Method Article

Pipeline für dreidimensionale multidimensionale anatomische Untersuchung des menschlichen Herzens

DOI:

10.3791/66817

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll stellt eine umfassende Pipeline zur Analyse von Proben aus menschlichen Herzen dar, die sich über die mikroskopische und makroskopische Skala erstrecken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die detaillierte Untersuchung von nicht versagenden menschlichen Herzen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden, bietet eine einzigartige Möglichkeit, strukturelle Analysen auf mikroskopischer und makroskopischer Skala durchzuführen. Zu diesen Techniken gehören das Tissue Clearing (modifizierte Immunmarkierungs-gestützte dreidimensionale (3D) Bildgebung von Organen, die durch Lösungsmittel freigegeben wurden) und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsverfahren gehören stereoskopische Dissektion und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsverfahren gehören grobe Dissektion, Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie), CT und 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens. Vor der makroskopischen Untersuchung kann eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt werden, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten. Die Anwendung dieser Techniken in Kombination zur Untersuchung des menschlichen Herzens ist einzigartig und entscheidend für das Verständnis der Beziehung zwischen unterschiedlichen anatomischen Merkmalen wie koronaren Gefäßen und Myokardinnervation im Kontext der 3D-Architektur des Herzens. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden im Detail und enthält repräsentative Ergebnisse, um die Fortschritte in der Erforschung der menschlichen Herzanatomie zu veranschaulichen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Da die Funktion der Form folgt, ist das Verständnis der Architektur des Herzens von grundlegender Bedeutung für das Verständnis seiner Physiologie. Obwohl zahlreiche Untersuchungen die kardiale Anatomie von der Mikro- bis zur Makroskala aufgedeckt haben 1,2,3, sind mehrere Fragen ungeklärt, insbesondere solche, die sich auf die menschliche Herzanatomie beziehen. Dies liegt zum Teil daran, dass grundlegende Studien, die sich auf die funktionelle Anatomie konzentrierten, im Allgemeinen Tierherzen verwendeten 4,5,6, die sich oft von menschlichen Herzen unterscheiden 1,7,8. Darüber hinaus neigt jede einzelne Studie, auch die mit menschlichen Herzproben, dazu, sich auf sehr spezifische Strukturen zu konzentrieren, was es schwierig macht, die Ergebnisse auf den Kontext des gesamten Herzens anzuwenden. Dies gilt umso mehr, wenn die fokussierten Strukturen auf Mikro- oder Mesoskalen liegen, wie z. B. der Perinexus9 und die ganglionierten Plexus10.

In diesem Zusammenhang bietet die systemische Strukturuntersuchung des menschlichen Herzens, das für eine Transplantation abgestoßen wurde, eine einzigartige und seltene Gelegenheit, einen umfassenden Atlas der kardialen Strukturen im Fokus über mikroskopische und makroskopische Skalen zu erhalten11. Zu den mikroskopischen Untersuchungsprotokollen gehören die Gewebereinigung (modifizierte Immunmarkierungs-fähige dreidimensionale (3D) Bildgebung von lösemittelfreigeschalteten Organen, iDISCO+)12,13 und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsprotokollen gehören stereoskopische Dissektion, Makrofotografie und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsprotokollen gehören die grobe Dissektion14, die Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie)15,16,17, die CT, die virtuelle Dissektion18 und der 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens17. Zur Vorbereitung der makroskopischen Untersuchung wird eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten 14,19,20,21. Die kombinierte Anwendung dieser Techniken ist einzigartig und entscheidend, um unterschiedliche anatomische Merkmale im Kontext der 3D-Architektur des menschlichen Herzens zu korrelieren.

Da die Möglichkeit, eine nicht-pathologische menschliche Herzprobe zu erhalten, extrem begrenzt ist, maximiert ein hierin beschriebener Multiskalenansatz die Verwendung der Probe. Durch die Anwendung verschiedener Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden, werden repräsentative Ergebnisse dem Leser veranschaulichen, wie die Ergebnisse für verschiedene Zwecke genutzt werden können, einschließlich der Entdeckung in der wissenschaftlichen Forschung11 (umfassende Analysen der kardialen Innervation, der Verteilung ganglionierter Plexus), der Verbesserung klinischer Verfahren (Simulation für chirurgische und interventionelle Ansätze) und der anatomischen Ausbildung (reale 3D-Demonstration der Herzanatomie).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie verwendete anonymisierte Gewebeproben, die von nicht versagenden menschlichen Spenderherzen entnommen wurden, und wurde vom Institutional Review Board der University of California, Los Angeles (UCLA) genehmigt. Es wurden Proben von nicht versagenden Herzen entnommen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden. Die Herzen wurden druckperfundiert, in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und vor der Gewebeverarbeitung mit den folgenden Methoden abgebildet. Abbildung 1 fasst das Flussdiagramm der Reihenfolge der Studie zusammen. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Untersuchung im Mikromaßstab

  1. Gewebereinigung mit modifiziertem Immunmarkierungs-fähiger 3D-Bildgebung von lösungsmittelfreigegebenen Organen (iDISCO+) Protokoll.
    1. Präparieren Sie 4 % PFA-fixiertes Gewebe mit einem Skalpell, das in die 3 mm × 16 mm × 25 mm Kammer für die konfokale Mikroskopie passt. Um dickeres Gewebe abzubilden, können zusätzliche Kammern und/oder Abstandshalter auf dem Objektträger gestapelt werden.
    2. Proben mit abgestuftem Methanol (MeOH) (20 %, 40 %, 60 %, 80 % und 100 % MeOH in deionisiertem H2O [vol/vol]) für jeweils 1 h bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren dehydrieren.
    3. 1 h bei RT mit 100 % MeOH waschen und bei RT unter Rühren über Nacht in 66 % Dichlormethan/33 % MeOH tauchen.
    4. Am nächsten Tag zweimal 1 h lang bei RT in MeOH (100 %) waschen, bei 4 °C kühlen und über Nacht bei 4 °C mit 5 % H2O2 in MeOH (vol/vol) behandeln.
    5. Rehydrieren Sie mit der abgestuften MeOH-Serie (80 %, 60 %, 40 % und 20 % MeOH) und waschen Sie in 0,01 mol/L PBS für jeweils 1 h bei RT unter Rühren.
    6. Waschen Sie das Taschentuch zweimal in 0,01 mol/L PBS mit 0,2 % Triton X-100 für 1 h bei RT.
    7. Bereiten Sie sich auf die Immunmarkierung vor, indem Sie 0,01 mol/l PBS, 20 % Dimethylsulfoxid (DMSO), 0,2 % Triton X-100 und 0,3 mol/l Glycin 2 Tage lang bei 37 °C unter Rühren permeabilisieren.
    8. 0,01 mol/l PBS mit 10 % DMSO, 0,2 % Triton X-100 und 5 % normalem Eselserum für weitere 2 Tage bei 37 °C unter Rühren einbinden.
    9. Markierung mit einem primären Antikörper, der mit MeOH kompatibel ist, konjugiert mit Fluorophoren, verdünnt in 0,01 mol/l PBS mit 10 mg/ml Heparin (PTwH), 0,2 % Tween-20, 5 % DMSO und 3 % normalem Eselsserum für 3-4 Tage bei 37 °C unter Rührung.
    10. Die Antikörperlösung wird aufgefüllt und weitere 3-4 Tage bei 37 °C unter Rühren inkubiert.
    11. Nach 1-wöchiger Inkubation in Primärantikörperlösung 4 bis 5 Mal in PTwH über Nacht bei RT waschen.
    12. Inkubieren Sie mit einem Sekundärantikörper, der an in PTwH verdünnte Fluorophore, 3 % normales Eselsserum konjugiert ist, 3 Tage lang bei 37 °C unter Rühren.
    13. Die Sekundärantikörperlösung wird aufgefüllt und weitere 3 Tage bei 37 °C unter Rühren inkubiert.
    14. Nach 6-tägiger Inkubation in Sekundärantikörperlösung 4-5 Mal über Nacht bei RT in PTwH waschen.
    15. Dehydrieren Sie mit einer abgestuften MeOH-Serie (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % und 100 % MeOH). Die Probe kann über Nacht bei RT gelagert werden.
    16. In 66 % Dichlormethan/33 % MeOH 3 h bei RT unter Rühren inkubieren.
    17. Zweimal 15 min bei RT unter Rühren zweimal in 100% Dichlormethan waschen.
    18. Inkubieren und lagern Sie die Proben in Benzylether. Füllen Sie das Röhrchen, um zu minimieren, dass Luft die Probe oxidiert.
  2. Bildgebung von gewebefreigelegten Proben
    1. Befestigen Sie eine Kammer mit Klebstoff auf einem Objektträger und tragen Sie Nagellack um den Umfang der Kammer auf. Für dickeres Gewebe können zusätzliche Kammern und/oder Abstandshalter auf dem Objektträger gestapelt werden.
    2. Legen Sie das gereinigte Gewebe in die Kammer, füllen Sie es mit Benzylether und bringen Sie ein Deckglas an.
    3. Tragen Sie Nagellack um das Deckglas auf, um eine Versiegelung zu erzeugen.
    4. Mit einem aufrechten konfokalen Laserscanning-Mikroskop mit einer 5- oder 10-fachen Linse erhalten Sie Tilescan- und Z-Stapel-Bilder, um Bilder in einer Tiefe bis zum Arbeitsabstand des Objektivs zu erhalten.
    5. Aufnahme mit einer Auflösung von 1024 x 1024 unter Verwendung von Laserlinien, die für die Emissionsspektren der verwendeten Fluorophore geeignet sind. Die Autofluoreszenz der Muskeln ist mit der 488-nm-Laserlinie sichtbar.
    6. Stellen Sie sicher, dass die Schrittweite der Z-Achse der Nyquist-Probenahme auf der Grundlage der numerischen Apertur des angegebenen Objektivs11 entspricht.
    7. Fügen Sie Bilder zusammen und verwenden Sie Software für die 3D-Visualisierung.
    8. Erstellen Sie Abbildungen mit MIP-Bildern (Maximum Intensity Projection) von Z-Stacks für einzelne und zusammengeführte Kanäle (Abbildung 2).
  3. Immunhistochemie
    HINWEIS: Nachdem das Gewebe in Paraffin eingebettetwurde 22, wird das folgende Verfahren verwendet, um Objektträger für immunhistochemische Untersuchungen zu erstellen.
    1. Herstellung von Brechungsindex-Matching-Lösung (RIMS).
      1. Bereiten Sie 0,1 mol/l Phosphatpuffer vor, indem Sie 10,9 g Na2HPO4 (wasserfrei) und 3,1 g NaH2PO4 (Monohydrat) zu deionisiertem H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 1 l (pH 7,4) hinzufügen. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem Filter und lagern Sie sie bei RT.
      2. Verdünnen Sie den Phosphatpuffer auf 0,02 mol/L.
      3. Lösen Sie Histodenz in 30 mL 0,02 mol/l Phosphatpuffer auf, indem Sie die Lösung 10 Minuten lang mit einem magnetischen Rührstab in der Endlagerflasche rühren, die verschlossen sein kann, um Verdunstung und Kontamination zu minimieren.
      4. Fügen Sie Natriumazid zu einer Gesamtkonzentration von 0,01 % (w/v) hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,5 ein.
      5. Passen Sie die RI an, indem Sie die Endkonzentration von Histodenz variieren.
      6. Lagern Sie die RIMS monatelang bei RT. Verwerfen, wenn eine mikrobielle Kontamination festgestellt wird.
        HINWEIS: Autoklavieren Sie KEINE Lösungen, die Natriumazid enthalten.
    2. Vorbereitung von Objektträgern für immunhistochemische Untersuchungen
      1. Erstellen Sie Schnitte mit einer Dicke von 5 μm mit dem Mikrotom. Wenden Sie einen Gewebeschnitt auf geladene Objektträger an.
      2. Entfernen Sie das Paraffin, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in >75%igem Xylol inkubieren. Schieben Sie die Objektträger für weitere 10 Minuten in einen zweiten Behälter mit Xylol.
      3. Entfernen Sie das Xylol, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 100 % EtOH, dann 5 Minuten lang 95 % EtOH und 5 Minuten lang 70 % EtOH eintauchen.
      4. Spülen Sie die Objektträger 5 min lang mit entionisiertem H2O ab.
      5. Tauchen Sie die Objektträger 25 Minuten lang bei 90-95 °C in einen Antigen-Retrieval-Puffer.
      6. Lassen Sie den Behälter 1 h lang unter Rühren auf RT abkühlen.
      7. Tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei 4 °C in Einweichpuffer (0,01 mol/L PBS + 0,4 % Triton X-100).
      8. Umkreisen Sie das Gewebe mit einem PAP-Stift. Geben Sie PBS zu jedem Objektträger und legen Sie ihn in eine befeuchtete Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern.
      9. Waschen Sie die Objektträger mit PBS bei RT unter Rühren für 5 min.
      10. Block mit Blockierungspuffer (0,01 mol/L PBS + 10% Eselserum + 0,1% TX-100) für 1 h unter Rühren.
      11. Inkubieren Sie mit einem Primärantikörper, der über Nacht bei 4 °C in einem Blockierungspuffer verdünnt ist.
      12. Lassen Sie die Dias am nächsten Tag 15 Minuten lang auf RT erwärmen.
      13. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal mit 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 für 5 min.
      14. Mit einem in Blockierungspuffer verdünnten Sekundärantikörper 1 h bei RT unter Rühren inkubieren.
      15. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal mit 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 für 5 min.
      16. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal mit 0,01 mol/L PBS für 5 min.
      17. Geben Sie 1 Tropfen RIMS mit einer Pipette und bringen Sie ein Deckglas an.
      18. Tragen Sie Nagellack um das Deckglas auf, um die Versiegelung zu erzeugen.
      19. Als Negativkontrolle ist eine Probe ohne den Primärantikörper durchzuführen, um das Fehlen einer spezifischen Färbung nachzuweisen.
    3. Bildgebung von immungefärbten Objektträgern
      1. Bilden Sie die Objektträger mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop mit 10x-, 20x- und 40x-Objektiven ab.
      2. Aufnahme mit einer Auflösung von 1024 x 1024 unter Verwendung von Laserlinien, die für die Emissionsspektren der verwendeten Sekundärantikörper geeignet sind.
      3. Erstellen Sie Abbildungen mit MIP-Bildern (Maximum Intensity Projection) von Z-Stacks für einzelne und zusammengeführte Kanäle (Abbildung 3).

2. Untersuchung auf der Mesoskala

  1. Stereoskopische Dissektion
    1. Führen Sie feine Dissektionen durch, die sich auf winzige oder dünne Strukturen konzentrieren, wie z. B. den atrioventrikulären Knoten, die Arterie des atrioventrikulären Knotens und den Plexus des Herznervs (im Submillimeter- bis Millimeterbereich) entweder mit einer Schreibtischlampe mit Lupe, chirurgischen Teleskopen oder einem Stereomikroskop.
  2. Mikro-CT-Untersuchung
    HINWEIS: Die CT-Bildgebung wird nach der Druckperfusion und -fixierung und in allen Stadien der Dissektion mit einem Mikro-Positronen-Emissions-Tomographie (PET)/CT-Scanner durchgeführt (Abbildung 4).
    1. Erwärmen Sie die CT-Röntgenquelle 25 Minuten lang, bevor Sie die Probe abbilden.
    2. Legen Sie die Herzprobe auf das Scannerbett.
    3. Bewegen Sie das Scannerbett in eine horizontale Position von 544 mm und eine vertikale Position von 14 mm, um das Herz im CT-Sichtfeld (FOV) zu zentrieren.
    4. Erfassen Sie ein CT-Bild bei 80 kVp, 150 μA, mit 720 Projektionen während einer Scanzeit von 1 Minute bei einer räumlichen Auflösung von 200 μm.
    5. Rekonstruieren Sie die CT-Daten mit einem Sichtfeld von 12 cm x 12 cm x 10 cm und einer Matrix von 600 x 600 x 500 Voxeln und speichern Sie sie als DICOM-Datei.

3. Untersuchung auf der Makroskala

  1. Druckperfusion und Fixierung
    ANMERKUNG: Die Autoren modifizieren die zuvor beschriebenen Druckperfusions- und Fixationstechniken und wenden sie auf die nicht versagenden menschlichen Herzen an, die für eine Transplantation abgestoßen wurden 14,19,20,21.
    1. Verwenden Sie Pumpen mit hohem Durchfluss für die Perfusionsfixierung. Verwenden Sie entweder 100 % Ethanol14, 4 % PFA oder 10 % Formalin für das Fixiermittel.
      HINWEIS: Das Herz wird wiederhergestellt, wobei die aufsteigende Aorta, der Lungenstamm und die Vena cavae sowie die Lungenvenen so distal wie möglich reseziert und in Lösung23 der University of Wisconsin verabreicht werden.
    2. Verwenden Sie zwei chirurgische Kanülen 20-24 Fr für die Rechts- und Linksherzperfusion. Für eine Rechtsherzperfusion kanülieren Sie die obere Hohlvene und platzieren Sie einen Schlot am Lungenstamm oder in der Lungenarterie mit halb geschnittenen Kunststoffspritzen der Größe 12-30 ml, die an Dreiwege-Absperrhähnen befestigt sind.
    3. Verschließen Sie die untere Hohlvene und die andere Lungenarterie mit einem Garn, nachdem Sie eine verriegelte, halb geschnittene Kunststoffspritze oder ein 1,5-5,0-ml-Zentrifugenröhrchen in geeigneter Größe eingesetzt haben.
      1. Für eine antegrade Perfusion des linken Herzens kanülieren Sie eine der Lungenvenen und platzieren Sie einen Entlüftungsöffnung am distalen geschnittenen Ende der Aorta mit den halb geschnittenen Kunststoffspritzen der Größe 12-30 ml mit Luer-Lock-Spitzen, die an Dreiwege-Absperrhähnen befestigt sind.
      2. Bei einer retrograden Perfusion des linken Herzens wird einer der Aortenbogenäste kanüliert und an einem anderen Ast des Aortenbogens ein Entlüftungsöffnung angelegt. Legen Sie die Spitzen der Kanülen in beide Herzkammern.
    4. Verschließen Sie andere Gefäßöffnungen mit Schnur, nachdem Sie eine verriegelte halbgeschnittene Kunststoffspritze oder ein 1,5-5,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in geeigneter Größe eingeführt haben. Verwenden Sie eine dünne Gaze, um den Einführteil der Spritzen/Schläuche/Kanülen abzudecken, um ein Auslaufen und Verrutschen zu verhindern. Beheben Sie große Lecks mit Nähten, Bändern oder Verklumpungen. Kleine Undichtigkeiten sind zulässig.
    5. Hänge das Herz in einen Plastikbehälter.
    6. Verbinden Sie den 22-24 Fr Weichplastikschlauch mit jeder Kanüle und führen Sie das andere Ende des Schlauchs in den mit dem Fixiermittel gefüllten Behälter ein.
    7. Zirkulieren Sie das Fixiermittel durch den Rechts- und Linksherzkreislauf unter Verwendung einer High-Flow-Pumpe, die auf ca. 100-300 ml/min für das rechte Herz und 200-400 ml/min für das linke Herz eingestellt ist, um etwa 20 mmHg im rechten Ventrikel bzw. 80 mmHg im linken Ventrikel zu erreichen.
    8. Halten Sie die Durchblutung 24 Stunden lang bei 4 °C.
    9. Waschen Sie das Herz mit 0,01 mol/L PBS für 30 min unter viermaligem Rühren.
    10. Lagern Sie das Herz in 0,01 mol/L PBS/0,02 % Natriumazid bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Druck-Perfusions-Fixierung ist nur bei einem frischen Herzen wirksam, nicht bei einem Herzen, das von einem einbalsamierten Leichnam geborgen wurde.
  2. Grobe Sektion
    1. Führen Sie in jeder Phase der Dissektion eine progressive Dissektion mit fotografischen Aufnahmen durch.
    2. Um die klinische Relevanz zu erhalten, ist besonders darauf zu achten, dass Strukturen nicht verzerrt/verformt werden, um die physiologische Morphologie des Herzens zu erhalten.
    3. Bilden Sie Zielstrukturen mit klinisch relevanter Orientierung ab, z. B. mit rechter anteriorer Schrägausrichtung.
  3. Fotografie
    1. Platzieren Sie das druckdurchblutete und feste Herz auf einem Stativ mit einer Plattform, die mit mehreren Zinken montiert ist und um 360° gedreht werdenkann.
    2. Fotografieren Sie das Herz mit einer digitalen Spiegelreflexkamera (Abbildung 5)24 und verwenden Sie dabei mehrere Leuchtdioden-Lichtpaneele, die auf den C-Stativen angebracht sind, und ein breites schwarzes Duvetyn-Hintergrundtuch.
    3. Fotografieren Sie mit dem Objektiv mit einer langen Brennweite (200 mm) für einen Arbeitsabstand von 4-6 Fuß, um die Verzerrung des Motivs zu minimieren14.
  4. Anaglyphen
    1. Um Anaglyphenbilder anzuzeigen, rekonstruieren Sie ein Paar von Fotos oder volumengerenderten Bildern aus CT-Datensätzen mit einem Unterschied von 10° im Rotationswinkel auf der horizontalen Ebene.
    2. Konvertieren Sie einen Satz dieser zweidimensionalen (2D) Bilder, die als Stereogramm bezeichnet werden, in Anaglyphen mit der Freeware16.
    3. Um eine Anaglyphe anzuzeigen, verwenden Sie eine rote/cyanfarbene Brille.
  5. Photogrammetrie
    HINWEIS: Photogrammetrie ist die angewandte Wissenschaft der Erzeugung einer dreidimensionalen oberflächengerenderten Rekonstruktion aus mehreren zweidimensionalen Fotos, die aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen wurden17.
    1. Hängen Sie die Probe auf C-Stative auf oder legen Sie sie auf den Rotationstisch, um mit einem Smartphone Hunderte von multidirektionalen Fotos zu erhalten.
    2. Generieren Sie das 3D-Modell im FBX-Format mit handelsüblicher Software.
  6. CT-Untersuchung
    HINWEIS: CT-Scans können nach der Druckperfusion und -fixierung und in jedem Stadium der Dissektion durchgeführt werden.
    1. Hängen Sie die Herzprobe an einen Stab, der über der Oberseite des Behälters platziert ist. Um zu verhindern, dass das Herz während des Scans schwingt, stützen Sie die Basis des Herzens mit Kunststoffzinken ab, die am Boden des Behälters befestigt sind. So dient die Luft als negativer Kontrast.
    2. Führen Sie den CT-Scan mit einem handelsüblichen Multidetektor-Reihen-CT-Scanner mit den folgenden Parametern durch: Röhrenspannung von 120 kV, Röhrenstrom von 800-900 mA und eine Gantry-Drehung von 280 ms. Das Dosislängenprodukt beträgt im Allgemeinen 500-1200 mGy.cm.
    3. Rekonstruieren Sie axiale Bilddaten mit den folgenden Parametern: eine Schnittdicke, 0,6 mm; ein inkrementelles Intervall von 0,3 mm; ein möglichst kleines Sichtfeld (in der Regel 100-200 mm); und eine Matrix, 512 × 512.
  7. Virtuelles Sezieren
    1. Analysieren Sie die CT-Scanbilder mit kommerziell erhältlicher Software, um virtuelle Präparierbilder zu erstellen.
      ANMERKUNG: Die virtuelle Dissektion ist eine Modifikation des Volumen-Rendering-Prozesses, bei dem der Fokus auf die Wände der Herzkammern und Gefäße18 verlagert wird. Bei diesem Prozess wird durch manuelles Thresholding die erweiterte Kammer praktisch aus den ursprünglichen Datensätzen entfernt.
    2. Visualisieren Sie die nicht verbesserten Wände, Septen und Ventile mit virtueller Dissektion, um Bilder zu erzeugen, die der groben Dissektion ähneln. Im Gegensatz zur groben Dissektion der Herzproben sind die Schnittebenen bei der virtuellen Dissektion praktisch unbegrenzt. Fast jede Ansicht kann neu erstellt werden, um die gewünschten Strukturen nach Bedarf zu visualisieren.
  8. 3D-Druck
    1. Öffnen Sie die kompatible Datei der Herzprobe in der 3D-Druckersoftware.
    2. Verwenden Sie das Profil von 0,10 mm Fast DETAIL für die Druckeinstellungen im 3D-Drucker und reduzieren Sie die Druckgeschwindigkeit auf 20 mm/s. Aktivieren Sie Stützmaterial generieren.
    3. Verwende das Profil des TPU-Filaments für "Filamenteinstellungen" im 3D-Drucker.
    4. Verwenden Sie das Profil der Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 Düse für "Druckereinstellungen" im Drucker.
    5. Nachdem das Schneiden abgeschlossen ist, speichern Sie die BGCODE-Datei auf einem USB-Flash-Laufwerk für den 3D-Druck.
    6. Verwenden Sie das 1,75 mm TPU-Filament für den 3D-Druck der menschlichen Herzprobe. Trocknen Sie das TPU-Filament vor dem 3D-Druck 6 Stunden lang mit einem Filamenttrockner.
    7. Um die Filamentspannung während des 3D-Drucks zu reduzieren, platzieren Sie die Filamentspule auf einem Spulenhalter mit eingebautem Lager, um die Rotation der Filamentspule zu erleichtern. Führen Sie den 3D-Druck mit einem handelsüblichen 3D-Drucker mit einem strukturierten, pulverbeschichteten Stahlblech durch.
    8. Entfernen Sie vorsichtig Stützmaterialien, wenn der 3D-Druck abgeschlossen ist.

Results

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Untersuchungen im Mikromaßstab
Die Anwendung von Tissue Clearing ermöglicht die Bildgebung größerer Gewebemengen in 3D mittels konfokaler Mikroskopie. Im Herzen können Ganglien mit Herzneuronen und die neuronale Musterung der Myokardinnervation sichtbar gemacht werden (Abbildung 2). Abbildung 3 zeigt ein konfokales Bild des Myokards des linken Ventrikels des Menschen, immungefärbt für Nerven und glatte Muskelzellen. Es wird festgestellt, dass Blutgefäße das Myokard durchqueren, und es werden zahlreiche Nervenfasern identifiziert, sowohl in Verbindung mit als auch unabhängig von Blutgefäßen.

Meso- und makroskalige Untersuchungen
Bei der Verwendung von absolutem Ethanol für eine 24-stündige Druckperfusion und -fixierung wird die natürliche Farbe der Probe gebleicht, das Gewebe dehydriert25 und die Elastizität erheblich reduziert. Auf der anderen Seite bleiben bei der Fixierung mit PFA und Formalin die natürliche Farbe und Elastizität bemerkenswert erhalten. Aus diesen Gründen wird hauptsächlich PFA oder Formalin als bevorzugtes Fixiermittel verwendet.

Abbildung 6 zeigt repräsentative Bilder der groben Zerlegung, der virtuellen Zerlegung, des STL-Polygonmodells und des dreidimensionalen Drucks. Abbildung 7 zeigt repräsentative Bilder der Anaglyphen, die sowohl aus groben als auch aus virtuellen Sezierbildern erstellt wurden. Die Tiefenwahrnehmung kann mit einer Anaglyphenbrille erreicht werden. Das aufgenommene photogrammetrische Modell kann mit kommerziell erhältlicher Software aus fast allen Richtungen beobachtet werden und zeigt komplexe anatomische Merkmale, die für routinemäßige Transkatheter-Herzeingriffe relevant sind. Durch die Anwendung dieser Techniken auf das Herz, das mit Druckperfusion und -fixierung präpariert wird, können dreidimensionale Informationen über das Herz fast ewig entweder digital oder physisch gespeichert und unbegrenzt geteilt werden. Abbildung 8 zeigt die 3D-Drucke im 50%-Maßstab, die von den präparierten Herzen repliziert wurden, die für eine Transplantation abgestoßen wurden.

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Abbildung 1: Flussdiagramm des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Von Gewebe befreiter Schnitt des rechten Vorhofs des Menschen. (A) Rechts hintere schräge Ansicht eines rechten Vorhofs mit dem für die Gewebereinigung präparierten Plexus des rechten Vorhofs (RAGP). (B) RAGP-Probe vor und nach der Gewebereinigung. (C) Projektion der maximalen Intensität eines iDISCO+-clearierten Teils von humanem RAGP mit immungefärbten Ganglien (Pfeilspitzen), die mit dem panneuronalen Markerprotein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5) immungefärbt sind. Die Maßstabsleisten sind 1 cm (A), 5 mm (B) und 500 μm (C). Diese Abbildung ist eine Adaption von Hanna et al.11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Immungefärbte Objektträger des menschlichen linken Ventrikels. Konfokales Bild aus dem Myokardschnitt des linken Ventrikels des Menschen, immungefärbt mit dem panneuronalen Markerprotein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5) und dem Marker für glatte Muskelzell α-Aktin der glatten Muskulatur (αSMA). Die Autofluoreszenz des Muskels ist mit der 488-nm-Laserlinie (grün) sichtbar. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Mikrocomputertomographische Bildgebung von Herzproben. (A) Mikro-Computertomographie-Aufbau für die Bildgebung von Herzproben. (B) Benutzeroberfläche für die Mikro-Computertomographie-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Fotostudio im UCLA Cardiac Arrhythmia Center. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Bruttodissektion (oben links), virtuelle Dissektion (oben rechts), STL-Polygonmodell (unten links) und dreidimensionaler Druck (unten rechts) Bilder des Aorten- und Mitralklappenkomplexes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Anaglyphen einer groben Dissektion (links) und einer virtuellen Dissektion (rechts) des Aorten- und Mitralklappenkomplexes. Eine Anaglyphenbrille (rot/cyan) ist notwendig, um eine Tiefenwahrnehmung zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Dreidimensionaler Druck von Herzproben. (A) Dreidimensionaler (3D) Druckeraufbau für den 3D-Druck von Herzproben mit einem TPU-Filament. (B) Repräsentative Herz-3D-Drucke, die mit den in dieser Studie beschriebenen Methoden hergestellt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die vorliegende Studie zeigt die umfassende Pipeline zur Analyse von Proben, die aus ganzen menschlichen Herzen gewonnen wurden. Repräsentative Befunde zeigen mikro- bis makroskalige anatomische Untersuchungen, die routinemäßig an einem einzelnen Herzen durchgeführt werden. Da eine menschliche Herzprobe äußerst wertvoll ist, ist ein Multiskalenansatz ideal und effektiv, um keine Teile der Probe zu verschwenden, indem mehrere Protokolle für verschiedene Zwecke angewendet werden, einschließlich der Entdeckung in der wissenschaftlichen Forschung, der Verbesserung klinischer Verfahren und der anatomischen Ausbildung mit Aufrechterhaltung der anatomischen Korrelation im Kontext des gesamten Herzens.

Bei der mikroskaligen Untersuchung können Immunfärbung und Mikroskopie eingesetzt werden, um die Zytoarchitektur menschlicher Herzproben zu verstehen. Hier wird die Anwendung von Gewebeclearing und Immunhistochemie zur Untersuchung der kardialen Neuroanatomie auf zellulärer Ebene demonstriert. Die Anwendung dieser Techniken ist hilfreich bei der Charakterisierung des kardialen Nervensystems und der myokardialen Innervationsmuster in Bezug auf interessierende Strukturen, wie das kardiale Leitungssystem und die Herzkammern. Obwohl eine hervorragende räumliche Auflösung erreicht wird, ist der Einsatz der konfokalen Mikroskopie, insbesondere bei gewebefreigelegten Proben, zeitaufwändig. Die Lichtblattmikroskopie kann verwendet werden, um die Zeit für die Bildaufnahme auf Kosten der räumlichen Auflösung zu reduzieren.

In Bezug auf die meso- bis makroskalige Untersuchung liegt die räumliche Auflösung von Mikro-CT-Scannern in der Institution der Autoren zwischen 10 und 200 μm. Die Probengröße ist auf 20 mm für einen 10-μm-Scan und 120 mm für einen 100-200-μm-Scan begrenzt. Mikro-CT-Scanner in der Anstalt der Autoren können nicht das ganze Herz aufnehmen. So erfordert ein Ganzherzscan in der Institution der Autoren die Verwendung eines klinischen CT-Scanners mit einer räumlichen Auflösung von 600 μm, obwohl Fortschritte die Entwicklung von Mikro-CT-Scannern ermöglicht haben, die das gesamte Herz abbilden können2. Die technologische Entwicklung, wie z.B. die Photonenzählung CT, wird sicherlich weitere Möglichkeiten erweitern. Die Verbesserung der räumlichen Auflösung der STL-Datei sollte der erste Schritt sein, um die Qualität des 3D-Drucks weiter zu verbessern. Die höheren Kosten des 3D-Drucks schränken die Anwendung der Technik in der klinischen Routine ein. Photogrammetrie-Bilder, die von einer beliebigen Smartphone-Anwendung erzeugt werden, sind einfach zu entwickeln und von akzeptabler Qualität, erfordern jedoch weitere ausgefeilte, aber teure und zeitaufwändige Systeme, um die Auflösung zu verbessern26. Zur Visualisierung in 3D sind die erweiterte Realität mit speziellen Kopfbedeckungen27,28 und holographischen Monitoren29 zusätzliche Werkzeuge, die aber auch durch höhere Kosten begrenzt sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch umfassende Strukturanalysen über mikroskopische und makroskopische Skalen hinweg die mikroskalige Anatomie jeder Struktur und ihr funktioneller Beitrag im Kontext des gesamten Herzens verstanden werden können. Mit der Entwicklung der hochauflösenden Bildgebung vergrößert sich die Distanz zwischen der mikro- und makroskaligen Anatomie dramatisch. Experten für elektronenmikroskopische Analysen von Kardiomyozyten sind möglicherweise nicht mit der Anzahl der Mitralsegel vertraut und umgekehrt. Um ein umfassendes Verständnis der Herzmorphologie zu ermöglichen, müssen die Wissenschaftler immer wieder weitere Details jedes Baumes erforschen und dabei den gesamten Wald aus der Vogelperspektive betrachten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den Menschen, die ihre Körper für die Förderung von Bildung und Forschung gespendet haben. Wir danken der OneLegacy Foundation, die die Grundlage für die Gewinnung von Spenderherzen für die Forschung bildete. Wir danken auch Anthony A. Smithson und Arvin Roque-Verdeflor vom UCLA Translational Research Imaging Center (Department of Radiology) für ihre Unterstützung bei der CT-Datenerfassung. Dieses Projekt wurde vom UCLA Amara Yad Project unterstützt. Wir danken Dr. Kalyanam Shivkumar und Dr. Olujimi A. Ajijola für den Aufbau und die Pflege einer Pipeline für die Forschung im menschlichen Herzen. Wir danken unserer Research Operations Managerin, Amiksha S. Gandhi, für ihr Engagement bei der Unterstützung unserer Projekte. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der NIH-Zuschüsse OT2OD023848 & P01 HL164311 und Leducq Grant 23CVD04 für Kalyanam Shivkumar, des American Heart Association Career Development Award 23CDA1039446 für PH und des UCLA Amara-Yad Project (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project) ermöglicht. Der in dieser Studie verwendete GNEXT microPET/CT-Scanner wurde durch einen NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1 S10 OD026917-01A1) finanziert.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichP3813
3D ViewerMicrosoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Kaninchen IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Schaf IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED ObjektivNikon
Anti-Aktin, α-Glatte Muskulatur - Cy3 AntikörperSigma-AldrichC6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Puffer, pH 8,0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (Protein-Genprodukt 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (Tyrosinhydrox-Ylase)Abcamab1542
Anti-VAChT (vesikulärer Acetylcholin-Transporter)Synaptic Systems139 103
BenzyletherSigma-Aldrich108014
RinderserumalbuminSigma-AldrichA4503-10G
Cheetah 3D-Drucker-Filament (95A), 1,75 mmNinjaTek
Deckglas, 22 mm x 30 mm, Nr. 1,5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Kaninchen IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-165-152
DichlormethanSigma-Aldrich270997-100ML
DimethylsulfoxidSigma-AldrichD8418-500ML
Ethanol, 100%Decon Laboratorien2701
GlycinSigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut von SchweinenSigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
Wasserstoffperoxid-LösungSigma-AldrichH1009-500ML
BildgebungssoftwareZeissZEN (black edition)
BildgebungssoftwareOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3mm
KIRI EngineKIRI Innovation
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeissLSM 880
LEAD-2 - Vertikal & Mehrkanal-SchlauchpumpeLONGER
Lightview XLBrightech
Methanol (Certified ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Normales EselserumJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Original Prusa MK4 3D-DruckerPrusa Research
PAP penAbcamab2601
Paraformaldehyd, 32%Elektronenmikroskopie Sciences15714-S
PolycamPolycam
Primärer Antikörper
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
Sekundärantikörper
SlowFade Gold Antiface EindeckmittelInvitrogenS36936
Natriumazid, 5% (w/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definition ASSiemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Teleskope, Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerFree ware entwickelt von Masuji Suto
Superfrost Plus Mikroskop Objektträger, vorgereinigtFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
XylolSigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2Ziosoft, AMIN

References

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