Methodenartikel

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

DOI:

10.3791/66806

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3. Mai 2024

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1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie wird ein neuartiges κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbad vorgestellt, das bemerkenswerte reversible Jamming-Unjamming-Übergangseigenschaften aufweist. Diese Attribute tragen zur Konstruktion biomimetischer Gewebe und Organe im eingebetteten 3D-Bioprinting bei. Das erfolgreiche Drucken von herz-/ösophagusähnlichem Gewebe mit hoher Auflösung und Zellwachstum demonstriert hochwertige Bioprinting- und Tissue-Engineering-Anwendungen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der eingebettete dreidimensionale (3D) Biodruck unter Verwendung eines körnigen Hydrogel-Stützbades hat sich als wichtige Technik für die Erstellung biomimetischer Gerüste erwiesen. Die Entwicklung eines geeigneten Gelsuspensionsmediums, das die präzise Abscheidung von Biotinte mit der Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen in Einklang bringt, stellt jedoch mehrere Herausforderungen dar, insbesondere bei der Erzielung der gewünschten viskoelastischen Eigenschaften. Hier wird ein neuartiges κ-Carrageen-Gel-Stützbad durch einen einfach zu bedienenden mechanischen Mahlprozess hergestellt, wodurch homogene submikroskalige Partikel hergestellt werden. Diese Submikrogele weisen ein typisches Bingham-Fließverhalten mit geringer Fließspannung und schnellen Scherverdünnungseigenschaften auf, die eine reibungslose Abscheidung von Biotinten ermöglichen. Darüber hinaus gewährleisten der reversible Gel-Sol-Übergang und die Selbstheilungskräfte des κ-Carrageen-Mikrogel-Netzwerks die strukturelle Integrität der gedruckten Konstrukte und ermöglichen die Schaffung komplexer, mehrschichtiger Gewebestrukturen mit definierten architektonischen Merkmalen. Nach dem Druck können die κ-Carrageen-Submikrogele leicht durch eine einfache phosphatgepufferte Kochsalzlösung entfernt werden. Weiteres Bioprinting mit zellbeladenen Biotinten zeigt, dass Zellen innerhalb der biomimetischen Konstrukte eine hohe Lebensfähigkeit von 92% aufweisen und Pseudopodien schnell vermehren sowie eine robuste Proliferation beibehalten, was auf das Potenzial dieser Bioprinting-Strategie für die Gewebe- und Organherstellung hinweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neuartige κ-Carrageen-Submikrogel-Medium einen vielversprechenden Weg für eingebettetes Bioprinting von außergewöhnlicher Qualität darstellt und tiefgreifende Auswirkungen auf die In-vitro-Entwicklung von gentechnisch hergestellten Geweben und Organen hat.

Einleitung

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Tissue-Engineering-Gerüste, einschließlich elektrogesponnener Fasern, poröser Schwämme und Polymer-Hydrogele, spielen eine zentrale Rolle bei der Reparatur und Rekonstruktion geschädigter Gewebe und Organe, indem sie ein strukturelles Gerüst bieten, das das Zellwachstum, die Geweberegeneration und die Wiederherstellung der Organfunktion unterstützt 1,2,3. Herkömmliche Gerüste stoßen jedoch auf Herausforderungen bei der genauen Nachbildung nativer Gewebestrukturen, was zu einer Diskrepanz zwischen dem technischen und dem natürlichen Gewebe führt. Diese Einschränkung behindert die effiziente Heilung von defektem Gewebe und unterstreicht die dringende Notwendigkeit von Fortschritten beim Gerüstdesign, um eine genauere Biomimikry zu erreichen. Dreidimensionales (3D) Bioprinting ist eine innovative Herstellungstechnik, die komplexe biologische Gewebestrukturen Schicht für Schicht mit Hilfe von Biomaterialtinten und -zellen präzise konstruiert4. Unter den verschiedenen Biomaterialien erweisen sich Polymer-Hydrogele mit ihrem unverwechselbaren Netzwerk, das die In-situ-Verkapselung von Zellen erleichtert und ihr Wachstum entscheidend unterstützt, als ideale Biotinten 5,6. Nichtsdestotrotz neigen viele weiche und hochhydratisierte Hydrogele dazu, während des Druckprozesses eine Unschärfe oder einen schnellen Zusammenbruch der gedruckten Gerüststrukturen zu induzieren, wenn sie als Biotinten verwendet werden. Um diese Herausforderung zu meistern, verwendet die eingebettete 3D-Bioprinting-Technologie ein Mikrogelbad als Stützmaterial, das eine präzise Abscheidung von weicher Biotinte ermöglicht. Nach der Gelierung der Hydrogel-Biotinten werden durch Entfernen des Mikrogelbads veredelte bionische Gerüste mit komplizierten Strukturen erhalten. Materialien wie Gelatine 7,8, Agarose9 und Gellangummi10,11 wurden verwendet, um Mikrogelbäder für den eingebetteten 3D-Biodruck herzustellen und die Anwendung von weichen Hydrogelen im Tissue Engineering erheblich voranzutreiben. Die mikrometergenaue und ungleichmäßige Partikelgröße dieser Partikelgele wirkt sich jedoch nachteilig auf die Auflösung und Wiedergabetreue des 3D-Drucksaus 12,13,14. Es besteht ein dringender Bedarf, einen gelartigen Suspensionsschwimmer mit kleinen und gleichmäßig dispergierten Partikeln herzustellen, der Vorteile bei der Erzielung von High-Fidelity-Bioprinting bietet.

In diesem Protokoll wird ein neuartiges Opfergranulat-κ-Carrageen-Suspensionsbad mit einem einheitlichen Submikron-Gehalt für den eingebetteten 3D-Druck vorgestellt. Dieses innovative Submikrogel-Badverhalten des schnellen Jamming-Unjamming-Übergangs ermöglicht die präzise Herstellung von biomimetischen Hydrogel-Gerüsten mit hoher Strukturtreue15. Unter Verwendung dieses neuen Suspensionsmediums wird eine Reihe von biomimetischen Gewebe- und Organkonstrukten mit mehrschichtigen Gewebestrukturen erfolgreich gedruckt, wobei eine Komposit-Biotinte aus Gelatinemethacrylat und Seidenfibromethacrylat verwendet wird. In dieser Studie haben wir die Speiseröhre als biomimetisches 3D-Bioprinting-Objekt ausgewählt, vor allem weil die Speiseröhre nicht nur eine mehrschichtige Gewebestruktur aufweist, sondern auch ihre Muskelschicht eine innere kreisförmige und eine äußere longitudinale komplexe Schichtstruktur aufweist. Die Sicherstellung der richtigen Ausrichtung und Organisation dieser Schichten ist für die Regeneration des funktionellen Gewebes unerlässlich. Daher ist es uns ein großes Anliegen, die vielschichtige Architektur der Speiseröhre nachzubilden. Noch wichtiger ist, dass wir κ-Carrageen-Submikrogele als Suspensionsbad und GelMA/SFMA als Biotinte verwendeten, um ein biomimetisches Gerüst für das Tissue Engineering zu entwerfen und zu konstruieren. Die gedruckte Speiseröhre kann durch wiederholtes Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung leicht gelöst werden. Darüber hinaus ist das κ-Carrageen-Submikrogelbad frei von zytotoxischen Substanzen, was eine hohe Zytokompatibilität gewährleistet15. Die glatten Muskelzellen, die in anisotropen Gerüsten geladen sind, zeigen eine bemerkenswerte Spreizaktivität. Dieses einheitliche Sub-Mikrogel-Suspensionsmedium bietet einen neuen Weg für die Herstellung komplexer Gewebe und Organe durch eingebetteten 3D-Biodruck.

Protokoll

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1. Vorbereitung des κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbades

  1. Bereiten Sie 500 mL κ-Carrageen-Suspensionsbad (0,35 % Gew./Vol.) vor, indem Sie 1,75 g κ-Carrageenpulver in 500 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in einer 1.000 mL Glasflasche geben.
  2. Führen Sie einen 70 mm Magnetrührstab in die Glasflasche ein, um die wässrige Mischung zu verrühren. Ziehen Sie den Glasflaschenverschluss fest und lösen Sie ihn dann um eine halbe Umdrehung.
  3. Stellen Sie die Glasflasche in ein 70 °C heißes Wasserbad und erhitzen Sie sie. Schalten Sie den Magnetrührer mit einer Drehzahl von 300 U/min ein, stellen Sie die Flasche auf und rühren Sie, bis sich das Polymer vollständig aufgelöst hat.
  4. Nehmen Sie eine weitere Glasflasche und stellen Sie sie zur Sterilisation in einen Autoklaven mit 121 °C für 30 Minuten.
  5. Nachdem der Hochdrucksterilisator auf 80 °C abgekühlt ist, nehmen Sie die Flasche aus dem Sterilisator und stellen Sie sie zur weiteren Handhabung auf die ultrareine Werkbank.
  6. Die vollständig gelöste κ-Carrageen-Lösung wird mit einem 0,22 μm Filter in die sterilisierte Glasflasche filtriert.
    HINWEIS: Führen Sie die Filtration schnell durch, während die Lösung heiß ist, um zu verhindern, dass das κ-Carrageen abkühlt und den Filter verstopft.
  7. Die κ-Carrageen-Lösung wird 12 h lang bei 4 °C gelagert, um eine kationenvernetzte Gelierung zu induzieren.
  8. Mahlen Sie die κ-Carrageen-Hydrogele mechanisch mit einem 60-mm-Magnetrührer mit einer Rührgeschwindigkeit von 1200 U/min bei 25 °C, bis es erfolgreich in einen flüssigen Zustand übergeht, was ca. 60 Minuten dauert.
    HINWEIS: Lagern Sie die κ-Carrageen-Hydrogele zwischen 25-37 °C, um eine Gelierung bei niedrigen Temperaturen oder eine Auflösung bei hohen Temperaturen zu vermeiden.

2. Herstellung von Biotinten aus Gelatinemethacrylat/Seidenfibroinmethacrylat-Verbundwerkstoffen

  1. Bereiten Sie Komposit-Biotinten her, indem Sie 10 % (wt/vol) Gelatinemethacrylat (GelMA) und 6 % (wt/vol) Seidenfibroinmethacrylat (SFMA) in PBS-Lösung (pH 7,4) kombinieren. Wiegen Sie 2,0 g GelMA und 1,2 g SFMA-Pulver separat ab.
  2. Geben Sie die Pulver langsam in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 10 mL PBS-Lösung separat in die 50 mL Zentrifugenröhrchen.
  3. Jeweils mit einem 10 mm Magnetrührer bestücken und ständig umrühren und im Wasserbad bei 45 °C erhitzen. Lassen Sie die GelMA- und SFMA-Pulver vollständig auflösen, was ca. 30 Minuten dauert.
  4. Die GelMA- und SFMA-Lösungen werden in gleichem Volumen unter ständigem Rühren bei 45 °C gemischt. Filtern Sie die Komposit-Biotinten mit einem Filter mit einer Porengröße von 100 μm.
  5. Sterilisieren Sie die Komposit-GelMA/SFMA-Biotinten durch UV-Bestrahlung in einer Biosicherheitswerkbank für 12 h.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Biotinten sofort vor und verwenden Sie sie, um eine vorzeitige Gelierung der SFMA durch Selbstorganisation zu verhindern.

3. Rheologische Charakterisierung des κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbades

  1. Inbetriebnahme und Vorbereitung von rheologiebezogenen Geräten.
    1. Schalten Sie den Luftkompressor für 30 Minuten ein und stellen Sie sicher, dass der Druck 30 psi erreicht. Entfernen Sie die Lagerklemme, indem Sie die Zugstange gegen den Uhrzeigersinn drehen. Befestigen Sie die schwarze Abdeckung darunter und drehen Sie die Knopfachse oben am Instrument im Uhrzeigersinn.
    2. Schalten Sie das Rheometer ein und lassen Sie es initialisieren. Schalten Sie den Wasserumlaufschalter ein und lassen Sie die Temperatur 15 °C erreichen.
    3. Öffnen Sie die Rheometer-Steuerungssoftware, um die Online-Verbindung herzustellen.
  2. Kalibrieren Sie das Rheometer und installieren Sie die parallele Plattengeometrie.
    1. Führen Sie die Gerätekalibrierung in der Steuerungssoftware durch, was hauptsächlich die Anpassung des Trägheitspfads des Kalibrierinstruments umfasst. Montieren Sie eine parallele Plattengeometrie mit einem Durchmesser von 40 mm am Ende der Zugstange. Halten Sie die Sperrtaste 3 Sekunden lang gedrückt, um die Motorwelle in die Ausgangsposition zu bewegen und eine konsistente Geometrieplatzierung zu gewährleisten.
    2. Wählen Sie in der Steuerungssoftware den Kalibrier-Manager aus und klicken Sie anschließend auf die Tasten Trägheit, Reibungskalibrierung und Rotationsabbildung , um die parallele Plattengeometrie zu kalibrieren.
  3. Nullen Sie die Spalthöhe des Rheometers, indem Sie ein Standardverfahren zur Spaltnullierung durchführen, um eine präzise Messung zu gewährleisten.
  4. Richten Sie die Versuchsschritte ein, einschließlich einer Strömungsrampe mit einer Scherrate von 0,01 bis 1000 1/s, einem Amplituden-Sweep von 0,1 % bis 100 % Dehnung bei 10 rad/s, einem mehrstufigen Oszillationszeit-Sweep mit einer Dauer von 60 s und abwechselnden Dehnungen von 1 % und 100 % bei 10 rad/s und einem mehrstufigen Peak-Hold-Sweep mit einer Dauer von 120 s und einer abwechselnden Scherrate von 0,1 1/s und 10 1/s.
  5. Geben Sie 2 ml 0,35 % κ-Carrageen-Suspensionen auf die Peltier-Platte des Rheometers.
  6. Positionieren Sie den Geometriespalt auf 510 μm und entfernen Sie einen überschüssigen Überlauf am Rand der Spannvorrichtung. Stellen Sie den Probenspalt auf 500 μm ein, damit sich die Probe leicht über den Klemmrand hinaus erstrecken kann.
  7. Führen Sie ein Strömungsexperiment durch, indem Sie die Strömungsrampe aus den Optionen für den Versuchsplan auswählen.
    1. Wählen Sie den Test Strömungsrampe im Versuchsplan aus. Stellen Sie die Schergeschwindigkeiten von 0,001 bis 10 1/s bei einer Temperatur von 25 °C ein.
    2. Führen Sie Schritt 3.5 und das Experiment Strömungsrampe für die hinzugefügte Probe aus.
  8. Führen Sie einen zyklischen Peak-Hold-Test durch, um die Rückgewinnungsleistung des Materials zu bewerten.
    1. Wählen Sie im Versuchsplan den Peak Hold Sweep und stellen Sie 5 aufeinanderfolgende Experimente mit einer Zeit von 120 s bei 25 °C ein.
    2. Legen Sie die Scherrate für den ersten, dritten und fünften Schritt auf 0,01 1/s und für den zweiten und vierten Schritt auf 10 1/s fest.
    3. Fügen Sie eine neue Probe von 2 ml hinzu. Führen Sie Schritt 3.5 und den zyklischen Wiederherstellungstest durch.
  9. Durchführung einer Viskoelastizitätsanalyse, um den potenziellen Gel-Sol-Übergang des κ-Carrageen-Suspensionsbades zu bewerten.
    1. Wählen Sie den Amplituden-Sweep-Test in der Versuchsplanung aus. Die Schwingungsdehnung wird bei einer Temperatur von 25 °C von 0,1 % bis 100 % eingestellt. Klicken Sie auf "Start ", um das Amplituden-Sweep-Experiment für das hinzugefügte Sample durchzuführen.
  10. Führen Sie eine alternative Dehnungsanalyse durch, um die elastische Rückstellleistung des Materials zu bewerten.
    1. Wählen Sie Oszillation Time Sweep im Versuchsdesign und setzen Sie 5 aufeinanderfolgende Experimente mit einer Zeit von 60 s bei 25 °C.
    2. Stellen Sie die Dehnung für den ersten, dritten und fünften Schritt auf 1 % und für den zweiten und vierten Schritt auf 100 % ein.
    3. Fügen Sie eine neue Probe von 2 ml hinzu. Führen Sie Schritt 3.5 und den kontinuierlichen zyklischen Wiederherstellungstest durch.
      HINWEIS: Reinigen Sie die Geometrieplatte und die Peltierplatte nach jedem Versuchstest und fügen Sie eine neue Probe von 2 ml hinzu.

4. Drucken von biomimetischen Hydrogel-Gerüsten mit einem speziell entwickelten Mikroextrusions-Biodrucker

  1. Entwerfen Sie Würfel im STL-Format mit einer 3D-Grafiksoftware und laden Sie gewebeähnliche Modelle aus der 3D-Datenbank herunter (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).
    1. Importieren Sie die Modelle im STL-Format in die PANGO Software und geben Sie die Druckparameter ein. Legen Sie die spezifischen X-, Y- und Z-Koordinaten des Modells im 3D-Raum fest, geben Sie die erwartete Skalierungsgröße des Modells in Millimetern (mm) ein, passen Sie die Größe und das Skalierungsverhältnis des Objekts auf der X-, Y- und Z-Achse an und passen Sie den Drehwinkel des Modells im Raum nach Bedarf an.
    2. Geben Sie den geschätzten Filamentdurchmesser (in der Regel etwa 200-500 μm für die meisten Biotinten) in das Feld für die Schichtdicke ein, um die Dicke jeder Schicht auf der Z-Achse zu bestimmen. Stellen Sie die Druckgeschwindigkeit entsprechend der erwarteten Linienstärke (ca. 10-90 mm/s) und stellen Sie die Fülldichte auf 30%-80% ein.
    3. Exportieren Sie die finalen Parameter als G-Code auf eine SD-Karte.
  2. Lassen Sie den Biodrucker und die Mikroextrusionspumpe laufen.
    1. Schalten Sie die Steuerung der Mikroextrusionspumpe ein, wählen Sie die entsprechende Volumenspritze (5 mL) aus und stellen Sie die Extrusionsrate auf 0,08 mL/min und die Extrusionsdauer in Abstimmung mit der gewünschten Druckzeit ein, die durch Division des Hydrogelvolumens durch die Extrusionsrate erzielt wird.
    2. Setzen Sie die Spritze mit einer Nadel mit einem Innendurchmesser von 210 μm in den Spritzenschlitz des Biodruckers ein.
    3. Stellen Sie die Spritzensteuerung so ein, dass der Kolben der Spritze in engem Kontakt mit der Schraube steht.
    4. Geben Sie 3 ml Suspensionsbad in eine 35-mm-Zellkulturschale. Positionieren Sie die Schale basierend auf den Codeeinstellungen auf der Plattform und vergewissern Sie sich, dass sich der Druckkopf 1 mm über dem Boden der Schale befindet.
      HINWEIS: Führen Sie einen Vortest durch, um die Genauigkeit der Schüsselpositionen auf der Druckplattform während des Drucks sicherzustellen.
    5. Legen Sie die SD-Karte mit dem Code in den 3D-Biodrucker ein, aktivieren Sie die Codedatei, starten Sie den Biodrucker und klicken Sie auf die Schaltfläche Start auf dem Controller.
  3. Bearbeitung der Konstrukte
    1. Setzen Sie das gedruckte Konstrukt 1 Minute lang 405 nm blauem Licht aus, um die Photovernetzung zu starten.
    2. Entfernen Sie das κ-Carrageen-Gel mit einer 1-ml-Pipette, gefolgt von der Zugabe von 3 mL PBS (pH 7,4) zum Waschen und anschließenden Entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine gründliche Wäsche.
      HINWEIS: Führen Sie den Waschvorgang vorsichtig durch, um eine Beschädigung der gedruckten Konstrukte zu vermeiden.

5. Eingebettetes 3D-Bioprinting von Analoga der Speiseröhrenmuskulatur

  1. Kultivieren Sie glatte Muskelzellen (eSMCs) der Speiseröhre von Kaninchen.
    1. Die Kultur wird in T75-Kolben mit 2 x 106 Zellen unter Verwendung von 15 ml DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin, eingeleitet.
    2. Halten Sie die eSMCs bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 und 95 % Luft, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichen.
  2. Herstellung von Biotinte für die Muskelschicht der Speiseröhre
    1. Aspirieren Sie das Medium bei Erreichen der Konfluenz und waschen Sie die eSMCs mit 5 mL 1x PBS.
    2. 2 ml 0,2 % Trypsin-EDTA in den Kolben geben und 2 Minuten inkubieren, um die Zellen zu verdauen. Tippen Sie auf den Kolben, um die Zellen von der Wand zu lösen.
    3. Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 2 mL DMEM und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Messen Sie die Zelldichte mit einem Zellzähler mit 10 μl Zellsuspension.
    4. Bei 675 x g für 3 min zentrifugieren, den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in den Komposit-GelMA/SFMA-Biotinten resuspendieren (wie in Schritt 2.1 vorbereitet). Passen Sie die endgültige Zellkonzentration an, um eine Dichte von 10 x 106 Zellen/ml in der Biotinte zu erreichen und so die Bedingungen für nachfolgende 3D-Bioprinting-Anwendungen zu optimieren.
  3. Vorbereitung des 3D-Biodruckers und der zugehörigen Materialien
    1. Autoklavieren Sie die wichtigsten Druckinstrumente, einschließlich Spritzennadeln, Pinzetten, einem Magnetrührer und einer 1000-ml-Silikatglasflasche, unter Standard-Sterilisationsbedingungen (121 °C für 30 Minuten), um eine aseptische Umgebung für den Druckprozess zu gewährleisten.
    2. Stellen Sie den Bioprinter in eine Biosicherheitswerkbank und sterilisieren Sie ihn 30 Minuten lang mit ultraviolettem (UV) Licht, um die Sterilität zu erhalten.
    3. Bereiten Sie 50 ml steriles κ-Carrageen und 5 ml sterile GelMA/SFMA-Komposit-Biotinten vor, wie in Schritt 1 bzw. Schritt 2 beschrieben.
    4. Entwerfen Sie das Modell, stellen Sie die gewünschten Parameter ein und bereiten Sie den Bioprinter vor, wie in Schritt 4.1 beschrieben.
  4. Initiierung des Bioprinting-Prozesses
    1. Führen Sie die in den Schritten 4.2 und 4.3 beschriebenen Verfahren durch, um die 3D-Ösophagusmuskelschicht zu biodrucken, gefolgt von PBS-Waschen und -Austausch.
    2. Führen Sie während des gesamten Druckprozesses einen Zelldruck mit sterilen Techniken durch, um das Risiko einer Zellkontamination in der gedruckten Struktur zu minimieren.
  5. Austausch von Zellkulturmedien nach dem Druck
    1. Aspirieren Sie das PBS vorsichtig und ersetzen Sie es durch 3 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin. Stellen Sie sicher, dass die gedruckten Konstrukte vollständig eingetaucht sind, um optimale Zellwachstumsbedingungen zu gewährleisten.
    2. Die Zellkulturschale mit den gedruckten Konstrukten wird in einem auf 37 °C eingestellten Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium täglich durch frisches Medium, verwenden Sie jedes Mal 3 ml und überwachen Sie den Zustand der Zellen in den Konstrukten mit Hilfe der Lichtmikroskopie.

6. Bewertung der Lebensfähigkeit von eSMCs in den gedruckten Konstrukten mittels Live/Dead-Assay-Färbung

  1. Entfernen Sie das Zellkulturmedium nach 5 Stunden Inkubation und waschen Sie die zellbeladenen Konstrukte mit PBS.
  2. Geben Sie 2 mL der Standard-Calcein-AM/Propidiumiodid-Lösung (1:1000) zu den gedruckten zellbeladenen Konstrukten und inkubieren Sie.
  3. Waschen Sie die Konstrukte nach einer 45-minütigen Inkubation 3x mit PBS und fügen Sie dann frisches Zellkulturmedium hinzu.
  4. Beobachten Sie lebende und tote Zellen und nehmen Sie Fluoreszenzbilder mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) auf.

7. Beobachtung der eSMCs innerhalb der gedruckten Konstrukte mittels FITC-Phalloidin/DAPI-Färbung

  1. Färben Sie die gedruckten Konstrukte mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), markiertem Phalloidin (Grün) für F-Aktin und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, blau) für den Kern nach 5 Tagen Inkubation.
  2. Vorbereitung der Fixierlösung
    1. Kombinieren Sie 4 mL 1x PBS mit 0,16 mL Paraformaldehyd (PFA) in einem 5 mL Polyethylen (PE)-Röhrchen, um eine Endkonzentration von 4% zu erreichen.
    2. Stellen Sie die Kulturschale mit den biogedruckten Konstrukten auf eine saubere Oberfläche. Entfernen Sie das Medium und bedecken Sie die Konstrukte vorsichtig mit der PFA-Lösung, um sicherzustellen, dass sie vollständig eintauchen. Lassen Sie die Fixierung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur erfolgen, bevor Sie die Lösung verwerfen.
      HINWEIS: Gehen Sie während des Zufüge- und Entfernungsprozesses vorsichtig mit Flüssigkeiten um, um die strukturelle Integrität der biogedruckten Konstrukte zu erhalten.
    3. Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in die Kulturschale und tauchen Sie die Konstrukte vollständig ein, um alle verbleibenden Färbereagenzien zu entfernen.
  3. Permeabilisierung der Zellmembran
    1. Formulieren Sie eine 0,5%ige Triton X-100-Lösung, indem Sie 20 μl Triton X-100 zu 4 mL 1x PBS in einem 5 mL PE-Röhrchen hinzufügen.
    2. Verabreichen Sie die Triton X-100-Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellmembranen zu durchdringen, und entfernen Sie dann die Lösung.
    3. Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in die Kulturschale und tauchen Sie die Konstrukte vollständig ein, um alle verbleibenden Färbereagenzien zu entfernen.
  4. Blockieren unspezifischer Bindungen
    1. Stellen Sie eine 3%ige Blockierungslösung aus Rinderserumalbumin (BSA) in einem 5-ml-PE-Röhrchen her, indem Sie 0,12 mL BSA zu 4 mL 1x PBS hinzufügen.
    2. Führen Sie die BSA-Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in die Konstrukte ein, um unspezifische Stellen zu blockieren, und verwerfen Sie dann die Lösung.
  5. Aktinfärbung mit FITC-Phalloidin
    1. 0,2%ige FITC-Phalloidin-Lösung in einem 5 mL PE-Röhrchen mit 4 mL 1x PBS und 8 μl Färbereagenz herstellen.
    2. Tauchen Sie die Konstrukte 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln in diese Lösung und entsorgen Sie dann die Lösung.
    3. Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in die Kulturschale und tauchen Sie die Konstrukte vollständig ein, um verbleibende Färbereagenzien zu entfernen.
  6. Nukleare Färbung mit DAPI
    1. Tragen Sie 4 ml DAPI-Färbelösung auf die Konstrukte auf und stellen Sie eine vollständige Abdeckung sicher.
    2. Inkubieren Sie 20 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, bevor Sie die DAPI-Lösung entfernen.
  7. Abschließendes Waschen und PBS-Eintauchen: Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in die Kulturschale und tauchen Sie die Konstrukte vollständig ein, um verbleibende Fleckenreagenzien zu entfernen.
    HINWEIS: Bereiten Sie Färbelösungen im Voraus vor und gehen Sie vorsichtig damit um. Zu keinem Zeitpunkt sollten die Zellen innerhalb des Kulturgefäßes austrocknen.
  8. Beobachtung mit einem konfokalen Mikroskop: Untersuchen und abbilden Sie die gefärbten Konstrukte mit der konfokalen Mikroskopie, um das Zellwachstum zu beurteilen und eine umfassende Dokumentation der Ergebnisse zu gewährleisten.

8. Bewertung der Proliferation von eSMCs innerhalb der gedruckten Konstrukte mit Hilfe des CCK-8-Assays

  1. Entfernen Sie das Nährmedium an den Tagen 7 und 14 aus den Konstrukten. Waschen Sie die Konstrukte mit PBS, um Medienreste und abgelöste Zellen zu entfernen.
  2. Fügen Sie jedem Konstrukt CCK-8-Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der CCK-8-Lösung ausreicht, um jedes Konstrukt vollständig abzudecken.
  3. Inkubieren Sie die Konstrukte mit der CCK-8-Lösung bei 37 °C für 2 h. Nach der Inkubation wird der Überstand vorsichtig auf eine neue 96-Well-Platte umgefüllt.
  4. Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das körnige κ-Carrageen-Gelbad wurde durch mechanisches Aufbrechen der Bulk-Hydrogele in eine partikuläre Gelaufschlämmung erzeugt. Die jüngste Studie zeigte, dass die κ-Carrageen-Partikel einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 642 ± 65 nm mit einheitlichen Morphologien bei mechanischer Mischung von 1000 U/min15 aufwiesen, was deutlich kleiner ist als die Abmessungen von Mikrogelen, die zuvor in der Literatur berichtet wurden 16,17,18. Längere Bruchzeiten und höhere Geschwindigkeiten führen zu kleineren Mikropartikelgrößen mit einer Mischzeit von 60 min bei 1200 U/min, die in dieser Studie Submikropartikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 565 ± 86 nm ergibt (Ergänzende Abbildung 1). Es wird erwartet, dass eine solche kleine Partikelgröße die Auflösung von Druckprozessen erhöht. Diese Partikel lagern sich durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen und Kationenwechselwirkungen zu einem körnigen Gel zusammen (Abbildung 1A). Unter Belastung zeigt das κ-Carrageen-Submikrogel-Medium charakteristische Verhaltensweisen wie Nachgeben, Scherverdünnung und einen reversiblen Jamming-Unjamming-Übergang, die alle für ein erfolgreiches eingebettetes 3D-Bioprinting unerlässlich sind. Abbildung 1B zeigt das repräsentative Fließverhalten und die Scherverdünnung von körnigen κ-Carrageen-Gelen nach einem Fließrampentest. Mit zunehmender Scherrate von 0,001 auf 10 s-1 bleiben die Scherspannungen für 0,35 % (Gew./Vol.) granulare κ-Carrageen-Gele bei Scherraten unter 0,3 s-1 relativ unverändert, was auf eine niedrige Fließspannung von 3,5 Pa hinweist. Anschließend wird beobachtet, dass die Schubspannungen linear mit den Schergeschwindigkeiten zunehmen, was auf ein Strömungsverhalten hindeutet, das dem eines Bingham-Fluids ähnelt. Darüber hinaus zeigen rheologische Messungen der κ-Carrageen-Submikrogele einen ausgeprägten Übergang vom Gel zum Sol. Diese Gele ergeben sich bei Stämmen von mehr als 10 % und durchlaufen bei einer Dehnung von 35 % einen Gel-Sol-Übergang (Abbildung 1C). Die geringe Ausbeutedehnung der Submikropartikel-Gele wird auf das physikalische Netzwerk zurückgeführt, das durch Wasserstoffbrückenbindungen und kationische Wechselwirkungen aufgebaut wird. Ein solches Gel-Sol-Übergangsverhalten ist reversibel. Wie in Abbildung 1D gezeigt, sinkt der Speichermodul der κ-Carrageen-Submikrogele bei einer Dehnung von 100 % von 38 Pa auf 6 Pa, was unter dem Verlustmodul liegt, was auf einen Solzustand hinweist. Umgekehrt kehrt der Speichermodul bei einer plötzlichen Verringerung der Dehnung auf 1 % schnell auf etwa 38 Pa zurück. Es übertrifft den Verlustmodul innerhalb von 5 s, was darauf hindeutet, dass die κ-Carrageen-Submikrogele in der Lage sind, die physikalischen Vernetzungen zwischen den Partikeln schnell wiederherzustellen.

Die granularen κ-Carrageen-Gele, die sich durch ihre kleinen und homogenen Morphologien auszeichnen, weisen scherverdünnende Eigenschaften, eine schnelle Selbsterholung und ein Fließspannungsverhalten auf, was für ihren Einsatz in eingebetteten 3D-Bioprinting-Anwendungen von Vorteil ist. Zur Beurteilung der Wirksamkeit der κ-Carrageen-Submikrogel-Suspension als Stützbad für den eingebetteten Druck wird eine weit verbreitete Biotinte, die aus 10 % (wt/vol) Gelatinemethacrylat und 6 % (wt/vol) Seidenfibroinmethacrylat-Kompositen (GelMA/SFMA) besteht, für die Druckversuche innerhalb des κ-Carrageen-Mediums 19,20 verwendet. Das GelMA wurde zur Verbesserung der Visualisierung mit Rhodamin markiert21. Wie in Abbildung 2A dargestellt, ist das körnige κ-Carrageen-Gelbad hochtransparent und ermöglicht so die Echtzeitüberwachung des Druckprozesses. Die von der Düse erzeugten Scherraten reichen von 0,66 bis 6 s-1, wenn die Düsengeschwindigkeiten im Bereich von 10-90 mm/s variieren. Das κ-Carrageen-Submikrogelbad zeigt auch bei kontinuierlicher zyklischer Scherung bei Wechselraten von 6 s-1 und 0,01 s-1 noch innerhalb von 20 s ein Selbstheilungsverhalten (Ergänzende Abbildung 2). Innerhalb des κ-Carrageen-Submikrogelbades wurde eine Gitterstruktur von 15 x 15 x 2 mm3 mit einer Schichtdicke von 150 μm aufrechterhalten. Bemerkenswert ist, dass das Gitter eine bemerkenswerte Integrität und Auflösung aufwies, mit einzelnen Filamenten mit einer Breite von etwa 200 μm und einem Abstand zwischen den Filamenten von etwa 350 μm, wie durch konfokale Bilder der Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) bestätigt wurde (Abbildung 2B, C). Darüber hinaus wies die 3D-Gitterstruktur ein poröses Netzwerk mit miteinander verbundenen Poren auf. Dies sind wichtige Attribute, die die Druckbarkeit beeinflussen und letztendlich das zelluläre Verhalten beeinflussen, wie z. B. das Überleben, die Proliferation und das Differenzierungspotenzial der Zellen.

Um die Eignung des κ-Carrageen-Submikrogel-Mediums für die Erzeugung komplexer Gewebe- und Organstrukturen weiter zu bestätigen, wurden ein humanes Herzmodell und eine Tri-Leaflet-Herzklappe unter Verwendung der GelMA/SFMA-Tinte bei einer hohen Infill-Dichte von 80 % hergestellt. Das gedruckte Herzmodell repliziert die anatomische 3D-Form, einschließlich der großen Venen und Arterien (Abbildung 2D), genau und weist nach der Wasserentnahme eine mechanische Stabilität auf (Abbildung 2E). Die dreisegelige Herzklappe weist deutliche Klappensegel und Stützstrukturen auf (Abbildung 2F). Außerdem lassen sich die Filamente innerhalb der Konstrukte leicht abziehen (Abbildung 2G). Darüber hinaus wird ein hierarchisches zyklisches Modell wie die Speiseröhre genau nachgebildet. Wie in Abbildung 2H und 2I gezeigt, weist der gedruckte Ösophagus eine klare Schichtung auf, mit deutlichen Abgrenzungen zwischen den einzelnen Schichten, um die entsprechenden Gewebeschichten der Speiseröhre zu replizieren, was darauf hindeutet, dass das κ-Carrageen-Submikrogel-Medium die für das Tissue Engineering erforderliche strukturelle Komplexität unterstützt. Während das derzeitige Modell nicht die volle Funktionalität authentischer menschlicher Gewebe und Organe repliziert, bietet das κ-Carrageen-Submikrogelbad möglicherweise eine praktikable und vielversprechende Strategie für die In-vitro-Herstellung komplizierter Gewebe und Organe mit potenziellen Anwendungen in Forschung, Therapie und Diagnose.

Gittergerüste mit longitudinaler und transversaler Anisotropie ahmen die Muskelschicht des Ösophagus nach (Abbildung 3A,B), die aus einer ausgeprägten inneren zirkulären Muskelschicht und einer äußeren longitudinalen Muskelschicht besteht. Um diese anisotrope Architektur in vitro zu replizieren, wurden glatte Muskelzellen (eSMCs) der Speiseröhre von Kaninchen sorgfältig in die GelMA/SFMA-Biotinten eingebettet. Durch die Verwendung des κ-Carrageen-Submikrogel-Mediums wurde erfolgreich ein biomimetisches Gerüst mit eSMCs erreicht, das der zweischichtigen Muskelstruktur des Ösophagus sehr ähnlich ist. Die Lebensfähigkeit von Zellen, die in Hydrogelen verkapselt sind, wurde mit der Lebend/Tot-Färbung nach 5 h Kultur bewertet. Es zeigte sich ein überwiegendes Vorhandensein von lebenden Zellen (grün gefärbt) und ein minimaler Anteil toter Zellen (rot gefärbt) innerhalb der Hydrogelnetzwerke, was auf eine hohe Zellviabilität hinweist (Abbildung 3C). Die quantitative Analyse ergab eine bemerkenswert hohe Überlebensrate von bis zu 92 % (Abbildung 3D). Diese Ergebnisse deuten auf die Biokompatibilität des Hydrogelmaterials sowie auf die Wirksamkeit der Druck- und Vernetzungsmethoden bei der Erhaltung der Zellintegrität hin. Um die Zellmorphologie innerhalb der GelMA/SFMA-Konstrukte weiter zu untersuchen, wurden Phalloidin (grün)/DAPI (blau) Bilder nach 3 Tagen Zellkultur aufgenommen. Wie in Abbildung 3E gezeigt, hat eine signifikante Anzahl von eSMCs innerhalb der biomimetischen Konstrukte eine Fülle von Pseudopodien projiziert und eine Ausrichtung entlang der Mikrofasern gezeigt, wie nach 3-tägiger Kultur gezeigt wird. Die 3D-Rekonstruktion bestätigt zudem die exakte Nachbildung der Muskelschichten der Speiseröhre (Ergänzende Abbildung 3). Zusätzlich wurde die eSMC-Proliferation mit dem CCK-8-Assay an den Tagen 1, 7 und 14 untersucht. Die Absorptionsgradwerte bei 450 nm stiegen von Tag 1 auf Tag 7 und 14 deutlich an, was ein robustes proliferatives Verhalten widerspiegelt (Ergänzende Abbildung 4). Diese Ergebnisse zeigen das signifikante Potenzial des κ-Carrageen-Submikrogel-Mediums bei der Erleichterung eines qualitativ hochwertigen biomimetischen Bioprintings.

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Abbildung 1: Selbstorganisiertes κ-Carrageen-Submikrogelmedium und seine rheologische Analyse. (A) Schematische Darstellung eines κ-Carrageen-Submikrogel-Floats, der durch Wasserstoffbrückenbindungen und Kationenwechselwirkungen für eingebettetes 3D-Bioprinting gebildet wird. (B) Strömungsrampe an 0,35 % (wt/vol) gestauten κ-Carrageen-Submikrogelen bei 25 °C. (C) Messungen des Gel-Sol-Übergangs in κ-Carrageen-Submikrogelen über einen Amplitudensweep von 0,1 % bis 100 % bei 25 °C. (D) Analyse der Selbstheilung in 0,35 % (wt/vol) κ-Carrageen-Submikrogelen nach kontinuierlicher zyklischer Scherung bei abwechselnd 1 % und 100 % Dehnung bei 25 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Eingebettetes 3D-Bioprinting mit hoher Wiedergabetreue von Rhodamin-markierten GelMA/SFMA-Tinten unter Verwendung des κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbads. (A) Echtzeit-Beobachtung des eingebetteten 3D-Drucks in einem κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbad. (B, C) Konfokale Bilder des Laser-Scanning-Mikroskops, die die (B) 3D-Rekonstruktion und (C) die innere Struktur der gedruckten Gitter veranschaulichen. (D, E) Fotografien eines 3D-gedruckten herzähnlichen Modells in einer Wasserlösung (D) und in seinem natürlichen Zustand (E). (F) Bilder einer dreiblättrigen Herzklappe und (G) die Filamente, die von den Konstrukten abgezogen werden. (H) Fotografien von oben und (I) in der Vorderansicht, die ein mit der GelMA/SFMA-Tinte gedrucktes Speiseröhrenmodell zeigen, das hierarchische Vier-Schichten-Strukturen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Eingebettetes zellbeladenes Bioprinting unter Verwendung des κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbades. (A, B) Schematische Diagramme von (A) der inneren kreisförmigen und äußeren longitudinalen Muskelstruktur des Ösophagus und (B) einem anisotropen biomimetischen Gerüst der Speiseröhrenmuskulatur, das durch eingebettetes 3D-Bioprinting hergestellt wurde. (C) Lebende/tote Färbebilder und (D) quantitative Lebensfähigkeit von eSMCs, die in GelMA/SFMA-Gerüsten nach 5 Stunden gezüchtet wurden. (E) Projektionsbilder von eSMCs, die an Tag 3 in GelMA/SFMA-Gerüsten gezüchtet wurden. Von links nach rechts: der Zellkern, das F-Aktin und die Merge-Ansicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: (A) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, die die homogene Morphologie von κ-Carrageen-Submikrogelen zeigt. (B) Die Durchmesserverteilung von κ-Carrageen-Mikropartikeln wurde mit einem Laser-Nanometer-Partikelgrößenanalysator gemessen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Selbstrückgewinnungsanalyse an κ-Carrageen-Submikrogelen von 0,35 % (Gew./Vol.) bei kontinuierlicher zyklischer Scherung bei abwechselnden Raten von 0,01 s-1 und 6 s-1 bei 25 °C. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: 3D-Rekonstruktionsbild der gedruckten Gitter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Die Proliferationsaktivität von eSMCs, die nach 1, 7 und 14 Tagen in das GelMA/SFMA-Hydrogel eingekapselt waren, wurde mit dem CCK-8-Assay (n = 3) bewertet. Die statistische Signifikanz wurde durch eine unidirektionale ANOVA analysiert, gefolgt von einer Tukey-Post-hoc-Analyse zwischen drei Gruppen, **p<0,01, ****p < 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Die Herstellung von κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbädern für den Einsatz im Bioprinting ist ein sorgfältig orchestrierter Prozess, der mehrere kritische Schritte umfasst, um sicherzustellen, dass das resultierende Medium die gewünschten Eigenschaften zur Unterstützung von Biotinten aufweist. Zunächst wird eine κ-Carrageen-Lösung hergestellt, indem das κ-Carrageen-Pulver in deionisiertem Wasser bei erhöhten Temperaturen aufgelöst wird, wodurch eine homogene Mischung entsteht. Die Konzentration der Lösung ist entscheidend und muss für die anschließende Gelierung optimiert werden. 0,3-0,6 % (Gew./Vol.) κ-Carrageen zeigte eine hervorragende Leistung im eingebetteten 3D-Bioprinting15. Beim Abkühlen geht diese Lösung in ein Bulk-Gel über.

Das Bulk-Gel wird dann einer mechanischen Mahlstrategie unterzogen, um Submikrogelpartikel herzustellen. Dabei handelt es sich um hohe mechanische Kräfte, die das Gel in gleichmäßig große Partikel zerlegen. Die Parameter des Mahlprozesses, einschließlich Scherintensität, Zeit und Temperatur, werden präzise gesteuert, um die gewünschte Partikelgrößenverteilung zu erreichen. Nach dem Mahlen werden die Submikrogel-Partikel bei 25-37 °C gelagert, um eine Aggregation oder Auflösung zu verhindern, was für die Aufrechterhaltung einer gleichmäßigen Suspension, die komplizierte Bioprinting-Aufgaben unterstützt, unerlässlich ist. Es wird empfohlen, das Gel sofort vorzubereiten und zu verwenden.

Die Herstellung von κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbädern ist einfach zu bedienen und stellt die Ausrichtung auf industrielle Anwendungen und die wachsende Nachfrage nach groß angelegten Tissue Engineering- und regenerativen Medizinbemühungen sicher. Darüber hinaus verwenden κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbäder zellkompatibles PBS oder Kulturmedium als Lösungsmittel, was eine hervorragende Biokompatibilität gewährleistet und es zu einem idealen Medium für die Unterstützung von Zellen in biogedruckten Konstrukten macht. Die Haltbarkeit des körnigen Gels beträgt unter aseptischen Zubereitungsbedingungen ca. 1 Monat.

Das κ-Carrageen-Submikrogelbad zeichnet sich durch sein plastisches Fließverhalten nach Bingham aus (Abbildung 1B) und weist hervorragende scherverdünnende Eigenschaften in Verbindung mit schnellen Selbstheilungsfähigkeiten auf (Abbildung 1C,D), die für die Verbesserung der Präzision gedruckter Konstrukte von entscheidender Bedeutung sind. Die Anwendung dieses Sub-Mikrogel-Bades hat sich bei der Herstellung von Geweben mit mehrstufigen Architekturen als wirksam erwiesen (Abbildung 2), um die Herstellung von Strukturen mit hoher Wiedergabetreue und Auflösung zu gewährleisten. Bemerkenswert ist, dass die Fähigkeit zur schnellen Ausbreitung von Pseudopodien in Zellen, die in zellbeladene Biotinten eingebettet sind (Abbildung 3), die Kompatibilität des Bades mit zellulären Prozessen unterstreicht. Folglich ist dieses κ-Carrageen-Submikrogel-Bad vielversprechend für den Bereich der In-vitro-Gewebe- und Organherstellung. Es wird einen tiefgreifenden Einfluss auf das Tissue Engineering und die regenerative Medizin haben, indem es die Entwicklung komplexerer, lebensfähigerer und funktionell integrativer Gewebekonstrukte ermöglicht.

Trotz des beträchtlichen Potenzials des κ-Carrageen-Submikrogelbads für Anwendungen im Bioprinting und Tissue Engineering gibt es noch einige Herausforderungen und Einschränkungen. Ein Hauptanliegen ist, dass seine Zusammensetzung dem Zellkulturmedium sehr ähnlich sein sollte, was für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit während des längeren Drucks großer Organe entscheidend ist. κ-Carrageen-Submikrogele werden überwiegend unter Verwendung von PBS als Lösungsmittel hergestellt, was die Einarbeitung verschiedener Zellkulturmedien zum Auflösen des Materials erfordert. Neben PBS wird κ-Carrageen auch mit einer Calciumchloridlösung gelatiniert. Calciumchloridlösung kann jedoch Toxizität für die Zellen verursachen oder ein osmotisches Druckungleichgewicht erzeugen. Daher wäre die Verwendung eines Zellkulturmediums ideal für κ-Carrageen-Lösungsmittel und Vernetzungsmittel. Darüber hinaus stellt die sterile Produktion von Mikrogelen mit hohem Durchsatz eine große Herausforderung dar. Die Sterilisation von κ-Carrageen-Lösungen erfordert die Filtration durch einen 0,22-μm-Filter bei erhöhten Temperaturen. Die Ausbeute an sterilem κ-Carrageen wird jedoch häufig durch verschiedene Faktoren beeinträchtigt, darunter die Qualität der PBS-Lösung und die Abkühlung des κ-Carrageens während des Filtrationsprozesses. Jede Filtrationscharge ergibt in der Regel nur 20-50 ml steriles κ-Carrageen, was ein erhebliches Hindernis für die Hochdurchsatzproduktion von κ-Carrageen-Mikrogelen darstellt. Folglich wird sich die zukünftige Forschung auf die Optimierung des Biofabrikationsprozesses, die Bewertung der langfristigen Lebensfähigkeit und Funktion von Zellen und die Erforschung der Integration von gedruckten Geweben in lebende Systeme konzentrieren.

Offenlegungen

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Die Autoren haben kein finanzielles Interesse an den in diesem Manuskript beschriebenen Produkten.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde unterstützt von der Ningbo Natural Science Foundation (2022J121, 2023J159), dem Schlüsselprojekt der Natural Science Foundation der Stadt Ningbo (2021J256), der Open Foundation des State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers (Fudan University) (K2024-35) und dem Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases der Provinz Zhejiang, China (2022E10026). Vielen Dank für die technische Unterstützung durch die Core Facilities, Health Science Center der Universität Ningbo.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3D-BiodruckerMaßgeschneidertes
4',6-Diamidino-2-PhenylindolSolarbio Life ScienceC0065Gebrauchsfertiges
405 nm UV-LichtEFLXY-WJ01
Cell CounterCorningCyto smart 6749
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopLeicaSTELLARIS 5
DMEM mit hohem GlukosegehaltVivaCellC3113-0500Hoher Glukosegehalt mit Natriumpyruvat und L-Glutamin
Dynamisches RotationsrheometerTA InstrumentDiscovery HR-20
Glatte Muskelzellen der SpeiseröhreGeliefert von der Abteilung für Zellbiologie und regenerative Medizin, Health Science Center, UniversitätPrimärzellen aus der Speiseröhre des Kaninchens
Fötales RinderserumUEF9070L
Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes PhalloidinSolarbio Life ScienceCA1610300T
GelatinemethacrylatEFLEFL-GM-6060%ige Substitution
k-CarrageenAladdinC121013-100g
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl)-phosphinatAladdinL157759-1g365~405 nm
Lebend-Tot-KitbeyotimeC2015M
Mikroplatten-ReaderPotenovPT-3502B
ParaformaldehydSolarbio Life ScienceP1110 4 %
Penicillin/StreptomycinSolarbio Life ScienceMA0110100 &akut;
Phosphatgepufferte KochsalzlösungVivaCellC3580-0500pH 7,2-7,4
Seide FibroinmethacrylatEFLEFL-SilMA-00139% Substitution
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Trypsin-EDTAVivaCellC100C10,25%, ohne Phenolrot
Ningbo

Referenzen

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