Methodenartikel

Chirurgische lumbale Sympathektomie bei Mäusen

DOI:

10.3791/66821

⸱

5. Juli 2024

 , 
1Medical Scientist Training Program, Emory University School of Medicine, 2Neuroscience Graduate Program, Laney Graduate School, Emory University, 3Department of Cell Biology, Emory University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die chirurgische Entfernung der postganglionären lumbalen sympathischen Neuronen bei einer Maus vor. Dieses Verfahren wird eine Vielzahl von Studien ermöglichen, die darauf abzielen, die Rolle der sympathischen Innervation in distalen Gewebezielen zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Periphere Nervenverletzungen sind häufig, und nur bei 10 % der Patienten wird eine vollständige funktionelle Wiederherstellung nach einer Verletzung erreicht. Das sympathische Nervensystem spielt viele entscheidende Rollen bei der Aufrechterhaltung der körperlichen Homöostase, aber es wurde selten im Zusammenhang mit peripheren Nervenverletzungen untersucht. Das Ausmaß der postganglionären sympathischen neuronalen Funktionen in distalen Zielen in der Peripherie ist derzeit unklar. Um die Rolle der sympathischen Innervation peripherer Ziele besser untersuchen zu können, bietet ein chirurgisches "Knock-out"-Modell einen alternativen Ansatz. Obwohl dies chemisch erreicht werden kann, kann die chemische Zerstörung von postganglionären sympathischen Neuronen unspezifisch und dosisabhängig sein. Die Anwendung einer chirurgischen lumbalen Sympathektomie bei Mäusen, die einst als "praktisch nicht praktikabel" bei Kleintieren galt, ermöglicht ein spezifisches Targeting von postganglionären sympathischen Neuronen, die die Hintergliedmaßen innervieren. Dieses Manuskript beschreibt, wie die L2-L5 lumbalen Sympathikusganglien einer Maus als Überlebensoperation chirurgisch entfernt werden können, wodurch die Schweißreaktion der Hinterpfote und die Anzahl der sympathischen Axone im Ischiasnerv zuverlässig verringert werden.

Einleitung

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Periphere Nervenverletzungen (PNIs) können zu motorischen, sensorischen und sympathischen Defiziten bei distalen Gewebezielen führen, die sich selten voll funktionsfähig erholen1. Die PNI-Forschung hat sich oft auf die motorische und sensorische Regeneration konzentriert; Fast ein Viertel des Ischiasnervs der Ratte besteht jedoch aus unmyelinisierten sympathischen Axonen2. Die Rolle der sympathischen Innervation in den peripheren Geweben ist jedoch nicht vollständig geklärt3. Das sympathische Nervensystem spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der körperlichen Homöostase und ist an der Immunregulation, der Thermoregulation, dem Gefäßtonus, der mitochondrialen Biogenese und mehr beteiligt 4,5,6,7,8,9,10,11 . Wenn die sympathische Innervation an der neuromuskulären Verbindung verloren geht, werden trotz Aufrechterhaltung der Motoneuron-Innervation eine anhaltende Muskelschwäche und synaptische Instabilität beobachtet12. Es wurde gezeigt, dass diese sympathische Regulation der synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Verbindung mit zunehmendem Alter abnimmt13,14, was zur Sarkopenie beiträgt, die als altersabhängige Verringerung von Muskelmasse, Kraft und Kraft definiertist 15. Ein besseres Verständnis der Rolle der sympathischen Innervation peripherer Gewebe ist notwendig für die Entwicklung von Therapien, die die funktionellen Ergebnisse für Patienten mit PNIs und anderen Formen der sympathischen Dysfunktion optimieren.

Die Sympathektomie ist ein leistungsfähiges experimentelles Instrument, mit dem die Rolle der sympathischen Innervation im distalen Zielgewebe untersucht werden kann. Insbesondere entfernt die Entfernung der sympathischen Ganglien auf L2-L5-Ebene einen Großteil der sympathischen Innervation zu den unteren Gliedmaßen, was besonders nützlich für Forscher ist, die sich für den Ischiasnerv interessieren.

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme von postganglionären sympathischen Neuronen im L2-L5-Spiegel aus einer Maus als Überlebensoperation. Dieses Verfahren erfordert mikrochirurgische Fähigkeiten von Nagetieren und Vertrautheit mit der Anatomie von Mäusen und verursacht bei effektiver Durchführung keine sichtbaren phänotypischen Unterschiede. Eine chirurgische lumbale Sympathektomie wurde in der Nagetierforschung eingesetzt, mehr bei Ratten als bei Mäusen 16,17,18,19,20,21; Ein detailliertes Protokoll, das das Protokoll beschreibt, existiert derzeit jedoch nicht. Frühere Studien, in denen die lumbale Sympathektomie angewendet wurde, konzentrierten sich hauptsächlich auf die Rolle der sympathischen Innervation bei der Schmerzreaktion, die im Allgemeinen durch Sympathektomie bei verschiedenen Nervenverletzungsmodellen abgeschwächt wird. In weniger Studien wurde diese Technik bei Mäusenangewendet 22, wahrscheinlich aufgrund der geringeren Größe der anatomischen Orientierungspunkte, da man davon ausging, dass die Anwendung einer chirurgischen Sympathektomie bei Kleintieren "praktisch nicht praktikabel" sei23,24. Lokalisierte Sympathektomien in Form von Mikrosympathektomien wurden auch in Nagetiermodellen eingesetzt, ebenfalls meist im Zusammenhang mit dem Schmerzverhalten 25,26,27. Die Mikrosympathektomie verwendet im Gegensatz zur totalen lumbalen Sympathektomie einen dorsalen Zugang, bei dem ein Segment des grauen Ramus zu einem bestimmten Spinalnerv getrennt und entfernt wird, was eine sehr gezielte Sympathektomie ermöglicht, die weitreichende Nebenwirkungen vermeidet.

Da Mausmodelle für viele Studien, die eine genetische Manipulation erfordern, von entscheidender Bedeutung sind, wird dieses Verfahren auch über die Bandbreite peripherer Nervenverletzungen hinaus vielseitige Anwendungen haben. Mit einem transabdominalen Zugang können die lumbalen sympathischen Ganglien zuverlässig sichtbar gemacht und von der Maus reseziert werden, ohne dass sichtbare Nebenwirkungen erkennbar sind. Obwohl Protokolle für die chemische Zerstörung postganglionärer sympathischer Neuronen verfügbar sind, wie z.B. die Verwendung von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)23,24, ermöglicht dieses chirurgische Verfahren ein anatomisch spezifisches Targeting der postganglionären lumbalen sympathischen Ganglien. Durch den Einsatz einer chirurgischen Sympathektomie werden auch die unspezifischen und dosisabhängigen Bedenken im Zusammenhang mit pharmakologischen Methoden vermieden28,29.

Die Anwendung chemischer Sympathektomien durch Verabreichung von 6-OHDA wurde 1967 als einfacher Weg zur selektiven Destruktion adrenerger Nervenenden beschrieben, da chirurgische Sympathektomien bei Kleintieren nicht bevorzugt wurden23,24. 6-OHDA ist ein katecholaminerges Neurotoxin, das endogen bei Patienten mit Parkinson-Krankheit gebildet wird, und seine Toxizität beruht auf seiner Fähigkeit, freie Radikale zu bilden und die Elektronentransportkette in den Mitochondrien zu hemmen30,31. Durch Noradrenalinaufnahme-1-Transportmechanismen ist 6-OHDA in der Lage, sich in noradrenergen Neuronen, wie z. B. postganglionären sympathischen Neuronen, anzureichern28. Schließlich wird das Neuron durch 6-OHDA zerstört; Die Endstationen im peripheren Nervensystem regenerieren sich jedoch, wobei die funktionelle Aktivität auch dann wiederhergestellt wird, wenn der Aminspiegel noch reduziert ist. Als Reaktion auf 6-OHDA gibt es auch unterschiedliche Dosisschwellen für verschiedene Organe, und es hat sich gezeigt, dass höhere Dosen von 6-OHDA unspezifischere Wirkungen zeigen, was seine neurotoxischen Folgen auf nicht-Katecholamin-haltige Neuronen und sogar nicht-neuronale Zellen ausweitet. Neben noradrenergen Neuronen sind auch dopaminerge Neuronen von 6-OHDA betroffen29, so dass die chemische Sympathektomie letztlich weniger spezifisch für postganglionäre sympathische Neuronen ist als die chirurgische Sympathektomie.

Daher ermöglicht eine chirurgische lumbale Sympathektomie die gezielte Ablation der sympathischen Innervation zu den unteren Extremitäten, die mit einer Vielzahl von experimentellen Techniken und genetischen Manipulationen bei der Maus kombiniert werden kann, um zu untersuchen, wie das sympathische Nervensystem zu verschiedenen Verletzungs- und Krankheitszuständen beiträgt.

Protokoll

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Alle Versuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Emory University (unter der IACUC-Protokollnummer PROTO201700371) genehmigt. In dieser Studie wurden vier adulte weibliche Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6J im Alter von 14 Wochen und einem Gewicht zwischen 16 und 21 g verwendet. Die Details zu den hier verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente: 1 scharfe Schere, 2 Pinzetten mit feiner Spitze, 1 Nadelschrauber.
  2. Erwärmen Sie ein Heizkissen auf 37 °C und legen Sie es unter die OP-Tischplatte.
  3. Sprühen Sie den Operationsbereich einschließlich der Anästhesie-Induktionskammer mit Desinfektionsmittel ein und wischen Sie es gründlich mit Küchenpapier ab.
  4. Stellen Sie sicher, dass Sie sich richtig kleiden und die Hände waschen, bevor Sie die Maus anfassen.
  5. Füttern Sie die Maus mit Meloxicam in einer Dosis von 5 mg/kg Körpergewicht und lassen Sie der Maus genügend Zeit, das Arzneimittel vollständig zu schlucken, um eine Aspiration während der Induktion zu vermeiden.
  6. Induzieren Sie die Maus unter Narkose mit 3 % Isofluran in 1 l/min Sauerstoff (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
  7. Sobald die Maus betäubt ist (keine Reaktion auf das Einklemmen der Zehen), legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Operationstisch, mit der Nase in einem angepassten Nasenkonus.
  8. Sobald die Maus richtig in den Nasenkegel eingesetzt ist, stellen Sie den Isofluran auf 2 % ein, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
  9. Tragen Sie Augengel auf die Augen der Maus auf, um Keratokonjunktivitis sicca (trockenes Auge) zu verhindern.
  10. Stellen Sie sicher, dass die Maus ordnungsgemäß mit chirurgischem Klebeband an der Operationstischplatte befestigt ist.
  11. Überwachen Sie kontinuierlich die Atmung und die richtige Atemfrequenz.
  12. Rasieren Sie das Fell vom Bauch der Maus von der Höhe der Genitalien bis unter die Rippen.
  13. Sobald das Fell entfernt ist, wischen Sie zunächst den Operationsbereich in kreisenden Bewegungen, von der Mitte zur Peripherie, mit 70% Ethanol ab. Wischen Sie dann den Operationsbereich in den gleichen kreisenden Bewegungen mit Betadin ab. Wiederholen Sie sowohl den Ethanol- als auch den Betadin-Schritt insgesamt 3 Mal.
  14. Drapieren Sie die Maus mit einem sterilen OP-Tuch mit einem entsprechend großen Loch, das aus der Mitte ausgeschnitten ist, um das Operationsfeld sichtbar zu machen. Die Rautenform kann hergestellt werden, indem der Vorhang in zwei Hälften gefaltet und ein gleichschenkliges Dreieck mit einer Höhe von ~10 mm und einer Basis von ~15 mm geschnitten wird.

2. Schnitte

  1. Erstellen Sie mit einer scharfen Schere und einer Pinzette mit feiner Spitze einen Mittellinienschnitt von ~1 mm über dem Niveau der Schamsymphyse bis ~2 mm unterhalb der Rippen.
  2. Identifizieren Sie die Faszie der Mittellinie (Linea alba) zwischen den beidseitigen Musculus rectus abdominis. Heben Sie mit der Pinzette die Bauchmuskeln von den darunter liegenden Organen weg und schneiden Sie entlang der Linea alba, um in die Bauchhöhle zu gelangen.
    HINWEIS: Die Linea alba kann identifiziert werden, indem man die beidseitigen Rektus-Abdominus-Muskeln vorsichtig seitlich zieht, um eine dünnere Faszienlinie freizulegen, die in Längsrichtung entlang der Mittellinie32 liegt. Durch den Schnitt durch die Linea alba kann der Muskel leichter geschlossen werden.
  3. Ziehen Sie die Bauchmuskulatur und die Haut mit 5-0 Nähten seitlich zurück, um die nächsten Schritte richtig zu visualisieren.

3. Identifizierung der L2-L5 lumbalen Sympathikusganglien

  1. Die sympathischen Ganglien der Lendenwirbelsäule liegen hinter der Bauchschlagader und der Vena cava inferior. Um die Aorta sichtbar zu machen, entfernen Sie den Darm teilweise aus der Bauchhöhle.
    HINWEIS: Die sympathischen Ganglien auf L2-L5-Ebene verlaufen von der Höhe der Aortenbifurkation in die Beckengefäße bis zur Höhe der linken Nierenarterie21,33.
    1. Legen Sie ein steriles, mit steriler Kochsalzlösung getränktes Baumwollquadrat auf das Tuch, das oberhalb und links vom Schnitt liegt. Schieben Sie vorsichtig mit 2 sterilen Applikatoren mit Wattespitze den Dickdarm und den Dünndarm teilweise auf das mit Kochsalzlösung getränkte Wattequadrat.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Blinddarm und der Blinddarm aus der Bauchhöhle herausragen und dass der absteigende Dickdarm sichtbar ist.
    2. Decken Sie den freiliegenden Darm mit einem weiteren mit Kochsalzlösung getränkten Wattequadrat ab.
    3. Überwachen Sie regelmäßig die Peristaltik während der gesamten Operation, die durch rhythmische Bewegung des Darms identifiziert werden kann.
  2. Identifizieren Sie den absteigenden Dickdarm, d. h. den Teil des Darms, der sich in Richtung Rektum und Anus bewegt und sichtbare Fäkalien enthalten kann, und lenken Sie diese Struktur mit einer geschlossenen Pinzette nach links ab, um die Bauchschlagader und die untere Hohlvene freizulegen. Diese beiden Gefäße sind durch Bindegewebe verbunden und sollten sich als eine Einheit bewegen.
    1. Heben Sie mit einer Pinzette die Bauchgefäße am umgebenden Bindegewebe an. Während dieser angehoben wird, legen Sie vorsichtig eine 5-0 Nylonnaht durch das Bindegewebe.
      ACHTUNG: Punktieren Sie die Bauchgefäße NICHT mit der Nadel: Dies führt zu einer schnellen Dekompensation der Maus und wahrscheinlich zum Tod.
    2. Nachdem die Naht durch das Bindegewebe eingeführt wurde, lenken Sie die Bauchgefäße nach links ab. Dadurch entsteht ein dreieckiges Fenster, das eine direkte Visualisierung der beidseitigen Psoas-Muskeln ermöglicht.
      HINWEIS: Aufgrund der intimen Verbindungen, die die Ganglien mit den Bauchgefäßen haben, werden die sympathischen Ganglien, obwohl sie sich typischerweise in der Mittellinie befinden, zusammen mit den Gefäßen leicht nach links (rechte Maus) abgelenkt. Sobald die Bauchgefäße abgelenkt sind, sollte man sich ein Dreieck vorstellen, wobei die beiden Seiten auf der linken Seite aus den abgelenkten Bauchgefäßen bestehen und die rechte Seite durch die Mittellinie der Maus (zwischen den bilateralen Psoas-Muskeln) definiert wird. Die sympathischen Ganglien liegen in der Mitte dieses Dreiecks (Abbildung 1A). Sie bewegen sich vertikal nebeneinander und erscheinen durchscheinend. Sie können ein kleines Gefäß überlappen, das in die Mittellinie der Maus eintaucht und flach auf dem rechten Psoasmuskel liegt. Verwenden Sie eine Pinzette, um alle darüber liegenden Faszien stumpf zu präparieren, um die Ganglien freizulegen (Abbildung 1B).
  3. Identifizieren Sie die linke Nierenarterie und die linke Hoden- oder Eierstockarterie.
    HINWEIS: Hierbei handelt es sich um große Gefäße, die ein Viereck bilden, dessen Seiten aus der linken Nierenarterie nach oben, der Mittellinie und der Bauchaorta/der unteren Hohlvene des Tieres seitlich und der linken Hoden- oder Eierstockarterie nach unten bestehen. Die Ganglien auf L2-Ebene sind groß und liegen innerhalb dieses Vierecks (Abbildung 1A). Präparieren Sie vorsichtig stumpf, um mit einer Pinzette in dieses Viereck einzudringen, und identifizieren Sie die beidseitigen L2-Ganglien (Abbildung 1B).
  4. Sobald der untere und obere Teil der Ganglien identifiziert sind, greifen Sie mit einer Pinzette nach dem unteren Aspekt der sichtbaren beidseitigen Ganglien und ziehen Sie ihn nach oben. Die Visualisierung von weiter unten gelegenen Ganglien, wie L4 und L5, kann verbessert werden, indem alle Organe, die die Sicht behindern, mit der zweiten Pinzette sanft nach unten gedrückt werden.
    HINWEIS: Die Visualisierung des in Schritt 3.2.2 erwähnten perforierenden Mittelliniengefäßes gewährleistet eine vollständigere lumbale Sympathektomie. Mit einer zweiten Pinzette in der anderen Hand ziehen Sie die Faszien und neuronalen Verbindungen, die die Ganglien im Bauch halten, weg und ziehen gleichzeitig mit der ersten Pinzette die Ganglien selbst nach oben. Nur eine Pinzette sollte die Ganglien festhalten, während die andere die Faszien und neuronalen Verbindungen klärt. Auf Höhe der linken Hoden- oder Ovarialarterie kann es für die L2-Identifizierung hilfreich sein, wenn die unteren Kettenganglien noch intakt sind, da sich die L2-Ganglien bewegen, wenn sie von der unteren Kette gezogen werden. Die Ganglien L3-5 können an der Hoden- oder Eierstockarterie gebrochen werden, bevor die Ganglien L2 mit einer Pinzette aus dem Viereck entnommen werden. Die einzigen Ganglien, die innerhalb des Vierecks vorhanden sind, sind die L2-Ganglien.
  5. Dieses Verfahren sollte einen minimalen Blutverlust aufweisen. Wenn Blutungen auftreten, stellen Sie vor dem Verschluss eine ausreichende Blutstillung sicher.

4. Verschluss der Haut

  1. Nachdem eine ausreichende Blutstillung erreicht ist, entfernen Sie die Naht, die die Bauchgefäße an Ort und Stelle hält.
  2. Setzen Sie mit 2 sterilen Applikatoren mit Wattespitze den umgeleiteten Darm vorsichtig in die Bauchhöhle ein.
  3. Führen Sie mit einer resorbierbaren Naht 5-0 einen Laufstich aus, um sich den Bauchmuskeln anzunähern.
  4. Bei 5-0 Nylon-Naht verwenden Sie einfache unterbrochene Stiche, um die Haut zu schließen.
  5. Tragen Sie eine großzügige Schicht antibiotischer Salbe, wie z. B. Neosporin, auf die Inzisionsstelle auf.
  6. Stellen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen.
  7. Beobachten Sie die Maus alle 15 Minuten, bis sie wach und gehfähig ist. Dies dauert in der Regel weniger als 30 Minuten.

5. Pilocarpin-Schweiß-Assay

HINWEIS: Zur Beurteilung der Erschöpfung der sympathischen funktionellen Aktivität nach einer lumbalen Sympathektomie wurde 7 Tage nach der lumbalen Sympathektomie ein Pilocarpin-Schweißtest durchgeführt.

  1. Bereiten Sie eine 1%ige Pilocarpinhydrochloridlösung in 0,9 % NaCl zusammen mit einer Mischung aus 10 % Kartoffelstärke in Rizinusöl vor.
  2. Bedecken Sie mit einem Pinsel die Plantaroberfläche des Fußes mit Betadin. Lassen Sie diese Schicht vollständig trocknen.
  3. Sobald die Betadinschicht trocken ist, tragen Sie mit einem separaten Pinsel eine Schicht 10 % Stärke in Rizinusöl auf.
  4. 0,25 μl/g Körpergewicht von 1 % Pilocarpin subkutan mit einer Spritze in die lose Haut über dem Hals verabreichen. Starten Sie unmittelbar nach der Verabreichung von Pilocarpin einen Timer.
  5. Machen Sie 8 Minuten nach der Injektion Fotos von der Plantaroberfläche des Fußes.
  6. Zählen Sie bei Fiji die Anzahl der dunklen Flecken auf allen sechs (6) Fußballen (Abbildung 2A).

6. Immunhistochemie

HINWEIS: Um die Degeneration sympathischer Axone in den peripheren Nerven nach lumbaler Sympathektomie zu beurteilen, wurden die bilateralen Ischiasnerven am postoperativen Tag 21 entnommen.

  1. Betäuben Sie die Mäuse (gemäß Schritt 1 des Protokolls), entnehmen Sie die beidseitigen Ischiasnerven und schläfern Sie das Tier dann umgehend ein (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
  2. Platzieren Sie die Ischiasnerven 20 Minuten lang direkt in 4 % Paraformaldehyd in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und übertragen Sie sie dann in 20 % Saccharose in 0,1 M PBS für eine Kryoprotektion über Nacht bei 4 °C.
  3. Die Ischiasnerven werden mit einem Kryostaten in Längsrichtung bei 20 μm durchtrennt und auf geladenen Objektträgern platziert.
  4. Blockieren Sie die Nervenabschnitte mit 10% normalem Ziegenserum (NGS) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 1% Tween 20 (TBST) für 1 h bei Raumtemperatur.
  5. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und ersetzen Sie ihn durch die Primärantikörper Kaninchen-Anti-Tyrosin-Hydroxylase und Hühnchen-Anti-Neurofilament-schwer, verdünnt im Blocking-Puffer (10% NGS in TBST) bei 1:750 bzw. 1:1000. Lassen Sie die Primärantikörper über Nacht in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Waschen Sie den Objektträger 3 Mal mit TBST, jeweils 10 Minuten, bevor Sie die Sekundärantikörper Ziegen-Anti-Kaninchen 647 und Ziegen-Anti-Huhn 488 auftragen, die beide bei 1:200 im Blockierungspuffer verdünnt sind. Lassen Sie die Sekundärantikörper 2 h lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
  7. Waschen Sie die Rutsche 4 Mal à 10 Minuten mit TBST und lassen Sie die Rutsche vor der Montage an einem lichtgeschützten Ort trocknen.
  8. Stellen Sie Nervenschnitte im Abstand von mindestens 40 μm am Fluoreszenzmikroskop auf dem 10x-Objektiv dar.
  9. Auf Fidschi begradigen Sie die Nervenabschnitte und zeichnen Sie drei zufällig platzierte vertikale Linien, die sich über die Breite des Abschnitts erstrecken. Zählen Sie die Anzahl der Axone, die jede vertikale Linie kreuzen, und dividieren Sie diese durch die Breite des Abschnitts an der vertikalen Linie. Wiederholen Sie den Vorgang für jede der drei vertikalen Linien pro Abschnitt. Mittelwerten Sie die drei erhaltenen Werte pro Schnitt und mitteln Sie die Werte der drei Abschnitte pro Nerv weiter.

Ergebnisse

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Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entfernung von postganglionären lumbalen sympathischen Neuronen aus einer Maus. Zwei Mäuse erhielten lumbale Sympathektomien und zwei Mäuse dienten als Kontrollen. Um eine erfolgreiche chirurgische lumbale Sympathektomie zu erreichen, muss eine adäquate Visualisierung zumindest der beidseitigen lumbalen Sympathikusganglien L2 und L3 erreicht werden, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Die Entfernung der Ganglien L4 und L5 würde eine vollständige sympathische Denervierung des Unterkörpers erreichen; Die Visualisierung der unteren Ganglien kann jedoch durch die Urogenitalorgane behindert werden. Frühere retrograde Tracing-Studien haben gezeigt, dass sich die Mehrzahl der Neuronen in den L2-L5-Ganglien in den L2- und L3-Ganglien befindet. Obwohl nur weibliche, altersgleiche Mäuse verwendet wurden, um die repräsentativen Ergebnisse zu erzielen, wurde dieses chirurgische Verfahren sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen viele Male reproduziert, ohne dass signifikante anatomische Unterschiede in Bezug auf die Lage der Hoden- oder Ovarialarterie und der sympathischen Ganglien beobachtet wurden.

Nach Entfernung der Ganglien nimmt die Schwitzreaktion als Reaktion auf Pilocarpin rapide ab, wobei am postoperativen Tag 7 signifikante Unterschiede zu beobachten waren (Abbildung 2). Der postoperative Tag 7 wurde aufgrund der exponentiellen Abnahme der sympathisch vermittelten Schwitzaktivität innerhalb von 7 Tagen nach verschiedenen Ischiasnervverletzungen bei Ratten gewählt34. Da es bis zu 14 Tage dauern kann, bis die Axondegeneration abgeschlossen ist, und aufgrund möglicher Schwierigkeiten bei der intraoperativen Visualisierung der L4- und L5-Ganglien (Blase und Genitalorgane können die Sicht behindern), kann es sein, dass die Schwitzreaktion nicht vollständig abgetragen wird 35,36.

Die Tyrosinhydroxylase-positive (TH+) Axondichte war bis zum postoperativen Tag 21 signifikant verringert, ohne dass sich die Dichte der Neurofilament-Schwerkette (NF-H) änderte (Abbildung 3). Es ist unwahrscheinlich, dass TH+-Axone vollständig erschöpft sind, da das Vorhandensein von sensorischen TH+-Axonen, die niederschwellige Mechanorezeptoren innervieren, und mögliche Schwierigkeiten bei der Visualisierung der gesamten lumbalen Sympathikusketteauftreten 37.

Statisches Gleichgewicht in der Bauchanatomie; Diagramm und beschriftetes chirurgisches Bild der linken Niere und der Gefäße.
Abbildung 1: Intraoperative Ansicht der sympathischen Ganglien der Lendenwirbelsäule. (A) Schematisch mit erwarteten Landmarken. (B) Repräsentatives intraoperatives Bild mit beschrifteten Orientierungspunkten. Die sympathischen Ganglien der Lendenwirbelsäule befinden sich hinter der absteigenden Bauchschlagader und der Vena cava inferior (abgelenkt). Die Ganglien werden mit der Ablenkung der Bauchgefäße nach rechts der Maus gezogen und befinden sich am rechten Psoas, der sich nach unten und oben verläuft. Die bilateralen L2-Ganglien können zwischen der linken Nierenarterie und der linken Hoden- oder Ovarialarterie sichtbar gemacht werden, und die L3-Ganglien sind inferior zur linken Hoden- oder Ovarialarterie zu sehen. Maßstab: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Funktion der Schweißdrüse in Nagetierpfoten; Diagramm, Mikroskopbilder und Grafik zum Vergleich von Schweißflecken.
Abbildung 2: Die chirurgische lumbale Sympathektomie reduziert die Anzahl der Schweißflecken an der Hinterpfote. (A) Schematische Darstellung der Ballenpositionen auf der Plantarfläche der Hinterpfote der Maus. (B) Ein repräsentatives Bild der Schwitzreaktion 8 Minuten nach der Injektion von Pilocarpin bei einem intakten Tier. (B') Vergrößertes Bild mit weißen Pfeilen, die eine ausgewählte Anzahl von Schweißflecken anzeigen. (C) Ein repräsentatives Bild der Schwitzreaktion 8 Minuten nach der Injektion von Pilocarpin bei einem sympathektomierten Tier am postoperativen Tag 7. (C') Vergrößertes Bild mit weißen Pfeilen, die eine ausgewählte Anzahl von Schweißflecken anzeigen. (D) Die Gesamtzahl der Schweißflecken auf allen sechs Fußballen der Hinterpfote bei intakten und sympathektomierten Mäusen. Die Daten werden mit der Linie dargestellt, die den Median darstellt. Mann-Whitney-Test. *p < 0,05. Maßstabsleisten: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Axondichteanalyse, Balkendiagrammvergleich, Kontroll- vs. SynprX-Gruppen, Fluoreszenzmikroskopie.
Abbildung 3: Die chirurgische lumbale Sympathektomie (Sympx) reduziert die Anzahl der sympathischen Axone im Ischiasnerv. (A) Tyrosinhydroxylase (TH)-positive Axone pro μm des Ischiasnervs (Breite des Nervs) am postoperativen Tag 21. Repräsentative Nervenabschnitte der TH-Färbung bei einer intakten (B) und sympathektomierten (B') Maus. (C) Neurofilament-schwere Kette (NF-H)-positive Axone pro μm des Ischiasnervs. Repräsentativer Nervenschnitt der NF-H-Färbung bei einer intakten (D) und sympathektomierten (D') Maus. Magenta gestrichelte Linien stellen mögliche zufällig platzierte vertikale Linien dar, die sich über die Breite des Nervenabschnitts erstrecken, der zur Berechnung der Axondichten im Nerv verwendet wird. Magentafarbene Pfeile zeigen eine ausgewählte Anzahl von Axonen an, die die zufällig platzierten vertikalen Linien kreuzen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Ungekoppelter t-Test. **p < 0,01. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Die lumbalen sympathischen Ganglien sind sehr kleine Strukturen, die sich hinter vielen kritischen Bauchorganen und großen Gefäßen befinden. Daher erfordert dieses Verfahren eine hohe Präzision und Genauigkeit. Ein Großteil der Schwierigkeit liegt in der intraoperativen Identifizierung der sympathischen Ganglien. Es wird vorgeschlagen, dass der Lernende zunächst in der Lage ist, die Ganglien in einem Mauskadaver zu identifizieren, bevor er dieses Verfahren an einer lebenden Maus versucht. Eine Fehlerbehebung muss häufig bei der Identifizierung der sympathischen Ganglien nach der Umleitung des Darms erfolgen. Um eine adäquate Visualisierung zu gewährleisten, muss der absteigende Doppelpunkt sichtbar sein. Die Darmablenkung außerhalb der Bauchhöhle muss den Blinddarm einschließen. Zusätzlich kann die Blase voll und vergrößert sein, was die Sicht auf den absteigenden Dickdarm und in weiterer Folge auf die absteigende Bauchschlagader und die untere Hohlvene behindern kann. Im Idealfall wird die Blase manuell exprimiert, sobald die Maus unter Narkose steht, bevor der erste Hautschnitt vorgenommen wird. Sollte die Blase jedoch nicht exprimiert und die intraoperative Sicht blockiert werden, ist eine schonende Expression mit 2 sterilen Applikatoren mit Wattespitze möglich. Achten Sie darauf, die Harnleiter, die an der hinteren Seite der Blase befestigt sind, nicht zu beschädigen. Sobald die abdominale Aorta und die untere Hohlvene hinter dem absteigenden Dickdarm identifiziert sind, ist eine adäquate Ablenkung und Stabilisierung der Gefäße entscheidend für die Visualisierung der sympathischen Ganglien. Die Faszie ist relativ hart, und wenn die Naht ausschließlich durch die Schicht der Faszien und neuronalen Verbindungen und nicht durch die Gefäßwände gelegt wird, sollten die Gefäße mindestens 1 mm von der Mittellinie entfernt gezogen werden. Die Faszie, die über den sympathischen Ganglien liegt, kann mit einer Pinzette sanft wegpräpariert werden. Sollte während des Eingriffs ein kleines Gefäß brechen, üben Sie mindestens 10 s lang Druck mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze aus, um eine ausreichende Blutstillung vor dem Verschluss zu gewährleisten. Werden bei der Operation die großen Bauchgefäße punktiert, sollte die Maus schnell eingeschläfert werden.

Obwohl diese Methode eine direkte Visualisierung und Entfernung der sympathischen Ganglien ermöglicht und somit im Vergleich zu chemischen Sympathektomien ein spezifischeres Targeting dieser postganglionären sympathischen Neuronen ermöglicht23, gibt es einige Einschränkungen. Diese Operation führt zur Entfernung der L2-L5 lumbalen Sympathikusganglien; Aufgrund der visuellen Obstruktion, die durch lebenswichtige Urogenitalorgane verursacht wird, sind die untersten Ganglien, wie z. B. die Ganglien auf L4-L5-Ebene, während dieses Eingriffs schwieriger zu visualisieren und zu entfernen. Die Mehrzahl der Neuronen, die die unteren Gliedmaßen innervieren, befindet sich in den großen L2-Ganglien. Die L5-Ganglien sind extrem klein und enthalten weniger Neuronen, wie in früheren Fluoreszenz-Retrograd-Tracing-Experimenten gezeigtwurde 38; Wenn diese Neuronen jedoch nicht entfernt werden, kann dies die Analyse der Ergebnisse der distalsten Strukturen, wie z. B. der Füße, verzerren. Um bessere Ergebnisse bei der Untersuchung der distalen Ziele in den Füßen zu erzielen, wäre es ratsam, das entnommene Gewebe zu überprüfen, um die Anzahl der entfernten Ganglien zu zählen. Dies kann über eine fluoreszierende Reportermaus erfolgen, bei der die postganglionären sympathischen Neuronen leicht sichtbar gemacht werden können, oder über einen fluoreszierenden retrograden Tracer, der vor der Operation in das distale Ziel injiziert wird. Zu den fluoreszierenden Reportermäusen für diesen Zweck gehören die ThCre:mTmG (siehe Materialtabelle), die eine extrem spärliche Markierung von Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronen39 aufweist, die Phox2bCre:tdTomato (siehe Materialtabelle), die eine moderate Markierung von postganglionären sympathischen Neuronen40,41 aufweist, und die ThCre:tdTomato (siehe Materialtabelle)), die eine umfangreiche Markierung der postganglionären sympathischen Neuronenaufweist 42. Dies ist keine vollständige Liste der verfügbaren Leitungen.

Darüber hinaus benötigen Mäuse aufgrund des großen Schnitts, der für diesen chirurgischen Eingriff erforderlich ist, möglicherweise eine längere Erholungsphase, bevor weitere Experimente durchgeführt werden können. Mäuse sollten mindestens 3 Tage lang auf ordnungsgemäßen Stuhlgang, Urinieren und Füttern überwacht werden. Darüber hinaus kann eine unsachgemäße Blutstillung zu unbehandelten intraabdominalen Blutungen führen, die zu unerwarteten Zeitpunkten zum Tod von Mäusen führen können. Daher ist die Sicherstellung, dass die Blutstillung vor dem chirurgischen Verschluss erreicht wird, entscheidend für den Erfolg zukünftiger Experimente. Die sympathischen Neuronen können auch chemisch angegriffen werden, wie bereits erwähnt24.

Der Einsatz chirurgischer Sympathektomien wird eine Vielzahl von Studien ermöglichen, die darauf abzielen, die Rolle der postganglionären sympathischen Innervation in distalen Zielen zu untersuchen, wie z. B. die Rolle der sympathischen Innervation an der neuromuskulären Verbindung12. Zusätzlich können fluoreszierende retrograde Tracing-Techniken eingesetzt werden, um die sympathische Reinnervation von distalen Geweben zu quantifizieren, da dieses Protokoll angepasst werden kann, um die Ganglien en bloc aus paraformaldehyd-fixierten Mäusen zu extrahieren38. Im Zusammenhang mit peripheren Nervenverletzungen wird dieses chirurgische "Knock-out"-Modell eine bessere Charakterisierung der erwarteten sympathischen Funktionserholung in zuvor innervierten Geweben ermöglichen.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke unter der Fördernummer K01NS124912 und teilweise durch einen Entwicklungszuschuss des NIH-finanzierten Emory Specialized Center of Research Excellence in Sex Differences U54AG062334 und des Medical Scientist Training Program der Emory University School of Medicine unterstützt. Vielen Dank an David Kim, Postbakkalaureat, für die Durchtrennung von Ischiasnerven und an HaoMin SiMa, Forschungsspezialist, für den 3D-Druck einer Telefonhalterung für unser Stereomikroskop, die das Filmen des Videos ermöglichte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-0 absorierbares NahtmaterialCP Medical421A
5-0 Nylon NahtmaterialMed-Vet InternationalMV-661
70% EthanolSigma-AldrichE7023-4L
Anästhesie-InduktionskammerKent Scientific VetFloVetFlo-0530XS
Anästhesie-VerdampferKent Scientific VetFlo13-005-202
BetadinHealthyPetsBET16OZ
C57BL/6J MäuseJackson Laboratory#000664
Huhn Anti-Neurofilament-lastigesAbcamab72996
KryostatLeicaCM1850
Datenanalyse-SoftwarePrisma
Pinzette mit feiner SpitzeWorld Precision Instruments500233
FluoreszenzmikroskopNikonTi-E
Ziege Anti-Huhn 488InvitrogenA32931
Ziege Anti-Kaninchen 647InvitrogenA21245
HeizkissenBraintree Scientific39DP
BildanalysesoftwareFidschi
BildgebungssoftwareNikonNIS-Elements
IsofluranMed-Vet InternationalRXISO-250
MeloxicamMed-Vet InternationalRXMELOXIDYL32
NadeltreiberRoboz Surgical StoreRS-7894
Normales ZiegenserumAbcamab7481
Ophthalmic SalbeRefreshRefresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutierte MäuseJackson Laboratory #016223, #007914
PilocarpinhydrochloridSigma-AldrichP6503
Kaninchen Anti-Tyrosin-HydroxylaseAbcamab112
Kleine gerade Schere Fine Science Tools14084-09
Sterile Wattestäbchen 2x2Dynarex3252
Sterile Applikatoren mit WattespitzeDynarex4301
Steriles TuchMed-Vet InternationalDR4042
Sterile KochsalzlösungMed-Vet International1070988-BX
ThCre:mTmG mutierte MäuseMutant Mouse Resource and Research CentersStamm #017262-UCDJackson Laboratory, Stamm #007576
ThCre:tdTomato mutierte MäuseEuropean Mouse Mutant ArchiveStamm #00254Jackson Laboratory, Stamm #007914

Referenzen

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Sympathisches Nervensystemperiphere Nervensch digungpostganglion re sympathische NeuronenOperation an M usensympathische AxonregenerationGangliendissektionTyrosinhydroxylase F rbungIschiasnervneuronale Zellkultur

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