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Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

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DOI:

10.3791/66834

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4. Oktober 2024

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1John T. Milliken Department of Medicine, Division of Nutritional Sciences and Obesity Medicine, Washington University School of Medicine, 2Nutrition and Obesity Research Center, Cellular and Molecular Biology Core, Washington University School of Medicine, 3Nutrition and Obesity Research Center, Animal Model Research Core, Washington University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Zusammenfassung

Die mitochondriale Funktion, ein Eckpfeiler der zellulären Energieproduktion, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase. Seine Funktionsstörung in der Skelettmuskulatur wird mit weit verbreiteten Stoffwechselstörungen (z. B. Diabetes und Fettleibigkeit), Muskeldystrophien und Sarkopenie in Verbindung gebracht. Es gibt zwar viele Techniken zur Bewertung des mitochondrialen Gehalts und der Morphologie, aber die wichtigste Methode zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion ist die Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) durch Respirometrie. Die Quantifizierung des mitochondrialen OXPHOS gibt Aufschluss über die Effizienz der mitochondrialen oxidativen Energieproduktion und der zellulären Bioenergetik. Ein hochauflösendes Respirometer ermöglicht hochempfindliche, robuste Messungen von mitochondrialem OXPHOS in permeabilisierten Muskelfasern, indem es Änderungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in Echtzeit misst. Die Verwendung von permeabilisierten Muskelfasern im Gegensatz zu isolierten Mitochondrien bewahrt die mitochondrialen Netzwerke, erhält die Integrität der mitochondrialen Membran und ermöglicht letztendlich physiologisch relevantere Messungen. Dieses System ermöglicht auch die Messung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität - dynamische Aspekte des Muskelenergiestoffwechsels. Hier stellen wir einen umfassenden Leitfaden für mitochondriale OXPHOS-Messungen in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mit einem hochauflösenden Respirometer zur Verfügung. Skelettmuskelgruppen setzen sich aus verschiedenen Fasertypen zusammen, die sich in ihrer mitochondrialen Brennstoffpräferenz und Bioenergetik unterscheiden. Mit Hilfe eines hochauflösenden Respirometers beschreiben wir Methoden zur Bewertung sowohl aerober Glykolyt- als auch Fettsäuresubstrate, um die Brennstoffpräferenz und die metabolische Flexibilität fasertypabhängig zu beurteilen. Das Protokoll ist vielseitig und sowohl auf menschliche als auch auf Nagetiermuskelfasern anwendbar. Ziel ist es, die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit von mitochondrialen Funktionsbewertungen zu verbessern, was unser Verständnis einer für die Muskelgesundheit wichtigen Organelle verbessern wird.

Einleitung

Mitochondrien sind der Eckpfeiler der zellulären Energieproduktion und damit unverzichtbar für die Aufrechterhaltung einer optimalen zellulären und organismischen Homöostase. Diese doppelmembranigen Organellen sind in erster Linie für die oxidative Phosphorylierung verantwortlich. Dieser Prozess wandelt Nährstoffe wie Zucker und Fettsäuren effizient in Adenosintriphosphat (ATP) um, die zelluläre Energiewährung. Neben ihrer Rolle im Energiestoffwechsel sind Mitochondrien auch wichtige Regulatoren verschiedener zellulärer Prozesse, einschließlich Apoptose, Kalziumhomöostase und reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)1,2. Aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären und organismischen Homöostase haben Störungen der mitochondrialen Funktion oft nachteilige Auswirkungen auf die Gesundheit des Gewebes und des Organismus. In der Skelettmuskulatur ist die mitochondriale Dysfunktion mit zahlreichen Krankheitszuständen verbunden, darunter Stoffwechselstörungen (z. B. Fettleibigkeit, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen), Sarkopenie und Muskeldystrophie 3,4,5,6,7,8.

Mitochondriale Dysfunktion kann sich in erster Linie als veränderter Gehalt, Anzahl und Morphologie der Mitochondrien sowie durch einen gestörten Stoffwechsel manifestieren. Um ein umfassendes Verständnis der mitochondrialen Dysfunktion zu erreichen, bedarf es daher eines integrativen und ganzheitlichen Ansatzes. Erste Charakterisierungsstudien umfassen die Untersuchung der Expressionsniveaus von Proteinkomplexen der Atmungskette als Auslese des mitochondrialen Gehalts, die Quantifizierung der mitochondrialen DNA und Marker der Biogenese als Maß für die mitochondriale Biogenese sowie eine ausgeklügelte elektronenmikroskopische Bildgebung zur Beurteilung der mitochondrialen Morphologie 9,10. Zusätzliche Bewertungen der mitochondrialen Funktion umfassen die Bewertung der zellulären ROS- und ATP-Produktion und des mitochondrialen Membranpotenzials9.

Da Mitochondrien für die zelluläre Energieproduktion und die Homöostase unerlässlich sind, ist die Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) ein Kennzeichen für die Beurteilung der mitochondrialen funktionären Phosphorylierung. Die hochauflösende Respirometrie von permeabilisierten Muskelfasern ermöglicht die Messung von Echtzeitänderungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs als Auslese für die dynamischen Veränderungen der mitochondrialen OXPHOS-Atmungskettenaktivität 9,11,12. Die Anwendung selektiver chemischer Modulatoren und Inhibitoren ermöglicht es, die Aktivität verschiedener Atmungskomplexe direkt und sequentiell zu messen. Obwohl isolierte Mitochondrien in der Respirometrie verwendet werden können, erhält die Verwendung frischer, permeabilisierter Muskelfasern die endogenen mitochondrialen Netzwerke und die Membranintegrität - was physiologisch relevantere Messungen ermöglicht. Da verschiedene Muskelfasertypen unterschiedliche Substratpräferenzen und Atmungsraten haben, ermöglicht dieses System außerdem, Veränderungen der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität basierend auf dem Fasertyp13 zu messen.

Hier beschreiben wir ein umfassendes Protokoll für mitochondriale OXPHOS-Messungen mit menschlichen oder Maus-Skelettmuskelfasern in einem hochauflösenden Respirometersystem. Enthalten sind Methoden zur Quantifizierung der mitochondrialen Sauerstoffatmung in oxidativen oder glykolytischen Fasern unter Verwendung von Pyruvat oder Palmitoyl-Carnitin als Substrat. Dieses Protokoll ermöglicht die Verwendung anderer Brennstoffsubstrate, um spezifische metabolische Fragen im Zusammenhang mit Defekten bei der Substratnutzung und der Brennstoffpräferenz zu beantworten.

Protokoll

Alle Verfahren an Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Washington University genehmigt. Mäuse jeden Geschlechts, Alters und Gewichts können für diese Experimente verwendet werden und hängen von der Art der experimentellen Fragestellung ab, die man beantworten möchte. Bei den hier verwendeten Mäusen handelt es sich um adulte (12-16 Wochen alte), männliche Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6. Alle menschlichen Verfahren wurden vom Institutional Review Board der Washington University genehmigt. Die Studienteilnehmer stimmten der Datennutzung zu, und die in diesem Protokoll enthaltenen repräsentativen Daten von Probanden stammen aus einer veröffentlichten Studie14. Die Daten stammen von nicht-diabetischen Frauen nach der Menopause (55-75 Jahre). Einzelheiten zur Vorbereitung der für den Assay erforderlichen Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt. Informationen zu den spezifischen Reagenzien, Werkzeugen und Maschinen, die im Assay verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Eine schematische Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

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Abbildung 1: Schema für die hochauflösende Respirometrie an permeabilisierten Skelettmuskelproben. Die in diesem Manuskript beschriebene Methode ist in 6 Abschnitte unterteilt: 1) Vorbereitung von Respirationspuffern und Reagenzien, 2) Vorbereitung von Instrumenten und Reagenzien am Tag des Assays, 3) Vorbereitung und Permeabilisierung von Muskelproben, 4) Vorbereitung von Probe und Instrument, 5) Durchführung des Respirationsassays und 6) Datenanalyse. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Vorbereitung des Assays und Kalibrierung des Instruments

  1. Am Tag des Assays die erforderliche Anzahl von Aliquots jeder Atmungsverbindung (Blebbistatin, Palmitoyl-Carnitin, Glutamat, Malat, ADP, Succinat, Cytochrom C, FCCP) entfernen und auf Eis auftauen. Fläschchen mit BIOPS und MiR05 auf Eis auftauen.
  2. Bereiten Sie Saponin- und Pyruvatlösungen wie in Tabelle 1 angegeben vor. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von MiR05 wie in Tabelle 1 vor. Bereiten Sie 5 ml Arbeitslösung von MiR05 pro Instrument (2 Kammern) vor. Skalieren Sie nach Bedarf.
  3. Schalten Sie das hochauflösende Respirometriesystem und das Vakuumsystem ein. Entfernen Sie die Stopfen, entfernen Sie die 70%ige Ethanol-Lagerlösung durch Vakuum und füllen Sie die Kammer wieder mit hochreinem molekularem H2O. Entfernen Sie H2O durch Vakuum und füllen Sie es wieder auf. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Wäschen. Geben Sie nach der letzten Wäsche 2 ml MiR05 (ohne Kreatin oder Blebbistatin) in jede Kammer.
  4. Öffnen Sie die Respirometrie-Software. Nachdem die Software gestartet wurde, öffnet sich ein Popup-Fenster für die Instrumenteneinstellungen. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit der Kammer auf 750 U/min, die Temperatur auf 37 °C und das Datenaufzeichnungsintervall auf 2 s ein. Stellen Sie die Verstärkung auf 1 und die Polarisationsspannung auf 800 mV für die Sauerstoffsensoren ein. Klicken Sie auf Mit Oxygraph verbinden , um die Kommunikation mit dem Gerät herzustellen.
  5. Nachdem die Kommunikation hergestellt wurde, öffnet sich ein Dialogfeld zum Benennen und Speichern der experimentellen Datei. Speichern Sie die Datei mit dem aktuellen Datum und der Kalibrierung. Nach dem Speichern der Datei wird ein Popup-Dialogfeld mit experimentellen Details angezeigt. Für den Kalibrierlauf werden keine Informationen benötigt, und die Box kann geschlossen werden.
  6. Aufzeichnung der Sauerstoffkonzentration für mindestens 30 Minuten, damit sich die Kammern erwärmen können und Signale für die Luftkalibrierung aufgezeichnet werden können. Dies kann während der Vorbereitung der Muskelfasern erfolgen, wie in Schritt 2 unten beschrieben.
  7. Markieren Sie am Ende des Kalibrierzeitraums einen Kalibrierbereich quer durch den Bereich, in dem die Sauerstoffkonzentration (blaue Linie) stabil ist. Halten Sie dazu die Umschalttaste und die linke Maustaste gedrückt und ziehen Sie über einen Bereich auf der Timeline.
  8. Öffnen Sie das Kalibrierungsfenster, indem Sie zum Oxygraph > O2-Kalibrierung gehen. Wählen Sie für die Luftkalibrierung die in Schritt 1.8 generierte Markierung aus. Klicken Sie auf Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren.
  9. Die Schritte 1.6-1.8 für die verbleibende Kammer wiederholen. Führen Sie täglich eine Luftkalibrierung durch. Stoppen Sie die Aufzeichnung der Luftkalibrierung und speichern Sie die Datei, indem Sie die Verbindung zum Gerät trennen. Nachdem die Proben fertig sind, fahren Sie mit Schritt 3 fort, um den Assay durchzuführen.

2. Entnahme und Permeabilisierung von Skelettmuskelfasern

  1. Isolierung von Gewebe bei Mäusen
    1. Füllen Sie für jede zu analysierende Probe eine Vertiefung einer 12-Well-Kulturschale mit 1 mL BIOPS. Teller zum Abkühlen auf Eis stellen.
    2. Nachdem Sie die Maus durch Inhalation von Kohlendioxid eingeschläfert haben, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation, entnehmen Sie den interessierenden Skelettmuskel und achten Sie darauf, das gesamte Bindegewebe und Fett zu entfernen (Abbildung 2A). Lege den Muskel in eine der Vertiefungen, die BIOPS enthalten. Bis zur Faservorbereitung auf Eis legen.
      HINWEIS: Jeder Skelettmuskel kann mit diesem Protokoll untersucht werden - welcher Muskeltyp untersucht wird, hängt von der experimentellen Fragestellung ab, die man beantworten möchte. Bei Skelettmuskeln mit gemischten Fasertypen, wie z.B. dem Gastrocnemius, ist es möglich, das Gewebe in weiße und rote Schnitte zu unterteilen, um überwiegend schnell zuckende (weiße Schnitte) und überwiegend langsam zuckende (rote Schnitte) Fasern zu messen (Abbildung 2B).
  2. Isolierung von menschlichem Gewebe
    1. Entnehmen Sie Gewebe gemäß dem klinischen Protokoll14. Spülen Sie das Tuch schnell mit kaltem, sterilem PBS ab und legen Sie es in ein konisches Röhrchen mit 2 ml BIOPS-Lösung. Halten Sie das Taschentuch bis zur Faservorbereitung auf Eis.
  3. Faservorbereitung
    1. Die Permeabilisierung erfolgt in einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Geben Sie 2 ml BIOPS-Lösung in einen Satz Vertiefungen und 2 ml MiR05 in einen anderen Satz Vertiefungen. Für jede zu untersuchende Probe ist ein Satz Wells erforderlich.
    2. Packen Sie ein Tablett mit Eis und stellen Sie eine Petrischale aus Glas kopfüber auf das Eis. Achte darauf, den Muskel immer auf Eis zu halten.
    3. Übertragen Sie die entnommenen Muskelproben mit einer Pinzette auf die gekühlte Petrischale-Plattform. Reinigen Sie das Gewebe mit zwei Pinzetten mit feiner Spitze und einem Präpariermikroskop mit Lichtquelle sanft, indem Sie alle Sehnen, Faszien und Fettgewebe entfernen, die am Muskel befestigt sind.
    4. Nachdem sämtliches fremdes Muskelgewebe entfernt wurde, ziehen Sie die Muskelfasern mit der feinen Pinzette vorsichtig auseinander, bis sie zu kleinen Bündeln durchscheinender Fasern mit einer Länge von 0,75 - 1,0 mm gehören (Abbildung 2C-D). Nachdem Sie die Fasern getrennt haben, übertragen Sie die Faserbündel mit der Pinzette in eine Vertiefung auf der 6-Well-Platte, die BIOPS-Lösung auf Eis enthält.
    5. Geben Sie 20 μl 5 mg/ml Saponinlösung in jede BIOPS-Vertiefung und inkubieren Sie die Platte auf Eis, während Sie sie 20 Minuten lang in einem kalten Raum sanft schaukeln.
    6. Übertragen Sie nach der Saponinbehandlung die Muskelfasern in die Vertiefung mit MiR05, um sie vor dem Assay zu spülen. Inkubieren Sie auf Eis und wiegen Sie ihn 15 Minuten lang sanft in einem kalten Raum.
    7. Nachdem die Faserinkubation in MiR05 abgeschlossen ist, sammeln Sie die Fasern mit einer scharfen Pinzette und tupfen Sie die Muskelfasern vorsichtig mit einem Tuch trocken. Tarieren Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff auf einer feinen Waage und geben Sie 2-3 mg Fasern in das Röhrchen. Notieren Sie das endgültige Fasergewicht an der Seite jedes Rohrs. Lege das Rohr auf Eis. Wiederholen Sie den Vorgang mit anderen Proben. Fahren Sie sofort mit Schritt 3 fort.

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Abbildung 2: Trennung der Skelettmuskelfasern der Maus. (A) Grobe Morphologie von Maus-Gastrocnemius nach der Ernte. (B) Dissektion des Gastrocnemius in rote (links) und weiße (rechts) Segmente. (C) Mechanisch getrennte Muskelfasern. (D) Ein 10-faches Bild von erfolgreich getrennten Muskelfasern. Die Maßstabsleiste beträgt 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Aufbereitung von Muskelproben im Respirometer

  1. Vakuumieren Sie das MiR05, das für die Gerätekalibrierung verwendet wird, wie in Schritt 1 oben beschrieben, aus und geben Sie 2,1 ml funktionierende MiR05-Lösung in jede Kammer.
  2. Initiieren Sie eine neue Datei für das Experiment mit den gleichen Geräteeinstellungen wie in Schritt 1.5 beschrieben. über. Legen Sie den Dateinamen fest und speichern Sie die Einstellungen.
  3. Nachdem Sie den Dateinamen festgelegt haben, wird das nächste Dialogfeld für bestimmte experimentelle Details angezeigt. Geben Sie die Probeninformationen und das Gewicht jeder Probe ein, die jeder Kammer hinzugefügt wurde. Schließen Sie das Dialogfeld.
  4. Sobald Sie sich in der neuen experimentellen Datei befinden, stellen Sie die Kalibrierung ein, indem Sie das Fenster O2-Kalibrierung öffnen. Klicken Sie auf Aus Datei kopieren und wählen Sie die Datei aus, die in Schritt 1.9 gespeichert wurde. über. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren . Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibende Kammer.
  5. Übertragen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig Muskelfaserbündel in die Beatmungslösung für die entsprechende Kammer. Wiederholen Sie den Vorgang für die restliche Kammer.
  6. Setzen Sie die Stopfen auf die Kammer und schließen Sie die Kammer vorsichtig halb, indem Sie die Stopfen etwa zur Hälfte nach unten schieben. Sobald die O-Ringe an den Stopfen in die Kammerwand einrasten und Widerstand vorhanden ist, führen Sie eine Drehbewegung aus, während Sie nach unten drücken, um zu schließen. Wenn die Kammer halb geschlossen ist, ist eine kleine Luftblase am oberen Rand der Kammer zu beobachten.
    HINWEIS: Permeabilisierte Fasern unterliegen unter normalen Atemwegsbedingungen Einschränkungen der Sauerstoffdiffusion. Um diese Einschränkung zu umgehen, wird der Assay unter erhöhten Sauerstoffkonzentrationendurchgeführt 11.
  7. Füllen Sie eine 10-ml-Kunststoffspritze mit reinem Sauerstoff aus einem Sauerstofftank. Legen Sie die lange, stumpfe Nadel, die mit dem Instrument geliefert wurde, auf die Spritze. Platzieren Sie die Nadel in der ersten Kammer und geben Sie langsam ca. 1 ml Sauerstoff in die Kammer ab.
  8. Überwachen Sie die Sauerstoffkonzentration in der Kammer in der Respirometrie-Software. Wenn die Sauerstoffkonzentration der Kammer 350-400 nmol/ml erreicht, drehen Sie den Stopfen vorsichtig, während Sie ihn nach unten drücken, um die Kammer vollständig zu schließen. Schauen Sie in die Kammer und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen zurückbleiben. Wenn eine Luftblase vorhanden ist, öffnen Sie die Kammer vorsichtig und schnell wieder, fügen Sie 100 μl zusätzliche funktionierende MiR05-Lösung hinzu und schließen Sie die Kammer schnell wieder. Wiederholen Sie den Vorgang mit den restlichen Kammern.
  9. Die Sauerstoffkonzentrationen sollten während des Assays über 250 nmol/ml gehalten werden. Fügen Sie bei Bedarf zusätzlichen Sauerstoff hinzu, indem Sie die Kammer teilweise öffnen, mehr Sauerstoff aus der Spritze in die Luftblase geben und die Kammer vorsichtig wieder schließen.
  10. Normalisieren Sie die Sauerstoffflussdaten auf die Masse des für das Experiment verwendeten Gewebes. Um die Diagramme anzupassen, ändern Sie das Layout so, dass es O2 Flux (pmol O2 / (s x mg)) widerspiegelt. Wählen Sie im Layout-Menü das Layout 06 - Spezifischer Flussmittel pro Probeneinheit aus. Die Daten werden nun normalisiert auf die Gewebemenge in jeder Kammer dargestellt.

4. Hochauflösende Respirometrie

  1. Wenn sich die Sauerstoffkonzentration (blaue Linie) und derO2-Fluss (rote Linie) nach der Sauerstoffzugabe stabilisiert haben, beginnen Sie mit dem Atmungsprotokoll. Sauerstoff kann als stabil angesehen werden, wenn die blaue Linie flach ist oder langsam abnimmt. O2 -Flussmittel sollte ebenfalls flach sein und innerhalb von 5 pmol O2 / s x mg liegen.
  2. Alle Reagenzien mit Glasspritzen hinzufügen. Es ist wichtig, nicht dieselbe Spritze für Substrate, Inhibitoren und Entkoppler zu verwenden. Halten Sie für jeden eine separate Spritze bereit. Nach der Zugabe jeder Verbindung den Sauerstofffluss 1-2 Minuten lang aufzeichnen, nachdem sich die Atmungsfrequenz stabilisiert hat, bevor Sie das nächste Reagenz hinzufügen.
  3. Messung der Atmung
    1. Geben Sie mit einer 10-μl-Glasspritze 2,5 μl 0,8 M Malat in jede Kammer. Drücken Sie F4 , um die Zeitleiste zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit M. Nehmen Sie einen stabilen O2 -Fluss für 1-2 Minuten auf.
    2. Fügen Sie nährstoffspezifische Reagenzien hinzu, wie unten beschrieben.
      1. Aerobe Glykolytikum: Geben Sie mit einer 10-μl-Glasspritze 10 μl 2 M Glutamat und 5 μl 2 M Pyruvat in jede Kammer. Drücken Sie F4 , um die Zeitleiste zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit G P. Nehmen Sie einen stabilen O2 -Fluss für 1-2 Minuten auf.
      2. Fettsäure: Geben Sie mit einer 10-μl-Glasspritze 10 μl 2 M Glutamat und 10 μl 10 mM Palmitoyl-Carnitin in jede Kammer. Drücken Sie F4 , um die Zeitachse zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit G PC. Stabiles Ø2 -Flussmittel für 1-2 min.
    3. Geben Sie mit einer 25-μl-Glasspritze 20 μl 0,5 M (mit MgCl2) ADP in jede Kammer. Drücken Sie F4 , um die Zeitachse zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit ADP. Stabiles Ø2 -Flussmittel für 1-2 min.
    4. Geben Sie mit einer 25-μl-Glasspritze 20 μl 1 M Succinat in jede Kammer. Drücken Sie F4 , um die Zeitleiste zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit S. Nehmen Sie einen stabilen O2 -Fluss für 1-2 Minuten auf.
    5. Geben Sie mit einer 10-μl-Glasspritze 5 μl 4 mM Cytochrom C in jede Kammer. Drücken Sie F4 , um die Zeitleiste zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit Cyt C. Nehmen Sie einen stabilen O2 -Fluss für 1-2 Minuten auf.
    6. Titrieren Sie in drei 1-μl-Boli mit 1 mM FCCP unter Verwendung einer 10-μl-Glasspritze. Bei der Zugabe von FCCP kommt es in der Regel zu einem Mischungseffekt, der zu einer kurzzeitigen Abnahme desO2-Flussmittelgehalts führt. Warten Sie, bis dasO2-Flussmittel ansteigt und sich stabilisiert, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Drücken Sie nach jeder Hinzufügung F4 , um die Zeitachse zu markieren und mit FCCP zu markieren. Stabiles O2 -Flussmittel für 1 min nach jeder Zugabe aufzeichnen.
  4. Wenn der Atmungstest abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Stopper, indem Sie sie drehen und nach oben ziehen. Spülen Sie die Kammern 3x mit ultrareinem H2O aus einer Spritzflasche, gefolgt von 3x mit 70% Ethanol aus einer Spritzflasche. Füllen Sie die Kammern nach der abschließenden Ethanolspülung mit 70 % Ethanol zur Lagerung.
  5. Setzen Sie die Stopper in die Kammern, bis Sie einen Widerstand spüren. Schließen Sie die Stopfen nicht ganz. Setzen Sie Kappen über die Stopper, speichern Sie die Assay-Datei und trennen Sie das Instrument von der Respirometry-Software. Schalten Sie das Instrument aus.

5. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Analysedatei in der Respirometrie-Software. Extrahieren Sie Daten aus stabilen Sauerstoffflussregionen, die nach der Injektion von Atmungsverbindungen erhalten wurden.
  2. Um interessante Bereiche zu markieren, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, klicken Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie das Feld über den Bereich der stabilen O2 -Flussrate für die unten aufgeführten Assay-Phasen.
  3. Untersuchungsstufen 14,15,16,17,18,19,20
    1. Markieren Sie die Zeitleiste nach der Zugabe von Malat/Glutamat/Pyruvat (aerobes glykolytisches Protokoll) oder Malat/Glutamat/Palmitoyl-Carnitin (Fettsäureprotokoll). Diese Rate entspricht der Sensitivitätsrate des Komplex-I-Zustands 2 (LEAK(n)).
    2. Markieren Sie die Zeitachse nach dem Hinzufügen von ADP. Diese Rate entspricht der Respirationsrate des Komplex-I-Zustands 3 (CI OXPHOS).
    3. Markieren Sie die Zeitleiste nach der Zugabe von Succinat. Diese Rate entspricht der Respirationsrate des Komplexes I+II Zustand 3 (CI+II OXPHOS).
    4. Markieren Sie die Zeitleiste nach der Zugabe von Cytochrom C. Diese Rate entspricht der Respirationsrate des Komplexes I+II+Cytochrom Zustand 3 (CI+II+Cyt C OXPHOS).
    5. Markieren Sie den Zeitplan für die FCCP-Titration mit der höchstenO2-Flussrate . Diese Rate steht für die maximale Atemfrequenz (MAX ETS).
  4. Rufen Sie die Datenwerte für die markierten Bereiche auf der Zeitachse ab, indem Sie > Statistiken markieren auswählen. Kopieren Sie die O2 -Flussrate (pmol O2/(s x mg)) für die markierte Kammer in eine Tabelle.
  5. Wiederholen Sie die Markierung und Datenextraktion für die zusätzlichen Kammern.
  6. Berechnen Sie das respiratorische Kontrollverhältnis (RCR), indem Sie Komplex I+II Zustand 3 (nach Succinatzugabe) durch Komplex I Zustand 2 (vor ADP-Zugabe) dividieren.

Ergebnisse

Abbildung 3 und Abbildung 4 zeigen Sauerstoffdiagramme von aeroben Glykolytik- bzw. Fettsäure-Respirometrieprotokollen für ordnungsgemäß präparierte murine rote und weiße Gastrocnemius-Muskelfasern. Ebenfalls gezeigt werden repräsentative quantifizierte Ergebnisse als Referenz. Abbildung 5 zeigt ein Sauerstoffdiagramm der aeroben glykolytischen Respirometrie in menschlichen Muskelbiopsieproben, die ordnungsgemäß vorbereitet wurden. Repräsentative quantifizierte Ergebnisse werden ebenfalls gezeigt. Es ist zu beachten, dass in Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 die Zugabe von Cytochrom C nach ADP-Zugabe keinen Einfluss auf den Sauerstofffluss hat, was darauf hindeutet, dass die äußere mitochondriale Membran der Probe intakt ist. Abbildung 6 zeigt ein Sauerstoffdiagramm der aeroben glykolytischen Respirometrie, bei dem die Zugabe von Cytochrom C nach ADP zu einem Anstieg (40% Anstieg) des Sauerstoffflusses führt, was darauf hindeutet, dass die äußere Mitochondrienmembran beschädigt wurde und die Probe daher nicht für die Respirometrie verwendet werden sollte - mögliche Gründe für dieses Ergebnis können unsachgemäße Handhabung oder Einfrieren/Auftauen des Gewebes sein. Verlängern Sie die Permeabilisierung des Gewebes und verwenden Sie kein frisch isoliertes Gewebe.

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Abbildung 3: Sauerstoffverbrauch in der Maus. Die Ergebnisse zeigen den Sauerstoffverbrauch in (A) rotem und (B) weißem Gastrocnemius unter Verwendung des Pyruvatprotokolls. Zustand 2 des Flussmittels nach Zugabe von Malat, Glutamat und Pyruvat (blauer Farbton, CI LEAK). Eine signifikante Stimulation desO2 - Verbrauchs wird nach ADP-Verabreichung beobachtet (grüner Farbton, CI OXPHOS), wobei die Atmung nach der Zugabe von Succinat (violetter Farbton, CI+II OXPHOS) weiter angetrieben wird. Cytochrom C induzierte keinen signifikanten Anstieg (<15%), was darauf hindeutet, dass die äußere Mitochondrienmembran intakt ist (orangefarbener Farbton, CI+II+Cyt C OXPHOS). Die Mitochondrien werden nach Zugabe von FCCP (gelber Farbton, MAX ETS) entkoppelt. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration in einer geschlossenen Kammer dar. Die rote Linie stellt die Rate des Sauerstoffverbrauchs (O2 -Fluss) dar. Zugesetzte Verbindungen: Malat (m), Glutamat (g), Pyruvat (p), Adenosindiphosphat (ADP), Cytochrom C (cyt c), Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP). (C) Das Balkendiagramm zeigt repräsentative Ergebnisse (n=8). Die Daten werden als ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Sauerstoffverbrauch in der Maus. Die Ergebnisse zeigen den Sauerstoffverbrauch in (A) rotem und (B) weißem Gastrocnemius unter Verwendung des Palmitoyl-Carnitin-Protokolls. Zustand 2 des Flussmittels nach Zugabe von Malat, Glutamat und Palmitoylcarnitin (blauer Farbton, CI LEAK). Eine signifikante Stimulation desO2 - Verbrauchs wird nach ADP-Verabreichung beobachtet (grüner Farbton, CI OXPHOS), wobei die Atmung nach der Zugabe von Succinat (violetter Farbton, CI+II OXPHOS) weiter angetrieben wird. Cytochrom C induzierte keinen signifikanten Anstieg (<15%), was darauf hindeutet, dass die äußere Mitochondrienmembran intakt ist (orangefarbener Farbton, CI+II+Cyt C OXPHOS). Die Mitochondrien werden nach Zugabe von FCCP (gelber Farbton, MAX ETS) entkoppelt. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration in einer geschlossenen Kammer dar. Die rote Linie stellt die Rate des Sauerstoffverbrauchs (O2 -Fluss) dar. Zugesetzte Verbindungen: Malat (m), Glutamat (g), Palmitoylcarnitin (pc), Adenosindiphosphat (ADP), Cytochrom C (cyt c), Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP). (C) Das Balkendiagramm zeigt repräsentative Ergebnisse (n=7). Die Daten werden als ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse für den Sauerstoffverbrauch im menschlichen Vastus lateralis unter Verwendung des Pyruvatprotokolls. (A) Flussfluss des Zustands 2 nach Zugabe von Malat, Glutamat und Pyruvat (blauer Farbton, CI LEAK). Eine signifikante Stimulation desO2 - Verbrauchs wird nach ADP-Verabreichung beobachtet (grüner Farbton, CI OXPHOS), wobei die Atmung nach der Zugabe von Succinat (violetter Farbton, CI+II OXPHOS) weiter angetrieben wird. Cytochrom C induzierte keinen signifikanten Anstieg (<15%), was darauf hindeutet, dass die äußere Mitochondrienmembran intakt ist (orangefarbener Farbton, CI+II+Cyt C OXPHOS). Die Mitochondrien werden nach Zugabe von FCCP (gelber Farbton, MAX ETS) entkoppelt. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration in einer geschlossenen Kammer dar. Die rote Linie stellt die Rate des Sauerstoffverbrauchs (O2 -Fluss) dar. Zugesetzte Verbindungen: Malat (m), Glutamat (g), Pyruvat (p), Adenosindiphosphat (ADP), Cytochrom C (cyt c), Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP). (B) Das Balkendiagramm zeigt repräsentative Ergebnisse von Vastus lateralis-Biopsien (n = 24). Die Daten sind als ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Repräsentatives Ergebnis, das eine beeinträchtigte Integrität der äußeren mitochondrialen Membran bei rotem Gastrocnemius der Maus zeigt. Zustand 2 des Flussmittels nach Zugabe von Malat, Glutamat und Pyruvat (blauer Farbton, CI LEAK). Eine signifikante Stimulation desO2 - Verbrauchs wird nach ADP-Verabreichung beobachtet (grüner Farbton, CI OXPHOS), wobei die Atmung nach der Zugabe von Succinat (violetter Farbton, CI+II OXPHOS) weiter angetrieben wird. Cytochrom C induzierte einen signifikanten Anstieg desO2-Verbrauchs (>15%), was auf eine Schädigung der äußeren Mitochondrienmembran hinweist. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration in einer geschlossenen Kammer dar. Die rote Linie stellt die Rate des Sauerstoffverbrauchs (O2 -Fluss) dar. Zugesetzte Verbindungen: Malat (m), Glutamat (g), Pyruvat (p), Adenosindiphosphat (ADP), Cytochrom C (cyt c), Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Reagenzienaufbereitung von Atmungsmitteln und Atmungslösungen. Es werden Einzelheiten zur Vorbereitung der für den Assay erforderlichen Reagenzien vorgestellt, einschließlich der endgültigen Stammkonzentrationen und deren Zubereitung und Lagerung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet ein umfassendes und unkompliziertes Template-Protokoll zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion in permeabilisierten Skelettmuskelfasern sowohl für Human- als auch für Mausproben. Die Verwendung von permeabilisierten Fasern anstelle von isolierten Mitochondrien hat mehrere Vorteile. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, dass für die Verwendung von permeabilisierten Fasern kleine Mengen an Gewebe (2-5 mg) erforderlich sind, wodurch diese Methode sowohl für menschliche Muskelbiopsieproben als auch für Mausmuskeln geeignet ist. Ein weiterer Vorteil gegenüber isolierten Mitochondrien besteht darin, dass die zelluläre Architektur intakt bleibt, wodurch die Erhaltung der strukturellen und funktionellen Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und zellulären Komponenten gewährleistetwird 12,21,22,23.

Die Verwendung von Pyruvat, Malat und Glutamat in unserem aeroben glykolytischen Protokoll bietet eine umfassende, breit angelegte Bewertung der NADH-Versorgung von Komplex I 24,25,26,27,28. Während dieser umfassende Ansatz eine Bewertung der Komplex-I-Aktivität unter ganzheitlichen und physiologisch relevanten Stoffwechselbedingungen ermöglicht, kann die Verwendung von Pyruvat-Malat oder Glutamat-Malat ein geeigneterer experimenteller Ansatz sein. Zum Beispiel kann die Verwendung von Glutamat-Malat Unterschiede in der mitochondrialen Funktion im Zusammenhang mit dem Aminosäurekatabolismus herauskitzeln29. Wir ermutigen die Forscher, sorgfältig zu überlegen, welchen Ansatz sie für ihr spezifisches Forschungsmodell verwenden sollten.

Während sich dieses Protokoll auf die Verwendung von Substraten zur Beurteilung der mitochondrialen Aktivität konzentriert, kann die Verwendung spezifischer Inhibitoren erforderlich sein, um experimentelle Ziele zu erreichen. Zum Beispiel kann Rotenon verwendet werden, um Komplex I 12,21,30 zu hemmen, Oligomycin zur Hemmung von Komplex V (ATP-Synthase)12,21 und Antimycin A zur Blockierung von Komplex III12,21 zur Beurteilung der nicht-mitochondrialen Atmung. Das oben bereitgestellte Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Verwendung spezifischer Inhibitoren einzubeziehen. Bemerkenswert ist, dass ein Vorbehalt in Bezug auf die Verwendung von Inhibitoren darin besteht, dass diese Verbindungen klebrig sind und eine umfangreiche Reinigung erfordern, um sie aus der Instrumentenkammer zu entfernen. Wir stellen fest, dass die Verwendung einer Lösung von 10% BSA für 60 min für die Entfernung von Restinhibitoren ausreichend ist.

Die LEAK-Atmung bezieht sich auf die Sauerstoffverbrauchsrate, die unabhängig von der ATP-Synthese ist. Diese Rate stellt den Rückfluss von Protonen in die mitochondriale Matrix dar, der über die innere Mitochondrienmembran hinweg erfolgt. Es gibt drei anerkannte Methoden, um den Sauerstoffverbrauch unabhängig von der ATP-Synthese (LEAK) zu bewerten. Die erste, LEAK(n), misst den Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Substraten, jedoch ohne Zusatz von Adenylaten (ADP oder ATP)31,32,33. Dieser LEAK-Zustand stellt die intrinsische Undichtigkeit der Mitochondrienmembran dar. Die zweite Methode, LEAK(t), wird in Gegenwart von ATP34 gemessen, und die dritte, LEAK(o), wird in Gegenwart des ATP-Synthase-Inhibitors Oligomycin 35,36,37 gemessen. Dieses Protokoll verwendet LEAK(n) für diese Bewertung, aber je nach experimentellen Zielen und Modellen können andere Methoden zur Messung des LEAK-Sauerstoffflusses geeignet sein.

Für diesen Assay wird MiR05 sowohl mit Kreatin (3 mg/ml) als auch mit Blebbistatin (10 μM) ergänzt. Der mitochondriale ADP-Transport wird durch die Kreatinkinase (CK) erleichtert, und Kreatin wird der Atmungslösung zugesetzt, um die CK-Aktivität zu sättigen38,39. Muskelfasern können sich spontan zusammenziehen und sind auch empfindlich gegenüber ADP-induzierter Kontraktion. Um die mitochondriale Atmungsaktivität ohne den Einfluss der Kontraktion zu beurteilen, wurde Blebbistatin zugesetzt, um die kontraktile Aktivität der Fasernzu hemmen 38. Darüber hinaus deuten Studien an der menschlichen Muskulatur darauf hin, dass die Atmungskapazität durch die Biopsiemethode (Mikrobiopsie versus Bergstrom-Nadel) beeinflusst werden kann und dass dieser Unterschied auf Unterschiede in der erhaltenen Faserlänge zurückzuführen sein kann40,41. Kürzere Fasern können während der Zubereitung anfälliger für Beschädigungen sein, und die Verwendung von Blebbistatin hilft, die Funktion zu erhalten. Es kann bestimmte Bedingungen geben, unter denen die Faserentspannung nicht mit den Forschungszielen vereinbar ist, und in diesem Fall kann Blebbistatin aus der MiR05-Lösung ausgeschlossen werden.

Die Permeabilisierung der Skelettmuskelfasern mit Saponin erzeugt Poren in der Plasmamembran und ermöglicht es Substraten und Inhibitoren, ungehindert in die Zelle einzudringen. Saponin hat eine hohe Affinität zu Cholesterin, das reich und reichlich in zellulären Plasmamembranen vorhanden ist, während die Mitochondrienmembranen cholesterinarm sind42,43. Es wird erwartet, dass die Saponinbehandlung, die in diesem Protokoll zur Faservorbereitung verwendet wird, die Integrität der mitochondrialen Membran bewahrt. Eine Schädigung der Mitochondrien kann auch durch Scherkräfte entstehen, die sich aus der mechanischen Trennung des Gewebes in Fasern ergeben. Wir schlagen vor, dass die Trennung des Gewebes in Faserbündel schnell und mit minimalem Aufwand durchgeführt wird. Um mögliche mitochondriale Schäden zu beurteilen, haben wir die Titration von Cytochrom C in das Atmungsprotokoll aufgenommen. Cytochrom C kann keine intakte äußere Mitochondrienmembran12 passieren, daher deutet jede Erhöhung desO2-Flusses nach Zugabe von Cytochrom C darauf hin, dass während des Probenvorbereitungsprozesses eine Schädigung der äußeren Mitochondrienmembran aufgetreten ist. In einer unserer jüngsten Studien fanden wir heraus, dass derO2-Fluss nach Zugabe von Cytochrom C um 8%15 anstieg, was bestätigt, dass die in diesem Protokoll vorgeschlagene Saponinkonsum keine mitochondrialen Schäden hervorruft. Wir schlagen vor, dass jede Probe, die nach Zugabe von Cytochrom C einen Anstieg desO2-Flusses um mehr als 15 % zeigt, von der Analyse ausgeschlossen werdensollte 44. Dieser Schritt dient ausschließlich der Qualitätskontrolle und nicht der Bewertung der Aktivität des Komplexes IV.

Während sich die hochauflösende Respirometrie durch hochempfindliche und zuverlässige Messungen des Sauerstoffverbrauchs auszeichnet, besteht eine bemerkenswerte Einschränkung der Instrumente darin, dass nur zwei Proben gleichzeitig pro Instrument gemessen werden können. Dies erfordert eine sorgfältige Abwägung bei der Konzeption von Studien mit Kohorten mit mehreren Stichproben. Auch wenn die Versuchung groß sein mag, im Laufe des Tages Messungen an verschiedenen Probensätzen durchzuführen, raten wir den Forschern dringend, den Einfluss des zirkadianen Rhythmus auf den Stoffwechsel zu berücksichtigen. Untersuchungen an menschlichen und Nagetier-Skelettmuskeln haben einen Einfluss der biologischen Uhr auf die Mitochondrienfunktion gezeigt 45,46. Daher empfehlen wir, Messungen über mehrere Tage zur gleichen Tageszeit durchzuführen, um diese zirkadianen Schwankungen zu berücksichtigen.

Um reproduzierbare und robuste Respirometrie-Messungen zu gewährleisten, muss das Respirometer regelmäßig gereinigt, gewartet und kalibriert werden. Die Luftkalibrierung, wie im Protokoll beschrieben, sollte täglich durchgeführt werden. Wir empfehlen den Benutzern, auch eine vollständige monatliche Kalibrierung (sowohl Luft als auch Null) der polarographischen Sauerstoffsensoren durchzuführen. Weitere Informationen zu dieser Kalibriermethode und Anweisungen zur routinemäßigen Gerätewartung finden Sie in der Dokumentation und auf der Website des Herstellers.

Die hochauflösende Respirometrie ist nach wie vor der Goldstandard für die Messung der mitochondrialen Atmung. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode ermöglicht eine robuste Beurteilung der mitochondrialen Kapazität sowohl in der Skelettmuskulatur von Nagetieren als auch beim Menschen. Dieses Protokoll wurde auf Studien angewendet, in denen die mitochondriale Funktion im Zusammenhang mit genetischen Mausmodellen15,16 im Zusammenhang mit chronischen Nierenerkrankungen19 nach Verabreichung von Nahrungsergänzungsmitteln14,20 und Bewegung17,18 untersucht wurde.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom Nutrition Obesity Research Center, dem NIH-Stipendium P30 DK056341 und dem NIH-Stipendium K01 HL145326 unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 & Mikro; L Hamilton Spritze (Glasspritze)ThermoFisher14-813-125Für die Titration von Atmungsassays
25 & Mikro; L Hamilton Spritze (Glasspritze)ThermoFisher14-813-133Für die Titration von Atmungsassays
ADPMerck117105Respirometrie Assay
Dissektionsschale aus schwarzem GlasScinticaDD-90-S-BLKFür die Probenvorbereitung
BlebbistatinSigmaB0560Arbeitslösung MiR05 Lösung
BSA, fettsäurefreiSigmaA6003MiR05 Lösung
CalciumcarbonatSigmaC4830BIOPS Lösung
KreatinSigma27900Arbeiten MiR05 Lösung
Cytochrom CSigmaC7752Respirometrie
Assay DatLabOroboros InstrumentsN/ARespirometrie Software
Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632BIOPS Lösung
D-SaccharoseSigma84097MiR05 Lösung
EGTASigmaE4378BIOPS & MiR05 Lösung
FCCPSigmaC2920Respirometrie
Assay GlutamatSigmaG1626Respirometrie Assay
HEPESSigmaH7523MiR05 Lösung
Imidazol Sigma56750BIOPS Lösung
KH2PO4 SigmaP5379MiR05 Lösung
LactobionsäureSigma153516MiR05 Lösung
MalatSigmaM1000Respirometrie Assay
MES Hydrat SigmaM8250BIOPS Lösung
MgCl2 - 6 H2O SigmaM2670BIOPS & MiR05 Lösung
Oroboros Oxygraph-2K (O2K) SystemOroboros Instruments10203-03Hochauflösendes Respirometer
Palmitoyl-CarnitinSigmaP4509Respirometrie
Assay KaliumhydroxidSigmaP1767BIOPS Lösung
PräzisionspinzetteFisher17-467-168Für die Probenvorbereitung
SaponinSigmaS2149für die Faserpermeabilisierung
Natrium ATPSigma A2383BIOPS Lösung
NatriumphosphokreatinSigmaP7936BIOPS Lösung
NatriumpyruvatSigmaP2256Respirometrie Assay
SuccinatSigmaS2378Respirometrie Assay
Taurin  SigmaT0625BIOPS & MiR05-Lösung

Referenzen

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