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LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

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DOI:

10.3791/66831

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3. Mai 2024

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. Wir verwenden die Durchflusszytometrie zur Analyse von Annexin V und 7-AAD-Doppelfärbung, um den Zelltod zu erkennen, wobei wir die gesamte Zelle verwenden und Rasterelektronenmikroskopie einsetzen, um die Zellmembranmorphologie zu beobachten.

Zusammenfassung

Der Zelltod ist ein grundlegender Prozess in allen lebenden Organismen. Das Protokoll etabliert eine Lipopolysaccharid (LPS) und Adenosintriphosphat (ATP)-induzierte Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)-differenzierte Lipidablagerung im humanen Monozyten (THP-1)-Makrophagenmodell, um den Zelltod zu beobachten. LPS in Kombination mit ATP ist eine klassische Entzündungsindufuhrmethode, die häufig zur Untersuchung von Pyroptose verwendet wird, aber Apoptose und Nekroptose reagieren auch auf die Stimulation durch LPS/ATP. Unter normalen Umständen ist Phosphatidylserin nur im inneren Segel der Plasmamembran lokalisiert. In den frühen Stadien der Pyroptose, Apoptose und Nekroptose bleibt die Zellmembran jedoch intakt und Phosphatidylserin ausgesetzt, und in den späteren Stadien verliert die Zellmembran ihre Integrität. Hier wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um die Doppelfärbung von Annexin V und 7-Aminoactinomycin D (AAD) zu analysieren, um den Zelltod der gesamten Zellen nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass substanzielle Zellen nach Stimulation mit LPS/ATP abstarben. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie beobachten wir die möglichen Formen des Zelltods in einzelnen Zellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zellen nach Stimulation mit LPS/ATP Pyroptose, Apoptose oder Nekroptose durchlaufen können. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beobachtung des Todes von Makrophagen nach Stimulation mit LPS/ATP. Die Ergebnisse zeigten, dass der Zelltod nach LPS- und ATP-Stimulation nicht auf Pyroptose beschränkt ist und dass auch Apoptose und nekrotische Apoptose auftreten können, was den Forschern hilft, den Zelltod nach LPS- und ATP-Stimulation besser zu verstehen und eine bessere experimentelle Methode zu wählen.

Einleitung

Der Zelltod ist ein grundlegender physiologischer Prozess in allen lebenden Organismen. In den letzten Jahren haben umfangreiche Studien gezeigt, dass der Zelltod an der Immunität und dem Gleichgewicht im Organismus beteiligt ist. Die Erforschung des Zelltods hilft uns, den Ausbruch und die Entwicklung von Krankheiten besser zu verstehen. Es wurden mehrere Formen des programmierten Zelltods beschrieben, und es wurden einige wichtige Ziele in diesen Prozessen identifiziert. Pyroptose, Apoptose und Nekroptose sind die drei genetisch definierten programmierten Zelltodwege, die am inneren Gleichgewicht und an der Krankheit beteiligt sind1.

Die Pyroptose zeichnet sich durch die Bildung von Membranporen und die Freisetzung von Zellinhalten aus. Aktivierte Caspasen oder Granzyme spalten Gasdermine, um ihre N-terminalen Domänen zu trennen, die dann oligomerisieren, an die Membran binden und Poren bilden 2,3,4. Die Gasderminpore bietet einen atypischen Sekretionskanal durch die Zellmembranen, was zu nachgeschalteten Zellreaktionen führt, einschließlich der Freisetzung von Inhaltsstoffen und des Ioneneinstroms 2,3,4. Letztendlich kommt es in den Zellen zu einem Plasmamembranriss und einer pyroptotischen Lyse, die durch Ninjurin-15 erleichtert wird. Bei der Apoptose bilden aktivierte Bax und Bak Oligomere auf der mitochondrialen Außenmembran und setzen Cytochrom C frei, das durch ein Gleichgewicht zwischen proapoptotischen und antiapoptotischen Proteinen der BCL-2-Familie, Initiator-Caspasen (Caspase-8, -9 und -10) und Effektor-Caspasen (Caspase-3, -6 und -7) reguliert wird1,6,7. Zu den morphologischen Veränderungen der Apoptose gehören Membranblasen, Zellschrumpfung, Kernfragmentierung, Chromatinkondensation und apoptotische Körperbildung 6,8. Die Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Protein-Kinase 1 (RIPK3) und die Mixed-Lineage-Kinase-Domain-like (MLKL) sind zwei nachgeschaltete Kernkomponenten des nekrotischen Mechanismus1. RIPK3 rekrutiert und phosphoryliert MLKL, p-MLKL oligomerisiert, assoziiert mit der Zellmembran, initiiert Membranperforationen, verursacht Ioneneinstrom, erhöht die intrazelluläre Osmolarität und schließlich Zellruptur 6,9. Gasdermine und MLKL binden an die Plasmamembran und vermitteln Pyroptose bzw. Nekroptose, während BAX/BAK die Apoptose durch Bindung an die äußere Membran der Mitochondrien vermittelt6.

Obwohl jeder Signalweg spezifische Mechanismen und Ergebnisse hat, führen sie zu ähnlichen Veränderungen der Zellmembran. Unter normalen Umständen ist Phosphatidylserin (PS) nur im inneren Segel der Plasmamembran lokalisiert. In den frühen Stadien der Pyroptose, Apoptose und Nekroptose wird PS jedoch außerhalb der Plasmamembran exponiert. Caspase-3/Caspase-7 aktiviert die TMEM16- und XKR-Familien, was zu einer asymmetrischen Zellmembran führt und PS während der Apoptose10 externalisiert. Der Gasdermin D-vermittelte und MLKL-vermittelte Ca2+-Einstrom führt zum Verlust der Symmetrie der Phospholipid-Doppelschicht auf der Zellmembran und zur Exposition von PS. Die Exposition tritt vor dem Verlust der Integrität der Zellmembranauf 11,12. Basierend auf den ähnlichen Veränderungen in der Membran dieser drei Arten des programmierten Zelltods verwenden wir die Durchflusszytometrie, um die Doppelfärbung von Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) zu analysieren und den Zelltod nachzuweisen. Annexin V, ein calciumabhängiges Phospholipid-bindendes Protein, weist eine hohe Affinität zu PS auf, das als empfindliche Sonde zum Nachweis von exponiertem PS auf der Oberfläche der Plasmamembran dienen kann13. 7-AAD ist eine Nukleinsäurefärbung, die nicht die gesamte Zellmembran passieren kann. Es ähnelt Propidiumiodid (PI), einem häufig verwendeten Nukleinsäurefarbstoff. Sie haben ähnliche Fluoreszenzeigenschaften, aber 7-AAD hat ein engeres Emissionsspektrum und weniger Interferenzen mit anderen Detektionskanälen. Aufgrund dieser Ähnlichkeiten reicht es nicht aus, zwischen Pyroptose, Apoptose und Nekroptose zu unterscheiden. Wir haben die Durchflusszytometrie verwendet, um den Zelltod ganzer Zellen nachzuweisen. Mit einer zweiten Methode wird die Zellmembran mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) erfasst, um die möglichen Formen des Zelltods in einzelnen Zellen zu beobachten.

Wir etablierten eine Lipopolysaccharid (LPS) und Adenosintriphosphat (ATP)-induzierte Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)-differenzierte Lipidablagerung in humanen Monozyten (THP-1)-Makrophagenmodellen, um den Zelltod zu beobachten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beobachtung des Zelltods und nicht auf die Untersuchung von Mechanismen.

Protokoll

1. Zelllinie und Zellkultur

  1. Die humane monozytäre Zelllinie THP-1 wird in RPMI-1640 vollständigem Kulturmedium mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM β-Mercaptoethanol gezüchtet. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5 % CO2 -befeuchteter Luft. Subkulturzellen alle 2-3 Tage.
    HINWEIS: THP-1 ist eine Suspensionszelle, wählen Sie diese Option, um die Hälfte des Mediums für die Subkultivierung zu wechseln. Bei der Betrachtung vieler Zellfragmente unter dem Lichtmikroskop zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in dem vorgewärmten, frischen vollständigen Zellkulturmedium.
  2. Verwenden Sie für alle Experimente Zellen (in den Passagen 4-10) in der logarithmischen Wachstumsphase. Wenn sich die Zellen in einem guten Zustand und in einer logarithmischen Wachstumsphase befinden, sind sie unter dem Lichtmikroskop bei 100 x rund, hell, dicht und ohne Klumpen und Zellfragmente.

2. Differenzierung von THP-1-Zellen

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von PMA mit einer Konzentration von 1 mM vor (lösen Sie 1 mg PMA in 1,62 mL Dimethylsulfoxid). Die PMA-Stammlösung mit vollständigem Zellkulturmedium auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 100 nM verdünnen.
  2. Sammeln Sie die Zellen in der Kulturschale in einem sterilen 10-ml-Zentrifugenröhrchen. Bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, Zellen mit 3 mL vollständigem Kulturmedium resuspendieren, das PMA enthält.
  3. Öffnen Sie den Zellzähler und die Zählsoftware. Pipettieren Sie 20 μl Zellsuspension auf die Zellzählerplatine und setzen Sie sie in die Zellzählerplatine ein. Klicken Sie auf Vorschau B1, drehen Sie den Knopf unten rechts am Instrument und passen Sie die Brennweite an, um die Zellen mit hellem Zentrum und klaren Konturen in der Software zu erstellen. Klicken Sie auf Zählen , um die Zählung zu starten.
  4. Basierend auf den Zählergebnissen verwenden Sie ein vollständiges Kulturmedium, das PMA enthält, um eine Zelldichte auf 1 x 106 Zellen/ml einzustellen. Keimzellen in einer 6-Well-Platte, inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 , bevor Sie mit der weiteren Behandlung beginnen.

3. Behandlung von THP-1-Zellen

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von LPS mit einer Konzentration von 1 mg/ml vor (lösen Sie 1 mg LPS in 1 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)). Die LPS-Stammlösung mit serumfreiem Medium auf eine Endarbeitskonzentration von 1 μg/ml verdünnen. Bereiten Sie eine Stammlösung von Na2ATP mit einer Konzentration von 500 mM vor (lösen Sie 0,3026 g ATP in 1 mL PBS).
  2. Das PMA-haltige Medium aus den Vertiefungen aspirieren und mit PBS 1x waschen. Geben Sie der Kontrollgruppe serumfreies Medium und der Modellgruppe serumfreies Medium mit LPS zu. Die Platte wird 6 Stunden lang bei 37 °C + 5 % CO2 inkubiert, bevor mit der weiteren Behandlung fortgefahren wird.
  3. Nach 6 Stunden wird die ATP-Stammlösung bis zu einer endgültigen Arbeitskonzentration von 500 nM in die Modellgruppe gegeben. Die Platte wird 45 Minuten lang bei 37 °C + 5 % CO2 inkubiert, bevor Sie fortfahren.

4. Durchflusszytometrische Analyse (Methode 1)

  1. Vorbereitung von Versuchsproben
    1. Keimen und inkubieren Sie die Zellen in 6-Well-Platten gemäß Schritt 2. Richten Sie vier Kontrollgruppen ohne Behandlung ein: eine Kontrolle ohne Färbung, zwei Kontrollen mit einfacher Färbung (eine für jeden Fleck) und eine Kontrolle mit doppelter Färbung. Legen Sie eine Behandlungsgruppe fest und behandeln Sie gemäß Schritt 3.
    2. Nach der Behandlung wird der gesamte Überstand aus den Vertiefungen abgesaugt und mit PBS 2x gewaschen. Geben Sie 500 μl 0,05 % Trypsin (nicht-EDTA) in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 s lang im Inkubator.
    3. Geben Sie 1 ml RPMI-1640 vollständiges Kulturmedium in jede Vertiefung, um die Zellablösung zu verhindern, und sammeln Sie die Zellen in das 5-ml-Röhrchen. Bei 300 x g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    4. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Legen Sie die Röhrchen mit den Zellen für 3 min in ein Wasserbad bei 37 °C. Alle Proben bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    5. 200 μl 5x Bindungspuffer mit 800 μl destilliertem Wasser auf 1x Bindungspuffer verdünnen. Fügen Sie 100 μl 1x Bindungspuffer hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und übertragen Sie die Zellen in das 5-ml-Röhrchen.
    6. Geben Sie 5 μl Annexin V-PE-Lösung für 10 Minuten in ein Röhrchen mit Zellen der Kontrollgruppe und 5 μl 7-AAD-Lösung für 5 Minuten in ein anderes Röhrchen mit Zellen der Kontrollgruppe (als Einzelfärbekontrollen separat). Wirbeln Sie jedes Röhrchen vorsichtig durch, um die Proben zu mischen, zu färben und bei Raumtemperatur lichtgeschützt zu inkubieren. Geben Sie 400 μl PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es vorsichtig ein, um die Inkubation zu beenden.
    7. 5 μl Annexin V-PE-Lösung in die restlichen Röhrchen geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Wirbeln Sie jedes Röhrchen vorsichtig durch, um die Proben zu mischen, zu färben und bei Raumtemperatur lichtgeschützt zu inkubieren. Nach 5 min 5 μl 7-AAD-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur hinzufügen. Geben Sie 400 μl PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie vorsichtig vortexen, um die Inkubation zu beenden.
    8. Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 35-μm-Nylonnetz, das Teil der 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen ist. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und warten Sie auf den Test. Mischen Sie es vor dem Testen vorsichtig und setzen Sie es dann in das Gerät ein.
  2. Durchflusszytometrie
    1. Verwenden Sie für die Tests ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortier-Durchflusszytometer. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware für das Durchflusszytometer und bestätigen Sie die Leistung des Detektors und des Lasers. Klicken Sie auf das Zytometer , wählen Sie Fluidik-Start, warten Sie, bis das System bereit ist. Schließen Sie Strömungskammerblasen aus, indem Sie auf Zytometer > Reinigungsmodi > Entgasungs-Durchflusszelle klicken.
    2. Klicken Sie auf Experiment, wählen Sie in der Reihenfolge Neuer Ordner, Experiment, Probe, Röhrchen und Name bearbeiten. Ein fünfeckiger Pfeil vor der Röhre, der grün wird, wenn er aufleuchtet.
    3. Klicken Sie auf das Symbol von Cytometer FACSCelesta (ein Tastenkombinationssymbol), wählen Sie Parameter und dann FSC, SSC und PE-Signal aus. Klicken Sie auf das Symbol des globalen Arbeitsblatts (ein Tastenkombinationssymbol), um das PE-Histogramm zu erstellen. Für das in dieser Studie verwendete Durchflusszytometer ist PE für Annexin V bei 586 nm zu verwenden und auf der X-Achse zu zeichnen; PerCP-Cy5.5 für 7-AAD bei 700 nm und Plot auf der Y-Achse.
    4. Führen Sie zuerst die nicht gefärbte Kontrollprobe in das Gerät ein. Klicken Sie auf das Symbol des Akquise-Dashboards (ein Tastenkombinationssymbol) und rufen Sie mindestens 10.000 Ereignisse aus der gewünschten Population ab. Schließen Sie Ablagerungen mithilfe eines Anschnitts (P1) in einem FSC-A- und SSC-A-Punktdiagramm aus. Stellen Sie die Durchflussmenge auf mittlere Geschwindigkeit ein und zeichnen Sie Daten auf. Passen Sie die Spannung so an, dass die Zellpopulation auf der Diagonale des FSC/SSC-Histogramms platziert wird, und klicken Sie auf Neustart. Stellen Sie die Durchflussmenge auf mittlere Geschwindigkeit ein und zeichnen Sie Daten auf.
    5. Klicken Sie auf Nächstes Rohr und führen Sie die Einzelfärberegler von Annexin V und 7-AAD aus, um die Kompensation anzupassen. Führen Sie die restlichen Röhren aus und sammeln Sie Daten.

5. REM-Bildgebung (Methode 2)

  1. Vorbereitung von Versuchsproben
    1. Zellen säen und inkubieren Sie sie in 6-Well-Platten gemäß Schritt 2 und behandeln Sie sie gemäß Schritt 3.
    2. Nach der Behandlung den gesamten Überstand aus den Vertiefungen ansaugen und 2x mit PBS waschen. Geben Sie 500 μl 0,05 % Trypsin (nicht-EDTA) in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 s lang im Inkubator.
    3. Geben Sie 1 ml RPMI-1640 vollständiges Kulturmedium in jede Vertiefung, um die Zellablösung zu verhindern, und sammeln Sie die Zellen in das 5-ml-Röhrchen. Bei 300 x g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    4. Die Zellen werden 2 h lang bei Raumtemperatur mit 500 μl elektronenmikroskopischem Fixiermittel (2,5 % Glutardialdehyd, 100 mM Phosphorsalze) fixiert, gefolgt von einer Übernachtung bei 4 °C.
    5. Chrom-Alaun-Lösung herstellen: 1,0 g Gelatine in 100 ml Reinstwasser geben, 70 °C im Wasserbad erhitzen und gleichmäßig umrühren. 0,05 g Chrom-Alaun zugeben, gleichmäßig umrühren und mit Filterpapier filtrieren. Tauchen Sie das saubere Deckglas 2 h bei 37 °C in Chrom-Alaun-Lösung und trocknen Sie es für die spätere Verwendung im 37 °C-Ofen.
      HINWEIS: Der Zweck besteht darin, eine Zellablösung während des Experiments zu verhindern.
    6. Sammeln Sie Zellen aus fester Lösung. Bei 300 x g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Fügen Sie 100 μl PBS hinzu und blasen Sie die Zellen vorsichtig weg. Lassen Sie die Zellensuspension auf das Deckglas fallen, lassen Sie sie 5 Minuten stehen. Saugen Sie den gesamten Überstand an und waschen Sie ihn 3x mit PBS für jeweils 5 Minuten.
      HINWEIS: Der Vorgang muss vorsichtig durchgeführt werden, um eine Zellablösung zu verhindern. Schütteln Sie nicht kräftig, bewegen Sie sich langsam und fügen Sie Flüssigkeit langsam entlang der Wand hinzu.
    7. 500 μl 1%ige Osminsäurefixierung für 1 Stunde zugeben. Saugen Sie den gesamten Überstand an und waschen Sie ihn 3x mit PBS für jeweils 5 Minuten.
    8. Die Proben werden nacheinander in einer Reihe von Ethanol (EtOH)-Konzentrationen (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 %) für 15 Minuten pro EtOH-Lösung dehydriert.
      HINWEIS: Die Deckgläser können mehrere Tage bei 4 °C in 100 % EtOH aufbewahrt werden, sollten jedoch so schnell wie möglich trocknen, um eine übermäßige Austrocknung zu vermeiden.
    9. Schalten Sie den Critical-Point-Trockner ein, öffnen Sie den CO2 - Tank, kühlen Sie die Kammer auf 10 °C. Wickeln Sie die Probe bei einem Kammerdruck von 0 psi schnell mit Filterpapier ein und legen Sie sie in die Kammer.
    10. Öffnen Sie das Einlassventil, beobachten Sie durch das CO2 - Beobachtungsfenster, erhöhen Sie den CO2 -Gehalt der Flüssigkeit zwischen den beiden roten Linien (Obergrenze nicht überschreiten), schließen Sie das Einlassventil. Die Probe 10 Minuten einweichen. Öffnen Sie gleichzeitig das Einlass- und das Auslassventil, um das CO2 für 1 min auszugleichen (flüssiges CO2 verdrängt EtOH). Schließen Sie das Auslassventil, um den CO2 -Gehalt der Flüssigkeit in die angegebene Position anzuheben, und schließen Sie das Einlassventil.
    11. Stellen Sie die Temperatur auf 35 °C und den Druck auf 1250 psi ein. Sobald sich Temperatur und Druck stabilisiert haben, wird der Druck bei 100 psi/min abgebaut. Entnehmen Sie die Probe, wenn der Kammerdruck Null ist, und schalten Sie das Gerät aus.
    12. Montieren Sie Proben mit leitfähigem Klebeband auf REM-Aluminium-Probenhaltern. Verwenden Sie einen Sputter-Coater, um die Proben mit einer Schicht (2-5 nm) Gold zu überziehen.
  2. Bildgebung
    1. Verwenden Sie hochauflösendes Kaltfeld-Emissions-REM für die Bildgebung. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung des REM auf 3 kV ein. Stellen Sie den Arbeitsabstand auf 10 mm ein. Stellen Sie die Vergrößerung auf 1.000x ein, um das Panorama zu betrachten. Stellen Sie die Vergrößerung auf 5.000x und 20.000x ein, um die Plasmamembran zu lokalisieren und die Probe abzubilden.
      HINWEIS: Der Prozess der Visualisierung von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen mittels REM ist ähnlich wie bei anderen Zell- und Gewebetypen und hängt von den verwendeten Instrumenten ab. Die Referenz14 bietet ein detailliertes SEM-Protokoll mit begleitenden Videos.

Ergebnisse

Die Zellproben wurden wie im Protokoll beschrieben behandelt und der Durchflusszytometrie-Nachweis wurde durchgeführt. Normale Zellen können nicht mit Annexin V und 7-AAD (Annexin V-/7-AAD-) gefärbt werden. In den frühen Stadien der Pyroptose, Apoptose und Nekroptose war PS exponiert und an Annexin V gebunden, aber die Zellmembran war noch intakt und schloss 7-AAD aus dem extrazellulären Raum aus (Annexin V+/7-AAD-). In den späteren Stadien verliert die Zellmembran ihre Integrität, die Zellen werden gleichzeitig mit Annexin V und 7-AAD gefärbt, was zu doppelt positiven Ergebnissen führt (Annexin V+/7-AAD+). Die nekrotischen Zellen wurden nur mit 7-AAD (Annexin V-/7-AAD+) angefärbt. Abbildung 1 zeigt, dass nach LPS/ATP-Stimulation die Anzahl der Zellen in der Q2-Region signifikant zunahm, was auf den Zelltod hindeutet.

Wir verwenden REM, um die Oberfläche der Plasmamembran zu erfassen und die Eigenschaften der Membran einer einzelnen Zelle direkt zu beobachten. Abbildung 2A zeigt die Kontrollzellen, Abbildung 2B-D zeigt die Zellen nach LPS/ATP-Stimulation. Wir beobachteten Zellen mit Merkmalen der Pyroptose, einschließlich Membran-Blebbing und Rupturmembran (Abbildung 2B), Zellen mit apoptotischen Eigenschaften, einschließlich Membran-Blebbing und Zellschrumpfung (Abbildung 2C), und Zellen mit Nekroptose-Eigenschaften, einschließlich Zellschwellung und Rupturmembran (Abbildung 2D).

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Abbildung 1: Nachweis der Annexin V/7-AAD-Doppelfärbung mittels Durchflusszytometrie. (A) Annexin V negative und 7-AAD-negative Färbung (Q4), Annexin V positive und 7-AAD negative Doppelfärbung (Q3), Annexin V positive und 7-AAD positive Färbung (Q2) sowie Annexin V negative und 7-AAD-positive Färbung (Q1). (B) Quantitative Daten für Buchstabe A. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n=3), ungepaarter t-Test, **p < 0,01 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. (A) Kontrollgruppe, 5.000-fache/20.000-fache Vergrößerung. (B, C, D) Die LPS/ATP-Gruppe zeigt Membranblasen, Membranruptur (↑), Zellschwellung (↑) und Zellschrumpfung (↑) bei 5.000x/20.000x Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In diesem Manuskript wurden zwei Methoden zum Nachweis von LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen verwendet. Es wurde eine Annexin V/7-AAD-Doppelfärbung verwendet, und die Ergebnisse wurden durchflusszytometrisch aus der Gesamtfärbung analysiert. Wie bei anderen durchflusszytometrischen Analysen wurden eine Gruppe von ungefärbten Zellen und zwei Gruppen von einfach gefärbten Zellen gebildet, um falsch positive und falsch negative Ergebnisse auszuschließen. Die Ergebnisse zeigen, dass nach der LPS/ATP-Stimulation mehrere Zellen die Membranintegrität verloren, was darauf hindeutet, dass es zum Zelltod gekommen sein könnte. Diese Nachweismethode ermöglicht es uns, den Zelltod ganzer Zellen zu bewerten. Es ist erwähnenswert, dass die Doppelfärbung von Annexin V/7-AAD nicht ausreicht, um zwischen Pyroptose, Apoptose und Nekroptose zu unterscheiden. In den frühen Stadien dieser drei Formen wird PS außerhalb der Plasmamembran exponiert, und die Annexin-V-Färbung ist positiv. Die Integrität der Membran geht im späten Stadium dieser drei Formen verloren, und die Färbeergebnisse zeigen eine doppelt positive Färbung. Daher haben wir REM verwendet, um die möglichen Formen des Zelltods weiter zu beobachten.

Bei der Apoptose kommt es zu einer BAX/BAK-Porenbildung an der mitochondrialen Außenmembran, einer anschließenden Zellschrumpfung und einem Zellmembran-Blubbing. Bei der Nekroptose wird MLKL eingesetzt, um Poren in der Zellmembran zu öffnen, während das Pyroptosesignal Gasdermin aktiviert, um Poren in der Zellmembran zu bilden. Es ist erwähnenswert, dass sowohl die Pyroptose als auch die Nekroptose im Endstadium von einer Zellmembranruptur begleitet werden. Gasderminporen sind jedoch viel größer als MLKL-Poren, so dass Gasderminporen keine Ionenselektivität aufweisen. Nekroptotische Zellen zeigen eine signifikante Schwellung in der Morphologie15. Sie enden schließlich mit einem Membranbruch. Unabhängig vom Signalweg, der der Aktivierung der Zellmembranpermeabilität vorgeschaltet ist, gehen Veränderungen in der Zellmembran mit diesen drei Formen des Zelltods einher. Wir verwendeten REM, um die Zellmembran weiter zu beobachten, was eine intuitive Möglichkeit bietet, den Zelltod zu untersuchen. Wir beobachteten die Merkmale der Pyroptose, einschließlich des Blasens der Membran und der Rupturmembran, und der Nekroptose, einschließlich der Zellschwellung und der Rupturmembran, die mit den von früheren Forschern untersuchten Merkmalenübereinstimmten 15. Wir beobachteten Membranblasen und Zellschrumpfung, was mit den Eigenschaften der Apoptose übereinstimmt, die von früheren Forschern untersucht wurden16.

In früheren Studien wurde die Kombination von LPS und ATP häufig verwendet, um Pyroptose zu induzieren. Interessanterweise beobachteten wir Merkmale der Apoptose und Nekroptose. Obwohl alle drei Formen beim LPS/ATP-induzierten Zelltod auftreten können, haben frühere Studien gezeigt, dass Pyroptose die dominierende Todesart bleibt. LPS ist eines der am besten charakterisierten pathogenassoziierten molekularen Muster. ATP, das von sterbenden Zellen freigesetzt wird, hat eine hohe Konzentration in der Zelle. Extrazelluläres ATP gehört zu den gefahrenassoziierten molekularen Mustern17. LPS/ATP ist eine klassische zweistufige Stimulationsmethode zur Induktion von Pyroptose. Die Forschung hat gezeigt, dass die Zugabe von ATP zu LPS-stimulierten Zellen Caspase-118 schnell aktivieren kann, während die Stillschaltung des Caspase-1-Gens den LPS/ATP-induzierten Zelltod signifikant umkehren kann19. In früheren Studien haben wir auch eine LPS/ATP-induzierte Aktivierung von apoptotischen und nekrotischen Zielproteinen gefunden20,21. Obwohl LPS/ATP ein klassischer Pyroptose-Induktor ist, kann es auch Apoptose und Nekroptose induzieren.

Tatsächlich existieren diese drei Formen oft nicht unabhängig voneinander und sprechen zwischen den Signalstufen zusammen. Zum Beispiel zielen Gasderminproteine auf die Mitochondrien ab, um die Freisetzung von Cytochrom c zu fördern und den mitochondrialen apoptotischen Signalwegzu verbessern 22. Die Aktivierung von Caspase-3 kann Gasdermin E spalten und dann die Pyroptose23 auslösen. Eine Studie deutet darauf hin, dass der MLKL/PIPK3-Signalweg an der Aktivierung von NLRP3-Inflammasomen beteiligt ist24. Dieser komplexe Crosstalk führte zum Konzept der PANoptose, definiert als ein inflammatorischer programmierter Zelltodweg, der durch den PANoptosomen-Komplex reguliert wird und Schlüsselmerkmale von Pyroptose, Apoptose und/oder Nekroptose aufweist, die nicht durch einen dieser programmierten Zelltodwege allein erklärt werden können25. Als das Konzept der PANoptose vorgeschlagen wurde, beschrieben die Wissenschaftler das Auftreten des programmierten Zelltods umfassender, was auch die Komplexität des programmierten Zelltods unterstreicht. Dies zeigt inzwischen auch die Grenzen dieser Forschungsmethode auf. Obwohl die Pyroptose als dominant beim LPS/ATP-induzierten Zelltod angesehen wird, kann man nicht bestimmen, wie hoch der Anteil dieser Todesformen ist oder ob sie alle existieren, auch wenn es sich um andere Formen des programmierten Todes handelt. Dies kann ein Bereich sein, den wir in Zukunft untersuchen sollten.

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von Makrophagen. Wir haben eine Methode der Prüfung vom Ganzen bis zum Individuum beschrieben, die auch auf andere Modelle und Zellen anwendbar ist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zellen möglicherweise Pyroptose, Apoptose oder Nekroptose durchlaufen haben, die nicht auf Pyroptose beschränkt ist, was den Forschern hilft, den Zelltod nach LPS- und ATP-Stimulation besser zu verstehen und eine bessere experimentelle Methode zu wählen. In früheren Studien wurde häufig die Doppelfärbung von Annexin V/7-AAD oder Annexin V/PI verwendet, um das Auftreten von Apoptoseanzuzeigen 26,27, einige Forscher haben sie auch zur Untersuchung der Apoptoseverwendet 28. Tatsächlich können wir nicht zwischen den drei Arten des Zelltods durch diese Doppelfärbung unterscheiden. Dieses Protokoll erinnert Forscher, insbesondere Anfänger, daran, dass die Doppelfärbung von Annexin V/7-AAD oder Annexin V/PI die Art des Zelltods nicht qualitativ beurteilen kann. Es kann nur Zellschäden und Zelltod als Ganzes anzeigen oder darauf hinweisen, dass die Zelle möglicherweise eine Form des Todes erlitten hat. In einer gezielteren Forschung ist es notwendig, eine Kontrollgruppe einzuführen, die andere Todesfälle hemmt, um zu zeigen, dass der programmierte Tod endgültig bevorsteht. In ähnlicher Weise werden in weiterer mechanistischer Forschung die kritischen Ziele verschiedener programmierter Tode untersucht.

Darüber hinaus haben wir bei der Vorbereitung des Experiments festgestellt, dass es derzeit viele detaillierte experimentelle Verfahren für das REM von adhärenten Zellen gibt, mit wenig Beschreibung der suspendierten Zellen. Im Folgenden finden Sie eine detailliertere Beschreibung der Probenvorbereitungsmethode für suspendierte Zellen. Schritt 5.5 ist ein notwendiger Schritt, um die Immobilisierung suspendierter Zellen auf Zellobjektträgern zu unterstützen. Nachfolgende Operationen müssen schonend durchgeführt werden, um eine Zellablösung zu verhindern. Neben der Chrom-Alaun-Lösung kann auch Poly-L-Lysin Zellen immobilisieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Jiayi Sun und Lu Yang vom Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie, Cuiping Chen vom State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources für die Hilfe bei der Rasterelektronenmikroskopie. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China [82104491], der Natural Science Foundation of Sichuan [2023NSFSC0674] und der Post-doctoral Science Foundation of China [2021M693789] unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Pankreasenzymlösung (ohne EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 mL Polystyrol-RundbodenröhrchenCORNING352235
5 mL ZentrifugenröhrchenLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
6-Well-Platte Sorfa Life Science Research Co., Ltd220100
Annexin V-PE/7-AAD Apoptose-AnalysekitAbsin (Shanghai) Biological Technology co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5&fach; Bindungspuffer, Apoptose-Positivkontrolllösung
Kelkultur CO2 InkubatorEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
Zellkulturschale, 100 mmSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
Cellometer K2 Fluoreszierender ZellzählerNexcelom Bioscience LLCCellometer K2
Cellometer SD100 ZählkammernNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
ZentrifugenmaschineHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
Chrom-Alaun Verifizierter Lieferant - Guangdong Wengjiang Chemisches Reagenz Co., Ltd.
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IR-Vortex-MischerVELP Scientifica SrlZX4
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PipetteEppendorf AGN/A
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RPMI-1640 komplettes NährmediumProcell Life Science& Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.CM0233RPMI-1640 + 10 % FBS + 0,05 mM β-Mercaptoethanol + 1 % P/S
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MantelflüssigkeitBECKMAN COULTER8546733
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