0,3 mm und -0,6 mm, in kaudaler Richtung. Quantifizieren Sie alle Erfassungsdaten, bevor Sie die statistische Analyse durchführen.
6. Überprüfen Sie die Standardabweichung der Intensitäten auf dem gesamten Bild, und bestimmen Sie einen Grenzwert als Gesamtmittelwert (μ) mit 2 Standardabweichungen (2σ), um Messungen, die anfällig für Bewegungsartefakte sind, objektiv auszuschließen (Abbildung 4E).
   HINWEIS: Der Mittelwert und die Standardabweichung der über das gesamte Bild geschätzten Werte für stille Bilder werden in der ersten Zeile der Datentabelle angegeben.
   VORSICHT: Bewegungsartefakte verhindern eine robuste Quantifizierung und sollten auf der Grundlage der Analyse des gesamten zeitlichen Bildes objektiv identifiziert werden.
7. Nehmen Sie den Durchschnitt des gesamten mittleren Leberblutvolumens, quantifiziert über 3 verschiedene Ebenen in 30 ROIs pro Tier in Schritt 4.3 (Abbildung 4F). Wenden Sie den ROUT-Test 1 % in einer statistischen Analysesoftware an, um Ausreißer-ROIs zu identifizieren, bevor Sie durchschnittlich 30 ROIs pro Tier erzielen. Um die Schätzung des Blutvolumens zu verbessern, zeichnen Sie zusätzliche Ebenen pro Tier auf.
8. Zur Verabreichung der Vehikelbehandlung desinfizieren Sie die Injektionsstelle, d. h. den unteren rechten oder linken Quadranten des Bauches, mit Gaze und 70 % Ethanol. Injizieren Sie 20 μl Kochsalzlösung oder DMSO ip mit einer 27G-Nadel und einer 1 mL Einwegspritze oder einer 30G Insulinspritze oder verabreichen Sie 100 μl (Hydroxypropyl)methylcellulose durch Sonde mit einer wiederverwendbaren Ernährungsnadel 30G mit runder Spitze. Diagrammdaten von 3 Kohorten, die Kochsalzlösung oder DMSO durch ip oder orale Verabreichung (po) von Cellulose erhielten (Abbildung 4G). Führen Sie die Analyse blind durch, ohne den Zustand und/oder die erhaltene Behandlung preiszugeben.
   HINWEIS: Die Verabreichung im Fahrzeug hat keinen Einfluss auf die Blutvolumenmessungen.

Ergebnisse

Im Anschluss an das Protokoll wird die Bildgebung des hepatischen Gefäßsystems auf der Grundlage der Standardisierung der anatomischen Strukturen und der entsprechenden Terminologie erleichtert (Abbildung 1). Um eine standardisierte Nomenklatur für Forscher mit präklinischen Lebermodellen vorzuschlagen, haben wir schematisch die gemeinsame Leberpositionierung in der Bauchhöhle von Mäusen dargestellt (Abbildung 1A), die strukturelle Anordnung der verschiedenen Leberlappen (Abbildung 1B) und das arterielle Gefäßnetzwerk spezifiziert (Abbildung 1C). Ausgestattet mit anatomischem Fachwissen wurde die In-vivo-UFUS-Bildgebung unter Verwendung eines 3D-gedruckten Wassertanks durchgeführt, um Bewegungsartefakte zu reduzieren (Abbildung 2A). Die akustische Impedanz wurde korrigiert, indem die Sonde in Wasser eingeführt und das Ultraschall-Transmissionsgel direkt auf die rasierte Haut des Tieres aufgetragen wurde. Durch diese Anordnung werden Atem- und andere Bewegungsartefakte reduziert, da die Sonde nicht in direktem Kontakt mit der sich bewegenden Brust und dem Bauch des Tieres steht. Auf diese Weise konnten wir die Gefäßstruktur des rechten und linken Lappens sichtbar machen, die aufgrund ihrer oberflächlichen Lage für UFUS leicht zugänglich sind (Abbildung 2B). Andere Leberlappen, wie z. B. der Schwanz- und Quadratlappen, befinden sich tiefer im Körper, was es schwieriger macht, das Lebergefäßsystem anatomisch anhand von UFUS richtig zu identifizieren.

Nachdem wir gezeigt hatten, wie wichtig standardisierte und allgemein akzeptierte anatomische Indikationen und Interpretationen von Gefäßstrukturen sind, führten wir mehrere Doppler-Scans in verschiedenen Ebenen durch, um einen umfassenden Überblick über das hepatische Gefäßsystem zu erhalten, das durch kontrastmittelverstärktes UFUS bei Mäusen abgebildet wurde (Abbildung 3). Wir haben das hepatische arterielle Netzwerk der einzelnen Leberlappen abgegrenzt, d.h. des linken lateralen (LL), des linken medialen (LM), des rechten lateralen (RL) und des rechten medialen (RM) Lappens. Darüber hinaus werden wichtige Arterien wie die Bauchschlagader (AA), die Leberarterie (HA), die linke laterale Leberarterie (LLHA) und die rechte mediale Leberarterie (RMHA) markiert. Es ist wichtig zu beachten, dass Leberlappen je nach Platzierung und peristaltischer Bewegung des Dünndarms (SM) sowie dem Zustand der Magenfüllung (S) leicht unterschiedlich positioniert sein können. Dieser kontrastverstärkte Überblick über das gesamte Gefäßsystem der Leber der Maus bietet einen umfassenden Gefäßatlas für die in vivo Leberbildgebung mittels UFUS.

Eine genaue Auswahl der anatomischen Ebenen ist entscheidend, um eine quantitative Ablesung aus einem Leberlappen zu erhalten. Robuste Blutvolumenmessungen können durch die manuelle Auswahl von 10 Regionen von Interesse (ROI) pro Ebene erreicht werden (Abbildung 4A). Für eine zuverlässige Quantifizierung des Blutvolumens der Mikrozirkulation ist eine stabile Erfassung mit geringer Variation der mittleren Bildintensitäten erforderlich. Dieser wird anhand des mittleren Bildwertes (MIV) des gesamten Bildes über die Zeit ermittelt (Abbildung 4B), im Gegensatz zu einer Aufnahme, die anfällig für signifikante Bewegungsartefakte ist (Abbildung 4C). Um Bewegungsartefakte zu behandeln, wurde die automatische Auswahl des niedrigen MIV für eine zuverlässige Quantifizierung des Leberblutvolumens verwendet (Abbildung 4D), indem die Standardabweichung aller temporalen niedrigen MIV eines gesamten Bildes aufgetragen wurde (Abbildung 4E). Doppler-Scans mehrerer Ebenen pro Tier zeigen eine akzeptable Intra- und Intervariabilität innerhalb und zwischen Mäusen aus 3 verschiedenen Kohorten nach Ausreißerbehandlung bei 30 ROIs pro Tier mit einem ROUT-Test von 1 % (Abbildung 4F). Um die Schätzung des Blutvolumens pro Tier zu verbessern, wird empfohlen, zusätzliche Ebenen aufzuzeichnen oder die Anzahl der pro Ebene ausgewählten ROIs zu erhöhen. Darüber hinaus können Blutvolumenmessungen zur Überwachung der medikamentösen Behandlung verwendet werden, die speziell auf die Mikrogefäße abzielt. Durch die Verabreichung des Vehikels über zwei Verabreichungswege zeigten wir, dass es keinen Einfluss auf die Leberblutvolumenmessungen gibt (Abbildung 4G). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Gendeletion oder die Verabreichung der Behandlung nicht durch die Vehikelverabreichung beeinflusst wird, was ein robustes Versuchsdesign gewährleistet. Insgesamt wird ein objektives und reproduzierbares quantitatives Protokoll für zukünftige Forschungen zur Erforschung von Lebergefäßdefekten in verschiedenen Mausmodellen bereitgestellt.

Abbildung 1: Anatomie der murinen Leber. (A) Schematische Übersicht über die Positionierung der Leber in der Bauchhöhle unter dem Zwerchfell der Maus. (B) Schematische Beschreibung der murinen Leber mit vier Leberlappen, d.h. linkem, quadratischem, kaudatiertem und rechtem Lappen, und der Pfortadertrias, bestehend aus der Pfortader, der Leberarterie und dem Gallengang. (C) Schematische Darstellung des arteriellen Netzwerks des haptischen Gefäßsystems. Identifizierung der Leberarterien (HA) und Äste (Ramus) mit lateinischer Nomenklatur. Abkürzung: HA = Leberarterie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ultraschnelle Doppler-Ultraschall (UFUS)-Bildgebung des Lebergefäßsystems bei Mäusen. (A) Schematischer Überblick über den Versuchsaufbau für die nicht-invasive in vivo Bildgebung. (B) Schematische Darstellungen der Abbildungsrichtung und der zugehörigen Vertreter des rechten und linken medialen Lappens sowie des linken lateralen Lappens, aufgenommen durch UFUS. Abkürzung: AA = Aorta abdominals, LLL = linker lateraler Lappen, LML = linker medialer Lappen, RML = rechter medialer Lappen. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentativer kontrastmittelverstärkter ultraschneller Doppler-Ultraschall (UFUS) des murinen Lebergefäßsystems. Ein Überblick über das gesamte Lebergefäßsystem einer adulten Maus, abgebildet in 3 Positionen, d.h. lateral rechts, medial und lateral links, in 4 Ebenen von kranial nach kaudal. Die Referenz befindet sich direkt unter dem Zwerchfell, das medial und 1 cm lateral rechts und links abgebildet ist, mit den gleichen Ebenen in kaudaler Richtung. Abkürzung: AA = Aorta abdominals, HA = Leberarterie, LLL = linker lateraler Lappen, LLHA = linke laterale Leberarterie, LML = linker medialer Lappen, RLL = rechter lateraler Lappen, RMHA = rechte mediale Leberarterie, RML = rechter medialer Lappen, SI = Dünndarm, S = Magen. Maßstabsleiste 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Quantitative Messung des Leberblutvolumens durch ultraschnellen Doppler-Ultraschall (UFUS). (A) Vertreter des Mediallappens (ML) von adulten C57BL/6-Wildtyp-Kontrollmäusen in Ebene 1, ausgewählt unter dem Zwerchfell, entsprechend 0 mm, Ebene 2 bei -0,3 mm und Ebene 3 bei -0,6 mm mit einer Auswahl von 10 Regionen von Interesse (ROIs). Maßstabsleiste 1 mm. Illustration eines Leistungsdopplers von 30s mit (B) stabiler Erfassung (grau) und (C) Gewebebewegung (rot) basierend auf mittleren Bildwerten in beliebigen Einheiten (A.U.) des Gesamtbildes zur quantitativen Beurteilung. (D) Automatisierte Erkennung niedriger Intensitäten (A.U.) zur quantitativen Messung des Blutvolumens über die Zeit. (E) Standardabweichung (St. Deviation) niedriger Intensitäten, aufgetragen zur Identifizierung instabiler Erfassungen (rot), die durch Bewegungsartefakte verursacht wurden, angezeigt durch einen Ausschnitt des Gesamtmittelwerts (μ) von der Anzahl (N) der Tiere aus 3 Kohorten mit 2 SD (2σ) Bewertung der Standardabweichung (SD) niedriger Intensitäten (A.U.) im physiologischen Zustand (grau) bei adulten C57BL/6-Wildtyp-Kontrollmäusen. (F) Die Quantifizierung der in vivo gemessenen Blutvolumenänderungen im Laufe der Zeit mit einem Durchschnitt über 3 Ebenen, d. h. insgesamt 30 ROI pro Tier, wird als Pixelintensität (A.U.) dargestellt. Ausreißererkennung durch ROUT-Test 1%. (G) Es besteht kein Unterschied zwischen der Art des Lieferfahrzeugs und dem Art der Verabreichung. Kohorte 1 (n=6) erhielt eine intraperitoneale (ip) Injektion von Kochsalzlösung, Kohorte 2 (n=3) ip-Injektion von DMSO und Kohorte 3 (n=6) eine orale Verabreichung (po) von Cellulose. Einfache ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest, ns P > 0,05. Abkürzung: A.U. = Arbitrary units, DMSO = Dimethylsulfoxid, ip = Intraperitoneal, po = Oral Administration, ROI = Region of Interest, St. Deviation = Standardabweichung, UFUS = Ultraschneller Doppler-Ultraschall. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Ultraschneller Doppler-Ultraschall (UFUS) quantitatives Skript zur Messung des Leberblutvolumens. Script gui_analysis.m bietet eine grafische Oberfläche für die automatische Positionierung der Region of Interest (ROI) für Blutvolumenmessungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In diesem Protokoll zeigen wir, wie eine nicht-invasive UFUS-Bildgebung des Lebergefäßsystems der Maus durchgeführt werden kann. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung des bildgebenden Verfahrens vor, die den Umgang mit den Tieren, die Bedienung des Ultraschallgeräts und die Datenanalyse zur Berechnung von Blutvolumenänderungen in vivo umfasst. Um die Interpretation der Ultraschalldaten zu erleichtern, geben wir einen umfassenden Überblick über die anatomischen Strukturen, die mit UFUS eindeutig sichtbar gemacht werden können. Des Weiteren beschreiben wir ein standardisiertes Quantifizierungsverfahren zur robusten Messung von Gefäßparametern. Das Erreichen einer geeigneten Auflösung ist ohne den Einsatz eines Kontrastmittels möglich, was eine sichere und unkomplizierte quantitative Bestimmung des hepatischen Blutvolumens der Mikrozirkulation ermöglicht. Wir betonen die Verwendung einer standardisierten anatomischen Nomenklatur, um Verwirrung und Fehlinterpretationen zu vermeiden, insbesondere bei der Bewertung quantitativer Messungen von Mikrogefäßen.

Über UFUS-Bildgebung von murinen Gefäßen wurde bereits berichtet, vor allem im Bereich der Neurowissenschaften⁷. Die Bildgebung des Gehirns wird im Gegensatz zur Leber, die sehr anfällig für Atembewegungen ist, nicht durch Bewegungsartefakte beeinflusst. Aufgrund der anatomischen Lage unter dem Zwerchfell muss die Haarentfernung im Bauchbereich sehr schonend durchgeführt werden, um durch Minimierung der körperlichen Kräfte auf die Brust- und Bauchregion keine unregelmäßige Atmung zu verursachen. Darüber hinaus ist das Erreichen eines angemessenen Anästhesiegrades unerlässlich, um eine regelmäßige oszillierende Atmung zu gewährleisten, ein Faktor, der in den Nachbearbeitungsschritten relativ leicht korrigiert werden kann. Die Empfindlichkeit von UFUS wurde hier durch die Anwendung eines Singularwert-Zerlegungsfilters (SVD) zur Entfernung von Bewegungsartefakten⁶ und durch die weitere Zensur von High-Motion-Frames erhöht. Die Power-Doppler-Filme mit hoher Bildrate werden hier mit 10 ms aufgenommen, um uns weiter zu ermöglichen, die Auswirkungen von Atembewegungen auf Frames zu visualisieren und zu messen, die aufgrund von Bewegungsartefakten hochwertige Spitzen erzeugten. Die Atemfrequenz könnte dann aus dem Peak in der Fast-Fourier-Transformation des durchschnittlichen Bildsignals identifiziert werden, und die entsprechenden Peak-Frames, die der hohen Bewegung des Organs entsprechen, können verworfen werden.

Die reproduzierbare Ultraschall-Doppler-Bildgebung innerhalb eines einzelnen Tieres im Laufe der Zeit sowie zwischen Tieren mit unterschiedlichem Körpergewicht kann immer noch auf mehrere Einschränkungen stoßen. Erstens kann die Positionierung der Leber durch Faktoren wie einen stark gefüllten Magen und die peristaltische Bewegung des Darms beeinflusst werden. Besonders ausgeprägt ist dieser Einfluss, wenn der linke laterale Leberlappen als Referenz gewählt wird. Daher empfehlen wir, den linken Seitenlappen nur bei größeren Tieren zu wählen und bei kleineren Tieren den rechten oder linken Mittellappen zu bevorzugen. Zweitens können bei verzweifelten Tieren schwere, nicht oszillierende Atembewegungen auftreten, was zu Bewegungsartefakten führt, die schwer zu korrigieren sind und daher nicht für die Berechnung des Blutvolumens verwendet werden können. Daher ist eine angemessene Wahl der Narkose zusammen mit einer auf das Körpergewicht abgestimmten Dosierung entscheidend. Schließlich schränkt die Auflösungsgrenze die Visualisierung der hepatischen Mikrovaskulatur ein, d.h. Blutgefäße können mit Durchmessern von bis zu 100 mm^{dargestellt werden 3}.

Kürzlich wurde die Verwendung von Kontrastmitteln vorgeschlagen, um ein detailliertes Bild des Gefäßsystems der Maus durch Verfolgung von Mikrobläschen zu erhalten. Ein solcher Ansatz kann eine hohe räumliche Auflösung erreichen und quantitative Blutgeschwindigkeitsmessungen liefern¹⁷. Die Verfolgung von Mikrobläschen ist jedoch nach wie vor eine große Herausforderung für die Bewegung innerer Organe, insbesondere wenn sie in 2D aufgenommen werden.

Hier zeigten wir, dass stabile Leberblutvolumenmessungen, die mit ultraschnellem Doppler durchgeführt wurden, an Kontrollmäusen aus drei Kohorten gewonnen werden konnten, die unterschiedliche Vehikel erhielten, die durch IP-Injektionen oder orale Sonde verabreicht wurden. Kürzlich wurden solche Blutvolumenmessungen erfolgreich in einem Mausmodell für eine Lebererkrankung^{eingesetzt 16}. Um dies näher zu erläutern, wurde die Gefäßausdehnung auf elektronenmikroskopischer Ebene nachgewiesen und durch quantitative Messungen mit UFUS bestätigt. Diese Studie unterstreicht die Sensitivität der in vivo-Bewertung zur Untersuchung von Gefäßdefekten auf funktioneller und quantitativer Ebene, selbst bei einer erhaltenen hepatischen Angioarchitektur, die für die klinische Diagnose und Überwachung vielversprechend ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll als Leitfaden für nicht-invasive qualitative und quantitative Studien des Lebergefäßsystems bei Mäusen dient. Aufgrund seines nicht-invasiven und unkomplizierten Verfahrens kann es auch für die longitudinale Nachsorge eingesetzt werden. Darüber hinaus birgt es das Potenzial, funktionelle Bewertungen von Blutgefäßen zu ermöglichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(Hydroxypropyl)methylcellulose HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0,5% HPMC
Zentrifuge ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Zentrifugenröhrchen 50 mL konisch Sterile Polypropylen	CELLSTAR Röhrchen	227 261
Wattestäbchen	Meditip Clean	G80215
Deionisiertes Wasser	im Haus
Enthaarungscreme	in der Nähe Drogerie
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML	steril
Ethanol absolut	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Ernährungsnadel, wiederverwendbar	FST Fine Science Tools	18064-20
Pinzette mit feiner Spitze Dumont #5 Pinzette	FST Fine Science Tools	11252-00
Mullkissen 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	Version 9
GUI Analyseskript	Inserm	gui_analysis.m	benötigt einen 10 ms Doppler-Scan
Heizkissen 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux Acculux	461265
Insulinspritze 30G 0,30 x 8 mm, 0,3 mL und 0,5 mL	BD Microfine + Demi	25636
Ketamin Anesketin	Dechra	REG NL 111764	100 mg/mL
Kimwipes KIMTECH fusselarmer Wischer	ULINE	S-8115
Laborband 19 mm x 50 m x 0,125 mm	Stokvis	M451
MATLAB Software	MathWorks	Version R2022b
Feuchtigkeitscreme	in der Nähe Drogerie
Nadel gelb 30G 0,3 x 13 mm	BD Microlance	304000
Augensalbe Oculentum Simplex	Added Pharma	220201
Papiertaschentücher	im Haus
Permanenter Labormarker	VWR	52877-310
Physiologische Salzlösung (NaCl 0,9%)	FRESENIUS KABI	B102986	steril
Scharfer Einwegbehälter Medical Dispo 2,5 L	APmedical	UN3291
Sterile Safe-Lock 1,5 mL Röhrchen	Eppendorf	0030 120.086
Spritze 1 mL	BD Plastipak	303172
Spritze 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
Timer	West Bend	40053
Trimmer	Exacta Aesculap	GT416
Ultrafast Ultraschall-Plattform	Iconeus &   INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus Ein Prototyp	mit einer Sequenz von 10 ms
Ultraschallübertragungsgel Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
Wassertank 3D-gedruckt 10 x 10 x 1,5 cm Polymethylpenten (PMP) 0,125 mm	GoodFellow Cambridge limited	ME311100/2	CAD-Datei auf Anfrage
Xylazin Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 mg/mL