Methodenartikel

Periorbitale Platzierung einer Laser-Doppler-Sonde zur Überwachung des zerebralen Blutflusses vor einem Verschluss der mittleren Hirnarterie in Nagetiermodellen

1.7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/66839

⸱

22. November 2024

 ,  ,  , 
1College of Nursing, University of Arizona, 2Department of Surgery, College of Medicine, University of Arizona

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Zusammenfassung

Hier wird ein minimal-invasives chirurgisches Verfahren gezeigt, bei dem die Laser-Doppler-Sonde über der distalen Region der mittleren Hirnarterie (MCA), einer für Ratten und Mäuse geeigneten periorbitalen Stelle, auf den Schädel aufgesetzt wird, um den Blutfluss während eines vorübergehenden MCA-Verschlusses zu beurteilen.

Zusammenfassung

Der Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) ist die Goldstandardmethode für die präklinische Modellierung des ischämischen Schlaganfalls bei Nagetieren. Eine erfolgreiche Okklusion ist jedoch selbst für die geschicktesten chirurgischen Hände nicht garantiert. Fehler treten vor allem dann auf, wenn das Filament nicht in der richtigen Tiefe platziert wird, und umfassen entweder keinen Infarkt oder eine Gefäßperforation, die zum Tod führen kann. Die Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) ist eine zuverlässige Technik, die während des MCAO-Verfahrens Echtzeit-Feedback über den regionalen zerebralen Blutfluss (CBF) liefert. Hier demonstrieren wir eine schnelle Technik zur periorbitalen Platzierung einer Laser-Doppler-Sonde zur Messung von CBF sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten. Unser Grundgedanke bestand darin, die LDF-Implementierung zu vereinfachen und eine breite Anwendung zu fördern, um die chirurgische Zuverlässigkeit zu verbessern. Die Technik macht eine Schädelausdünnung und spezielle Ausrüstung überflüssig, da die Platzierung im periorbitalen Bereich und nicht in der dorsalen Region erfolgt, was die Effizienz und einfache Einführung fördert. Das hier beschriebene Protokoll umfasst die präoperativen Vorbereitungen, die Platzierung der periorbitalen Dopplersonde und die postoperative Versorgung. Zu den repräsentativen Ergebnissen gehören visuelle Darstellungen von Verfahrenselementen sowie repräsentative LDF-Spuren, die erfolgreiche MCAO-Operationen veranschaulichen, wobei Fälle von erfolgloser Filamentplatzierung, die zu Komplikationen führten, veranschaulicht wurden. Das Protokoll veranschaulicht LDF bei der Bestätigung der korrekten Filamentplatzierung und bietet ein vereinfachtes Verfahren im Vergleich zu alternativen Methoden.

Einleitung

Die Methode des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO) ist bei Nagetieren weit verbreitet, seit sie 1986 in die wissenschaftliche Gemeinschaft eingeführt wurde, um sie bei Ratten anzuwenden1 , wobei die Longa-Adaption 1990beschrieben wurde 2 und Anpassungen für Mäuse bald darauffolgten 3. Obwohl in Longas Veröffentlichung nicht beschrieben, wurde die Verwendung des Laser-Doppler-Flowmetrie-Signals (LDF) zur Bestätigung der Filamentplatzierung bald in der Literatur beschrieben4. Die LDF-Beschäftigung während des MCAO-Verfahrens wird in der Literatur prominent dargestellt, wird aber in den aktuellen Standard Operational Procedures (SOPs) der Stroke Preclinical Assessment Networks (SPAN)5 als optionaler Schritt bezeichnet.

Die Verwendung von LDF bestätigt die korrekte Filamentplatzierung während des MCAO-Verfahrens und trägt daher zur Strenge des Studiendesigns und den nachfolgenden Ergebnissen bei, insbesondere in Experimenten zur Untersuchung der Wirksamkeit von Arzneimitteln. Die Verwendung von LDF reduziert chirurgische Fehler, die auf eine falsche Filamentplatzierung zurückzuführen sind, was zu der dichotomen Situation führt, dass entweder keine Verletzungen auftreten, wenn das Filament nicht weit genug platziert wird, oder dass Tiere aufgrund von Gefäßperforationen sterben, wenn das Filament zu weit eingeführt wird. Auf der anderen Seite ist die Verwendung von LDF nicht mit der Variabilität der Infarktgröße verbunden, die häufig nach dem MCAO-Verfahren beobachtet wird6. Die Verwendung von LDF im MCAO-Verfahren kann insbesondere bei Ratten als schwierig und belastend empfunden werden, da der Schädel dicker ist als bei Mäusen und vor der LDF-Platzierung eine Schädelausdünnung erforderlich sein kann 7,8. Auch die Platzierung der dorsalen Sonde wird häufig mit einigen Protokollen beschrieben, die eine spezielle Ausrüstung oder Vorbereitung erfordern 7,8,9. Bei einer dieser Barrieren kann es sein, dass die Implementierung des LDF zur Bestätigung der Filamentplatzierung nicht stattfindet.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde am Schädel und über dem distalen Bereich der mittleren Hirnarterie - eine periorbitale Platzierung - zur Beurteilung des Blutflusses während des MCAO-Verfahrens sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten. Unser Grundgedanke war es, ein Verfahren zu entwickeln, das mehrere Vorteile gegenüber einigen in der Literatur berichteten Methoden hat 7,8,9,10, da es minimalinvasiv und schnell ist und keine Schädelausdünnung oder spezielle Ausrüstung über die Laser-Doppler-Sonde hinaus erfordert.

Protokoll

Zur Veranschaulichung dieses Protokolls wurden adulte Mäuse und Ratten herangezogen (25 g, C57BL/6J, Jackson Laboratories; 250 g, Sprague Dawley, Envigo). Der Umgang mit Tieren und die Versuchsverfahren wurden mit Genehmigung und in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Arizona, den nationalen Gesetzen und gemäß den Grundsätzen der Labortierpflege11 durchgeführt. Ratten und Mäuse wurden mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zeitplan (7-19 Uhr) untergebracht, wobei Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung standen.

1. Präoperative Vorbereitung

HINWEIS: In der Regel wird die MCAO-Operation bei einem Nagetier als Überlebensoperation durchgeführt, bei der entweder eine aseptische oder eine reine Spitzen-Operationstechnik angewendet werden muss, wie in einem einrichtungsspezifischen IACUC-Protokoll beschrieben. In diesem Fall verwendet der Chirurg eine reine Spitzentechnik mit sterilisierten Instrumenten und Verbrauchsmaterialien.

  1. Desinfizieren Sie die chirurgische Arbeitsfläche mit handelsüblichem Desinfektionsmittel und bereiten Sie sterile chirurgische Packungen mit Instrumenten, Abdeckungen, Gaze, Tupfern, Nähten und Skalpellklingen durch Autoklavieren vor. Halten Sie während der Überlebensoperation sterile Bedingungen gemäß den von der IACUC zugelassenen Techniken aufrecht, wie z. B. das Abdecken von Mikroskopknöpfen und das Drapieren mit lebensmittelechter Plastikfolie.
  2. Verwenden Sie einen Germinator Trockenperlensterilisator, um chirurgische Instrumente zwischen den Eingriffen erneut zu sterilisieren, wenn während einer Sitzung mehrere Nagetieroperationen durchgeführt werden.
  3. Legen Sie die Ratte oder Maus in eine Induktionskammer und leiten Sie eine Anästhesie mit 3%-5% Isofluran ein (1 l/min bei einem kombinierten Gemisch aus 80% Luft und 20% Sauerstoff).
  4. Bringen Sie das Tier zur Anästhesie aus der Kammer auf die Bank und den Nasenkonus (Maus: 0,5 l/min 80 %/20 % Sauerstoff/Luft-Gemisch; Ratte: 1,5 l/min 80 %/20 % Sauerstoff/Luft-Gemisch). Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf und rasieren Sie vorsichtig den Raum zwischen Ohr und Augenhöhle an der Seite der MCAO-Operation (normalerweise die rechte), um keine Haut mit einer Haarschneidemaschine zu schneiden. Bei der Ratte ist das Grübchen des Schnurrbartes nach der Rasur etwa auf halbem Weg zwischen der Augenhöhle und dem Ohr sichtbar. Rasieren Sie weiterhin die Regionen, wie sie für das MCAO-Verfahren9 erforderlich sind (nicht im Rahmen dieses Dokuments).
  5. Bringen Sie das Tier bei Bedarf wieder in die Kammer oder bringen Sie es zu einem Nasenkonus auf dem vorbereiteten Operationstisch, der auf 37 °C erwärmt ist. Setzen Sie ein Rektumthermometer ein. Das Tier sollte während des gesamten Verfahrens bei einer Temperatur von ca. 36 °C ± 1 °C und gemäß dem genehmigten IACUC-Protokoll gehalten werden.
  6. Tragen Sie Betadin auf ein Wattestäbchen auf und desinfizieren Sie die Haut, indem Sie sich von der Mitte des Operationsbereichs spiralförmig nach außen bewegen. Mit einem Alkohol-Vorbereitungspad abwischen. Wiederholen Sie beide Schritte für insgesamt drei Zyklen. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie und beurteilen Sie sie alle 15 Minuten während des Eingriffs mit dem Zehenquetsch-Reflux.

2. Platzierung der periorbitalen Dopplersonde

  1. Machen Sie mit einer kleinen Schere einen vertikalen Schnitt (Maus: ~0,5 cm; Ratte: ~0,7 cm) zwischen dem Augenwinkel und der Falte des Ohrs, wie in Abbildung 2A (Maus) und Abbildung 3A (Ratte) gezeigt, um die Superfacia und den darunter liegenden Muskel freizulegen.
    HINWEIS: Behandeln Sie Schmerzen präoperativ gemäß der Genehmigung des IACUC-Protokolls.
  2. Schneiden Sie mit einer scharfen Pinzette und einer gebogenen Schere vorsichtig durch die Muskelschicht, bis der Schädel erreicht ist. Der Schädel wird flach und mit der Spitze der Pinzette schwer zu berühren sein. Dies ist das Fenster, in dem sich die Laser-Doppler-Sonde befinden wird, wie in Abbildung 2B dargestellt.
  3. Verwenden Sie eine Zange, um austretendes Blut zu gerinnen, das Fenster zu verbreitern und den Weg zum Schädel zu gewährleisten.
  4. Sobald das Fenster geöffnet ist, tupfen Sie es mit Wattestäbchen ab, um bei Bedarf überschüssiges Blut zu entfernen.
    Platzieren Sie die Maus oder Ratte in Rückenlage.
  5. Verwenden Sie eine Pinzette, um Haut oder Gewebe zurückzuziehen, und platzieren Sie die Dopplersonde so in das periorbitale Fenster, dass sie senkrecht am Schädel anliegt, ohne dass Haut oder Muskeln vorhanden sind, die das Lasersignal behindern. Dieser Bereich befindet sich über dem distalen MCA, wie in Abbildung 1A,B dargestellt. Sichern Sie die Sondenplatzierung mit Laborband. In diesem Protokoll wird die Verwendung einer geraden Sonde beschrieben.
    HINWEIS: Wir erkennen an, dass die Operationsprotokolle von Labor zu Labor unterschiedlich sind. In der Literatur (wenn darüber berichtet wird) schleifen einige den Schädel dünn, andere nicht9. Es könnte daran liegen, dass der Schädel in der periorbitalen Region dünner ist, aber das ist nur Spekulation. Nach unserer Erfahrung kann eine direkte Platzierung ohne Schleifen bei Mäusen und Ratten erreicht werden und wird in diesem Protokoll demonstriert.
  6. Überwachen Sie die relativen Blutflusswerte auf dem Monitor mit geeigneter Software (Abbildung 2D, Abbildung 3C,D). Die LDF-Messwerte variieren. Der optimale Bereich für den Nachweis von Blutflusstropfen liegt jedoch bei >200 Perfusionseinheiten (PU).
  7. Fahren Sie mit der MCAO-Operation9 fort (nicht im Rahmen dieses Artikels). Während der MCAO-Operation wird die Sonde durch kurzes Abbinden der Halsschlagader getestet, was zu einem plötzlichen Abfall des Blutflusses (~50%) führen sollte.

3. Entfernung der Dopplersonde und postoperative Pflege

  1. Entfernen Sie nach Abschluss der MCAO oder immer dann, wenn die Blutflussmessungen abgeschlossen sind, die Laser-Doppler-Sonde aus dem Operationsfenster. Die Dopplersonde bleibt in der Regel für die Dauer der Maus-MCAO-Operation an Ort und Stelle, da die Ischämiezeiten oft weniger als 90 Minuten betragen. Andererseits kann bei der MCAO-Behandlung der Ratte die Dopplersonde nach dem Platzieren des Filaments und während der Ischämie (typischerweise > 90 min) entfernt und dann erneut in das periorbitale Fenster eingesetzt werden, um die Reperfusion durch Wiederholung der Schritte 2.6 und 2.7 zu bestätigen.
    HINWEIS: In Abbildung 4A ist eine typische kontinuierliche LDF-Abtastung von der Maus-MCAO zu sehen. Typische LDF-Spuren aus einem MCAO-Verfahren an der Ratte sind in Abbildung 4B dargestellt.
  2. Injizieren Sie das von der IACUC zugelassene Lokalanästhetikum subkutan entlang der prospektiven Inzisionsstelle.
  3. Verschließen Sie die Haut mit 1-2 Nähten unter Verwendung eines chirurgischen Standardknotens mit resorbierbarem Nahtfaden oder chirurgischem Kleber gemäß dem zugelassenen IACUC-Protokoll. Behandlung von postoperativen Schmerzen gemäß IACUC-Protokollzulassung (z. B. Bupivacain HCL 0,5 % und Lidocain 2 %, einmal intrainzision bei Mäusen und Ratten). Die Tiere sollten nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie in der Lage sind, das Brustbein aufrechtzuerhalten, und es werden keine Tiere in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, bis sie sich vollständig erholt haben.

Ergebnisse

Die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde in der MCA-Region ist in Abbildung 1 visuell dargestellt und bietet ein Piktogramm des Gefäßsystems, das als visuelle Orientierung aus sagittaler und dorsaler Perspektive dient. Abbildung 2 fasst die kritischen Schritte für die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde und die Ergebnisse in der Maus zusammen. Abbildung 2A zeigt ein Bild einer anästhesierten und präparierten Maus mit einer gestrichelten Markierung an der Stelle des vertikalen Schnitts, der für die anschließende Platzierung der Laser-Doppler-Sonde erforderlich ist. Das periorbitale Fenster zum Schädel ist in Abbildung 2B dargestellt.

Abbildung 3 fasst die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde in der Ratte zusammen. Ein Bild einer anästhesierten und präparierten Ratte mit einer gestrichelten Markierung an der Stelle des vertikalen Schnitts, der für die anschließende Platzierung der Laser-Doppler-Sonde erforderlich ist, ist in Abbildung 3A dargestellt. Das periorbitale Fenster kann nicht angezeigt werden, da es tiefer als die Maus ist. In diesem Fall kann der Schädel ertastet werden, wie in Schritt 2.3 erwähnt. Die Laser-Doppler-Sonde, die in der periorbitalen Region der Ratte in Rückenlage platziert wurde, ist in Abbildung 3B dargestellt.

Ein typisches LDF-Tracing während des Maus-MCAO-Verfahrens ist in Abbildung 4A dargestellt. Sie veranschaulicht eine erfolgreiche Induktion einer Ischämie, die sich in einem deutlichen und unmittelbaren Abfall des relativen zerebralen Blutflusses (CBF) zeigt, wenn die Halsschlagader gebunden wird und erneut, wenn das Filament zum Ostium der MCA vorgeschoben wird. Der Beginn der Reperfusion zeigt sich am Ende der Abtastung, was sich in einem deutlichen und unmittelbaren Anstieg der relativen CBF zeigt, wenn die Halsschlagader gelöst wird und erneut, wenn das Filament aus der MCA herausgezogen wird. Ein typischer LDF-Wert der Ischämie während der MCAO-Operation bei Ratten ist in Abbildung 4B dargestellt, die eine erfolgreiche Induktion einer Ischämie zeigt, gefolgt von der Entfernung der Sonde und der erneuten Platzierung zur LDF-Messung während der Reperfusion. Bei der Rattenchirurgie können die Ischämiezeiten mehr als 60 Minuten betragen, und die Tiere können sich während der Ischämiephase erholen und sollten zur Reperfusion erneut anästhesiert werden. In diesem Fall wird die Sonde im periorbitalen Fenster neu positioniert und die LDF-Verfolgung wird fortgesetzt. Die Ischämie zeigt sich in der Verfolgung durch einen deutlichen und unmittelbaren Abfall der relativen CBF, wenn die Halsschlagader gebunden wird und das Filament zum MCA-Ostium vorgeschoben wird. Die Reperfusion zeigt sich in der zweiten LDF-Abtastung durch einen deutlichen und unmittelbaren Anstieg der relativen CBF, wonach die Halsschlagader gelöst wird und wiederum wenn das Filament aus dem Ostium der MCA zurückgezogen wird. Der periorbitale Doppler befindet sich über dem distalen Ast des MCA und damit im Bereich der Blutverteilung des MCA mit einer beobachteten Abnahme des CBF, wie die Verringerung des Blutflusses während des MCAO-Verfahrens zeigt, die in Abbildung 4 dargestellt ist.

In Abbildung 5 zeigen wir LDF-Traceings, die beispielhaft für fehlgeschlagene MCAO-Operationen stehen. Abbildung 5A fasst eine LDF-Abtastung aus einer Rattenoperation mit einem erfolgreichen Karotisverschluss zusammen, der sich später lockerte, und einer erfolglosen Filamentplatzierung, die durch einen langsamen Abfall des relativen CBF gekennzeichnet war. Dieses LDF-Muster ist typischerweise mit einer perforierten MCA assoziiert, die durch Autopsie bestätigt werden kann. Eine weitere Abtastung aus einer Maus-MCAO-Operation (Abbildung 5B) beleuchtet einen nicht schlüssigen Verschluss der Halsschlagader, der wahrscheinlich dazu beitrug, dass die Filamentplatzierung an den MCA-Ostien nicht erkannt werden konnte. Es wurde eine Perforation des MCA vermutet, da sich das relative CBF bei leichtem Zurückziehen des Filaments nur schleppend erholte. Diese Beispiele unterstreichen die entscheidende Rolle von LDF-Tracings bei der Identifizierung erfolgreicher und erfolgloser MCAO-Operationen und unterstreichen die Bedeutung sorgfältiger chirurgischer Verfahren und Maßnahmen für zuverlässige experimentelle Ergebnisse.

figure-results-1
Abbildung 1: Piktogramm der ungefähren Platzierung der Laser-Doppler-Sonde in Bezug auf MCA. Schematische Darstellung der Platzierung der Laser-Doppler-Sonde aus (A) sagittaler und (B) dorsaler Ansicht. Erstellt mit Biorender.com; KT26JWLYF6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Illustration der Operationsschritte für die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde in der Maus. (A) Bild der Position des vertikalen Schnitts, der für die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde erforderlich ist, mit der Maus in Rückenlage. (B) Bild des periorbitalen Fensters und des Schädels, das mit einer Pinzette und/oder Schere in der Maus präpariert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Illustration der Operationsschritte für die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde bei der Ratte. (A) Bild der Lage des vertikalen Schnitts, der für die Platzierung der Laser-Doppler-Sonde erforderlich ist, wobei sich die Ratte in Rückenlage befindet. (B) Platzierung der Laser-Doppler-Sonde im periorbitalen Bereich bei der Ratte in Rückenlage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Beispiele für LDF-Spuren, die das erfolgreiche MCAO-Verfahren bei Maus und Ratte bestätigen. (A) LDF-Messung der MCA-Region während des Maus-MCAO-Verfahrens. Diese Ablaufverfolgung veranschaulicht die Bestätigung von 1. Verschluss der Halsschlagader mit Krawatte; 2. Platzierung der Filamente am MCA; 3. Filamententfernung nach 60 min kontinuierlicher Ischämie; und 4. Reperfusion, wenn die Halsschlagader gelöst wird. Die Elemente a. und b. verdeutlichen, wie die Doppler-Verfolgung aussieht, wenn die Halsschlagader während der Ablesung gelöst und wieder gebunden wird. Diese Technik kann verwendet werden, um die Platzierung der Sonde zu bestätigen. (B) LDF-Messwerte der MCA-Region während des MCAO-Verfahrens bei Ratten. Wie bei der Maus veranschaulicht diese Verfolgung die Bestätigung von 1. Verschluss der Halsschlagader mit Krawatte und 2. Filamentplatzierung am MCA. Bei der MCAO-Behandlung der Ratte wird oft die Dopplersonde entfernt, und das Tier verbringt die gesamte Ischämiezeit wach und bewegt sich. Bei der Reperfusion wird der LDF vor der Reperfusion wiederhergestellt: 3. bestätigt die Filamententfernung und 4. Bestätigt, dass die Halsschlagader zur vollständigen Reperfusion gelöst ist. Sowohl bei Maus- als auch bei Ratten-MCAO-Verfahren wird die erfolgreiche Sondenplatzierung verwendet, um die korrekte Filamentplatzierung zu visualisieren, und ist angezeigt, wenn die Verfolgung zwei deutliche und plötzliche Abnahmen der LDF (für Ischämie) zeigt, gefolgt von zwei deutlichen und plötzlichen Erhöhungen der LDF (Reperfusion). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Beispiele für Laser-Doppler-Flowmetrie-Spuren, die auf erfolglose MCAO-Verfahren bei Maus und Ratte hinweisen. (A) Ein Beispiel für eine LDF-Abtastung, die auf eine nicht schlüssige Filamentplatzierung bei der Ratte hinweist. Während die Halsschlagader gebunden wurde (1.), sich lockerte (2.) und dann wieder gebunden wurde (3.), gab es eher einen undeutlichen und langsamen Abfall als einen plötzlichen Abfall des LDF, als das Filament bei der MCA Ostia war. Diese Rückverfolgung kann auf eine perforierte MCA hinweisen, und das Tier überlebt möglicherweise die ersten 24 Stunden der Reperfusion nicht. Die Filamentperforation kann mit einer Autopsie bestätigt werden. (B) Ein Beispiel für eine LDF-Abtastung, die auf eine nicht schlüssige Filamentplatzierung in der Maus hinweist. In dieser Nachverfolgung ist der Nachweis einer Karotisbindung nicht schlüssig (1.), gefolgt von einem undeutlichen Abfall des LDF mit Filamentplatzierung an den MCA-Ostien (2.). Hinzu kam, dass bei leichtem Zurückziehen des Filaments der relative zerebrale Blutfluss träge zunahm (3.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das MCAO ist das Goldstandardverfahren für die Modellierung von Hirnarterienverschluss und Reperfusion bei Nagetieren und war der Eckpfeiler der präklinischen Schlaganfallforschung, der die Induktion von fokaler Ischämie bei Nagetieren ermöglichte, um die Pathophysiologie des menschlichen Schlaganfalls nachzuahmen. Es handelt sich um ein anspruchsvolles chirurgisches Verfahren mit erheblicher inter- und sogar intrachirurgischer Variabilität. Es gibt zwar keine Hinweise darauf, dass die Anwendung von LDF die Variabilität reduziert, aber sie kann die wissenschaftliche Genauigkeit und die Studienergebnisse in einigen Designs verbessern. Dies wird erreicht, weil LDF die Filamentplatzierung validiert und Echtzeitinformationen über CBF während der Operation liefert, um zu bestätigen, ob ein Verschluss des MCA stattgefunden hat. Etwa 75% der Mausstudien beschreiben die Verwendung einer Laser-Doppler-Sonde12,13, während dies in einer Metaanalyse von Rattenstudien kein berichteter Parameter war14. Eine häufig verwendete Alternative zu LDF ist die Messung der Filamentinsertion (z. B. 18-20 mm von der Bifurkation der Halsschlagader bei Ratten) mit markierten Filamenten oder die Messung des verbleibenden Filaments, das aus dem Ansatzpunkt herausragt (z. B. 10 mm)10. Diese Alternative ist jedoch LDF unterlegen, da die genaue Tiefe des Einsetzens des Filaments je nach Faktoren wie der Größe und dem Gewicht der Ratte sowie dem spezifischen Protokoll, das im Experiment verwendet wird, leicht variieren kann. Solche Unterschiede sind wesentliche Überlegungen für die Reproduzierbarkeit der MCAO-Operation angesichts des Risikos einer Gefäßperforation oder eines unvollständigen Verschlusses - beides negative chirurgische Ergebnisse.

Obwohl LDF eine Methode zur Validierung der Filamentplatzierung ist und von SPAN unterstützt wird, ist dies kein erforderlicher Schritt in der veröffentlichten SPAN-SOP5. Das beschriebene Protokoll überwindet Barrieren wie die Verwendung spezieller Geräte und die schwierige Platzierung der Sonde an dorsalen Abschnitten des Schädels, wenn der Haupteingriff an einem in Rückenlage liegenden Tier durchgeführt wird. Diese Faktoren verlängern oft die Operationszeiten. Im Gegensatz dazu verwendet dieses Protokoll eine einzige, gerade Laser-Doppler-Sonde und einen Monitor, einen periorbitalen Platzierungsort und keine Schädelausdünnung. In Kombination führen diese Schritte zu einem stark vereinfachten und verkürzten (oft weniger als 5 min) Verfahren - eine signifikante Verbesserung gegenüber ähnlichen, aber alternativen Methoden, die in der Literatur beschrieben sind 7,8,9,10. Dieses Protokoll kann bei Bedarf auch von Chirurgen angepasst werden. Die Fehlerbehebung der beschriebenen Techniken kann eine Neupositionierung der Sonde erforderlich machen und einschließen, insbesondere wenn in Schritt 2.8 keine Abnahme des Blutflusses beobachtet wird.

Die Verwendung von LDF beschränkt sich auf die Bestätigung der Filamentplatzierung und wurde nicht mit einer Variabilität der Infarktgröße in Verbindung gebracht, die bei Maus- und Rattenmethoden >20 % betragen kann12,14. Die Infarktvariabilität ist seit langem ein Problem in der präklinischen Schlaganfallforschung. Während diese erhöhte Variabilität die Vielfalt der Infarktgrößen nachahmen kann, die beim Menschenbeobachtet wurde 13, kann die beobachtete Variabilität, wenn sie nicht richtig berücksichtigt wird, zu Studien führen, die nicht richtig aussagekräftig sind. Es gibt zwar keinen einzigen Faktor, der die Variabilität der Methode vorhersagt, aber die Bestätigung der Platzierung ist ein wichtiger Faktor für Studien zur Wirksamkeit von Arzneimitteln. Das hier beschriebene Protokoll wird zwar möglicherweise bereits bei Maus-MCAO-Verfahren eingesetzt, kann aber bei Ratten angesichts der häufigeren Beschreibungen der dorsalen Platzierung in der Literatur zu wenig genutzt werden9. Wir glauben, dass diese Beschreibung einer vereinfachten Platzierung einer Laser-Doppler-Sonde dazu beiträgt, die präklinischen Methoden der Schlaganfallforschung zu verfeinern, mit dem Ziel, die experimentelle Präzision und translationale Relevanz zu erhöhen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch NINDS 1R41NS124450 finanziert. Biorender: KT26JWLYF6

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
gebogene FederschereCastroviejo1501710
Pinzette #5Feinwissenschaftliche Werkzeuge11250-20
Pinzette #5/45Feinwissenschaftliche Werkzeuge1151-35
Forcepts KauterwerkzeugConmedM18019-01
LaborbandFisherbrand Beschriftungsband15-950
Laser-Doppler-MonitorMoore Instrumente MOORVMS-LDF
LDF SoftwarePerisoft für Windows oder moorSOFTNA
MausschneiderPhilips NorelcoMG7910
Periflux System 4000, Sonde 407Perimed Ausrüstung nicht mehr verfügbar
PlastikfolieGladPress n Seal
RattenschneiderOsterA5 oder ähnlich
Anästhesie für kleine NagetiereJD Medicalkundenspezifische
SchereExcelta362 Schere oder ähnliches
Temperaturüberwachungssystem mit SondePhysitempTCAT-2AC Controller
kleine

Referenzen

  1. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese J Stroke. 20 (1), 84-91 (1986).
  2. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84(1989).
  3. Hata, R., et al. A reproducible model of middle cerebral artery occlusion in mice: hemodynamic, biochemical, and magnetic resonance imaging. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (4), 367-375 (1998).
  4. Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab. 9 (5), 589-596 (1989).
  5. Lyden, P. D., et al. The stroke preclinical assessment network: Rationale, design, feasibility, and stage 1 results. Stroke. 53 (5), 1802-1812 (2022).
  6. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Effect of laser Doppler flowmetry and occlusion time on outcome variability and mortality in rat middle cerebral artery occlusion: inconclusive results. BMC Neurosci. 19 (1), 24(2018).
  7. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  8. Watcharotayangul, J., et al. Post-ischemic vascular adhesion protein-1 inhibition provides neuroprotection in a rat temporary middle cerebral artery occlusion model. J Neurochem. 123 Suppl 2 (Suppl 2), 116-124 (2012).
  9. Beretta, S., et al. Optimized system for cerebral perfusion monitoring in the rat stroke model of intraluminal middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. (72), e50214(2013).
  10. Ritter, L. S., Stempel, K. M., Coull, B. M., McDonagh, P. F. Leukocyte-platelet aggregates in rat peripheral blood after ischemic stroke and reperfusion. Biol Res Nursing. 6 (4), 281(2005).
  11. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.. , 8th ed., The National Academies Press. Washington, DC, USA. (2011).
  12. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Sci Rep. 6, (2016).
  13. Morais, A., et al. Embracing heterogeneity in the multicenter stroke preclinical assessment network (SPAN) trial. Stroke. 54 (2), 620-631 (2023).
  14. Ström, J. O., Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Method parameters' impact on mortality and variability in rat stroke experiments: a meta-analysis. BMC Neurosci. 14, 41(2013).

Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66839

Tags

Laser Doppler FlussmetriePlatzierung der periorbitalen Sondeisch misches SchlaganfallmodellNagetier SchlaganfallmodellFilamentplatzierungQuantifizierung der MikrogliaReperfusionsschadenSchlaganfall Chirurgieprotokoll
Periorbitale Platzierung einer Laser-Doppler-Sonde zur Überwachung des zerebralen Blutflusses vor einem Verschluss der mittleren Hirnarterie in Nagetiermodellen
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.