Methodenartikel

Ein visueller Ansatz zur Induktion von Dolichoektasie bei Mäusen zur Modellierung der durch große Gefäße vermittelten zerebrovaskulären Dysfunktion

DOI:

10.3791/66792

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17. Mai 2024

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1Brain Health Imaging Centre, Centre for Addiction and Mental Health, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 3Department of Neurology, Columbia University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir zeigen die chemische Induktion großer Blutgefäßerweiterungen bei Mäusen als Modell für die Untersuchung zerebrovaskulärer Dysfunktion, das für die Modellierung von vaskulärer Demenz und Alzheimer verwendet werden kann. Wir demonstrieren auch die Visualisierung des Gefäßsystems durch Injektion von Silikonkautschukmischung und eine klare visuelle Anleitung zur Messung von Veränderungen der Blutgefäßgröße.

Zusammenfassung

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Das Blut-Hirn-Gehirn (BHS) ist ein entscheidendes System, das die selektive Gehirnzirkulation mit der Peripherie reguliert und es den notwendigen Nährstoffen ermöglicht, in das Gehirn einzudringen und überschüssige Aminosäuren oder Toxine aus dem Gehirn auszuscheiden. Um zu modellieren, wie die BHS bei Krankheiten wie vaskulärer Demenz (VaD) oder Alzheimer (AD) beeinträchtigt werden kann, entwickelten Forscher neuartige Methoden zur Modellierung der Gefäßerweiterung. Eine beeinträchtigte BHS in diesen Krankheitszuständen kann nachteilig sein und zu einer Fehlregulation der BHS führen, was zu unerwünschten und pathologischen Folgen führt, die sich auf die Gehirnfunktion auswirken. Wir waren in der Lage, eine bestehende Technik zu modifizieren, die es uns ermöglichte, direkt in die Cisterna magna (CM) zu injizieren, um die Erweiterung der Blutgefäße mit Hilfe von Elastase zu induzieren und die Tight Junctions (TJ) der BHS zu stören. Mit dieser Methode konnten wir verschiedene Erfolgsmetriken im Vergleich zu früheren Techniken feststellen, darunter eine konsistente Erweiterung der Blutgefäße, eine geringere Mortalität oder eine verbesserte Genesung sowie die Verbesserung des Füll-/Trübungsmittels, einer Silikonkautschukmischung, die zur Markierung von Blutgefäßen für die Dilatationsanalyse verabreicht wird. Diese modifizierte minimal-invasive Methode hat vielversprechende Ergebnisse erzielt, mit einer Steigerung der anhaltenden Dilatation großer Blutgefäße um 19 % bis 32 % bei Mäusen von 2 Wochen bis 3 Monaten nach der Injektion. Diese Verbesserung steht im Gegensatz zu früheren Studien, die erst nach 2 Wochen eine erhöhte Dilatation zeigten. Zusätzliche Daten deuten auf eine anhaltende Expansion auch nach 9,5 Monaten hin. Dieser Anstieg wurde durch den Vergleich des Durchmessers der Blutgefäße der Elastase und der Vehikel-injizierten Gruppe bestätigt. Insgesamt ist diese Technik wertvoll für die Untersuchung pathologischer Störungen, die das Zentralnervensystem (ZNS) betreffen, anhand von Tiermodellen.

Einleitung

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Mikrovaskuläre Endothelzellen, die die Hirnkapillaren auskleiden, sind die Hauptkomponenten für die Bildung der Blut-Hirn-Schranke (BHS)1, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung dessen spielt, was in den Gehirnkreislauf mit der Peripherie eintritt oder ihn verlässt. Essentielle Nährstoffe, die für das Nervengewebe benötigt werden, dürfen in die BHS gelangen, während einige essentielle Aminosäuren wie Glutamat aus dem Gehirn ausgeschieden werden, da hohe Konzentrationen das Hirngewebe dauerhaft neuroexzitatorisch schädigen können2. Unter normalen physiologischen Bedingungen begrenzt die BHS die Menge an Plasmaproteinen wie Albumin 3,4 und Prothrombin, da diese schädliche Auswirkungen haben können 5,6,7. Schließlich schützt die BHS das Gehirn vor Neurotoxinen, die in der Peripherie zirkulieren, wie z. B. Xenobiotika aus der Nahrung oder der Umwelt1. Insgesamt ist die Schädigung des Hirngewebes irreversibel, und das Altern, das mit einem niedrigen Niveau der Neurogenese korreliert8, unterstreicht die Bedeutung der BHS für den Schutz und die Verhinderung von Faktoren, die den neurodegenerativen Prozess beschleunigen.

Bei der Dolichoektasie (oder Erweiterung der großen Blutgefäße) wird eine Abnahme der Gefäßelastizität beobachtet, die dazu führt, dass die Gefäße morphologische Veränderungen erfahren, wodurch sie dysfunktional werden9 und der Blutfluss im Gehirn vermindert wird. Diese Verringerung des Blutflusses verringert in der Folge die Sauerstoff- und Glukoseversorgung, was schließlich zu einer Schädigung der BHS durch die Aktivierung reaktiver Astrozyten führt10. Wenn die innere Elastinlamina der Gefäße durch Dolichoektasiegeschädigt ist 11, ist eine wiederholte Stimulation des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) für die Angiogenese erforderlich. Dies kann zur Bildung von undichten Gefäßen führen und schließlich zu einer pathologischen Angiogenese führen, die durch die Entwicklung defekter Gefäße gekennzeichnetist 12. Während der pathologischen Angiogenese, wenn Blutgefäße defekt werden, scheint ein Kompensationsmechanismus die Integrität der Gefäße wiederherzustellen, indem er die Tight-Junction-Proteine hochreguliert. Dieser Prozess kann jedoch unbeabsichtigt die BHS stören, wenn die strukturelle Integrität eines Blutgefäßes verloren geht13. Dies kann durch eine weitere Störung der BHS und die Förderung der Produktion von Amyloid-Plaquegeschehen 14. Darüber hinaus kann ein Austritt aus der Peripherie eine Neuroinflammation15 verursachen, die zu einer neuronalen Degeneration und einem anschließenden Gedächtnisverlust führt.

Strukturell gesehen besteht der Schutz, den die BHS bietet, in den Tight Junctions, die verhindern, dass xenobiotische Wirkstoffe aus dem Blut in das Gehirn gelangen. Wenn die BHS bestimmte Substanzen in das Gehirn eindringen lässt, geschieht dies hauptsächlich durch zwei Hauptprozesse: passive Diffusion oder spezifische Kanäle (wie Ionenkanäle und Transporter)1. Bei AD hat die Forschung gezeigt, dass ein dysfunktionales Gefäßsystem eine bedeutende Rolle beim Fortschreiten der Erkrankung spielt12,13. Die Bildung von Amyloid-beta (Aβ)-Plaques und Neurodegeneration können durch den Abbau der BHS12,13 und Störungen des zerebralen Blutflusses16 verursacht werden. Eine Verringerung des zerebralen Blutflusses ist bei älteren Personen zu beobachten, bei denen vaskuläre Demenz und AD 17,18 diagnostiziert wurden. Eine Schädigung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zusammen mit einer gestörten zerebralen Durchblutung (CBF) kann zu einer erhöhten Produktion von Aβ-Konzentration im Gehirn beitragen, begleitet von der Infiltration von Fremdstoffen aus dem peripheren Kreislauf19.

Um die Pathogenese neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer und vaskuläre Demenz (VaD) zu untersuchen, werden Modelle entwickelt, um die Krankheit zu replizieren. In-vitro-Modelle werden häufig verwendet, aber es fehlt die biologische Umgebung für umfangreiche Krankheitsmodellierungen wie gemischte Zellpopulationen, was die Bedeutung von in vivo-Modellen erforderlich macht. Mäuse werden häufig verwendet, da sie leicht genetisch manipuliert werden können, um menschenähnliche Eigenschaften (z. B. Pathologie) bei Krankheiten zu erzeugen. Mit den Fortschritten, die bisher gemacht wurden, besteht immer noch ein Bedarf an verbesserten Modellen, um Krankheitsphänotypen wie die Erweiterung großer Gefäße und ihre Rolle bei AD zu emulieren. Zu diesem Zweck sahen wir eine Chance und modifizierten eine Technik, die die Injektion von Elastase in die Cisterna magna von Mäusen beinhaltete20,21. Elastase ist ein Enzym, von dem gezeigt wurde, dass es Elastin im Bindegewebe22 und in den umgebenden Tight Junctions23 abbaut. Als Injektionspunkt wurde die Cisterna magna gewählt, da sie sich direkt über dem Willis-Kreis, dem größten Blutgefäß im Gehirn, befindet. Durch die Injektion von Elastase in die Cisterna magna können wir die BHS und die Blutgefäße beeinträchtigen, indem wir die Tight Junctions aufbrechen und eine Erweiterung der Blutgefäße induzieren (Willis-Kreis)24,25. Die Kombination dieser Technik mit der Verwendung eines AD-Mausmodells der Pathologie für ein besseres Verständnis der Pathogenese für die vaskuläre Komponente der AD kann wertvolle Einblicke in die komplexen Wechselwirkungen und Einflüsse zwischen diesen beiden unterschiedlichen Pathologien liefern.

Frühere Studien haben Fälle gezeigt, in denen Patienten sowohl die pathologischen Merkmale von AD als auch von VaD aufweisen, eine Erkrankung, die typischerweise als gemischte Demenz bezeichnet wird26,27. Das Verständnis der miteinander verbundenen Mechanismen zwischen beiden Erkrankungen kann daher eine umfassendere Perspektive auf das Fortschreiten und die Manifestation dieser neurodegenerativen Erkrankungen bieten und unser Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen und potenziellen therapeutischen Strategien verbessern. Zu diesem Zweck demonstrieren wir die Anwendung von Elastase in einem Mausmodell für die Alzheimer-Pathologie (AppNL-F) zur Identifizierung vaskulärer Veränderungen.

Protokoll

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Für diese Studie wurdenApp-NL-F-Mäuse(3 Monate alt) verwendet, die humane Amyloid-Plaque auf physiologischer Ebene exprimieren, obwohl dieses System mit jedem Nagetiermodell verwendet werden kann. Alle Tierverfahren wurden vom Animal Care Committee des CAMH genehmigt (Protokoll #843) und entsprachen den ethischen Standards der Richtlinien des Canadian Council on Animal Care. Die Mäuse wurden im eigenen Haus gezüchtet und in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser gehalten.

1. Ablauf der Injektion von Cisterna magna (CM)

  1. Chirurgischer Eingriff
    1. Legen Sie die Maus (APPNL-F, beide Geschlechter, 3 Monate) für 1 min in eine Narkose-Induktionskammer.
      HINWEIS: Spülen Sie die Kammer mindestens 1 Minute lang mit 5 % Isofluran, gemischt mit 1 % Sauerstoff.
    2. Nachdem die Maus betäubt wurde, nehmen Sie das Tier aus der Kammer und legen Sie es auf ein frisches OP-Tuch und halten Sie die Narkose (Isofluran, 2,5 %-3 %) aufrecht, indem Sie einen Nasenkegel über die Nase legen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Zeh einklemmen, um sicherzustellen, dass keine Reflexe auftreten.
    3. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um Trockenheit vorzubeugen. Dann injizieren Sie subkutan 0,1 ml Bupivacain (Lokalanästhetikum; 1-2 mg/kg 0,125%, mit einem Verdünnungsverhältnis von 1:2) an die Inzisionsstelle und Metacam (Analgetikum; 5 mg/kg, mit einem Verdünnungsverhältnis von 1:10). Halten Sie das Tier hydratisiert, indem Sie 0,5 ml Kochsalzlösung subkutan injizieren, bevor Sie den Eingriff durchführen, um einen möglichen Blutverlust während der Operation auszugleichen.
    4. Für eine klare Schnittstelle rasieren Sie den Hals an der Basis des Hinterhauptbeins, wischen Sie die Oberfläche mit sterilem PBS ab und übertragen Sie das Subjekt in Bauchlage auf den stereotaktischen Rahmen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Anästhesie durch den stereotaktischen Nasenkonus aufrechterhalten wird.
    5. Platzieren Sie die Nasenstange vom stereotaktischen Rahmen auf der Maus, um Stabilität zu gewährleisten und sicherzustellen, dass die oberen Zähne befestigt sind.
    6. Positionieren Sie den Tierkopf in einem Winkel von 120° zum Körper, um den Nacken anzuheben und zu dehnen, um den gewünschten chirurgischen Bereich freizulegen.
    7. Reinigen Sie die Operationsstelle mit Betadin-Peeling 3x, 70% Ethanol 3x und Betadinlösung 1x mit steriler 2 Zoll x 2 Zoll Gaze.
    8. Falten Sie die Haut vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt (1 cm).
      HINWEIS: Dies sollte die Mittellinie des Nackens zeigen.
    9. Führen Sie das Skalpell vorsichtig entlang der Mittellinie, um die Muskeln zu durchtrennen. Trennen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig die Muskeln, indem Sie sie nach links und rechts auseinander ziehen.
      HINWEIS: Dies sollte die Cisterna magna (umgekehrtes Dreieck) zeigen, die sich unter der Schädelbasis befindet (Abbildung 1).
  2. Zubereitung von Elastase
    HINWEIS: Die bestellte Packung Elastase (Pulverform) enthielt 250 Einheiten (U). Die Menge der Elastase, die jedem Tier injiziert werden soll, beträgt 2,5 μl. Die Menge an Elastase, die in den 2,5 μl enthalten sein sollte, sollte 15 Millieinheiten mU betragen.
    1. Berechnen Sie zunächst die Konzentration der zu injizierenden Lösung.
      Konzentration = Masse/ Volumen
      = 15 mU/2,5 μL
      = 6 mU/μL
      Daher beträgt die erforderliche Konzentration 6 mU/μL.
    2. Die Menge der Elastase beträgt 250 u und die Studie arbeitet mit MilliUnits, also konvertieren Sie die Einheiten in MilliUnits, was 250000 mU ergibt.
    3. Nachdem Sie eine Masse von 250000 mU und eine Konzentration von 6 mU/μl erreicht haben, ermitteln Sie das Volumen (PBS), das eine Verdünnung der Elastase und die Aufrechterhaltung einer Konzentration von 6 mU/μl erfordern würde.
    4. Ordnen Sie die gleiche Formel wie oben an, um das Volumen zu lösen:
      Volumen = Masse/Conc.
      = 250000 mU/ 6 mU/μL
      = 41666,67 μL
    5. Da es schwierig ist, 41666,67 μl zu pipettieren, wandeln Sie es einfach in Milliliter um, indem Sie es durch 1000 dividieren, um 41,66667 ml zu erhalten, um eine 1x-Lösung zu erhalten.
      1. Um die Lösung konzentrierter zu machen,erhöhen Sie sie um das 10- oder 100-fache.
      2. Erstellen Sie eine 10x-Lösung, da sie einfacher zu handhaben ist (siehe unten).
        10x Lösung ---------- 4,166667 mL (konz.)
    6. Geben Sie die 250 HE in ein 5-ml-Aliquotröhrchen und geben Sie 4,167 mL steriles PBS in das Aliquotröhrchen, um die 10-fache Stammlösung herzustellen.
    7. 10 μl Stammlösung pipettieren und in 100 aliquote Röhrchen geben, wobei 1000 μl der 4,167 ml Stammlösung gegeben werden. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 °C.
    8. Den Rest der Stammlösung in aliquoten Röhrchen bei 100 μl pro Röhrchen lagern und im Gefrierschrank bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Die Lösungen sind bei -20 °C bis zu 6 Monate lang ohne nennenswerten Aktivitätsverlust stabil. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass ein übermäßiges Einfrieren und Auftauen der Elastase die Stabilität verringern kann. Um dies zu verhindern, kann die Stammlösung vor dem Einfrieren so geteilt werden, dass jeweils nur eine Probe für die Injektion aufgetaut werden muss.
    9. Nach dem Auftauen eines der Aliquotröhrchen, das 10 μl einer 10-fachen Lösung enthält, fügen Sie 90 μl steriles PBS hinzu, um eine 100 μl 1x-Lösung zu erhalten.
    10. Wenn das Aliquotröhrchen, das 100 μl einer 10x-Lösung enthält, stattdessen aufgetaut wurde, fügen Sie einfach 900 μl PBS hinzu, um 1000 μl zu erhalten, was einer 1x-Lösung entspricht. Lagern Sie beide Lösungen 1 Woche lang bei 4 °C.
  3. Injizieren in die Cisterna magna
    HINWEIS: Reinigen Sie die Hamilton-Spritze vor dem Befüllen mit Elastase, indem Sie 5x mit destilliertem Wasser, dann 5x mit Ethanol und schließlich 5x mit destilliertem Wasser befüllen und aspirieren.
    1. Füllen Sie die Hamilton-Spritze mit 2,5 μl Elastase (Konzentration von 15 mU) und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
    2. Führen Sie die Spritze langsam mit der Fase nach oben in die Mitte der Cisterna magna ein.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, Blutgefäße zu durchstechen, die durch die Cisterna magna verlaufen.
    3. Entfernen Sie nach der Punktion die Fase. Dies erleichtert die Freisetzung einer kleinen Menge Liquor cerebrospinalis (CSF). Verwende ein steriles Wattestäbchen, um den überschüssigen Liquor aufzusaugen.
    4. Führen Sie die Fase wieder in die Einstichstelle ein, injizieren Sie langsam Elastase oder Vehikel über 1 Minute in die Cisterna magna und lassen Sie die Nadel 1 Minute lang an Ort und Stelle, um ein Austreten von Elastase zu verhindern.
    5. Nach dem Entfernen der Fase verschließen Sie die Inzisionsstelle mit einer nicht resorbierbaren chirurgischen Naht (#4-0 mit 3/8"-Nadel) und schalten Sie das Anästhetikum aus.
    6. Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es auf ein warmes Heizkissen mit 37 °C, bis sich das Subjekt erholt hat.
      HINWEIS: Eine weitere Dosis Metacam wird nach der Operation empfohlen, um die Schmerzen während der postoperativen Genesung zu lindern.

2. Injektion der Silikonkautschukmischung und Gewebeentnahme

  1. Betäuben Sie das Tier mit einer Überdosis Avertin (1 ml, 125-250 mg/kg).
    HINWEIS: Kneifen Sie den Zeh zusammen, um sicherzustellen, dass die Reflexe aufhören.
  2. Legen Sie das Tier auf eine Windel und befestigen Sie alle Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband mit der Brusthöhle nach oben
  3. Öffne die Brusthöhle mit einer Pinzette und einer Schere, um das Herz freizulegen.
  4. Führen Sie eine stumpfe 23-G-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens ein und perfundieren Sie sie 4 Minuten lang mit PBS, das mit Heparin (100 U/ml) infundiert ist, um die Blutgefäße mit einer Mikroperfusionspumpe zu reinigen.
  5. Ersetzen Sie die Pufferflasche durch eine Flasche mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) (hergestellt aus PBS) und perfundieren Sie weitere 4 Minuten.
  6. Bereiten Sie die Lösung der Silikonkautschukmischung (gelb) vor, indem Sie 5 mL der Verbindung mit 5 mL des Verdünnungsmittels in einem 50 mL Röhrchen mischen. Vor Gebrauch gründlich mischen.
  7. Füllen Sie eine 10 mL Spritze mit 10 mL Silikon Kautschuk Compo und. Befestigen Sie die Spritze an dem Schlauch, der mit einer stumpfen 23-G-Nadel verbunden ist, und injizieren Sie die Lösung vorsichtig manuell in das Herz.
    HINWEIS: Aufgrund der hohen Viskosität der Silikonkautschukmischung ist es wichtig, eine größere Zylinderspritze zu verwenden, da sonst der Druck zu groß ist, um den Kolben zu drücken.
  8. Entfernen Sie den Kopf der Maus nach der Injektion und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C, damit die Silikonkautschukmischung in den Gefäßen aushärten kann.
  9. Entfernen Sie am nächsten Tag vorsichtig den Schädel der Maus (vorzugsweise mit einer feinen Pinzette), extrahieren Sie das Gehirn und inkubieren Sie es über Nacht bei Raumtemperatur (RT) in 4% PFA.
  10. Nach einer 24-stündigen Inkubation in PFA das Gehirn in PBS 3x waschen, in 30%ige Saccharose geben und bei 4 °C lagern.

3. Quantitative Analyse

  1. Um qualitativ hochwertige Bilder des Circle of Willis im gesamten Gehirn aufzunehmen (Abbildung 3):
    1. Entferne das Gehirn aus der Saccharoselösung. Trocknen Sie das Gehirn gründlich mit einem Papiertuch ab, um die Oberflächenfeuchtigkeit abzuleiten.
    2. Positionieren Sie das Gehirn in einem Brain-Slicer. Platzieren Sie den Brain-Slicer unter ein Lichtmikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist.
    3. Fokussieren Sie das Mikroskop auf eine klare, hochauflösende Auflösung des Willis-Kreises.
  2. Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware mit einer 10-cm-Linealreferenz, um ca. 1 cm zu messen und die Pixelzahl zu notieren. Stellen Sie die 1-cm-Skala basierend auf dieser Messung ein und messen Sie dann die Dicke der Arteria basilaris horizontal, um ihren Durchmesser zu ermitteln.
  3. Verwenden Sie eine Standard-Pixeldichtemessungssoftware, um das Bild zu analysieren. Messen Sie (in Zentimetern) fünf separate Messwerte der Arteria basilaris mit einer Bildanalysesoftware und berechnen Sie den Mittelwert, um eine genaue Darstellung des Durchmessers der Arteria basilaris zu erhalten.
  4. Verwenden Sie eine 2-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), um die durchschnittliche Durchmesseränderung zwischen der Elastase und der Kontrollgruppe zu vergleichen.
    1. Berechnen Sie die prozentuale Änderung des Durchmessers mit der Formel unter 21:
      figure-protocol-1
      C = relative Veränderung
      X1 = Anfangswert (Fahrzeug)
      X2 = Endwert (Elastase)
      Betrachten Sie P-Werte unter 0,05 als statistisch signifikant. Führen Sie alle statistischen Analysen mit einer statistischen Analysesoftware durch.

4. Entfernung der Silikonkautschukmischung durch Alkoholentwässerung

HINWEIS: Es ist wichtig, das Gehirn zu dehydrieren, um die überschüssige Silikonkautschukmischung aus dem Blutgefäß zu entfernen, was möglicherweise die Qualität der Immunfärbung verbessern kann.

  1. Waschen Sie das Gehirn 3x mit PBS, um die Saccharose zu entfernen.
  2. Platzieren Sie das Gehirn in 25%, 50%, 75%, 95% und absolutes Ethanol für 24 Stunden bei jeder Konzentration, für eine Gesamtzeit von 5 Tagen.
  3. Nach der Dehydrierung des Gewebes legen Sie das Gewebe für 12-24 Stunden in Methylsalicylat (Konz. ≤100%). Das Ethanol und das Methylsalicylat ermöglichen die Entfernung von überschüssigem Silikon im Gewebe.
  4. Waschen Sie das Gehirn 3x in PBS, um Chemikalienreste zu entfernen, und lassen Sie es über Nacht auf einer Wippe bei 4 °C in frischem PBS ruhen.
  5. Legen Sie das Gehirn in Saccharose und lagern Sie es bei 4 °C, bevor Sie es schneiden und immunfärben.

5. Immunhistochemische Färbung

  1. Sektionierung von Gehirnen
    1. Lassen Sie das Gehirn vor der Immunsektion am Boden des mit Saccharose gefüllten Röhrchens absetzen.
    2. Frieren Sie das Gehirn auf der Mikrotomplattform mit einer Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein, die von Trockeneis umgeben ist. Schneiden Sie das Gehirn mit der Mikrotomklinge in 40 μm große Abschnitte.
    3. Übertragen Sie jeden Abschnitt mit einem feinen Pinsel in eine 96-Well-Platte mit Kryoschutzmittel, um ein Einfrieren zu verhindern.
    4. Verschließen Sie die 96-Well-Platte sicher mit Plastikfolie. Lagern Sie die versiegelte Platte in einem -20 °C Gefrierschrank.
  2. Immunfluoreszenzfärbung (am Beispiel von NeuN)
    1. Legen Sie die Abschnitte in eine 24-Well-Platte. Führen Sie drei Waschgänge mit PBS durch, um das Kryoprotektivum zu beseitigen.
    2. Um eine unspezifische Bindung zu vermeiden, inkubieren Sie 1 h lang bei RT mit einer Blockierungslösung, die 2 % Ziegenserum, 0,1 % Triton-X 100 und 1 % BSA enthält.
    3. Bereiten Sie alle Komponenten in PBS vor.
      HINWEIS: Der verwendete Primärantikörper enthielt monoklonales Maus-Anti-NeuN mit einer Verdünnung von 1: 500. Der verwendete Sekundärantikörper enthielt polyklonales Ziegen-Anti-Maus-568 mit einer Verdünnung von 1:200.
    4. Verdünnen Sie das monoklonale Maus-Anti-NeuN in der oben erwähnten Blockierungslösung.
    5. Geben Sie den verdünnten Antikörper in jede Vertiefung. Über Nacht bei 4 °C inkubieren, durch Folie vor Licht geschützt.
    6. Nach der Primärinkubation waschen Sie die Abschnitte 3x mit PBS. Verdünnen Sie das polyklonale Ziegen-Anti-Maus-568 in der gleichen Blockierungslösung.
    7. Geben Sie den verdünnten Antikörper in jede Vertiefung. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren, durch Folie lichtgeschützt.
    8. Waschen Sie die Abschnitte nach der zweiten Inkubation 3x mit PBS.
    9. Bereiten Sie die Montage vor, indem Sie die Abschnitte langsam mit feinen Pinseln auf Dias übertragen. Alle Abschnitte trocknen lassen.
    10. Tragen Sie 125-150 μl lichtbeständiges Eindeckmedium auf, sobald die Abschnitte getrocknet sind. Platzieren Sie Deckgläser vorsichtig.
    11. Lassen Sie die Dias 24 h bei RT im Dunkeln trocknen und versiegeln Sie die Kanten mit Nagellack. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder mit Bildgebungssoftware auf.

Ergebnisse

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Es gelang uns, die Cisterna magna unterhalb der Hinterhauptregion des Schädels zu lokalisieren, nachdem wir die Maus vorsichtig auf dem stereotaktischen Rahmen positioniert und die Muskeln präpariert hatten. Diese anatomische Struktur, die einem umgekehrten Dreieck ähnelt und gelb hervorgehoben ist, befindet sich unter der Schädelbasis (Abbildung 1). Um die Präzision zu gewährleisten und eine Schädigung des Hirngewebes zu vermeiden, wurden 1-2 mm der Hamilton-Spritzenfase sanft in die Cisterna magna eingeführt.

Nach der Elastase-Injektion wurden die Tiere in drei verschiedenen Zeitintervallen mit PBS und 4 % PFA perfundiert: 2 Wochen, 1 Monat und 3 Monate. Anschließend wurden ihre Blutgefäße mit einer Silikonkautschukmischung fixiert, um die Visualisierung der Blutgefäße zu verbessern, wie in Abbildung 2 dargestellt. Qualitativ zeigt die Elastase-induzierte Dilatation eine erhöhte Sichtbarkeit der kleinen Blutgefäße um den Willis-Kreis und eine vergrößerte und gewundene Arteria basilaris im Vergleich zur Kontrollgruppe, die eine Vehikelinjektion erhielt, (Abbildung 3).

Die quantitative Analyse ergab einen signifikanten Unterschied zwischen der Elastase- und der Kontrollgruppe, wobei eine Vergrößerung der Blutgefäße in der Elastase-Gruppe nach 2 Wochen (32 % Anstieg; p-Wert = 0,019), 1 Monat (19 % Anstieg; p-Wert = 0,020) und 3 Monate (20 % Anstieg; p-Wert = 0,020) nach der Injektion beobachtet wurde (Abbildung 4). Die anschließende Dehydrierung des Gehirns durch eine allmähliche Erhöhung der Ethanolkonzentration, gefolgt von einem Eintauchen in Methylsalicylat, erleichterte die Entfernung der überschüssigen Silikonkautschukmischung und trug zu einer verbesserten Qualität der histologischen Färbung bei (Abbildung 5).

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Abbildung 1: Lage der Cisterna magna. Eine verbesserte Visualisierung zeigt die Cisterna magna, die aus den angrenzenden Nackenmuskeln isoliert wurde, und zeigt ihre Position in Bezug auf das Gehirn und die Schädelstruktur, insbesondere den Hinterhauptbein. Die Cisterna magna wird durch ein gelbes Dreieck hervorgehoben und ähnelt einem umgekehrten Dreieck, das Klarheit in der anatomischen Darstellung bietet. Maßstabsleisten: 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Injektion von gelbem Farbstoff. Die transkardiale Perfusion wurde verwendet, um das Gewebe für die histologische Färbung vorzubereiten. (A) Der Perfusionsaufbau für Mäuse beinhaltete das Pumpen von PBS in den Körper für 4 Minuten, um das Blut zu entfernen, gefolgt von PFA für weitere 4 Minuten zur Proteinfixierung. (B) Die Injektion von Farbstoff in den linken Ventrikel einer Maus nach der Perfusion verbessert die Sichtbarkeit der Blutgefäße im Gehirn und erleichtert die Beobachtung mit bloßem Auge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Piktogramm von Gehirnen, denen Elastase und PBS injiziert wurden. Die Visualisierung veranschaulicht die Vergrößerung der BA und die erhöhte Tortuosität um das CW nach der Elastase-Injektion im Vergleich zur Kontrollgruppe (PBS). CW, Kreis von Willis; BA, Arteria basilaris. Maßstabsleisten: 3 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Elastase-induzierte und anhaltende Erweiterung der Blutgefäße über 3 Monate. Im Vergleich zur Kontrollgruppe, die mit PBS behandelt wurde, beobachteten wir eine signifikante Erweiterung der Blutgefäße nach einer einzigen Elastase-Injektion in die Cisterna magna von 3 Monate alten Mäusen, die 3 Monate anhielt. Die Arteria basilaris wurde 2 Wochen, 1 Monat und 3 Monate nach der Elastase-Injektion gemessen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; 2-Wege-Anova, Sidak (Post-hoc-Prüfung); *p < 0,019 (2 Wochen), *p < 0,020 (1 Monat) und *p < 0,020 (3 Monate). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: NeuN-Färbung des dehydrierten Gehirns nach Entfernung von überschüssigem gelbem Farbstoff. Nachdem das Gehirn jeweils 24 Stunden lang in steigende Konzentrationen von Ethanol und Methylsalicylat versetzt worden war, wurde das Gehirn mit einem Mikrotom geschnitten und auf den neuronalen Marker NeuN gefärbt. In der Grafik ist ersichtlich, dass das (A) nicht dehydrierte Gehirn im Vergleich zum (B) dehydrierten Gehirn größere sichtbare Blutgefäße aufweist, wie der weiße Pfeil zeigt. Dies ermöglicht eine genauere Analyse dieser Abschnitte, da es die Hintergrundinterferenzen im Zusammenhang mit Blutgefäßen reduziert. Maßstabsbalken: 3 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Dieser Artikel zeigt ein verbessertes Protokoll für die zerebrovaskuläre Dilatation, das einen präzisen und unkomplizierten Ansatz für die Elastase-Injektion in die Cisterna magna von Mäusen bietet. Dieser anatomische Punkt dient als direkter Zugang zum Liquor cerebrospinalis und bietet einen wertvollen Weg für die Untersuchung verschiedener neurologischer Erkrankungen. Einer der Hauptvorteile dieser modifizierten Technik besteht darin, dass die Injektion einer Einzeldosis Elastase in die Cisterna magna von Mäusen in der Lage war, eine Erweiterung der großen Blutgefäße für mindestens 3 Monate zu verursachen und aufrechtzuerhalten, ohne dass eine wiederholte Injektion oder die Implantation einer Kanüle erforderlich war. Der Ansatz, Elastase in ein AD-Mausmodell zu verabreichen, ist ein weiterer bemerkenswerter Vorteil, insbesondere für die Beschleunigung der Ablagerung von Amyloid-Plaques im Gehirn. Typischerweise zeigtenAD-Modelle wie App NL-F-Mäuse (die in dieser Studie verwendet wurden) im Alter von 6 Monaten28 Jahren eine Plaquebildung. Dieses Modell wurde ausgewählt, weil diese Mäuse unter normalen Alterungsbedingungen von Natur aus eine menschenähnliche Amyloid-Ablagerung aufweisen. Die Injektion von Elastase in die Cisterna magna im Alter von 3 Monaten könnte die AD-Pathologie verschlimmern, indem sie den zerebralen Blutfluss reduziert16 und Störungen der Blut-Hirn-Schranke erhöht12,13.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Injektion von Substanzen in die Cisterna magna durch den Liquordruck behindert werden kann. Wir haben diese Einschränkung behoben, indem wir eine Methode entwickelt haben, die darauf abzielt, ihre Auswirkungen zu minimieren, da wir erkannt haben, dass wir die potenzielle Interferenz von Liquor cerebrospinalis (CSF) auf die Elastase-Abgabe an das Gehirn nicht ausschließen können. Die Fähigkeit der Elastase, Elastin zu verdauen, führt zu einer Verringerung der arteriellen Steifigkeit, wodurch die Arterien geschwächt werden und die Blutgefäße verlängert und gewunden werden29,30, was sie zu einer geeigneten Intervention bei der Entstehung von Dolichoektasie macht.

In der Regel dauert es etwa 20 Minuten, bis die chirurgische Injektion in die Cisterna magna pro Maus abgeschlossen ist. Während des Prozesses werden die Mäuse mit 1,5%-2% Isofluran betäubt, das als Vollnarkose verwendet wird. Es wird empfohlen, einen stereotaktischen Rahmen mit einer Zahnstange und Ohrstangen zu verwenden, um die Stabilität und Festigkeit des Mauskopfes während der Operation zu gewährleisten, was ein heikler und entscheidender Schritt ist. Eine falsche Positionierung auf dem stereotaktischen Rahmen kann zu einem geneigten Kopf und einer ungenauen Entbindung sowie zu einem möglichen Schlag auf ein Blutgefäß führen. Anstatt die Haut mit einem Skalpell zu schneiden, was unordentlich sein kann, kneifen wir die Haut mit einer feinen Pinzette und machen einen sauberen Schnitt mit einer chirurgischen Schere, um die Mittellinie des Nackens freizulegen. Das Skalpell fuhr dann entlang der Mittellinie, um einen sauberen Schnitt zu machen, und eine feine Pinzette wurde verwendet, um die Muskeln zu trennen. Insgesamt wird dadurch das Ausbluten minimiert, was der Maus hilft, sich viel schneller zu erholen.

Wir entschieden uns für eine 15 mU Dosierung von Elastase basierend auf den Ergebnissen früherer Arbeiten20, die zeigten, dass es keinen Unterschied zwischen 15 mU und 25 mU Dosierungen gab. Darüber hinaus stellten sie fest, dass höhere Konzentrationen zu erhöhten Sterblichkeitsraten führten. Während mit der 15-mU-Dosis eine Mortalitätsrate von 28 % berichtet wurde20, führte die in dieser Studie verwendete Methode zu keinen Todesfällen in der Kohorte. Wir hatten null Mortalitäten während des gesamten chirurgischen Prozesses aller Mäuse und eine Mortalität von 5-10% nach der Operation bis zu 3 Monate danach. Der Hauptfokus dieser Studie liegt jedoch auf dem Verständnis der Dolichoektasie, der Erweiterung großer Blutgefäße. Diese Betonung führte dazu, dass wir uns auf die Arteria basilaris als primäre Referenz für die Messung der Dilatation konzentrierten. Darüber hinaus induziert die Injektion von Elastase in die Cisterna magna von Mäusen eine breite Wirkung, die sowohl große als auch kleine Blutgefäße erweitert.

Bei der Injektion in die Zisterne magna eines Tieres ist es entscheidend, den Abstand zwischen dem Hirngewebe und dem Cisterna magna-Raum zu berücksichtigen, um eine Schädigung des Gehirns mit der Nadel zu vermeiden. Da Mäuse einen relativ geringen Abstand haben, führen wir nur die Fase der Spritze in die Cisterna magna ein. Um das Infektionsrisiko zu minimieren, muss der Eingriff mit sterilen chirurgischen Geräten durchgeführt werden, wobei die Maus betäubt wird. Die Verabreichung von Bupivacain und Metacam vor dem Eingriff kann dazu beitragen, postoperative Beschwerden zu reduzieren und eine schnellere Genesung der Tiere zu fördern. Die Cisterna magna, die sich an der Schädelbasis befindet, wird durch gründliches Trocknen des Operationsfeldes mit einem sterilen Wattestäbchen sichtbar gemacht. Für die aktuelle Untersuchung ist die Operationsregion etwa 1 cm groß, was der maximalen Fläche entspricht, die genutzt werden kann, um eine klare Sicht auf die Cisterna magna zu erhalten. Zusätzlich hilft die kleine Schnittstelle dem Tier, schneller zu heilen.

Es ist von entscheidender Bedeutung, die Wirkstoffretention im Cisterna magna-Raum zu maximieren. Frühere Forschungen versuchten, ein Austreten von Medikamenten zu verhindern, indem nach der Verabreichung von Elastase ein Wattestäbchen an der Injektionsstelle platziertwurde 21. Wir haben jedoch Bedenken hinsichtlich der Wirksamkeit dieser Methode, da die saugfähige Natur von Baumwolle an der Injektionsstelle möglicherweise die Wirksamkeit von Elastase beeinträchtigen könnte, indem sie nach der Injektion wieder resorbiert wird. In ähnlicher Weise wurde in einer anderen Studie20 die Nadel nach der Injektion von Elastase in die Cisterna magna schnell entfernt, was eine weitere potenzielle Herausforderung darstellt, um sicherzustellen, dass das optimale Medikament in den Cisterna magna-Raum gelangt, was möglicherweise zu einem Austritt von Elastase in die Zerebrospinalflüssigkeit führt. Daher beginnt die hier vorgeschlagene Methode mit der Punktion der Cisterna magna, um Liquor cerebrospinalis (CSF) freizusetzen, gefolgt von der Platzierung eines sterilen Wattestäbchens an der Einstichstelle, um überschüssigen Liquor zu absorbieren und den Druck im Raum zu verringern. Anschließend wird das Wattestäbchen entfernt und die Nadel wieder an derselben Stelle eingeführt, um die Elastase in den Zisternenraum zu injizieren, ohne das Wattestäbchen erneut aufzutragen. Darüber hinaus haben wir uns dafür entschieden, die Nadel 1-2 Minuten nach der Injektion an Ort und Stelle zu lassen, damit die Elastase ausreichend in der Cisterna magna diffundieren kann, bevor sie sanft zurückgezogen wird. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Technik eine injektionsfreie Hand und eine stetige Verankerung der Nadel erfordert, während die Cisterna magna punktiert und die Elastase langsam injiziert wird. Darüber hinaus ist es wichtig, die großen Blutgefäße in der Cisterna magna bei der Injektion nicht zu beschädigen, da dies zu Komplikationen wie dem Kreisen nach der Operation führen kann, was ein Endpunkt ist und eine Euthanasierung erfordert. Insgesamt zeigt die Methode eine Dilatation, die bis zu 3 Monate nach einer einzigen Elastase-Injektion in die Cisterna magna anhält und die bei früheren Methoden beobachtete2-wöchige Dilatation übertrifft 20,21. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz die Dauer der Dilatation verlängert, aber auch Substanzen wie Elastase konsequent direkt an das Gehirn abgibt. Diese Methode wird bevorzugt wegen ihres minimal-invasiven Ansatzes zum Transport von Substanzen über die Blut-Hirn-Schranke und bietet einen zusätzlichen Vorteil, da sie für die Abgabe von Medikamenten an das zentrale Nervensystem weiter ausgebaut werden kann.

Offenlegungen

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Es besteht kein Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Studie wurde durch die unschätzbaren Beiträge von Stephanie Tam ermöglicht, die bei den Operationen Unterstützung geleistet hat. Wir danken ihr herzlich für ihre Hilfe. Die National Institutes of Health (AG066162) zur Unterstützung dieser Forschung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
23 G KatheterUniversity Medstore2546-CABD305145Wird für die Perfusion benötigt  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolutes EthanolUniversity Medstorehttps://www.uoftmedstore.com/index.szZum Entfernen des Mikrofils
Betadin-Peeling#https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrubSterilisation
Betadin-LösungAmazonhttps://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHWSterilisation
BupivacainZur Verfügung gestellt von animal facilityN/AAnalgetic
Clippers BrainTree Scientific IncCLP-41590Rasierpelz
Baumwolle Q-tipUniversity Medstore1962Für die Chirurgie (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
ElastaseSigma-aldrich  E7885Zur Erweiterung von Blutgefäßen
EthanolUniversity Medstore39752-P016-EAANSterilisation (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Ziege Anti-Maus 568InvitrogenA11004Zum Färben reifer Neuronen
Graphpad-Prisma 10Graphpad-Prisma 10https://www.graphpad.com/Statistische Analysesoftware
Hamilton-SpritzeSigma-aldrich28614-UInjektion Elastase
WärmekissenAmazonhttps://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZAufrechterhaltung der Körpertemperatur
ImageJ SoftwareFiji Imagej softwareimagej.net (USA)Bildanalyse-Software
InduktionskammerBereitgestellt von TiereinrichtungN/AAnästhesie Induktion
Metacamzur Verfügung gestellt von TiereinrichtungN/AAnalgetikum
MethylsalicylatSigma-aldrichM6752Zum Entfernen der Mikrofile
MicrofilFlow Tech, Carver, Massachusettshttps://www.flowtech-inc.com/order/  Farbstoff (gelb)
Monoklonales Anti-NeuN-Anti-NeuN für die MausMillipore SigmaMAB377Zum Färben reifer Neuronen
Olympus VS200 Objektträgerscanner und VSI-Software.Olympus Life Sciencehttps://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[Downloads][id]=847254104Bildgebungssoftware
ParaformaldehydeUniversity MedstorePAR070.1Für die Proteinfixierung  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
PerfusionspumpeVWR Internationalhttps://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumpsWird für die Perfusion benötigt
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Operation ChirurgischeSchereUniversity Medstore22751-A9-240Für Chirurgie (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Chirurgisches KlebebandUniversity Medstorehttps://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2Befestigen Sie das Tier auf der Windel
NähteUniversity Medstore2297-VS881Für Chirurgie (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 PinzetteUniversity Medstore7731-A10-612Für chirurgische Eingriffe (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
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Referenzen

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