Methodenartikel

Ein webbasierter Workflow zur Auswahl gen- und gewebespezifischer Enhancer

DOI:

10.3791/66840

⸱

18. Juli 2025

 ,  ,  , 
1Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 3Stem Cell Medicine Department, Murdoch Children's Research Institute, The Royal Children's Hospital, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, reNEW Melbourne, Murdoch Children's Research Institute, 5Systems Biology Institute (SBI) Australia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen einen kodierungsfreien Workflow für Biologen vor, um gewebespezifische Gen-Enhancer nur mit browserbasierten Werkzeugen zu identifizieren. Unser Protokoll nutzt öffentliche H3K4me1/H3K27ac-Histonmarkierungen und Hi-C-Daten und ermöglicht es Forschern ohne Programmierkenntnisse, auf potenzielle regulatorische Elemente zuzugreifen, sie zu analysieren und zu identifizieren, die mit ihren interessierenden Genen verbunden sind.

Zusammenfassung

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Enhancer sind DNA-Regionen, die die Genexpression regulieren. Mutationen innerhalb von Enhancern können zu einer abnormalen Genregulation führen, die zu Krankheiten führt. Daher ist die Identifizierung von Enhancern, die die Genaktivität in bestimmten Geweben regulieren, entscheidend für das Verständnis der genetischen Grundlagen von Krankheiten. Enhancer sind jedoch schwer zu identifizieren, da sie keine Proteine kodieren. Obwohl zahlreiche Enhancer-Repositorien und Identifizierungswerkzeuge zur Verfügung stehen, kann die Komplexität dieser Werkzeuge eine Herausforderung für Biologen darstellen. Um Biologen die Nutzung dieser Ressourcen zu erleichtern, stellen wir ein biologenfreundliches Protokoll (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow) vor, das vorhandene webbasierte Genomikdaten wie H3K4me1- und H3K27ac-Histonmarkierungen und Daten zur Chromatinkonformationsanalyse (Hi-C) nutzt, um Enhancer zu entdecken, die mit einem interessierenden Gen (GoI) in einem Zielgewebe assoziiert sind, in dem der Enhancer aktiv ist. Dieses Protokoll ist vollständig webbasiert und erfordert keine Programmierkenntnisse von Endbenutzern. Wir haben die Nützlichkeit dieses Ansatzes demonstriert, indem wir Kandidaten-Enhancer charakterisiert haben, die TBX5, ein für die Herzentwicklung kritisches Gen, regulieren. Dieses Protokoll erleichtert die Identifizierung von Enhancern, die mit diesem Gen im linken Ventrikel assoziiert sind.

Einleitung

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Enhancer sind nicht-kodierende DNA-Regionen, die die Transkription, Entwicklung und zelluläre Differenzierung von Genen regulieren 1,2. Die Mutation von Enhancern kann zu verschiedenen Krankheiten führen, darunter Entwicklungsstörungen, Krebs und andere genetische Erkrankungen 3,4,5,6. Daher ist das Verständnis von Enhancern von größter Bedeutung, um Genexpression, Mutation und Krankheiten zu verstehen.

Um zu verstehen, wie Enhancer mit ihren Zielgenen interagieren, ist es wichtig, ihre Positionen innerhalb des Genoms zu identifizieren. Die Identifizierung der Enhancer-Positionen ist jedoch nicht immer einfach, da Enhancer sowohl in der Nähe der transkriptionellen Startstelle (TSS) als auch viel weiter entfernt lokalisiert werden können und sich über Dutzende bis Hunderte von Kilobasenerstrecken 2,7,8,9.

Trotz ihrer unvorhersehbaren genomischen Lokalisation weisen Enhancer unterschiedliche biochemische und strukturelle Signaturen auf, die eine systemische Rückverfolgung ermöglichen. Im Allgemeinen neigen Enhancer dazu, in intergenen und intronischen Regionen angereichert zu werden, wobei eine kleine Anzahl in Exons zu findenist 2,8. Sie sind oft durch spezifische Histonmodifikationen und die Bindung von Transkriptionsfaktoren gekennzeichnet, die ihre regulatorische Rolle definieren und ihre räumlich-zeitliche Aktivität über verschiedene Entwicklungsstadien und Gewebe hinweg bestimmen10,11.

ChIP-seq wird verwendet, um Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (TFBSs) und Histonmodifikationsmarkierungen zu identifizieren, wie z. B. das Kennzeichen von Enhancern, H3K4me1, aktive Enhancer-Markierungen, H3K27ac und H3K4me3-Markierungen, die an den Promotorregionen 1,12,13,14,15 angereichert sind. 3C-Techniken (Chromatin Conformation Capture) und ihre Derivate wie 4C, 5C, Hi-C und ChIA-PET werden verwendet, um physikalische Wechselwirkungen zwischen entfernten genomischen Regionen abzubilden. Während 3C auf spezifische Wechselwirkungen in bestimmten Geweben abzielt, bietet Hi-C eine genomweite Architektur über alle Zelltypenhinweg 16,17.

Zusätzlich zu den aktuellen Methoden wurden spezialisierte Ansätze zur Charakterisierung von Enhancern entwickelt, darunter gepoolte Enhancer-Datenbanken wie EnhancerAtlas oder EnhancerFinder18,19. Diese Werkzeuge erfordern jedoch oft, dass Forscher mehrere Datensätze integrieren, um mehrere Enhancer in vielen Geweben zu untersuchen, was für Biologen ohne Erfahrung in Bioinformatik und Data Mining überwältigend sein kann.

Hier beschreiben wir ein benutzerfreundliches Protokoll zur Auswahl von Enhancern, das vollständig auf vorhandenen Web-Tools basiert. Dies ermöglicht es den Forschern, ein Gen of Interest (GoI) abzufragen und entsprechende Enhancer abzurufen. Das Protokoll wählt hier Enhancer auf der Grundlage einer bestimmten Reihe von Kriterien aus: Histonmodifikationen, Chromatininteraktionen und Gewebespezifität 1,12,13,14,15,16,17,20,21. Enhancer, die in Introns gefunden werden, zeigen mit größerer Wahrscheinlichkeit gewebespezifische Aktivität im Vergleich zu intergenen Enhancern, die in den genomischen Regionen zwischen den Genenpositioniert sind 22. Um eine umfassende Abdeckung potenzieller aktiver Enhancer zu gewährleisten, haben wir den Suchbereich zwischen zwei benachbarten GoIs definiert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, regulatorische Elemente zu erfassen, die sich außerhalb des Genkörpers befinden. Wir verwendeten eine Enhancer-spezifische epigenetische Kennmarke, H3K4me1, und eine aktive Enhancermarke, H3K27ac, um Enhancer-Kandidaten aufzulisten. Diese Kandidaten wurden dann auf der Grundlage von Hi-C-Daten verfeinert, wobei Enhancer mit physikalischen Wechselwirkungen mit dem entsprechenden Promotor erhalten blieben. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Biologen durch den Prozess der Enhancer-Identifizierung zu führen, wobei nur öffentlich zugängliche webbasierte Tools verwendet werden. Durch die Integration von epigenetischen und Chromatin-Interaktionsdaten bietet der hier beschriebene Ansatz einen praktischen Rahmen, um Hypothesen über potenzielle Enhancer für eine weitere experimentelle Validierung zu generieren.

Protokoll

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HINWEIS: Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung finden Sie unter https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. Die im Protokoll verwendeten Daten sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 zusammengefasst. Die Fehlerbehebung ist in der Zusatzdatei 1 verfügbar.

1. Auffinden der indonesischen Regierung (Abbildung 1)

  1. Öffnen Sie den EnsEMBL-Genombrowser (https://www.EnsEMBL.org).
  2. Wählen Sie die passende Genomassemblierung passend zur Art und Version.
  3. Geben Sie GoI in das Suchfeld ein und klicken Sie auf Go.
  4. Wählen Sie den Link zur entsprechenden EnsEMBL-Gen-ID aus.
  5. Klicken Sie auf den Link zur Anzeige auf der Registerkarte "Region in Details ", die sich unterhalb des Zusammenfassungsabschnitts befindet, um durch die Region um die indische Regierung zu navigieren.

2. Definieren des Enhancer-Erkennungsbereichs (Abbildung 2)

  1. Identifizieren Sie die beiden benachbarten Gene der indischen Regierung, um den Nachweisbereich zu definieren. Verwenden Sie die Spur "Genlegende", um nach diesen Genen zu suchen, die als visuelle Elemente im Zusammenhang mit dem zusammengeführten EnsEMBL/Havanna in der Spur "Grundlegende Genannotationen aus GENCODE" annotiert sind. Bestimmen Sie die Richtungsabhängigkeit des GoI anhand der < und > Zeichen auf dem entsprechenden Gennamen in der GENCODE-Spur.
  2. Klicken und ziehen Sie, um die intergene Region zwischen diesen Genen auszuwählen, und klicken Sie im Popup-Fenster auf Zur Region springen , um den ausgewählten Bereich zu visualisieren. Definieren Sie den interessierenden Bereich jederzeit neu, indem Sie diesen Schritt wiederholen.
  3. (FAKULTATIV) Passen Sie die Anzeige an, indem Sie oben in der Spuranzeige die Option Titel hinzufügen/entfernen auswählen. Modulieren Sie die Zoomstufe mit den Zoom-/Navigationssteuerelementen über dem Spur-Viewer.

3. Analyse der Histonmarkierung (Abbildung 3)

  1. Wählen Sie in der Seitenleiste der Registerkarte "Region im Detail-Tab-Viewer" die Option "Diese Seite konfigurieren" aus.
  2. Wählen Sie in der Seitenleiste der Registerkarte "Regionsbild konfigurieren " in der Dropdown-Liste "Regulierung " die Option "Aktivität nach Zelle/Gewebe" aus.
  3. Verwenden Sie die Zell- /Gewebe-Suchleiste , um Gewebe von Interesse zu suchen und auszuwählen. Alternativ können Sie die alphabetische Navigationsleiste unter der Suchleiste verwenden, um interessante Taschentücher zu finden.
  4. Wählen Sie die Registerkarte Experimente neben Zelle/Gewebe aus.
  5. Wählen Sie H3K4me1 und H3K27ac als Marker für Enhancer und H3K4me3 als Marker für Promotoren aus.
  6. Wählen Sie Spuranzeige konfigurieren aus.
  7. Wählen Sie "Spuren anzeigen ", um H3K4me1-markierte Regionen im Enhancer-Erkennungsbereich und H3K4me3-markierte Regionen stromaufwärts der indischen Regierung zu visualisieren.
  8. Für die Enhancer-Kandidaten rufen Sie die Koordinaten der mit H3K4me1 markierten genomischen Regionen innerhalb der definierten Nachweisregionen ab, indem Sie auf die farbigen visual/box-Elemente in den neu hinzugefügten H3K4me1-Spuren klicken. Dadurch wird das Pop-up "Hists & Pols" angezeigt, das Informationen über die genomische Position des Elements im Basenpaar (bp) enthält.
    1. Rufen Sie aktive Enhancer-Kandidaten ab, indem Sie H3K4me1-Bereiche auswählen, in denen sich die farbigen Visual-/Box-Elemente von H3K4me1 und H3K27ac überlappen. Die Granularität der Zoomstufe kann sich auf die Anzahl der in diesem Track angezeigten Enhancer-Kandidaten auswirken.
    2. Alternativ können Sie die interessierenden Regionen für jedes genomische Merkmal manuell definieren, indem Sie auf die Spur klicken und ziehen, um die Peaks des Diagramms unter der Spur H3K4me1/H3K27ac zu kapseln. Kopieren Sie die Koordinaten des genomischen Standorts in eine Textdatei, und speichern Sie sie im .bed-Format .
  9. Replizieren Sie Schritt 3.8 für Promotorregionen ebenfalls mit der H3K4me3-Spur, wobei Sie sich auf die Region vor der indischen Regierung konzentrieren.

4. Analyse der Chromatinkonformationserfassung (Hi-C) (Abbildung 4)

  1. Greifen Sie auf das 4DN Data Portal (https://data.4dnucleome.org/) zu. Stellen Sie sicher, dass im gestapelten Hauptbalkendiagramm der Startseite von 4DN (Abbildung 5) Experimentsets als Y-Achse, Experimenttyp als X-Achse ausgewählt ist und das Diagramm nach Organismus gruppiert ist.
  2. Suchen Sie entlang der X-Achse des Hauptbalkendiagramms den In-situ-Hi-C-Balken. Klicken Sie auf den Teil der Leiste, der für Experimentiersets am Menschen gruppiert ist, und klicken Sie dann im Popup-Fenster auf die Schaltfläche Durchsuchen. Filtern Sie relevante Datensätze über den linken Seitenbereich.
  3. Klicken Sie auf den Link in der Spalte Titel der entsprechenden Bioprobe für das Gewebe von Interesse.
  4. Klicken Sie auf der Registerkarte "Verarbeitete Dateien" auf "Daten durchsuchen", um den Hi-C-Datensatz genauer zu untersuchen.
  5. Geben Sie die Koordinaten des identifizierten Promotors im Gewebe von Interesse ein (aus Schritt 3.9) und markieren Sie die Region horizontal, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Heatmap klicken (Abbildung 4). Die hinzugefügten Linien stellen sicher, dass die Promotorregion über die Heatmap hinweg visuell verfolgt wird. Entfernen Sie versehentliche Linien, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Linie klicken und horizontale/vertikale Linie und Reihe schließen auswählen.
  6. Geben Sie die Koordinaten aller experimentell validierten Kontrollverstärker23 ein, um den Interaktionsschwellenwert basierend auf ihrem Minimum zu berechnen. Es wurde bereits bestätigt, dass diese Kontrollverstärker mit der Promotorregion interagieren und als Benchmarks für die Definition der minimal signifikanten Wechselwirkung dienen.
  7. Definieren Sie den Promotor-Enhancer-Schwellenwert unter Verwendung der Kontroll-Enhancer, basierend auf dem niedrigsten Interaktionswert ungleich Null gemäß dem Farbschlüssel auf der rechten Seite der Matrix.
  8. Geben Sie die genomischen Koordinaten aller H3K4me1-assoziierten Regionen (aus Schritt 3.8) ein und markieren Sie sie vertikal auf der Hi-C-Heatmap. Dies ermöglicht ein Cross-Check-Muster, bei dem die Schnittmenge zwischen H3K4me1-markierten Enhancern (vertikal) und der Promotorregion (horizontal) auf signifikante Wechselwirkungen untersucht werden kann.
    1. Filtern Sie dann schwach interagierende Regionen heraus, indem Sie die Interaktionswerte von H3K4me3-markierten Regionen mit dem Interaktionsschwellenwert vergleichen (Schritt 4.6).
    2. Wählen Sie die genomischen Koordinaten aus, die Interaktionshäufigkeiten aufweisen, die höher sind als der in der 4DN-Portal-Heatmap definierte Schwellenwert. Diese Bereiche werden in der Heatmap als konzentriertere (dunklere) Signale angezeigt, außer im BED-Format.

Ergebnisse

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Um die Verwendung des vorgestellten Protokolls zu veranschaulichen, untersuchten wir das TBX5-Gen im menschlichen Herzen und untersuchten TBX5-assoziierte Enhancer unter Verwendung des umfassenden Arbeitsablaufs mit H3K4me1-, H3K27ac- und Hi-C-Daten. TBX5 ist ein Gen, das zur Entwicklung der Gliedmaßen und des Herzens beiträgt, einschließlich der Bildung der vier Kammern und der Septumtrennung24. Die Mutation in diesem Gen ist eine der Hauptursachen für das Holt-Oram-Syndrom (HOS), das Anomalien der Gliedmaßen und angeborene Herzfehler (KHK), einschließlich Septumdefekte, verursacht24. Die Mutation von TBX5-assoziierten Herzverstärkern kann die CHD24 entscheidend beeinflussen. In einer früheren Studie wurden drei bekannte TBX5-Enhancer in humanem kardialspezifischem Gewebe entdeckt - nämlich "Enhancer 2", "Enhancer 9" und "Enhancer 16" (Supplementary File 2), bei denen in transgenen Mäusen vergleichbare Phänotypen nachgewiesen wurden23.

Wir untersuchten H3K4me1- und H3K27ac-angereicherte Regionen zwischen RBM19 und TBX3, zwei flankierende Gene stromabwärts und stromaufwärts von TBX5 im Menschen, um mutmaßliche Enhancer am TBX5-Locus zu gewinnen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Um herzspezifische Enhancer zu identifizieren, wurden die Herzmuskelzellen ausgewählt. Die mutmaßlichen TBX5-Herzverstärkerregionen wurden als Koordinaten abgerufen (chr12: Start-Ende), und es wurden 22 sowohl H3K4me1- als auch H3K27ac-assoziierte Regionen identifiziert (Abbildung 3 und Zusatzdatei 3). Mutmaßliche TBX5-Herzverstärker wurden aus der genomischen Datenbank von EnsEMBL abgerufen und mit Hi-C-Daten in der 4DNucleome-Datenbank verglichen (Abbildung 4). Dies geschah, um mögliche Wechselwirkungen zwischen potenziellen Enhancern und dem TBX5-Herzpromotor abzuschätzen. Gemäß dem hier beschriebenen Protokoll wurde bestätigt, dass 21 von 22 genomischen Regionen mit dem TBX5-Promotor (chr12: 114400143-114410103) in den Herzmuskelzellen interagieren (Ergänzungsdatei 4). Es gab eine Region, die keine physische Interaktion mit dem Promotor aufwies (Abbildung 4, Schritt 4.8). Schließlich verglichen wir dieses Protokoll mit diesen biologisch validierten Enhancern und der aktuellen Goldstandard-Datenbank für Herzverstärker, dem VISTA Cardiac Enhancers Browser, und zeigten zusätzliche Enhancer, die derzeit nicht in der Datenbank erfasst sind25.

Wir haben einen Quervergleich der 21 TBX5-Enhancer , die von dem hier vorgestellten Protokoll abgerufen wurden, mit vorhandenen Datenbanken durchgeführt. Wir haben 4 TBX5-Enhancer aus dem VISTA Cardiac Enhancer Browser (Supplementary File 5)25 abgerufen. Von den 4 VISTA-identifizierten Herzverstärkern überlappten sich 3 Enhancer, hs2329, mm1282 und m370, mit den Regionen, die durch dieses webbasierte Enhancer-Nachweisprotokoll identifiziert wurden (Abbildung 5). Jeder der vorhergesagten Enhancer teilte sich auch die genomischen Regionen mit zuvor experimentell validierten Enhancern von Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) und Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), während sie keine Überlappung mit Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38) zeigten. Einer der VISTA-identifizierten Enhancer, hs498 , überlappte sich nicht mit irgendwelchen Enhancern, die durch dieses Protokoll vorhergesagt wurden, oder mit den experimentell validierten Enhancern23 von Smemo et al. (Abbildung 5), obwohl die Region eine partielle Überlappung mit H34Kme1-Markierungen aufwies (Abbildung 5). In ähnlicher Weise überlappte sich Enhancer 9 nicht mit den vorhergesagten Enhancern dieser Pipeline, sondern war mit H3K4me1-Markierungen assoziiert (Abbildung 5).

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Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Auffinden der indonesischen Regierung im EnsEMBL Genome Browser. Der Benutzer öffnet zunächst die EnsEMBL-Homepage (1.1), wählt die Spezies (Mensch) aus und gibt das Gen in die Suchleiste ein (1.2-1.3). Aus der Ergebnisliste wird die entsprechende Gen-ID ausgewählt (1.4), wodurch die Gen-Zusammenfassungsseite geöffnet wird. Der Benutzer klickt dann auf den Hyperlink Region in Detail (1.5), um die genomische Region um die indonesische Regierung herum zu visualisieren, einschließlich benachbarter Elemente und regulatorischer Merkmale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Definition der Enhancer-Nachweisregion um die injizierte Regierung mit dem EnsEMBL Genome Browser. Um den Enhancer-Nachweisbereich zu definieren, identifizieren Sie die beiden benachbarten Gene, die die GoI flankieren, mithilfe der Spur Basic Gene Annotations from GENCODE , wobei die Gene als dunkelgelbe Blöcke angezeigt werden, die mit zusammengeführten EnsEMBL/Havanna-Annotationen beschriftet sind. Die Transkriptionsrichtung jedes Gens wird durch Pfeilspitzen (< oder >) neben dem Gennamen (2.1) angezeigt. Um die intergene Region zwischen den benachbarten Genen auszuwählen, klicken und ziehen Sie über die Region von Interesse und wählen Sie dann im Popup-Fenster zum Vergrößern die Option Zur Region springen (2.2). Um regulatorische oder Enhancer-bezogene Anmerkungen hinzuzufügen, klicken Sie auf Spuren hinzufügen/entfernen (2.3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Konfiguration von Histon-Modifikationsspuren in der Enhancer-Detektionsregion mit dem EnsEMBL Genome Browser. Klicken Sie in der linken Symbolleiste auf Diese Seite konfigurieren (3.1), um auf das Streckenkonfigurationsfenster zuzugreifen und zu "Aktivität nach Zelle/Gewebe" im Abschnitt "Vorschriften" (3.2) zu navigieren. Wählen Sie im geöffneten Tab den Abschnitt "Experimente" (3.3) und verwenden Sie die Zell-/Gewebe-Suchleiste, um das gewünschte Gewebe (Herzmuskelzelle) zu finden und auszuwählen (3.4). Aktivieren Sie im Histon-Markierungsfeld (3.5) H3K4me1 und H3K27ac als aktive Enhancer-Markierungen und H3K4me3 als Promotor-Markierung und klicken Sie dann auf "Track-Anzeige konfigurieren" (3.6). Nachdem Sie die Track-Auswahl bestätigt haben, klicken Sie auf "Tracks anzeigen" (3.7), um zum Genom-Viewer zurückzukehren. Histonmarkierungspeaks werden nun im Nachweisbereich (3.8) als farbige Blöcke unter der entsprechenden Gewebemarkierung dargestellt (gelb: H3K4me1, blau: H3K27ac und orange: H3K4me3). "Hists & Pols"-Pop-up, das die genomischen Koordinaten der Region in Basenpaaren (chr:start-end) enthält, die kopiert und für die nachgelagerte Analyse gespeichert werden können. Ein "Hists & Pols"-Pop-up erscheint, nachdem Sie auf die farbigen Elemente in der Spur geklickt haben. Das Pop-up enthält die genomischen Koordinaten der Region in Basenpaaren (z.B. chr12:11443450-114451611 für die Promotorregion), die kopiert und für die nachgelagerte Analyse gespeichert werden können (3.8). Um mögliche Enhancer zu extrahieren, priorisieren Sie ebenfalls Regionen, in denen sich die Peaks von H3K4me1 und H3K27ac überlappen, wie die vertikale Ausrichtung von Peaks und Boxen über die Spuren hinweg zeigt (3.9). Überlappende Regionen können direkt ausgewählt werden, indem Sie auf die entsprechenden Felder klicken oder manuell über die ausgerichteten Peaks ziehen und klicken, um eine Region zu definieren (z. B. chr12:114400143-114410103 für eine aktive Kandidatenregion). Die im Pop-up angezeigten Koordinaten sollten für die nachgelagerte Validierung oder Visualisierung im BED-Format gespeichert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Visualisierung von Promotor-Enhancer-Chromatin-Wechselwirkungen unter Verwendung von Hi-C-Heatmaps aus dem 4D Nucleome Data Portal. Die Startseite des 4D Nucleome Data Portals zeigt ein gestapeltes Balkendiagramm an, das die verfügbaren Experimenttypen nach Organismus zusammenfasst. Der Datensatz "in situ Hi-C" für humane Proben wird durch Anklicken des entsprechenden Abschnitts des Balkens (4.1) ausgewählt. Eine gefilterte Liste relevanter Datensätze wird angezeigt. Es wird ein Hi-C-Datensatz ausgewählt, der von H9-Zellen abgeleitet wurde, die zu kardialen Myoblasten differenziert wurden (4.2). Der ausgewählte Datensatz (4.3) wird im HiGlass-Browser über die Schaltfläche Daten erkunden (4.4) geöffnet. Die genomische Region of Interest wird in das Koordinatenfeld (4.5) eingegeben, und die Kontaktmatrix wird als farbskalierte Heatmap gerendert. Dunklere Farben (tiefrot bis schwarz) deuten auf eine stärkere Chromatinkontaktfrequenz hin, während hellere Farben (weiß bis orange) eine schwächere Wechselwirkung darstellen. Ein horizontales Lineal wird an der Promotorkoordinate platziert, und vertikale Linien werden an den Positionen von drei experimentell validierten Kontrollverstärkern gezeichnet (4.6). Diese Schnittpunkte werden verwendet, um eine strenge Wechselwirkungsschwelle zu definieren, die durch das stärkste sichtbare Signal (dunkelste Farbe) unter den Promotor-Enhancer-Kontakten festgelegt wird (4.7). Zusätzliche vertikale Regeln werden an den Stellen der mit H3K27ac und H3K4me1 markierten Enhancer gezeichnet (aus Schritt 3.8). Kandidaten, deren Promotor-Enhancer-Schnittpunkte gleich oder dunkler als der Schwellenwert sind, werden beibehalten, während Kandidaten mit schwächeren Signalen (hellere Farbquadrate) ausgeschlossen werden (4.8). Gespeicherte Koordinaten werden manuell extrahiert und im BED-Format für nachgelagerte Analysen gespeichert. (a. Enhancer 2, b. Enhancer 9 und c. Enhancer 16) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Genomische Browseransicht von vorhergesagten TBX5-Enhancern im Vergleich zu VISTA-validierten Herzverstärkern und Kontroll-Enhancern. Genom-Browser-Snapshots zeigen den Enhancer-Suchbereich (SCHRITT 2) an, der vorhergesagte Enhancer, die vom webbasierten Protokoll abgerufen wurden (unten), mit VISTA-validierten Enhancern (oben) und experimentell validierten Kontroll-Enhancern (Mitte) vergleicht. Das Hauptfeld zeigt den vollständigen genomischen Locus mit annotierten regulatorischen Elementen, einschließlich der kardialmuskelzellspezifischen H3K4me1 (gelb), H3K27ac (blau) und H3K4me3-Peaks (orange). Drei vergrößerte Abbildungen erfassen die Übereinstimmung zwischen den vom Protokoll abgerufenen VISTA- und Kontrollverstärkern. Die Überlappung mit Control Enhancern ist mit roten Kästchen umrandet. Die Koordinaten für jede Unterregion werden in den unteren Browser-Fenstern angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: In der Studie verwendete Daten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: In der Studie verwendete webbasierte Tools. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Anweisungen zur Fehlerbehebung für den EnsEMBL Genome Browser. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Eine BED-Datei im GRCh38-Format, die experimentell validierten TBX5-Enhancer zur Herzkontrolle23. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Eine BED-Datei im GRCh38-Format, TBX5-Herzverstärker, die von STEP3 von EnsEMBL abgerufen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Eine BED-Datei im GRCh38-Format, TBX5-Herzverstärker, die von STEP4 von EnsEMBL abgerufen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 5: Eine BED-Datei im GRCh38-Format, TBX5-Herzverstärker, abgerufen vom VISTA-Herzverstärker-Browser25. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Das hier beschriebene webbasierte Protokoll fungiert als Workflow für den Enhancer-Abruf und nicht als Enhancer-Vorhersage. Durch die Nutzung öffentlich zugänglicher gewebespezifischer Datensätze, Histonmodifikationen (H3K4me1 und H3K27ac) und Hi-C-Interaktionsdaten werden potenzielle Enhancer eingegrenzt, die mit der indischen Regierung in Verbindung gebracht werden. Im Gegensatz zu computergestützten Vorhersagewerkzeugen, die auf maschinellem Lernen oder sequenzbasierten Modellen basieren, konzentriert sich unser Ansatz darauf, Enhancer nur auf der Grundlage experimenteller Daten zu finden. Die Anweisungen zur Fehlerbehebung für den EnsEMBL-Genombrowser finden Sie in der Zusatzdatei 1.

Dieser Workflow integriert Schlüsselelemente wie Histonmarkierungen und Chromatin-Interaktionsdaten, ähnlich wie fortschrittliche Methoden wie ChIA-PET und PLAC-seq, die Enhancer-Promotor-Wechselwirkungen mit höherer Genauigkeit abbilden10,11. Diese Methode ist jedoch von Vorteil, wenn hochauflösende experimentelle Techniken nicht durchführbar sind, da das Protokoll weniger ressourcenintensiv ist und viel Zeit spart.

Die primäre Einschränkung des oben vorgestellten Ansatzes ist seine Abhängigkeit von der Verfügbarkeit und Qualität vorhandener Datensätze, was die Genauigkeit der abgerufenen Interaktionen beeinträchtigen kann. Die Untersuchung der Enhanceraktivität während der kardialen Entwicklung im Zusammenhang mit TBX5-assoziierten genetischen Mutationen erfordert eine gewebespezifische Auflösung. Für eine solche Analyse wäre embryonales Herzgewebe aufgrund seiner Bedeutung für die Entwicklungsregulation am besten geeignet. Es gab jedoch keine embryonalen Datensätze, die Daten zur Histonmodifikation waren zum Zeitpunkt der Analyse öffentlich zugänglich. Um dies zu berücksichtigen, kann die Integration alternativer Ressourcen wie ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 oder EnhancerFinder den Nutzen der Pipeline erweitern, indem zusätzliche Datensätze für die Identifizierung und Validierung von Enhancern bereitgestellt werden18,19.

Im TBX5 REPFIX ergab die H3K4me1-basierte Analyse 22 mutmaßliche Enhancer als Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen. Die anschließende Hi-C-Analyse zeigte, dass 21 von 22 Enhancer-Kandidaten, die auf früheren Histon-Modifikationsmarkierungen basierten, mit dem TBX5-Promotor in den Herzmuskelzellen interagierten (Abbildung 5). Dies unterstützt die Zuverlässigkeit des auf Histonmodifikationsmarkierungen basierenden Ansatzes bei der Vorhersage von interessierenden Regionen.

Wir haben uns entschieden, der Sequenzkonservierung über Spezies hinweg in diesem Protokoll keine Priorität einzuräumen, obwohl dies ein gängiges Kriterium für die Identifizierung von Enhancern ist. Da es sich zuvor als weniger wirksam für gewebe- oder speziesspezifische Enhancer erwiesen hat, von denen viele während der Evolution nicht stark konserviert sind26. Vor diesem Hintergrund haben wir uns entschieden, uns auf Chromatin-basierte Marker zu konzentrieren, die direkter auf die Aktivität des funktionellen Enhancers hinweisen. Die Sequenzerhaltung kann jedoch in bestimmten Kontexten immer noch von Wert sein, z. B. bei der Untersuchung von Enhancern mit evolutionärer Bedeutung. In diesem Fall könnte es als optionaler Schritt für Nutzer hinzugefügt werden, die an konservierten regulatorischen Elementen interessiert sind.

Das Protokoll erwies sich als wirksam bei der Gewinnung von 21 herzspezifischen Enhancern für das TBX5-Gen von der EnsEMBL-Website, die sich zuvor der Identifizierung durch eine bestehende Plattform, den VISTA Cardiac Enhancers Browser, entzogen hatten. Obwohl das hier beschriebene Protokoll einen der Enhancer, hs498, nicht abrufen konnte, was auf die Möglichkeit einer Einschränkung der Detektion hindeutet, entdeckte der Ansatz einige Enhancer, die vom VISTA Cardiac Enhancers Browser nicht erkannt wurden. Eine weitere Validierung der abgerufenen Enhancer ist jedoch notwendig, da das Protokoll im Vergleich zu kuratierten VISTA-Datenbanken eine größere Anzahl von mutmaßlichen Regionen liefert. Diese höhere Anzahl erhöht das Risiko von falsch positiven Ergebnissen, und eine größere Anzahl vorhergesagter Enhancer bedeutet nicht unbedingt eine verbesserte Spezifität oder funktionelle Relevanz. Die Einbeziehung zusätzlicher experimenteller Datensätze oder funktioneller Assays wie Genexpressionsanalysen, CRISPR-Störungen oder Reporterassays wird entscheidend sein, um die biologische Validität dieser Kandidaten zu bestätigen, wie sie in Smemoet al. durchgeführt wurde." s Studie23.

Der Quervergleich mit drei experimentell validierten Enhancern zeigte eine partielle Überlappung mit den vorhergesagten Regionen (Abbildung 5). Der vorhergesagte Enhancer "e1" war breiter aufgestellt als der validierte Enhancer 2, während "e18" eine teilweise Überlappung mit Enhancer 16 aufwies (Abbildung 5). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Ansatz erfolgreich Regionen mit bekannter regulatorischer Aktivität identifiziert, obwohl die größere Spannweite der vorhergesagten Enhancer die Flexibilität der Enhancergrenzen widerspiegeln könnte. Enhancer fungieren oft als modulare Elemente, und ihre Aktivität kann vom Chromatinkontext, dem Zelltyp und dem Entwicklungszeitpunkt abhängen 2,27. Daher können vorhergesagte Regionen die zentralen aktiven Zentren mit benachbarten Sequenzen umfassen, die zur regulatorischen Funktion beitragen, trotz der Notwendigkeit einer experimentellen Validierung, um zu bestimmen, welche Teile dieser breiteren Vorhersagen in einem gewebespezifischen oder entwicklungsbezogenen Kontext funktionell aktiv sind. Während der VISTA Cardiac Enhancer Browser vier Regionen innerhalb des definierten Bereichs identifizierte, überlappte sich nur ein Enhancer, mm370, teilweise mit einem experimentell validierten Enhancer, Enhancer 16, und zwar speziell in der durch H3K4me1 markierten Region (Abbildung 5)23. Der verbleibende Teil von mm370, der sich nicht mit dem Enhancer 16 überschneidet, kann auf einen nicht funktionsfähigen oder inaktiven Subbereich des Enhancers28, 29 hinweisen.

Offenlegungen

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Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

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Wir danken den Mitgliedern des Ramialison Labors (Transcriptomics and Bioinformatics, reNEW Bioinformatics Hub) für die hilfreichen Gespräche. MR und HTN werden durch einen NHMRC Ideas Grant (APP1180905) unterstützt. Wir danken Richard Saffery für die Unterstützung. MR wird durch ein Future Leader Fellowship (107328) der Heart Foundation finanziert. Zusätzliche Infrastrukturmittel für das Murdoch Children's Research Institute wurden vom Australian Government National Health and Medical Research Council Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme bereitgestellt. Das Australian Regenerative Medicine Institute wird durch Zuschüsse der Regierung des Bundesstaates Victoria und der australischen Regierung unterstützt. Das Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wird durch Zuschüsse der Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ComputerarbeitsplatzN/AN/AWebbrowser-fähiger Rechner, Windows/Mac/Linux-Betriebssystem
4DN Datenportal4DN Datenportalhttps://data.4dnucleome.org/
GalaxieGalaxiehttps://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
Github (Englisch)Github (Englisch)https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
VISTA VISTA Cardiac Enhancer Browserhttps://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/

Referenzen

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  1. Barral, A., Déjardin, J. The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation. Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).
  3. Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).
  4. Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. Enhancer redundancy in development and disease. Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).
  5. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  6. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  7. Panigrahi, A., O'Malley, B. W. Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown. Genome Biol. 22 (1), 108(2021).
  8. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  9. Krivega, I., Dean, A. Enhancer and promoter interactions-long distance calls. Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations. Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).
  11. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  12. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  13. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  14. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  15. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  16. Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  17. de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).
  18. Gao, T., Qian, J. EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).
  19. Erwin, G. D., et al. Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction. PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).
  20. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  21. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  22. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  23. Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease. Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).
  24. Boogerd, C. J., Evans, S. M. TBX5 and NuRD divide the heart. Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).
  25. Dickel, D. E., et al. Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers. Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).
  26. Pennacchio, L. A., Visel, A. Limits of sequence and functional conservation. Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).
  27. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  28. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  29. Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers. Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).

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Enhancer IdentificationGene RegulationTissue Specific EnhancersWeb Based WorkflowH3K4me1 MarkerH3K27ac MarkerChromatin ConformationHi C DataEnsembl Genome BrowserHeart Development

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