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Methodenartikel

Neuartiges Quantifizierungsprotokoll für das Fortschreiten der kardiovaskulären Verkalkung unter Verwendung von longitudinalen MicroPET/MicroCT-Bildern

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DOI:

10.3791/66805

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15. November 2024

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1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 4Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopaedic Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 6Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 7Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses neuartige Protokoll beinhaltet die Quantifizierung des kardiovaskulären Verkalkungsverlaufs aus seriellen Mikro-Positronen-Emissions-Tomographie (PET)/Mikro-Computertomographie (CT)-Bildern bei kleinen Versuchstieren.

Zusammenfassung

Die Mikro-Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und die Mikro-Computertomographie (CT) sind leistungsfähige und ideale Forschungsinstrumente, um das Fortschreiten der kardiovaskulären Verkalkung zu verfolgen. Aufgrund ihrer nicht-invasiven Natur können kleine Forschungstiere zu mehreren Zeitpunkten abgebildet werden. Die Herausforderung liegt in der genauen Quantifizierung der kardiovaskulären Verkalkung. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das Bilder aus den späteren Krankheitsstadien als Vorlage verwendet, um das Fortschreiten der kardiovaskulären Verkalkung in Längsschnittstudien genau zu quantifizieren. Das Protokoll umfasst 1) die Ausrichtung des Brustbereichs in mehreren Bildern desselben Tieres während einer Längsschnittstudie als ersten Schritt, 2) die Definition einer Region of Interest (ROI) innerhalb des Herzens und der Aorta an der Stelle größerer Kalziumablagerungen, die in späteren Bildern sichtbar werden, und 3) die gleichzeitige Segmentierung und Quantifizierung von Kalziumablagerungen über alle Bilder, die während der Längsschnittstudie aufgenommen wurden. Diese optimierte Methode verbessert die Genauigkeit der Bildanalyse bei der Verfolgung des Fortschreitens der kardiovaskulären Verkalkung, indem sie die Präzision der ROI-Definition verbessert und die Variabilität reduziert, die mit früheren Techniken verbunden ist, die einzelne Scans unabhängig voneinander analysieren.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind eine der weltweit führenden Ursachen für Morbidität und Mortalität und erfordern eine gründliche Untersuchung, um ihre Mechanismen aufzudecken und wirksame präventive und therapeutische Strategien zu entwickeln. Die Verkalkung der Koronararterien (CAC) wird von Experten auf diesem Gebiet weithin als prädiktiver Faktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen anerkannt, der das Risiko einer kardiovaskulären Mortalität signifikant erhöht 1,2,3,4,5. Mikroskopische Verkalkungen gelten als die frühesten Stadien der kalzien Atherosklerose, und der Begriff "Mikroverkalkungen" wurde verwendet, um sich auf Kalziumablagerungen zwischen 0,5 und 50 μm mit einem Durchmesser von 6,7,8,9 zu beziehen. Es wird angenommen, dass diese kleinen Verkalkungen zu größeren Kalziumablagerungen zusammenwachsen, die das Fortschreiten von Kalkablagerungen befeuern 6,7.

Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und die Computertomographie (CT) dienen als wertvolle Forschungsinstrumente, die häufig zur nicht-invasiven Beurteilung der kardiovaskulären Verkalkung in vivo eingesetzt werden 5,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Diese bildgebenden Verfahren erweisen sich als besonders vorteilhaft für die Verfolgung des Fortschreitens der Gefäßverkalkung in Längsschnittstudien mit kleinen Versuchstieren 11,12,13,19. Die MicroCT-Bildgebung hat sich als wirksam bei der Erstellung anatomischer Bilder von relativ großen Kalziumablagerungen erwiesen 11,12,13,19,20.Sein Nutzen für die Abbildung kleiner Kalziumablagerungen in lebenden Tieren wird jedoch durch seine räumliche Auflösung von ~100 μm 8,14 eingeschränkt, was es schwierig macht, die Verkalkung in ihren Anfangsphasen zu untersuchen.

Ein bemerkenswerter Fortschritt ist die Einführung der kombinierten microPET/microCT-Bildgebung mit dem PET-Tracer, dem mit Fluorid-18 markierten Natriumfluorid (18F-NaF), als Standardmethode zum Nachweis von Verkalkungen aufgrund ihrer Bindung an die Mineraloberfläche. Bei diesem Ansatz wird radioaktiv markiertes 18F-NaF verwendet, das nachweislich die Calciummineraloberfläche10,13 identifiziert, da die Fluoridionen kovalent an Calciumhydroxylapatit binden und Hydroxylgruppen ersetzen, um Fluorapatit21 zu bilden. In Übereinstimmung mit der langsameren Austauschrate im Verhältnis zum radioaktiven Zerfall des 18F (Halbwertszeit ~110 min) und zur Clearance des Tracers durch die Nieren22 fanden Irkle und Kollegen13, dass die Bindung von 18F-NaF an kalzifizierte Karotisproben zum Zeitpunkt des Nachweises auf die Oberfläche beschränkt war. Daher sollte die Traceraufnahme in direktem Zusammenhang mit der Mineraloberfläche stehen, die größer ist, wenn eine bestimmte Menge an Mineral in mehreren kleinen Herden oder in poröser Form vorkommt, als wenn sie in wenigen, großen, festen Lagerstätten vorhanden ist. Durch die Akzentuierung der frühesten Stadien der Mineralisierung mit hoher Sensitivität kann die 18F-NaF-PET-Bildgebung wertvolle Einblicke in die frühen Stadien der Krankheit liefern, was sie besonders nützlich für die Untersuchung präventiver und therapeutischer Strategien macht 13,14,15.

Trotz der jüngsten Fortschritte in der kombinierten microPET/microCT-Bildgebung von Gefäßverkalkungen gibt es Möglichkeiten, die Genauigkeit der Bildanalyse in longitudinalen, kardiovaskulären Verkalkungsstudien zu verbessern. Herkömmliche Ansätze verwenden eine arbeitsintensive, manuelle Abgrenzung von Regionen des Interesses (ROI) um jede sichtbare verkalkte Region in jeder Maus zu jedem einzelnen Zeitpunkt während der Längsschnittstudie. Diese Methode verringert die Präzision, insbesondere in den frühen Krankheitsstadien, wenn sich die Größe der Kalziumablagerungen den Nachweisgrenzen des Scanners nähert, wodurch möglicherweise einige Bereiche mit winzigen Ablagerungen unsichtbar werden, die in geringer Dichte angeordnet sind.

Im Bereich der Bildgebung bezieht sich die Ausrichtung im Allgemeinen auf die räumliche Ausrichtung einer Reihe von Bildern. Die von uns vorgeschlagene Methode führt das Alignment als neuartige Lösung für die bestehenden Herausforderungen ein und ermöglicht es den Forschern, einen konsistenten Ort zu verwenden, um das Fortschreiten der Verkalkung in seriellen Bildern einzelner Probanden während einer Längsschnittstudie zu verfolgen. Angesichts der Tatsache, dass bekannt ist, dass die Gewebeverkalkung von nanoskaligen Matrixvesikeln (50-150 nm) ausgeht, die sich zu mikroskopisch kleinen, dann makroskopischen Hydroxylapatit-Mineralien23 zusammenschließen, kann man retrospektiv identifizieren, wo Mikroverkalkungen in frühen Bildern lokalisiert waren, bevor sie erkennbar sind.

Die Verfolgung desselben Ortes über die Zeit, ermöglicht durch Bildausrichtung, ist die Grundlage für diese Methode. Es entfällt die Notwendigkeit, die frühesten Verkalkungsstadien direkt zu identifizieren, da der ROI auf der Grundlage der spätesten Stadien zugewiesen wird, in denen die Mineralisierung leicht identifiziert werden kann. In diesem Protokoll stellen wir eine verbesserte, optimierte Datenanalysemethode vor, die das Ausrichten einer Zeitreihe von Bildern als wichtigen Schritt beinhaltet, um die genaue Quantifizierung der Kalziumablagerung in longitudinalen, kombinierten microPET/microCT-Bildgebungsstudien zu verbessern (Abbildung 1). Während wir die PET/CT-Datenanalyse als Beispiel verwenden, kann diese Methode auf die Analyse anderer longitudinaler Bildgebungsdaten angewendet werden, einschließlich der Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT), der Magnetresonanztomographie (MRT) und der optischen Bildgebung24.

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Abbildung 1: Flussdiagramm der Protokollübersicht. Flussdiagramm, das das neuartige Protokoll zur Quantifizierung der kardiovaskulären Verkalkung zusammenfasst. Zu den allgemeinen Schritten gehören die longitudinale Bildgebung, die Ausrichtung von Bildern, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden, sowie die Segmentierung und Quantifizierung des verkalkten Bereichs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

Die repräsentativen Bilder zeigen eine weibliche Apolipoprotein-E-defiziente (Apoe-/-) Maus. Die Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, Los Angeles, überprüft und genehmigt.

1. Scannen von Tieren

  1. Füttern Sie die Maus zwischen den beiden Bildaufnahmen mit einer Standarddiät ohne jeglichen Eingriff. Wechseln Sie jedoch vor dem ersten Bild im Alter von 15 Monaten im Alter von 12 bis 14 Monaten zu einer westlichen Ernährung (21 % Fett, 0,2 % Cholesterin), um eine Aortenverkalkung zu Beginn zu induzieren.
  2. Stellen Sie sicher, dass der microPET/CT-Scanner routinemäßig kalibriert ist, um eine optimale PET-Datenerfassung und CT-Co-Registrierung zu gewährleisten. Führen Sie die Kalibrierungen gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  3. Betäuben Sie die Maus vor der Bildgebung 10 Minuten lang mit 2 % Isoflurangas in einer Kammer. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie den Zeh des Tieres ohne Reaktion einklemmen.
  4. Erfassen Sie microPET- (350-650 keV, 10 Minuten Scanzeit) und 100 μm microCT (80 kVp, 150 μA, 720 Projektion, 1 Minute Scanzeit) in einem kombinierten microPET/CT-Scanner 60 Minuten nach der intravenösen Injektion von 3,7 MBq von 18F-NaF. Erfassen Sie die microCT-Scans unmittelbar nach den microPET-Scans.
    HINWEIS: Das Scannerbett bewegte das Tier vom PET-Modal zum CT-Modal, während das Tier unter Narkose und in der gleichen Position blieb.
  5. Rekonstruieren Sie microPET-Bilder mit einem 3D-geordneten Algorithmus zur Maximierung der Erwartungserwartung (24 Teilmengen und 3 Iterationen) mit Zufalls-, Dämpfungs- und Zerfallskorrektur. Rekonstruieren Sie die CT-Bilder mit einem modifizierten Feldkamp-Algorithmus.
    HINWEIS: Nach der Bildgebung wurde die Maus überwacht, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangte, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Am Ende der Längsschnittstudie wurden alle Mäuse euthanasiert.

2. Importieren Sie DICOM-Dateien in die DICOM-Viewer-Software

HINWEIS: Obwohl dieses repräsentative Protokoll die ORS Dragonfly-Software unter einer nicht-kommerziellen Lizenz verwendet, erstreckt sich seine Flexibilität auch auf andere DICOM-Viewer-Softwareoptionen.

  1. Starten Sie die DICOM-Viewer-Software, indem Sie auf die Anwendung doppelklicken.
  2. Navigieren Sie zu Datei in der oberen linken Ecke. Wählen Sie im Dropdown-Menü DICOM-Bilder importieren... aus, um das Erscheinungsbild des Fensters DICOM-Bilder verwalten anzuzeigen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S1A).
  3. Klicken Sie im Fenster DICOM-Bilder verwalten auf die Registerkarte Ordnerinhalt . Wählen Sie auf der rechten Seite Ordner öffnen... , um die Ordner auszuwählen, die die DICOM-Dateien enthalten, die für eine Längsschnittstudie von Interesse sind (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S1B).
  4. Identifizieren Sie die Ordner, die die DICOM-Dateien enthalten. Klicken Sie auf Ordner auswählen , um den ersten Ordner in das Fenster DICOM-Bilder verwalten zu importieren (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S1C).
  5. Wählen Sie sowohl PET ("PT") als auch CT ("CT") DICOM-Dateien im Fenster "DICOM-Bilder verwalten " aus. Klicken Sie anschließend auf der rechten Seite auf Studie anzeigen , um alle importierten DICOM-Bilder zu öffnen (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S1D).
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 für jeden Ordner, der DICOM-Bilder enthält, die sich auf dasselbe einzelne Subjekt in der Längsschnittstudie beziehen.

3. Passen Sie die DICOM-Viewer-Einstellungen an, um die Bildvisualisierung zu optimieren

  1. Ändern Sie das Layout, um vier Ansichten anzuzeigen (3D, transversal, koronal, sagittal), wie in der ergänzenden Datei 1 - Ergänzende Abbildung S2 dargestellt. Suchen Sie in der Dropdown-Liste Layout auf der linken Seite nach Ansichten (in der ausgewählten Szene) und wählen Sie ein Layout aus, in dem vier Ansichten angezeigt werden.
  2. Benennen Sie Bilder um, um Zeitpunkte anzuzeigen und anzugeben, ob es sich um PET- oder CT-Bilder handelt. Wählen Sie den Bildnamen aus und doppelklicken Sie , um jedes Bild umzubenennen.
  3. Aktivieren Sie ein Bild, indem Sie auf der rechten Seite auf das Dropdown-Menü Dateneigenschaften und -einstellungen zugreifen. Klicken Sie auf das Augensymbol links neben jedem Bildnamen, um die Sichtbarkeit umzuschalten (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S2)
  4. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast für jedes CT-Bild individuell an.
    HINWEIS: Die optimale Helligkeit und der Kontrastbereich der CT können je nach Motiv, Bildgebungsprotokoll, Scanner und Rekonstruktionsparametern variieren25,26; Alle Anpassungen sollten jedoch für einen einzelnen Probanden in einer Längsschnittstudie konsistent sein.
    1. Wählen Sie ein CT-Bild aus und schalten Sie es ein, indem Sie auf den Bildnamen unter Dateneigenschaften und -einstellungen klicken (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S2).
    2. Suchen Sie das Histogramm in der Dropdown-Liste Fensternivellierung , die sich auf der Registerkarte "Haupt" auf der linken Seite des Bildschirms befindet. LogY oberhalb des Histogramms aktivieren; Klicken und schieben Sie dann die gelben Bereichsindikatoren , um den zweiten Peak im Histogramm vollständig zu erfassen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S3A). Nehmen Sie leichte Anpassungen vor, bis die optimale Helligkeit/der optimale Kontrast erreicht ist. In Abbildung 2B finden Sie ein Beispiel für ein helligkeits-/kontrastangepasstes CT-Bild.
    3. Suchen Sie das Feld Ausgewählter Bereich unter dem Histogramm für die Fensternivellierung (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S3B). Notieren Sie sich die Werte für den ausgewählten Bereich , die in den nachfolgenden Schritten verwendet werden sollen.
    4. Wählen Sie ein zweites CT-Bild aus und schalten Sie es ein (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S3C). Geben Sie die ausgewählten Bereichswerte aus dem ersten CT-Bild in das Feld Ausgewählter Bereich für das zweite CT-Bild ein (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S3B-S3D). Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle aufeinanderfolgenden Bilder.
  5. Verfeinern Sie jedes PET-Bild, indem Sie den Filter Nachschlagetabelle einzeln anpassen.
    HINWEIS: Der optimale PET-Farbskalenbereich kann je nach Motiv, Bildgebungsprotokoll, Scanner und Rekonstruktionsparametern variieren27; Alle Anpassungen sollten jedoch für einen einzelnen Probanden in einer Längsschnittstudie konsistent sein.
    1. Wählen Sie ein PET-Bild aus und aktivieren Sie es, indem Sie auf den Bildnamen unter Dateneigenschaften und -einstellungen klicken (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S2).
    2. Suchen Sie in der Dropdown-Liste Fensternivellierung auf der Registerkarte Main nach Lookup Table (LUT) und scrollen Sie, um PET in der Dropdown-Liste LUT zu finden, und wählen Sie den PET-Filter (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S4A) aus.
    3. Passen Sie den ausgewählten Bereich mithilfe des Histogramms in der Dropdown-Liste Fensternivellierung an, um eine optimale Visualisierung zu erzielen. LogY oberhalb des Histogramms aktivieren; Fahren Sie dann fort, die gelben Bereichsindikatoren anzuklicken und in Richtung der Position zu schieben, die in der ergänzenden Abbildung S4B (ergänzende Datei 1) gezeigt ist. Nehmen Sie geringfügige Anpassungen vor, bis der optimale ausgewählte Bereich für die PET-Bildvisualisierung erreicht ist. In Abbildung 2D finden Sie ein Beispiel für ein PET/CT-Bild, das für den optimalen ausgewählten Bereich angepasst wurde.
    4. Suchen Sie die Dropdown-Liste "Ausgewählter Bereich " unter dem Histogramm "Fensterwaage" (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S4B). Notieren Sie sich die ausgewählten Bereichswerte, die in den nachfolgenden Schritten verwendet werden sollen.
    5. Wählen Sie ein zweites PET-Bild aus und schalten Sie es ein (Ergänzende Datei 1 - Abbildung S4C). Wiederholen Sie Schritt 3.5.2 für das zweite Bild.
    6. Geben Sie die ausgewählten Bereichswerte aus dem ersten PET-Bild in das Feld "Ausgewählter Bereich" für das zweite PET-Bild ein (Ergänzende Datei 1 - Abbildung S4B-S4D). Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle aufeinanderfolgenden Bilder.

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Abbildung 2: Anpassung der DICOM-Viewer-Einstellungen zur Optimierung der Bildvisualisierung. (A,B) Koronale Ansicht von CT-Bildern (A) vor und (B) nach Kontrast-/Helligkeitsanpassung. (C,D) Koronale Ansicht von PET/CT-Bildern (C) vor und (D) nach der Anpassung der Lookup-Tabelle. Abkürzungen: CT = Computertomographie; PET = Positronen-Emissions-Tomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Richten Sie den Brustbereich in CT-Bildern aus

HINWEIS: Der Einfachheit halber dient ein CT-Bild als "Basisbild" und wird nicht verschoben oder gedreht. Das zweite CT-Bild (und eventuell nachfolgende Serienbilder) wird verschoben und/oder gedreht, um es an das Basisbild anzupassen. Dies wird zum Zweck der Demonstration als "Overlay"-Bild bezeichnet. Bei der Ausrichtung ist es wichtig, zwischen dem Basisbild und allen anderen Überlagerungsbildern zu unterscheiden.

  1. Deaktivieren Sie alle PET-Bilder und schalten Sie das Basis-CT-Bild ein, indem Sie auf das Augensymbol links neben jedem Bildnamen in der Dropdown-Liste "Dateneigenschaften und -einstellungen " klicken.
  2. Ändern Sie die Deckkraft des CT-Bildes auf ~50%. Klicken Sie auf eine der 2D-Ansichten. Suchen Sie unter dem Feld Fensternivellierung das Dropdown-Menü Deckkraftzuordnung und schieben Sie die Deckkraftskala in die Mitte (Ergänzende Datei 1 - Abbildung S5).
  3. Schalten Sie das Overlay-CT-Bild ein und wiederholen Sie Schritt 4.2.
  4. Ändern Sie den Filter des Overlay-CT-Bildes, um zwischen dem Basis-CT-Bild und dem Overlay-CT-Bild zu unterscheiden. Suchen Sie in der Dropdown-Liste Fensternivellierung auf der Registerkarte Main nach Lookup Table (LUT). Scrollen Sie unter dem Dropdown-Menü LUT und klicken Sie auf den roten Filter.
    HINWEIS: In jeder Ansicht sollten nun zwei CT-Bilder vorhanden sein, wie in der ergänzenden Abbildung S5 (ergänzende Datei 1) dargestellt.
  5. Verwenden Sie die Werkzeuge "Verschieben/Drehen" in 2D-Ansichten, um den Brustbereich im Überlagerungsbild so nah wie möglich an dem im Basisbild auszurichten. Beziehen Sie sich auf den Brustkorb, die obere Wirbelsäule und das Brustbein als Indikatoren für die Ausrichtung des Brustkorbs im CT-Bild.
    HINWEIS: Die folgenden Aktionen können nur in 2D-Ansichten (transversal, koronal oder sagittal) ausgeführt werden (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S1). Um das beste Ergebnis zu erzielen, wechseln Sie zwischen allen drei 2D-Ansichten und verwenden Sie die Verschieben/Drehen-Werkzeuge, um den Brustbereich in jeder Ansicht auszurichten.
    1. Wählen Sie das Overlay-Bild in der Dropdown-Liste "Dateneigenschaften und -einstellungen " aus und klicken Sie einmal, um eine der 2D-Ansichten auszuwählen.
    2. Suchen Sie das Dropdown-Menü Verschieben/Drehen auf der Registerkarte Haupt und klicken Sie auf das Symbol Verschieben (Ergänzende Datei 1 - Abbildung S6A).
    3. Klicken und ziehen Sie auf das Übersetzungsfeld in der unteren linken Ecke und drehen Sie den Drehpunkt in der Mitte der ausgewählten 2D-Ansicht, um das Überlagerungsbild so zu verschieben, dass es ungefähr mit dem Basisbild übereinstimmt (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S6B). Beziehen Sie sich auf die Knochenstrukturen als Referenz für die Ausrichtung.
    4. Suchen Sie das Spurwerkzeug in der Dropdown-Liste "Manipulieren " und verschieben Sie die Achse in den Brustbereich, indem Sie auf die Mitte der Achse klicken und sie ziehen. Vergrößern Sie den Brustbereich, indem Sie auf die mittlere Scroll-Taste der Computermaus klicken und die Maus vom Bildschirm weg ziehen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S6C).
  6. Passen Sie die Ausrichtung für eine präzise Positionierung mit Bruststrukturen wie dem Brustkorb, der oberen Wirbelsäule und dem Brustbein durch weitere Translations- und Rotationsanpassungen an. Wechseln Sie zwischen 2D-Ansichten, und wiederholen Sie die Schritte 4.5.3 bis 4.5.4, bis die beiden Bilder so ausgerichtet sind, dass sie Abbildung 3 ähneln.
  7. Nachdem die Basis- und die erste Overlay-CT-Bilder ausgerichtet sind, ändern Sie den Filter des Overlay-CT-Bildes in der Dropdown-Liste LUT wieder in Graustufen . Wiederholen Sie Abschnitt 4 für alle Overlay-CT-Bilder desselben Tieres mit einem konstanten Basisbild.

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Abbildung 3: Ausrichtung aller CT-Bilder. (A,B) Koronale Ansicht von Basis- (grau) und Overlay-CT-Bildern (rot) (A) vor und (B) nach der Ausrichtung. (C,D) Sagittale Ansicht von CT-Bildern (C) vor und (D) nach der Ausrichtung. Blaue Pfeile zeigen den Brustkorb der Maus (1), (2) die Wirbelsäule und (3) das Brustbein. Abkürzung: CT = Computertomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. PET-Bilder mit entsprechenden CT-Bildern co-registrieren

HINWEIS: Die Ausrichtung des Overlay-CT-Bildes und des Basis-CT-Bildes führt zunächst zu einer Fehlausrichtung des Overlay-CT-Bildes mit dem jeweiligen PET-Bild, das in Abbildung 4 zu sehen ist. Das PET-Bild muss erneut mit dem entsprechenden CT-Bild co-registriert werden.

  1. Schalten Sie das Overlay-CT-Bild und das entsprechende PET-Bild ein, indem Sie auf das Augensymbol links neben dem jeweiligen Bildnamen klicken.
  2. Ändern Sie die Deckkraft der PET- und CT-Bilder auf ~50%. Suchen Sie in der Dropdown-Liste Fensternivellierung die Dropdown-Liste Deckkraftzuordnung und schieben Sie die Deckkraftskala in die Mitte (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S5).
  3. Verwenden Sie die Werkzeuge "Verschieben/Drehen" in 2D-Ansichten, um das PET-Bild mit dem entsprechenden CT-Bild auszurichten, basierend auf der Knochenstruktur im CT-Bild und der 18-F-NaF-Knochenoberfläche im PET-Bild.
    1. Wählen Sie in der Dropdown-Liste Dateneigenschaften und -einstellungen das PET-Bild aus, das dem Overlay-CT-Bild entspricht, und klicken Sie einmal, um eine der 2D-Ansichten auszuwählen.
    2. Suchen Sie das Dropdown-Menü Verschieben/Drehen auf der Registerkarte Haupt und klicken Sie auf das Symbol Verschieben (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S6A).
    3. Klicken und ziehen Sie auf das Verschiebungsfeld in der unteren linken Ecke und drehen Sie den Drehpunkt in der Mitte der ausgewählten 2D-Ansicht (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S6B), um das PET-Bild so zu verschieben, dass es mit dem CT-Bild ko-registriert wird.
  4. Wiederholen Sie Abschnitt 5 für alle Overlay-PET- und CT-Bilder, die nicht mit ihren CT-Bildern co-registriert sind.
    HINWEIS: Wenn die Co-Registrierung abgeschlossen ist, sollten die entsprechenden PET/CT-Bilder über die gesamte Länge des Körpers ausgerichtet werden, wie in Abbildung 4 gezeigt.

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Abbildung 4: Abgleich der PET-Bilder mit dem entsprechenden CT-Bild. Ein repräsentatives PET-Bild und das entsprechende CT-Bild (A, C) vor und (B, D) nach der Co-Registrierung. Nach Abschluss der Co-Registrierung sollten die PET- und CT-Bilder ausgerichtet werden, wie in Panel B gezeigt. Abkürzungen: CT = Computertomographie; PET = Positronen-Emissions-Tomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Identifizieren Sie kardiovaskuläre Verkalkungen

  1. Identifizieren Sie den Zeitpunkt mit den größten vorhergesagten verkalkten Regionen in der Längsschnittstudie (d. h. späte Verkalkungszeit oder vorbehandelte Probanden). Wählen Sie das Bild aus, das diesem Zeitpunkt entspricht, um als "Referenzbild" zu dienen, wobei die am deutlichsten sichtbare Verkalkung hervorgehoben wird. Dieses ausgewählte Bild dient dann als Vorlage für den Vergleich mit allen anderen Bildern, die kleinere Verkalkungsflächen zu unterschiedlichen Zeitpunkten enthalten.
  2. Schalten Sie das Referenz-CT-Bild ein, indem Sie auf das Augensymbol links neben dem Bild klicken. Wählen Sie das Spurwerkzeug in der Dropdown-Liste "Manipulieren " aus und verschieben Sie die Achse um die Herzregion.
  3. Vergrößern Sie die Ansicht, um die verkalkten Regionen (kleine helle, dichte Stellen) zu finden, die sich über der Herzsilhouette zwischen Brustkorb, Brustbein und Wirbelsäule befinden (Abbildung 5). Wenn die verkalkten Bereiche nicht sofort sichtbar sind, scrollen Sie durch die Ebenen jedes Bildes, indem Sie eine 2D-Ansicht auswählen und mit der Maus scrollen.
  4. Verschieben Sie die Spurachse , um den Mauszeiger über den verkalkten Bereich zu bewegen, um die Sichtbarkeit in allen 2D-Ansichten zu gewährleisten. Eine visuelle Referenz der Verkalkungsbereiche in einem CT-Bild einer Maus finden Sie in Abbildung 5.
  5. Schalten Sie das entsprechende PET-Bild ein, um das Vorhandensein von Verkalkungen zu überprüfen.
    HINWEIS: Wenn die PET-Bildeinstellungen und die Co-Registrierung entsprechend angepasst wurden, sollte das PET-Bild die Aktivität um den verkalkten Bereich herum anzeigen, wie in Abbildung 5D dargestellt.

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Abbildung 5: Identifizierung von verkalkten Regionen im Herzen. Verkalkungsregionen, die in repräsentativen (A) sagittalen, (B) transversalen und (C) koronalen CT-Bildern sowie (D) einem koronalen PET/CT-Bild dargestellt sind. Gelbe Pfeile zeigen Kalkablagerungen an. Blaue Pfeile kennzeichnen Referenzstrukturen, die zur Bestimmung des Ortes der Verkalkung verwendet werden. Abkürzungen: CT = Computertomographie; PET = Positronen-Emissions-Tomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Zeichnen Sie ROIs um die verkalkten Regionen herum

  1. Schalten Sie das PET-Referenzbild aus. Schalten Sie nur das CT-Referenzbild ein, indem Sie auf das Augensymbol links neben dem Bild klicken.
  2. Suchen Sie die Dropdown-Liste Formen , und wählen Sie die Kugelform aus (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S7). Passen Sie die Abmessungen der Kugel an, indem Sie auf die Kanten klicken und sie ziehen, um die Größe zu ändern. Positionieren Sie die Kugel neu, indem Sie auf das mittlere Quadrat klicken und es ziehen.
    1. Navigieren Sie durch die 2D-Ansichten, um die Kugel sorgfältig zu positionieren. Die Kugel sollte den gesamten identifizierten Verkalkungsbereich und einen Teil des umliegenden Bereichs einkapseln, jedoch umliegende Knochen vermeiden. Eine visuelle Anleitung zum optimalen Zeichnen von Kugeln finden Sie in der ergänzenden Abbildung S7 (Ergänzende Datei 1) für die richtige Platzierung der Kugel.
  3. Klicken Sie in der Dropdown-Liste "Dateneigenschaften und -einstellungen " mit der rechten Maustaste auf den Namen der Kugel und wählen Sie "Zum ROI hinzufügen..." (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S8A), gefolgt von der Auswahl von Neuer ROI (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S8B).
    1. Weisen Sie dem neu erstellten ROI einen passenden Namen zu. Wählen Sie unter Geometrie das CT-Bild aus, für das ein ROI generiert werden soll (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S8C).
    2. Aktivieren Sie die ROI, indem Sie auf das Augensymbol links neben dem ROI-Namen klicken, und beobachten Sie eine farbige ROI, die der Größe der zuvor gezeichneten Kugel entspricht, wie in der ergänzenden Abbildung S8D (ergänzende Datei 1) dargestellt.
  4. Suchen Sie die Registerkarte Segment links neben der Hauptregisterkarte (Abbildung 6A). Die Registerkarte "Segment" ermöglicht das Erstellen und Bearbeiten von ROIs.
    HINWEIS: Die folgenden drei Schritte sind darauf ausgerichtet, einen ROI mit einer Präzision zu erzielen, die ausschließlich verkalkte Bereiche innerhalb der vorgesehenen Kugel hervorhebt.
    1. Wählen Sie den Referenz-ROI in den Dateneigenschaften und -einstellungen aus und suchen Sie das Dropdown-Menü Bereich auf der Registerkarte Segment . Klicken Sie hier, um die Option Bereich definieren zu aktivieren (Abbildung 6A).
    2. Ändern Sie den definierten Bereich mithilfe des Felds "Ausgewählter Bereich " (Abbildung 6A). Stellen Sie sicher, dass der definierte Bereich alle nicht verkalkten Pixel mit Werten der Hounsfield-Einheit (HU) unterhalb des Kalziumschwellenwerts umfasst. In dieser Demonstration wird ein Schwellenwert von 300 HU für Kalzium verwendet, und das Pixel mit der niedrigsten Dichte in diesem Bild beträgt -2.626. Daher beträgt der gewählte Bereich -2.626-300 HU.
    3. Nachdem der ausgewählte Bereich konfiguriert ist, klicken Sie auf Entfernen (Abbildung 6A), um alle Pixel unterhalb des angegebenen Schwellenwerts aus dem Kugel-ROI zu entfernen.
      HINWEIS: Diese Aktion führt zu einem neuen ROI, der ausschließlich die verkalkten Bereiche innerhalb der Kugel hervorhebt und den Fokus für die weitere Analyse optimiert. Abgeschlossene ROIs sollten dem in Abbildung 6B dargestellten ROI ähneln.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 bis 7.4 für alle aufeinanderfolgenden CT-Bilder, um einzigartige neue ROIs unter Verwendung einer gemeinsamen Referenzkugel zu erstellen. Benennen Sie jeden ROI so, dass er mit der Identifizierung seines spezifischen CT-Bildes übereinstimmt, um eine prägnante und organisierte Analyse zu gewährleisten.
    HINWEIS: Es sollte NICHT notwendig sein, eine neue Kugel für die ROI-Analyse jedes Bildes zu erstellen, da die Referenzkugel den größten verkalkten Bereich aller Bilder einkapseln sollte, vorausgesetzt, die Ausrichtung ist genau.

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Abbildung 6: Verwendung der Segmentierung, um den ROI auf verkalkte Bereiche zu beschränken. (A) Die Pfeile führen durch die Schritte, die erforderlich sind, um unerwünschte Dichtedaten aus dem ROI zu entfernen. Der blaue Pfeil zeigt auf die Registerkarte Segment . Der gelbe Pfeil markiert die Funktion Bereich definieren . grüne Pfeile zeigen die ausgewählten Bereichseingaben an; und der rote Pfeil zeigt auf die Schaltfläche Entfernen . (B) Nach Abschluss der Protokollschritte 7.4 bis 7.4.3 sollte der ROI die verkalkten Bereiche, wie in diesem Panel dargestellt, spezifisch abgrenzen. Abkürzung: ROI = Region of Interest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. Quantifizieren Sie den ROI für jedes Bild

  1. Wählen Sie den ROI, der quantifiziert werden soll, in der Dropdown-Liste "Dateneigenschaften und -einstellungen " aus.
  2. Suchen Sie die Dropdownliste Statistische Eigenschaften auf der rechten Seite unter der Dropdownliste Grundlegende Eigenschaften (Abbildung 7).
  3. Suchen Sie die Tabelle Dataset unter Statistische Eigenschaften. Wählen Sie über das Dropdown-Menü auf der rechten Seite den entsprechenden Bildgebungsdatensatz aus, der mit dem zu quantifizierenden ROI korreliert (Abbildung 7).
    1. Wählen Sie bei der Quantifizierung der CT-Daten innerhalb des ROI den Namen des CT-Bildes aus, der mit dem ROI korreliert.
    2. Wählen Sie bei der Quantifizierung der PET-Daten innerhalb des ROI den Namen des PET-Bildes aus, der dem ROI entspricht.
  4. Klicken Sie auf Aktualisieren , um quantifizierte Werte des ausgewählten verkalkten Bereichs abzurufen. Notieren Sie sich die Werte für Min., Max und Mittelwert gemäß der Dataset-Tabelle. Verwenden Sie die Mittelwerte zur Quantifizierung (Abbildung 7).
  5. Suchen Sie die Volumenberechnung oben im Feld Statistische Eigenschaften . Verwenden Sie dieses Volumen zur Quantifizierung (Abbildung 7).
  6. Bei CT-Datenbeständen werden die Werte in HU angegeben. Berechnen Sie den volumetrischen Calciumgehalt (vHU) anhand des Produkts aus dem mittleren ROI-Wert (HU) und dem Volumen aus ROI (mm3)12.
  7. Bei PET-Datensätzen werden die Werte in Becquerel (Bq) angegeben, die den Zerfällen/Sekunde entsprechen. Konvertieren Sie in Bq/mm3 , indem Sie den mittleren ROI-Wert (Bq) durch das Volumen des ROI (mm3) dividieren, um die Traceraufnahmekonzentration zu erhalten.

figure-protocol-6
Abbildung 7: Quantifizierung des ROI. Die Registerkarte "Statistische Eigenschaften" für einen ausgewählten ROI. Die roten Pfeile veranschaulichen die Schritte, die erforderlich sind, um statistische Informationen für einen Datensatz basierend auf dem ROI zu erhalten. Die roten Felder zeigen das Volumen und den mittleren Wert der Hounsfield-Einheit an, die für weitere Analyseberechnungen unerlässlich sind. Abkürzung: ROI = Region of Interest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

Analysemethoden
Dieser Abschnitt veranschaulicht die erfolgreiche Auslastung durch repräsentative Ergebnisse. Hier zeigen wir das kombinierte microPET/microCT-Bild einer einzelnen Maus, die im Alter von 15 und 18 Monaten gescannt wurde, nachdem sie im Alter von 12 bis 14 Monaten einer westlichen Diät (21 % Fett, 0,2 % Cholesterin) unterzogen wurde. Gemäß den Protokollabschnitten 2-8 zur Quantifizierung der Verkalkung maßen vier unabhängige Forscher getrennt voneinander den volumetrischen Kalziumgehalt...

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Diskussion

Dieses neuartige Protokoll ist ein verbesserter Ansatz zur Quantifizierung der kardiovaskulären Verkalkung. Aufgrund des nicht-invasiven Charakters der Bildgebung können longitudinale microCT-Bilder aufgenommen werden, um das Fortschreiten der kardiovaskulären Verkalkung bei Kleintieren zu verfolgen. Obwohl microCT-Bilder allein das Fortschreiten des Kalziumgehalts zeigen können, können microPET-Bilder, sofern verfügbar, zusätzliche Informationen liefern, insbesondere die verbesserte Erk...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken allen Mitgliedern des UCLA Crump Preclinical Imaging Technology Center für ihre Hilfe bei der Datenerfassung und -verarbeitung sowie bei der Wartung von Geräten und Infrastruktur. Wir danken Jeffrey Collins für seine Hilfe beim Betrieb des Zyklotrons und der 18F-NaF-Synthese. Wir danken der UCLA Statistical Consulting Group für ihre Hilfe bei der statistischen Analyse. Diese Arbeit wird unterstützt durch den NIH Cancer Center Support Grant (2 P30 CA016042-44 bis MT) und die National Institutes of Health, Heart, Lung, and Blood Institute (HL137647 und HL151391 bis YT und LLD). Der GNEXT PET/CT-Scanner wurde durch den NIH S10 Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1S10OD026917-01A1 an Arion Chatziioannou) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 cc sterile InsulinspritzenExel International#26028Wird für die intravenöse Injektion von 18F-NaF PET Tracer
18F-NaF PET TracerCNSI Cyclotron
Biorender BiorenderVerwendet für Abbildung 1
Weibliche Apoe-/- MausJackson Laboratories#002052B6.129P2-Apoe tm1Unc/J
GNEXT PET/CTSofie Biosciences, Dulles, Virginia
IsofluranPiramal IntensivpflegeWird als Anästhesie für die Bildgebung von Mäusen
verwendet ORS DragonflyComet Technologies Canada Inc.
SPSS StatisticsIBM
Western Diät für MäuseEnvigo#TD8813921% Fett, 0,2% Cholesterin

Referenzen

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