Hier wird ein minimal-invasives chirurgisches Verfahren gezeigt, bei dem die Laser-Doppler-Sonde über der distalen Region der mittleren Hirnarterie (MCA), einer für Ratten und Mäuse geeigneten periorbitalen Stelle, auf den Schädel aufgesetzt wird, um den Blutfluss während eines vorübergehenden MCA-Verschlusses zu beurteilen.
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Methodenartikel
Periorbitale Platzierung einer Laser-Doppler-Sonde zur Überwachung des zerebralen Blutflusses vor einem Verschluss der mittleren Hirnarterie in Nagetiermodellen
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) ist die Goldstandardmethode für die präklinische Modellierung des ischämischen Schlaganfalls bei Nagetieren. Eine erfolgreiche Okklusion ist jedoch selbst für die geschicktesten chirurgischen Hände nicht garantiert. Fehler treten vor allem dann auf, wenn das Filament nicht in der richtigen Tiefe platziert wird, und umfassen entweder keinen Infarkt oder eine Gefäßperforation, die zum Tod führen kann. Die Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) ist eine zuverlässige Technik, die während des MCAO-Verfahrens Echtzeit-Feedback über den regionalen zerebralen Blutfluss (CBF) liefert. Hier demonstrieren wir eine schnelle Technik zur periorbitalen Platzierung einer Laser-Doppler-Sonde zur Messung von CBF sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten. Unser Grundgedanke bestand darin, die LDF-Implementierung zu vereinfachen und eine breite Anwendung zu fördern, um die chirurgische Zuverlässigkeit zu verbessern. Die Technik macht eine Schädelausdünnung und spezielle Ausrüstung überflüssig, da die Platzierung im periorbitalen Bereich und nicht in der dorsalen Region erfolgt, was die Effizienz und einfache Einführung fördert. Das hier beschriebene Protokoll umfasst die präoperativen Vorbereitungen, die Platzierung der periorbitalen Dopplersonde und die postoperative Versorgung. Zu den repräsentativen Ergebnissen gehören visuelle Darstellungen von Verfahrenselementen sowie repräsentative LDF-Spuren, die erfolgreiche MCAO-Operationen veranschaulichen, wobei Fälle von erfolgloser Filamentplatzierung, die zu Komplikationen führten, veranschaulicht wurden. Das Protokoll veranschaulicht LDF bei der Bestätigung der korrekten Filamentplatzierung und bietet ein vereinfachtes Verfahren im Vergleich zu alternativen Methoden.
Einleitung
Die Methode des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO) ist bei Nagetieren weit verbreitet, seit sie 1986 in die wissenschaftliche Gemeinschaft eingeführt wurde, um sie bei Ratten anzuwenden1 , wobei die Longa-Adaption 1990beschrieben wurde 2 und Anpassungen für Mäuse bald darauffolgten 3. Obwohl in Longas Veröffentlichung nicht beschrieben, wurde die Verwendung des Laser-Doppler-Flowmetrie-Signals (LDF) zur Bestätigung der Filamentplatzierung bald in der Literatur beschrieben4. Die LDF-Beschäftigung während des MCAO-Verfahrens wird in der Literatur prominent dargestellt, wird aber in den aktuellen Standard Operational Procedures (SOPs) der Stroke Preclinical Assessment Networks (SPAN)5 als optionaler Schritt bezeichnet.
Die Verwendung von LDF bestätigt die korrekte Filamentplatzierung während des MCAO-Verfahrens und trägt daher zur Strenge des Studiendesigns und den nachfolgenden Ergebnissen bei, insbesondere in Experimenten zur Untersuchung der Wirksamkeit von Arzneimitteln. Die Verwendung von LDF reduziert chirurgische Fehler, die auf eine falsche Filamentplatzierung zurückzuführen sind, was zu der dichotomen Situation führt, dass entweder keine Verletzungen auftreten, wenn das Filament nicht weit genug platziert wird, oder dass Tiere aufgrund von Gefäßperforationen sterben, wenn das Filament zu weit eingeführt wird. Auf der anderen Seite ist die Verwendung von LDF nicht mit der Variabilität der Infarktgröße verbunden, die häufig nach dem MCAO-Verfahren beobachtet wird6. Die Verwendung von LDF im MCAO-Verfahren kann insbesondere bei Ratten als schwierig und belastend empfunden werden, da der Schädel dicker ist als bei Mäusen und vor der LDF-Platzierung eine Schädelausdünnung erforderlich sein kann 7,8. Auch die Platzierung der dorsalen Sonde wird häufig mit einigen Protokollen beschrieben, die eine spezielle Ausrüstung oder Vorbereitung erfordern 7,8,9. Bei einer dieser Barrieren kann es sein, dass die Implementierung des LDF zur Bestätigung der Filamentplatzierung nicht stattfindet.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde am Schädel und über dem distalen Bereich der mittleren Hirnarterie - eine periorbitale Platzierung - zur Beurteilung des Blutflusses während des MCAO-Verfahrens sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten. Unser Grundgedanke war es, ein Verfahren zu entwickeln, das mehrere Vorteile gegenüber einigen in der Literatur berichteten Methoden hat 7,8,9,10, da es minimalinvasiv und schnell ist und keine Schädelausdünnung oder spezielle Ausrüstung über die Laser-Doppler-Sonde hinaus erfordert.
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Protokoll
Zur Veranschaulichung dieses Protokolls wurden adulte Mäuse und Ratten herangezogen (25 g, C57BL/6J, Jackson Laboratories; 250 g, Sprague Dawley, Envigo). Der Umgang mit Tieren und die Versuchsverfahren wurden mit Genehmigung und in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Arizona, den nationalen Gesetzen und gemäß den Grundsätzen der Labortierpflege11 durchgeführt. Ratten und Mäuse wurden mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zeitplan (7-19 Uhr) untergebracht, wobei Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung standen.
1. Präoperative Vorbereitung
HINWEIS: In der Regel wird die MCAO-Operation bei einem Nagetier als Überlebensoperation durchgeführt, bei der entweder eine aseptische oder eine reine Spitzen-Operationstechnik angewendet werden muss, wie in einem einrichtungsspezifischen IACUC-Protokoll beschrieben. In diesem Fall verwendet der Chirurg eine reine Spitzentechnik mit sterilisierten Instrumenten und Verbrauchsmaterialien.
- Desinfizieren Sie die chirurgische Arbeitsfläche mit handelsüblichem Desinfektionsmittel und bereiten Sie sterile chirurgische Packungen mit Instrumenten, Abdeckungen, Gaze, Tupfern, Nähten und Skalpellklingen durch Autoklavieren vor. Halten Sie während der Überlebensoperation sterile Bedingungen gemäß den von der IACUC zugelassenen Techniken aufrecht, wie z. B. das Abdecken von Mikroskopknöpfen und das Drapieren mit lebensmittelechter Plastikfolie.
- Verwenden Sie einen Germinator Trockenperlensterilisator, um chirurgische Instrumente zwischen den Eingriffen erneut zu sterilisieren, wenn während einer Sitzung mehrere Nagetieroperationen durchgeführt werden.
- Legen Sie die Ratte oder Maus in eine Induktionskammer und leiten Sie eine Anästhesie mit 3%-5% Isofluran ein (1 l/min bei einem kombinierten Gemisch aus 80% Luft und 20% Sauerstoff).
- Bringen Sie das Tier zur Anästhesie aus der Kammer auf die Bank und den Nasenkonus (Maus: 0,5 l/min 80 %/20 % Sauerstoff/Luft-Gemisch; Ratte: 1,5 l/min 80 %/20 % Sauerstoff/Luft-Gemisch). Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf und rasieren Sie vorsichtig den Raum zwischen Ohr und Augenhöhle an der Seite der MCAO-Operation (normalerweise die rechte), um keine Haut mit einer Haarschneidemaschine zu schneiden. Bei der Ratte ist das Grübchen des Schnurrbartes nach der Rasur etwa auf halbem Weg zwischen der Augenhöhle und dem Ohr sichtbar. Rasieren Sie weiterhin die Regionen, wie sie für das MCAO-Verfahren9 erforderlich sind (nicht im Rahmen dieses Dokuments).
- Bringen Sie das Tier bei Bedarf wieder in die Kammer oder bringen Sie es zu einem Nasenkonus auf dem vorbereiteten Operationstisch, der auf 37 °C erwärmt ist. Setzen Sie ein Rektumthermometer ein. Das Tier sollte während des gesamten Verfahrens bei einer Temperatur von ca. 36 °C ± 1 °C und gemäß dem genehmigten IACUC-Protokoll gehalten werden.
- Tragen Sie Betadin auf ein Wattestäbchen auf und desinfizieren Sie die Haut, indem Sie sich von der Mitte des Operationsbereichs spiralförmig nach außen bewegen. Mit einem Alkohol-Vorbereitungspad abwischen. Wiederholen Sie beide Schritte für insgesamt drei Zyklen. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie und beurteilen Sie sie alle 15 Minuten während des Eingriffs mit dem Zehenquetsch-Reflux.
2. Platzierung der periorbitalen Dopplersonde
- Machen Sie mit einer kleinen Schere einen vertikalen Schnitt (Maus: ~0,5 cm; Ratte: ~0,7 cm) zwischen dem Augenwinkel und der Falte des Ohrs, wie in Abbildung 2A (Maus) und Abbildung 3A (Ratte) gezeigt, um die Superfacia und den darunter liegenden Muskel freizulegen.
HINWEIS: Behandeln Sie Schmerzen präoperativ gemäß der Genehmigung des IACUC-Protokolls. - Schneiden Sie mit einer scharfen Pinzette und einer gebogenen Schere vorsichtig durch die Muskelschicht, bis der Schädel erreicht ist. Der Schädel wird flach und mit der Spitze der Pinzette schwer zu berühren sein. Dies ist das Fenster, in dem sich die Laser-Doppler-Sonde befinden wird, wie in Abbildung 2B dargestellt.
- Verwenden Sie eine Zange, um austretendes Blut zu gerinnen, das Fenster zu verbreitern und den Weg zum Schädel zu gewährleisten.
- Sobald das Fenster geöffnet ist, tupfen Sie es mit Wattestäbchen ab, um bei Bedarf überschüssiges Blut zu entfernen.
Platzieren Sie die Maus oder Ratte in Rückenlage. - Verwenden Sie eine Pinzette, um Haut oder Gewebe zurückzuziehen, und platzieren Sie die Dopplersonde so in das periorbitale Fenster, dass sie senkrecht am Schädel anliegt, ohne dass Haut oder Muskeln vorhanden sind, die das Lasersignal behindern. Dieser Bereich befindet sich über dem distalen MCA, wie in Abbildung 1A,B dargestellt. Sichern Sie die Sondenplatzierung mit Laborband. In diesem Protokoll wird die Verwendung einer geraden Sonde beschrieben.
HINWEIS: Wir erkennen an, dass die Operationsprotokolle von Labor zu Labor unterschiedlich sind. In der Literatur (wenn darüber berichtet wird) schleifen einige den Schädel dünn, andere nicht9. Es könnte daran liegen, dass der Schädel in der periorbitalen Region dünner ist, aber das ist nur Spekulation. Nach unserer Erfahrung kann eine direkte Platzierung ohne Schleifen bei Mäusen und Ratten erreicht werden und wird in diesem Protokoll demonstriert. - Überwachen Sie die relativen Blutflusswerte auf dem Monitor mit geeigneter Software (Abbildung 2D, Abbildung 3C,D). Die LDF-Messwerte variieren. Der optimale Bereich für den Nachweis von Blutflusstropfen liegt jedoch bei >200 Perfusionseinheiten (PU).
- Fahren Sie mit der MCAO-Operation9 fort (nicht im Rahmen dieses Artikels). Während der MCAO-Operation wird die Sonde durch kurzes Abbinden der Halsschlagader getestet, was zu einem plötzlichen Abfall des Blutflusses (~50%) führen sollte.
3. Entfernung der Dopplersonde und postoperative Pflege
- Entfernen Sie nach Abschluss der MCAO oder immer dann, wenn die Blutflussmessungen abgeschlossen sind, die Laser-Doppler-Sonde aus dem Operationsfenster. Die Dopplersonde bleibt in der Regel für die Dauer der Maus-MCAO-Operation an Ort und Stelle, da die Ischämiezeiten oft weniger als 90 Minuten betragen. Andererseits kann bei der MCAO-Behandlung der Ratte die Dopplersonde nach dem Platzieren des Filaments und während der Ischämie (typischerweise > 90 min) entfernt und dann erneut in das periorbitale Fenster eingesetzt werden, um die Reperfusion durch Wiederholung der Schritte 2.6 und 2.7 zu bestätigen.
HINWEIS: In Abbildung 4A ist eine typische kontinuierliche LDF-Abtastung von der Maus-MCAO zu sehen. Typische LDF-Spuren aus einem MCAO-Verfahren an der Ratte sind in Abbildung 4B dargestellt. - Injizieren Sie das von der IACUC zugelassene Lokalanästhetikum subkutan entlang der prospektiven Inzisionsstelle.
- Verschließen Sie die Haut mit 1-2 Nähten unter Verwendung eines chirurgischen Standardknotens mit resorbierbarem Nahtfaden oder chirurgischem Kleber gemäß dem zugelassenen IACUC-Protokoll. Behandlung von postoperativen Schmerzen gemäß IACUC-Protokollzulassung (z. B. Bupivacain HCL 0,5 % und Lidocain 2 %, einmal intrainzision bei Mäusen und Ratten). Die Tiere sollten nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie in der Lage sind, das Brustbein aufrechtzuerhalten, und es werden keine Tiere in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, bis sie sich vollständig erholt haben.
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Ergebnisse
Die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde in der MCA-Region ist in Abbildung 1 visuell dargestellt und bietet ein Piktogramm des Gefäßsystems, das als visuelle Orientierung aus sagittaler und dorsaler Perspektive dient. Abbildung 2 fasst die kritischen Schritte für die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde und die Ergebnisse in der Maus zusammen. Abbildung 2A zeigt ein Bild einer anästhesierten und präparierten Maus mit einer gestrichel...
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Diskussion
Das MCAO ist das Goldstandardverfahren für die Modellierung von Hirnarterienverschluss und Reperfusion bei Nagetieren und war der Eckpfeiler der präklinischen Schlaganfallforschung, der die Induktion von fokaler Ischämie bei Nagetieren ermöglichte, um die Pathophysiologie des menschlichen Schlaganfalls nachzuahmen. Es handelt sich um ein anspruchsvolles chirurgisches Verfahren mit erheblicher inter- und sogar intrachirurgischer Variabilität. Es gibt zwar keine Hinweise darauf, dass die A...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch NINDS 1R41NS124450 finanziert. Biorender: KT26JWLYF6
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| gebogene Federschere | Castroviejo | 1501710 | |
| Pinzette #5 | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 11250-20 | |
| Pinzette #5/45 | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 1151-35 | |
| Forcepts Kauterwerkzeug | Conmed | M18019-01 | |
| Laborband | Fisherbrand Beschriftungsband | 15-950 | |
| Laser-Doppler-Monitor | Moore Instrumente | MOORVMS-LDF | |
| LDF Software | Perisoft für Windows oder moorSOFT | NA | |
| Mausschneider | Philips Norelco | MG7910 | |
| Periflux System 4000, Sonde 407 | Perimed Ausrüstung nicht mehr verfügbar | ||
| Plastikfolie | Glad | Press n Seal | |
| Rattenschneider | Oster | A5 oder ähnlich | |
| Anästhesie für kleine Nagetiere | JD Medical | kundenspezifische | |
| Schere | Excelta | 362 Schere oder ähnliches | |
| Temperaturüberwachungssystem mit Sonde | Physitemp | TCAT-2AC Controller |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66839
