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Bewertung der strukturellen Merkmale in Triticum aestivum und Zea mays für die photosynthetische Differenzierung von C3 und C4 mittels Freihand- und Halbdünnschliffen

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DOI:

10.3791/66843

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12. Juli 2024

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1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Beurteilung der anatomischen Unterschiede zwischen den Blattquerschnitten von C3 undC 4 hilft dabei, die Effizienz der Photosynthese zu verstehen. In dieser Arbeit werden die freihändige und halbdünne Blattquerschnittspräparation und -untersuchung sowie die Vorbehalte bei der Präparation für die Kulturarten Triticum aestivum und Zea mays beschrieben.

Zusammenfassung

Die erhöhte Effizienz derC4-Photosynthese im Vergleich zumC3-Mechanismus ergibt sich aus ihrer Fähigkeit, CO2 in Bündelscheidenzellen zu konzentrieren. Die Wirksamkeit der C4-Photosynthese und die intrinsische Wassernutzungseffizienz stehen in direktem Zusammenhang mit dem Anteil von Mesophyll- und Bündelblattzellen, der Größe und Dichte der Bündelscheiden sowie der Größe, Dichte und Zellwanddicke der Bündelscheidenzellen. Eine schnelle mikroskopische Analyse dieser Merkmale kann mit der konventionellen Lichtmikroskopie an Freihand- und Halbdünnschnitten durchgeführt werden, die durch die Identifizierung und Untersuchung spezifischer Zelltypen wertvolle Informationen über die photosynthetische Effizienz in C4-Pflanzen liefert. Darüber hinaus werden Fehler in der Freihand- und Halbschliffvorbereitung aufgezeigt, die sich auf anatomische Messungen und Zelltypdiagnosen auswirken, sowie wie diese Fehler vermieden werden können. Dieser mikroskopische Ansatz bietet ein effizientes Mittel, um Einblicke in die photosynthetische Akklimatisierung an Umweltschwankungen zu gewinnen und hilft bei der schnellen Abschirmung von Nutzpflanzen für zukünftige Klimazonen.

Einleitung

Die Photosynthese ist ein grundlegender Prozess, bei dem Lichtenergie in chemische Energie umgewandelt wird und als Eckpfeiler der terrestrischen trophischen Netzwerke dient. Die meisten Pflanzen folgen demC3-Weg der Photosynthese, bei dem das primäre Photosyntheseprodukt die Drei-Kohlenstoff-Verbindung Glycerat 3-phosphat ist. Die C3-Photosynthese entwickelte sich vor über 2 Milliarden Jahren in der Atmosphäre, die reich an CO2 und arm an O21 ist. Das wichtige photosynthetische Enzym Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (Rubisco), das sich unter diesen Bedingungen entwickelt hat, ist für diederzeitigen Bedingungen mit niedrigem CO2 -Gehalt suboptimal, da es kompetitiv mit O2 reagiert und die Photorespiration2 einleitet. Die Photorespiration ist ein verschwenderischer Weg, der Energie verbraucht, anstatt sie zu produzieren und CO2 als Nebenprodukt freizusetzen. Folglich ist es von entscheidender Bedeutung, eine hohe CO2 -Konzentration um Rubisco in den Chloroplasten aufrechtzuerhalten, um eine Sauerstoffversorgung zu verhindern 3,4. Aufgrund der Unfähigkeit von C3 -Pflanzen, CO2 zu konzentrieren, kommt es zu einem signifikanten CO2 -Abbau aus der Umgebungsluft zu den Chloroplasten, was die Photosynthese bremst und das Pflanzenwachstum und die Biomasseproduktion beeinträchtigt 2,5,6.

In C3-Pflanzen wird die Photosynthese durch den Eintritt von CO2 durch die Spaltöffnungen, seine Diffusion durch das Mesophyll und die biochemische Aktivität der photosynthetischen Enzyme begrenzt. Der Eintrag von CO2 wird zunächst durch die stomatäre Leitfähigkeit begrenzt, die durch Umgebungsbedingungen wie Lufttemperatur und Luftfeuchtigkeit gesteuert wird. Dann diffundiert CO2 durch die innere gasförmige und flüssige Phase des Blattes zu Rubisco7. In C3-Pflanzen finden alle Stadien der Photosynthese in den Chloroplasten der Mesophyllzellen statt, und die Pflanzen müssen einen konstanten Einstrom von CO2 aus der Atmosphäre in die Chloroplasten aufrechterhalten. Die Abhängigkeit der CO2 -Verfügbarkeit in Chloroplasten von der Offenheit der Stomata, der Mesophyllarchitektur und den individuellen Zell- und Chloroplasteneigenschaften macht Pflanzen anfällig für Umwelteinflüsse, die sich schließlich auf die Photosynthese auswirken, wie z. B. geringe Wasserverfügbarkeit und hohe Temperaturen 7,8,9,10, was insbesondere ihre Anfälligkeit für den Klimawandel unterstreicht11.

Angesichts der Herausforderungen, die sich aus der Ineffizienz desC3-Signalwegs ergeben, sowie der Einschränkungen bei der Aufrechterhaltung eines optimalen CO2 -Gehalts und der Anfälligkeit für Umweltfaktoren hat sich bei bestimmten Pflanzen ein anderer Weg, derC4-Photosyntheseweg, entwickelt. Charakteristisch für C4-Pflanzen sind zwei räumlich getrennte biochemische Wege; Die anfängliche CO2 -Fixierung erfolgt in Mesophyllzellen durch Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, die eine höhere Affinität zu CO2 als Rubisco aufweist und auch keine Oxygenierungsaktivität aufweist. Das gebildete C4 -Produkt wird weiter zu den Bündelscheidenzellen transportiert, wo es decarboxyliert wird, und CO2 wird durch Rubisco (C3 Photosynthese) wieder freigesetzt und fixiert12,13,14. Die größere Affinität der PEP-Carboxylase zu CO2 und die dicken Zellwände der Bündelscheidenzellen ermöglichen eine CO2 -Konzentration in den Bündelscheidenzellen, und somit minimieren C4 -Pflanzen die Photorespiration durch räumliche Segregation der CO2 -Fixierung und des Calvin-Zyklus. Die Einführung des C 4-Signalwegs zeigt die adaptive Reaktion der Natur auf Umwelteinflüsse und bietet Einblicke in mögliche Strategien zur Verbesserung der Produktivität und Widerstandsfähigkeit von Nutzpflanzen bei sich ändernden Klimabedingungen15.

Die spezialisierte Anatomie der Blattstruktur bei C4-Pflanzen ist gekennzeichnet durch Adern, die von vergrößerten Gefäßbündelscheidenzellen umgeben sind, die Chloroplasten enthalten, und durch eine radiale Anordnung von Mesophyllzellen in einem äußeren Ring, der sich um die Bündelscheidenzellen herum bildet. Die Mesophyllzellen befinden sich in unmittelbarer Nähe zu den Bündelscheidenzellen, was einen schnellen und kontinuierlichen Transport von Metaboliten zwischen den beiden Zelltypen ermöglicht. Die Anordnung dieser Zelle ist typisch für C4-Pflanzen und wird als Kranz-Anatomie16 bezeichnet. Bei C 3-Spezies kann die Spezialisierung und Disposition der Mesophyllzellen variieren, aber die Bündelscheidenzellen sind deutlich kleiner und haben wenige oder gar keine Chloroplasten. Die spezifische Anatomie von Kranz ermöglicht die Konzentration von CO2 in Chloroplasten in Bündelscheidenzellen, in denen sich das C 3-carboxylierende Enzym Rubisco befindet, wodurch die Photorespiration wirksam behindertwird 4,17,18. Trotz seiner scheinbar komplexen Anordnung sind diese Veränderungen in der Evolution der Angiospermen mehrfach unabhängig voneinander aufgetreten, was darauf hindeutet, dass es sich um einen relativ praktikablen Evolutionsweg handelt 19,20,21, und es wurde gezeigt, dass sich verschiedene Taxa in einem Zwischenstadium zwischen demC3- und dem C4-Kohlenstoffstoffwechsel befinden, der alsC3-C4 oderC2 bezeichnet wird. mit der Fähigkeit, CO2 2 22,23,24,25 zu konzentrieren und wieder aufzunehmen.

Viele C4-Pflanzen sind Pflanzen mit hoher wirtschaftlicher Bedeutung, und die gentechnische Veränderung von C3-Pflanzen, wie z. B. Reis, zur Verbesserung ihrer Klimaresilienz und zur Sicherung des Ertrags war in den letzten Jahrzehnten ein Thema von Interesse26,27. Die technischen Bemühungen erfordern jedoch ein detailliertes Verständnis derC4-spezialisierten Anatomie und wie sie die Photosynthese steuert 2,28.

Die Etablierung der C4 Kranz-Anatomie ist eine Voraussetzung, um das ehrgeizige Ziel zu erreichen, die C4-Photosynthese in C3-Pflanzen zu entwickeln25. Das derzeitige Verständnis der Regulation der Kranz-Anatomie und der Methoden zum schnellen Screening ihrer wichtigsten anatomischen Merkmale ist jedoch begrenzt, was die Identifizierung von Hybridarten erschwert. Frühere Studien haben gezeigt, dass zu den wichtigsten Merkmalen, die die photosynthetische Effizienz in C3- und C4-Pflanzen regulieren, der Venenabstand, der Durchmesser des Bündelscheidenkomplexes und die Größe der Bündelscheidenzellen gehören14,29. Diese Merkmale können leicht mit Freihandschnitten gescreent und mit halbdünnen Schnitten quantitativ analysiert werden. Im Folgenden wird die Methode zur Beurteilung der Merkmale beschrieben, die eine anatomische Differenzierungsdiagnostik von C3 undC 4 mittels Freihandkreuz- und Lichtmikroskopie ermöglichen, nämlich der Fläche der Bündelscheide, des intervenalen Abstands und der Venenfrequenz.

Protokoll

1. Bedingungen für das Pflanzenwachstum

  1. Weizen (Triticum aestivum L. Var. Winterweizen, "Fredis") und Mais (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") als repräsentative C3 bzw. C4 Pflanzen auswählen. Züchten Sie beide Pflanzenarten in einer umweltkontrollierten Wachstumskammer aus Samen.
  2. Halten Sie die relative Luftfeuchtigkeit bei 55 % und die Lufttemperatur bei 25 °C/18 °C (Tag/Nacht) mit einer Lichtperiode von 12 Stunden. Halten Sie die photosynthetische Photonenflussdichte (Q) an der Pflanzenoberfläche bei 1200 μmol/m2/s, um ihre natürlichen Wachstumsbedingungen darzustellen. Ziehe alle Pflanzen bei einer CO2 -Konzentration von 400 μmol/mol an.
  3. Gießen Sie die Pflanzen jeden 2. Tag mit destilliertem Wasser und düngen Sie 10 Tage nach dem Auflaufen des Sämlings mit Hoaglands Lösung. Ziehen Sie die Pflanzen 60 Tage lang unter den gegebenen Bedingungen an und verwenden Sie vollständig ausgebreitete Blätter für mikroskopische Analysen.

2. Vorbereitung und Sichtung von Freihandsektionen

  1. Wählen Sie von jeder Pflanze 3 reife, nicht seneszente Blätter aus und bewahren Sie sie in destilliertem Wasser auf. Führen Sie mit einer neuen einseitigen Rasierklinge einen Nivellierschnitt durch, um einen rechten Winkel mit der Blattoberfläche zu bilden, um sicherzustellen, dass es sich bei den Abschnitten um Querschnitte handelt, die senkrecht zur Blattoberfläche stehen.
  2. Legen Sie die Blattprobe auf eine Glasplatte auf ein Stück Zahnwachs, um die Probe zu stabilisieren und ein Verrutschen zu vermeiden. Schneiden Sie, indem Sie die Klinge gerade nach unten auf das Blattexemplar bewegen, um sauber durch die Zellen zu schneiden. Bewahren Sie die Querschnitte in destilliertem Wasser auf.
  3. Montieren Sie die Proben auf einem Objektträger, indem Sie sie auf einen Wassertropfen legen und mit einem Glasdeckglas abdecken, um sie mikroskopisch zu betrachten und abzubilden. Vermeiden Sie das Einfangen von Luftblasen.
  4. Betrachten Sie den Objektträger unter einem Compoundlichtmikroskop mit 10- und 20-facher Vergrößerung. Speichern Sie Bilder gemäß der Softwareanleitung zusammen mit dem entsprechenden Maßstab.

3. Vorbereitung von halbdünnen Schnitten

  1. Aus den Zwischenrippenbereichen entlang der Mittelrippe aus Blättern von Z. mays und T. aestivum auf einer Glasplatte wie in Schritt 2.2 Abschnitte von ca. 3 mm x 5 mm Größe aus Blättern von Z. mays und T. aestivum schneiden. Achten Sie darauf, dass die Länge des Schnittabschnitts entlang der Maserung des Blattes verläuft.
  2. Geben Sie das Pflanzenmaterial in eine Spritze mit 1 mL Fixierpuffer (4 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH = 6,9, Tabelle 1).
  3. Halten Sie die Spritze senkrecht, entfernen Sie die Luft und pumpen Sie die Spritze mit einem Finger auf die Spitze, um ein Vakuum zu erzeugen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Proben am Boden der Spritze liegen, was auf eine erfolgreiche Infiltration hinweist.
  4. Füllen Sie den Inhalt der Spritze in ein beschriftetes Glasfläschchen um und lagern Sie ihn 48 Stunden lang bei 4 °C, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren (Tabelle 2).
  5. Entfernen Sie bei jedem Fläschchen vorsichtig das Fixiermittel mit einer Pipette und fügen Sie den Phosphatpuffer hinzu, bis die Probe bedeckt ist. 30 Min. ziehen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
  6. Entfernen Sie den Phosphatpuffer mit einer Pipette und fügen Sie das Osmiumtetroxid (VORSICHT) hinzu, bis die Probe bedeckt ist. Proben und andere organische Stoffe werden schwarz. Verwenden Sie Doppelhandschuhe. 1 Stunde ruhen lassen.
  7. Entfernen Sie die vorherige Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Proben mit destilliertem Wasser. 30 Minuten einwirken lassen Wiederholen Sie diesen Schritt 3x und verwenden Sie Doppelhandschuhe.
  8. Entfernen Sie die vorherige Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Proben mit der 50/50 destillierten Wasser-Ethanol-Lösung. 30 Min. ziehen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit destillierten Wasser-Ethanol-Lösungen der folgenden Reihen: 30/70, 20/80, 10/90 und 2x bei 100 % Ethanol. Proben in einer dieser Lösungen können über Nacht bei 4 °C belassen werden.
  9. Entfernen Sie die vorherige Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Proben mit 1/3 Harz-Ethanol-Lösung. Die Proben auf eine Mischplatte geben und 2 h ziehen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit Harz-Ethanol-Lösungen der folgenden Reihen: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 und 2x bei 100 % Harz. Proben in einer dieser Lösungen können über Nacht bei 4 °C belassen werden.
  10. Decken Sie die Kavitäten einer flachen Einbettungsform (16 Kavitäten, Kavitätenmaße: 14 L x 4,8 B x 3 T (mm)) mit 100% Harz ab und platzieren Sie die Proben an einem Ende der Kavität. Bereiten Sie für jede Probe mit Bleistift geschriebene Papieretiketten vor und platzieren Sie sie am anderen Ende des Hohlraums.
  11. Füllen Sie alle Kavitäten vollständig mit 100 % Harz und richten Sie die Proben und Etiketten aus, wenn sie sich bewegt haben. Decken Sie die Form mit Einbettfolie ab und polymerisieren Sie sie in einem Ofen gemäß den Produktrichtlinien für Acrylharz.
  12. Legen Sie den polymerisierten Block mit der Probe in den Probenhalter des Ultramikrotoms. Schneiden Sie den Block mit einem rauen Glasmesser ab, bis das Gewebe sichtbar wird und überschüssiges Harz entfernt wird.
  13. Schneiden Sie halbdünne Schnitte quer (1 μm) mit einem Glas- oder Diamantmesser. Sammeln Sie die Abschnitte mit einer Impfschlaufe aus Metall von der Wasseroberfläche und legen Sie sie auf einen Objektträger. Trocknen Sie den Objektträger auf einer heißen Platte (60 °C), um die Abschnitte auf dem Glas zu befestigen.
  14. Die fixierten Abschnitte 5 s lang mit Toluidinblau (1%ige wässrige Lösung) einfärben, dann mit destilliertem Wasser abspülen und auf der Heizplatte erneut trocknen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der chemische Fixierungsprozess unter einem Abzug durchgeführt wird. Die Glasmesser sollten regelmäßig ausgetauscht werden, um scharfe Schnitte zu gewährleisten, die Schnitte ohne Risse oder Verformungen ermöglichen.

4. Bildgebung der Proben

  1. Bildgebung von frischen Blattschnitten
    1. Richten Sie das Compoundlichtmikroskop mit der zugehörigen Software gemäß Handbuch ein.
    2. Lege den Objektträger auf die Bühne. Stellen Sie das Okular ein und betrachten Sie den Ausschnitt bei 10x, um einen Überblick zu erhalten, dann bei 20x- und 40x-Objektiven.
    3. Navigieren Sie bei jedem Ziel durch den Live-Kanal, konzentrieren Sie sich auf den interessierenden Bereich und lokalisieren Sie die Bündelscheidenzellen um die Vene.
    4. Sobald Sie fokussiert sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Einfrieren und fügen Sie die Skala hinzu, indem Sie auf der Registerkarte Werkzeuge auf die Schaltfläche Maßstabsleiste klicken. Speichern Sie das Bild in . TIF-Format für die Bildanalyse.
  2. Bildgebung von harzinfiltrierten Abschnitten
    1. Richten Sie das automatisierte Lichtmikroskop in Verbindung mit der dazugehörigen Software auf dem Computer ein.
    2. Laden Sie den transparenten Kanal und legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Fokussieren Sie sich mit einer 40-fachen Objektivvergrößerung auf den Ausschnitt und passen Sie die Helligkeit so an, dass alle Zellstrukturen sichtbar sind.
    3. Legen Sie den Positionsbereich des Schnitts mit der Navigatorfunktion fest, um sicherzustellen, dass der gesamte Schnitt abgebildet wird, und klicken Sie auf die Schaltfläche Heften .
    4. Klicken Sie auf Fertig und dann auf Start , damit das Mikroskop den gesamten Schnitt abbilden kann. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware und öffnen Sie die Kacheln, die vom Mikroskop aufgenommen wurden.
    5. Stellen Sie mithilfe der Funktion Ausrichten sicher, dass sich die Kacheln nicht überlappen. Passen Sie nach dem Generieren des Bildes die Positionierung, Helligkeit und Drehung auf der Registerkarte Anpassen an.
    6. Drucken Sie die Skala auf das Bild, bevor Sie sie in speichern. TIF-Format.
  3. Anatomische Messungen mit der ImageJ-Software
    1. Öffnen Sie die ImageJ-Software und laden Sie das Bild, indem Sie es in das Fenster ziehen.
    2. Kalibrieren Sie den Maßstab mit dem Linienwerkzeug wie folgt: Zeichnen Sie eine Linie über die Maßstabsleiste, wählen Sie "Analysieren" > "Maßstab festlegen", ändern Sie den bekannten Abstand in die Länge der Maßstabsleiste und ändern Sie die Längeneinheit in die richtige Einheit.
    3. Messen Sie die prospektive Eigenschaft, indem Sie das Linienwerkzeug auswählen, eine Linie über den Interessenbereich zeichnen und die Taste M drücken.
    4. Wählen Sie für Flächenmessungen das Polygonauswahlwerkzeug aus, und zeichnen Sie um das gewünschte Gewebe herum. Schließen Sie ab, indem Sie die Taste M drücken. Die Messungen werden als Popup-Fenster angezeigt, das zur weiteren Datenanalyse in eine Tabelle kopiert werden kann.

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt die korrekte Ausrichtung für das Schneiden des Blattes sowohl für das frische Schneiden als auch für die Lichtmikroskopie. Das Verfahren zum Schneiden frischer Schnitte mit einem einseitigen Rasiermesser und einem Zahnwachsblatt ist in Abbildung 1B zu sehen. Die daraus resultierenden Schnitte sind in Abbildung 1C dargestellt.

Abbildung 2 zeigt Freihandschnitte repräsentativer Blätter der C3 Pflanze T. aestivum und der C4 Pflanze Z. mays. Um die Vene herum sind Bündelscheidenzellen sichtbar, wobei Mais rundere und grünere Zellen aufweist, was auf ein höheres Vorkommen von Chloroplasten hinweist. Aus diesen Bildern ist es möglich, die Blattdicke und die Gesamtfläche der Bündelscheide zu ermitteln; Eine weitere Charakterisierung des Mesophylls ist mit dieser Methode jedoch nicht möglich.

Abbildung 3 zeigt halbdünne Querschnitte von T. aestivum und Z. mays. Bei dieser Methode sind alle Gewebe des Blattes sichtbar und messbar. Die Anatomie von Kranz ist bei Z. mays offensichtlich, mit Mesophyllzellen, die um die Venen angeordnet sind. Die Bündelscheiden sind vergrößert und mit Chloroplasten gefüllt, die sich insbesondere in Richtung der Mesophyllzellen konzentrieren. Dies ermöglicht einen schnellen Austausch von Metaboliten zwischen Bündelscheidenzellen und Mesophyllzellen. Anhand dieser Bilder wurden die folgenden strukturellen Merkmale der Blätter gemessen: Intervallabstand zwischen kleinen und großen Adern, Durchmesser der Bündelscheide, Gesamtfläche der Bündelscheide, Venenfläche, Anteil der Fläche der Bündelscheidenzellen, Fläche der Bündelscheidenzellen, Venenhäufigkeit innerhalb von 500 μm und Blattdicke. Die Boxplots in Abbildung 4 zeigen den Unterschied in diesen Merkmalen zwischen T. aestivum und Z. mays. Bis auf ein Merkmal, den Venenabstand zwischen großen Venen, unterscheiden sich alle Merkmale bei einem Konfidenzintervall von 95 % mit einem p-Wert < 0,05.

Abbildung 4 zeigt eine Sammlung von Boxplots, die die anatomischen Merkmalsunterschiede zwischen T. aestivum und Z. mays darstellen und die Unterschiede zwischen den Strukturender C3- und C4-Bündelscheiden veranschaulichen. Es gibt einen signifikanten Unterschied zwischen den Intervallabständen zwischen den Pflanzenarten, dem Durchmesser der Bündelscheide (unter gleichen Wachstumsbedingungen), dem Anteil der Bündelscheidenzellen und des nicht-photosynthetischen Materials (d. h. Venen) und der Venenhäufigkeit in einer Schnittbreite von 500 μm - all dies ist ein starker Hinweis darauf, was zwischen der Blattanatomie von C3 und C4 zu erwarten ist.

Abbildung 5 zeigt einige Beispiele für Fehler, die beim Schneiden oder Vorbereiten der Proben auftreten können. Die Blattanatomie in diesen Bildern ist maskiert oder deformiert und daher für die Charakterisierung nicht zuverlässig. Eine Überfärbung mit Toluidinblau kann in Abschnitten auftreten, die mit dem Ultramikrotom geschnitten wurden und in denen die Färbung zu lange verbleibt, wodurch die Zellstruktur verdeckt wird (Abbildung 5A,B). Während des Infiltrationsprotokolls können häufige Fehler auftreten, bei denen das Harz nicht vollständig in das Blattgewebe eindringt (Abbildung 5C,D). Blattquerschnitte, die entlang des Korns geschnitten werden, führen zu länglichen Zellen, in denen die Mesophyll- und Bündelscheidenzellen nicht lokalisiert oder korrekt gemessen werden können (Abbildung 5F,G,H).

Statistische Analysen wurden in R (Version 4.3.1) durchgeführt, um Boxplots zu erstellen. Die anatomischen Merkmale der Blätter wurden in dreifacher Ausfertigung gemessen (3 Blätter pro Pflanze, 3 Pflanzen pro Art).

Aufbau der Blattschnitt-Chromatographie; Extraktion von grünen Pigmenten. Diagramm der Schritte für die Pigmenttrennung.
Abbildung 1: Richtige Methode zum Schneiden von frischen Blattquerschnitten. (A) Die Ausrichtung der Blattabschnitte, um einen Querschnitt zu erhalten. (B) Technik zum Schneiden von Blättern mit einer einseitigen Rasierklinge auf einem Stück flachem Zahnwachs. (C) Die resultierenden Querschnitte erscheinen als dünne Blattsplitter, die bereit sind, auf einen Objektträger montiert und unter dem Mikroskop betrachtet zu werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Querschnittsmikroskopie der Blattstruktur der Pflanzen, 50μm und 100μm Skala, Detail des Gefäßgewebes.
Abbildung 2: Freihändige Schnitte repräsentativer Blätter. (A) Die C3-Pflanze Triticum aestivum (400-fache Vergrößerung); und (B) die C4-Pflanze Zea kann bei (200-facher Vergrößerung) gedeihen . Der Zelltyp wird durch Pfeile angezeigt, wobei V = Vene, BSC = Bündelscheidenzelle und MC = Mesophyllzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Pflanzenanatomiediagramm mit Querschnitt durch das Gefäßbündel mit Markierungen für Gewebe und Strukturen.
Abbildung 3: Halbdünne Querschnitte. (A) Zea mays und (B) Triticum aestivum zeigen die Unterschiede in den Bündelscheiden und Chloroplastenpositionen bei C4 Spezies mit Kranz-Anatomie (A) und C 3-Spezies ohne Kranz-Anatomie (B). Abkürzungen: Tl = Blattdicke, BS = Bündelscheide, SV = kleine Ader, ID = intervenaler Abstand und LV = große Ader. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Boxplots zum Vergleich von T. aestivum und Z. mays mittels T-Test; Zu den Metriken gehören SY-HD, LV-ID und VBA.
Abbildung 4: Boxplots, die den Unterschied in den anatomischen Merkmalen zwischen Triticum aestivum und Zea mays zeigen. (A) Intervallabstand zwischen kleinen Venen, (B) Intervallabstand zwischen großen Venen, (C) Durchmesser der Bündelscheide, (D) Gesamtfläche der Bündelscheide, (E) Venenfläche, (F) Fraktion der Bündelscheidenzellen, (G) Fläche der Bündelscheidenzellen, (H) Venenfrequenz innerhalb von 500 μm und (I) Blattdicke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mikroskopische Aufnahmen von Querschnitten des Pflanzengewebes, die die Zellstruktur und Anatomie hervorheben.
Abbildung 5: Beispiele für häufige Fehler, die bei der Gewebeverarbeitung auftreten können, gekennzeichnet durch rote Pfeile. Überfärbung in Proben, die in LR White Acrylharz (A), Triticum aestivum und (B) Zea mays eingebettet sind; Risse im Harz in Abschnitten, die in Spurrs Epoxidharz eingebettet sind, (C) Ceratozamia robusta und (D) Dioon mejiae; T. aestivum-Freihandschnitte mit (E) Querschnitt und (F) Längsschnitt; Verzerrung bei der Schnitteinteilung aufgrund von schrägen Schnitten bei (G) Annona muricata und (H) Encephalartos villosus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

LösungPräparatLetzter Band
Basis für Puffer 17,12 g Na2HPO4 auflösen. 2H2O in 200 mL destilliertem Wasser200 mL
Basis für Puffer 27,12 g NaH2PO4 auflösen. 2H2O in 200 ml destilliertem Wasser200 mL
Phosphat-PufferlösungMischen Sie 36 mL Base 1, 14 mL Base 2 und 50 mL destilliertes Wasser100 mL
Fixative LösungMischen Sie 9,25 ml 5 % Glutaraldehyd (Achtung: siehe Materialtabelle), 12,5 ml Phosphatpuffer und 28,25 ml destilliertes Wasser. Bei 4 °C lagern.50 mL

Tabelle 1: Rezept für die Fixierlösung.

SchrittBeschreibungDauerWiederholen
1Spülen mit PufferEntfernen Sie vorsichtig das Fixiermittel mit einer Pipette und fügen Sie den Phosphatpuffer hinzu, bis die Probe bedeckt ist. 30 Min. ziehen lassen.30 Minuten3x
2Färbung mit 1 % Osmiumtetroxid(Achtung: siehe Materialtabelle): Den Phosphatpuffer mit einer Pipette entfernen und das Osmiumtetroxid zugeben, bis die Probe bedeckt ist. Proben und andere organische Stoffe werden schwarz. Verwenden Sie Doppelhandschuhe.60 Minuten1
3Spülen der Proben mit destilliertem WasserEntfernen Sie die vorherige Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Proben mit destilliertem Wasser. 30 Min. ziehen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Verwenden Sie Doppelhandschuhe.30 Minuten3 mal
4Infiltration der Ethanol-SerieEntfernen Sie die vorherige Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Proben mit der 50/50 destillierten Wasser-Ethanol-Lösung. 30 Min. ziehen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit destillierten Wasser-Ethanol-Lösungen der folgenden Reihen: 30/70, 20/80, 10/90 und 100 % Ethanol.30 Minuten1
5Infiltration der Harz-Ethanol-SerieEntfernen Sie die vorherige Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Proben mit 1/3 Harz-Ethanol-Lösung. Die Proben auf eine Mischplatte geben und 2 h ziehen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit Harz-Ethanol-Lösungen der folgenden Serien: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 und 100 % Harz.ca. 120 Minuten1
6Vor der Polymerisation 72 h im Kühlschrank aufbewahren
7Polymerisieren Sie infiltrierte Blattschnitte gemäß den Produktspezifikationen, um in Harz eingebettete Proben zu erhalten.

Tabelle 2: Protokoll zur Harzinfiltration.

Diskussion

In diesem Artikel diskutieren wir sowohl die quantitativen als auch qualitativen Methoden zur Messung der Blattanatomie und Möglichkeiten, wie sie optimiert werden können. Darüber hinaus wird die Methodik auf repräsentative Kulturpflanzenarten angewendet, um zu bestimmen, welche anatomischen Merkmale für die Unterscheidung zwischenC3 - undC4-Querschnitten am nützlichsten sind. Das Verständnis dieser Merkmale ist von entscheidender Bedeutung, da Hybridarten, die alsC2-Photosynthese bezeichnet werden, zu einem vielversprechenderen Forschungsgebiet werden. Bisher wurde nur eine Kulturpflanzenart, Diplotaxis tenuifolia (Rucola), identifiziert, die C2 -Photosynthese nutzt, aber es ist wahrscheinlich, dass es mehr gibt als das, was die aktuellen Aufzeichnungen vermutenlassen 25. Ein hohes Maß an intraspezifischer photosynthetischer Diversität und Plastizität ist innerhalb der C2-Linien vorhanden. Dies impliziert, dass die Bestätigung des Auftretens der C2 -Photosynthese mehrere Beweislinien erfordert, wie z. B. den CO2 -Kompensationspunkt, ultrastrukturelle Analysen und Immunhistochemie30.

Freihand- und halbdünne Schnitte werden seit vielen Jahren zur Identifizierung und Vermessung spezifischer Pflanzengewebe verwendet, aber dieser Artikel zielt darauf ab, den speziellen Anwendungsfall anatomischer Blattstrukturen zu diskutieren, die die photosynthetische Differenzierung zwischen C3 - und C4-Kulturpflanzen beeinflussen. Es gibt Vorbehalte sowohl für das freihändige als auch für das halbdünne Schneiden, die berücksichtigt werden sollten. Freihändige Schnitte sind zwar schnell zu erhalten, führen aber wahrscheinlich zu Blattschnitten mit ungleichmäßigen Dicken, was quantitative Analysen erschwert. Dies kann durch den Einsatz spezieller Geräte für die Sektion von frischem Pflanzenmaterial (z. B. Vibratom oder Kryostat) vermieden werden. Die dickeren Schnitte beim Handschnitt können dazu führen, dass mehrere Zellschichten übereinander liegen, wodurch die Zellen und damit die Anatomie verschwimmen. Wenn der Zweck des Schneidens rein qualitativer Natur ist, bieten Freihandschnitte den Vorteil der chemischen Verarbeitung von Pflanzengeweben (d. h. Histochemie)31. Dies ermöglicht die qualitative Indikation des Vorhandenseins bestimmter Verbindungen in Pflanzenzellen. Umgekehrt ergeben halbdünne Schnitte fast immer gleichbleibend dicke Schnitte. Die Prozesse sind jedoch länger, filigran und damit fehleranfällig. Probleme, die auftreten können, sowie Möglichkeiten, sie zu vermeiden, werden weiter diskutiert.

Befestigend
Sowohl für freihändige als auch für halbdünne Schnitte muss frisches Material verwendet werden, d.h. Blätter von Pflanzen, die ausreichend mit Feuchtigkeit versorgt sind. Schnitte aus welken Blättern haben keine strukturelle Integrität, da die Zellen einen verringerten Turgordruck aufweisen. Bei der Herstellung von halbdünnen Schnitten aus in Harz eingebettetem Material ist es wichtig sicherzustellen, dass die Blattabschnitte unter einem Vakuum fixiert werden, um die Luft im Inneren des Flügels zu ersetzen. Dies ermöglicht die strukturelle Integrität und Osmose während des Infiltrationsprozesses. Wenn dieser Schritt nicht korrekt durchgeführt wird, ist es wahrscheinlich, dass die Zellen kollabieren, was zu Querschnitten führt, die die reale Blattstruktur nicht genau abbilden, und in der Folge zu falschen anatomischen Messungen32.

Umgekehrt kann ein hoher Vakuumdruck Blätter mit Weichteilen (wie Keimblättern) beschädigen, was zu geschrumpften Zellen oder zur Zerstörung der Proben führt. Dies kann vermieden werden, indem eine geeignete Einstellung der Vakuumpumpe verwendet wird oder indem Sie sie ganz überspringen und die Proben einfach in der Fixierlösung einweichen. Wenn letzteres bevorzugt wird, können die Proben an allen Seiten geschnitten werden, um das Eindringen des Fixiermittels in das Gewebe zu erleichtern.

Vor der Versickerung
Die Dicke der Zellwand und das Skleroidgewebe sind die einflussreichsten anatomischen Merkmale für die Permeation von Lösungen, die eine optimale Fixierung und Infiltration der Probe ermöglichen. Der Zweck von Skleroiden im Pflanzengewebe ist die mechanische Unterstützung und der Schutz, die den Infiltrationsprozess beeinflussen können33. Da diese Gewebe stark verdickte, verholzte Zellwände aufweisen, kann die Permeation von Lösungen behindert werden. Proben, die Infiltrationsprobleme aufweisen, führen zu halbdünnen Schnitten mit gebrochenen Zellen und Rissen im Harz (Abbildung 5C,D). Längsschnitte führen zu verzerrten Zellen, was zu Verzerrungen bei anatomischen Analysen und der Messung von Blattmerkmalen wie Zellgröße und Zelldichte führt (Abbildung 5F-H).

Infiltration von Harz
Eine qualitativ hochwertige Schnittführung ist für die Betrachtung von anatomischem Gewebe von entscheidender Bedeutung, das direkt von dem Medium beeinflusst wird, in das die Probe eingebettet ist. Die gebräuchlichsten Einbettungsmedien, die in der Pflanzenhistologie verwendet werden, sind Paraffinwachs-, Epoxid- und Acrylharze34,35. Das Einbetten von Wachs erfordert die Vorbereitung der Proben durch chemisches Fixiermittel und die Infiltration mit flüssigem Wachs, das bei Raumtemperatur ausgehärtet wird. Diese Schnitte führen in der Regel zu Abschnitten mit einer Dicke von 5-10 μm, die, wie hier gezeigt, genauso gut von Hand erreicht werden können (Abbildung 2) und nur unfixiertes frisches Gewebe erfordern. In diesem Fall ist die Anordnung der Zellen um die Bündelhülle herum entscheidend für die Unterscheidung zwischen C3- und C4-Pflanzen, was die Verwendung eines robusteren und steiferen Einbettungsmediums erfordert. Epoxidharz (Spurr's Resin36) und Acrylharz (LR White) wurden in dieser Studie sowohl auf Härte, Langlebigkeit, Probeninfiltration als auch auf die Haltbarkeit der Schnitte getestet. Epoxidharz wird seit Jahrzehnten bei der Einbettung von biologischem Material eingesetzt37. Acrylharze sind relativ neu und wurden ursprünglich aufgrund ihrer Elastizität im Laufe der Zeit für die Einbettung von Pflanzenproben in Betracht gezogen, da sie sich im Gegensatz zu Epoxidharzen nicht durch UV-Einwirkung verfärben und weniger anfällig für Schrumpfung sind38. LR White Acrylharz (harte Qualität) wurde aufgrund seiner ungiftigen und UV-stabilen Formel ausgewählt. Acrylharze sind in der Regel deutlich weniger viskos als Epoxidharze, was eine schnellere Infiltration der Probe ermöglicht, und die Härte des Materials ermöglicht ein saubereres Schneiden mit einem Mikrotom39. Abbildung 5C,D zeigt die Ergebnisse von Epoxidharz in Blattproben mit einer großen Menge an Strukturgewebe, bei denen Risse aufgrund der Weichheit von Epoxidharz im Vergleich zu Acrylharz unvermeidlich sind (Abbildung 3).

Ultramikrotomie
Das Entfernen von überschüssigem Harz kann zu Rissen im Harz führen, die in die Probe eindringen. Um dies zu vermeiden, ist es wichtig, die Dichte und Sprödigkeit des für die Einbettung gewählten Harzes zu berücksichtigen. Wenn Sie tiefer in den Abschnitt schneiden, sollten Artefakte vermieden werden, die durch Hand- oder grobes Trimmen des Messers verursacht werden. Die Probe sollte senkrecht zum Probenhalter ausgerichtet und durch Erhöhen der Vergrößerung durch das Okular sowie durch Betrachten eines festen und gefärbten Abschnitts validiert werden. Pflanzenzellen, die nicht im perfekten rechten Winkel geschnitten sind, erscheinen als konische Zellen, wobei ein Ende größer ist als das andere40.

Nachfärbung
Toluidinblau (1 % in wässriger Lösung) wurde verwendet, um halbdünne Schnitte zu färben, die auf dem Ultramikrotom geschnitten wurden. Wenn der Fleck zu lange auf dem Schnitt trocknen gelassen wird, führt dies zu einer Überfärbung, die zu einer Übersättigung des Schnitts bei der Aufnahme führt (Abbildung 5A). Wenn der Fleck nicht gut gefiltert wird, führt dies dazu, dass ungelöste Partikel auf dem Schnitt trocknen und die Visualisierung der anatomischen Strukturen behindern (Abbildung 5B). Dieses Problem kann vermieden werden, indem bei der Herstellung von Toluidinblau-Lösung ein feiner Filter verwendet wird und die Exposition des Abschnitts gegenüber dem Fleck begrenzt wird. Die Proben werden vor dem Färben auf einer Heizplatte bei 60 °C getrocknet, um sicherzustellen, dass der Schnitt mit dem Glasobjektträger verbunden ist, sollten jedoch nicht länger als 10 s Toluidinblau ausgesetzt werden, bevor sie gespült und erneut getrocknet werden41.

Überlegungen zu anatomischen Messungen
Die in dieser Arbeit gezeigten Messungen sind nur ein Beispiel für die vielen anatomischen Merkmale, die mit Hilfe von halbdünnen Schnitten quantitativ beurteilt werden können, einschließlich eines Teils des interzellulären Luftraums, der durchschnittlichen Mesophylldicke (ohne Gefäßgewebe) und der Mesophylloberfläche, die den interzellulären Lufträumen pro Einheit der Blattflächeausgesetzt ist 42. Während jedoch die Größe der Bündelscheidenzellen ein wichtiger Indikator für die Unterscheidung zwischen demC3- und demC4-Stoffwechsel ist, ist die Wanddicke der Bündelscheidenzellen ein weiteres wichtiges Merkmal, das allein anhand der Lichtmikroskopie nicht betrachtet werden kann, da sie den Grad der Undichtigkeit der Bündelscheidenzellen bestimmt, d.h. die Menge an CO2, die in die Mesophyllzellen zurückdiffundiert42, 43. Urheberrecht Eine hohe Leckage verringert die photosynthetische Effizienz, da ein großer Teil der Energie, die für die CO2 -Fixierung durch PEP-Carboxylase verwendet wird, verloren geht 44,45,46. Für solche Ultrastrukturanalysen sind Transmissionselektronenmikroskopie und Bildanalysen erforderlich. Obwohl für die vorliegende Studie nur die Lichtmikroskopie in Betracht gezogen wurde, beinhaltet das Protokoll die Behandlung mit Osmiumtetroxid, einem Kontrast- und Fixiermittel, das ein Eckpfeiler der TEM-Mikroskopie ist. Polymerisierte Proben können somit bei Bedarf auch dann für die TEM-Analyse verwendet werden, wenn dies bei der Vorbereitung nicht berücksichtigt wird.

Obwohl die anatomische Diagnose Kranz-ähnliche Strukturen leicht nachweisen kann, kann das Vorhandensein von C4 auch durch Gasaustauschmessungen diagnostiziert werden, die eine typische C4-Physiologie zeigen können, d.h. einen niedrigen CO2 -Kompensationspunkt, eine begrenzteO2 -Hemmung der Photosynthese und eine unterschiedliche Kohlenstoffisotopenzusammensetzung 2,4,47.

Es sollte auch beachtet werden, dass die Kranz-Anatomie für die Entwicklung der C 4-Photosynthese nicht notwendig ist, wie die Entdeckung einzelliger C4-Pflanzen zeigt 48,49,50. Eine anatomische Analyse allein reicht daher möglicherweise nicht aus, um die Physiologie von C4 in weniger untersuchten Taxa nachzuweisen. Die Kopplung von anatomischer Charakterisierung mit physiologischer Analyse bietet leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung von Blattmerkmalen und ihrer Struktur-Funktions-Beziehung sowohl bei Kulturpflanzen als auch bei Wildpflanzen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Die Autoren erkennen das H2020-Programm der Europäischen Union an (Projekt GAIN4CROPS, GA Nr. 862087). Das Kompetenzzentrum AgroCropFuture Agrarökologie und neue Kulturpflanzen in zukünftigen Klimazonen wird vom estnischen Ministerium für Bildung und Forschung finanziert. Wir danken Professor Evelin Loit-Harro für die Bereitstellung von Samen von T. aestivum und Z. mays, Paula Palmet und Vaiko Vainola für ihre Unterstützung bei der Erstellung von Blattquerschnitten und João Paulo de Silva Souza für die Unterstützung bei der Analyse. Alle Bilder wurden von der Mikroskopie-Abteilung der Estnischen Universität für Biowissenschaften im Rahmen verschiedener Projekte gewonnen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO42H2O) reinesPENTA, CZ10028-24-7
Einbettfolie, 7,8 mil dick, 8 x 12,5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
Ethanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Gefahr: Flüssigkeit und Dampf leicht entzündlich.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 BildgebungssystemThermo Fisher Scientific, US
Flacheinbettende PTFE-Form mit Metallrahmen, 16 KavitätenPELCO, US10501
Glasfläschchen 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldehyd 50% ige LösungVWR Life Science, US23H2856331Gefahr: Bei Einatmen tödlich. Giftig beim Verschlucken. Verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden. Kann Atemwegsreizungen verursachen. Tragen Sie Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augen- und Gesichtsschutz.
Histo DiamantmesserDiatomee, US
LEICA EM UC7Leica Wien, AT
LR Weißes Harz harte QualitätElektronenmikroskopie Sciences, US14383Gefahr: Verursacht Hautreizungen. Verursacht schwere Augenreizungen Kann zu Reizungen der Atemwege führen. Kann Schläfrigkeit oder Benommenheit verursachen Tragen Sie Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augen- und Gesichtsschutz.
ObjektträgerNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 und Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Gefahr: Lebensgefahr bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. Verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden Tragen Sie doppelte Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augen- und Gesichtsschutz.
Pipetten- und PipettenspitzenThermo Scientific, FIKJ16047
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat (NaH2PO4 . 2H2O) reinesPENTA, CZ13472-35-0
Spritze 10 mlEcoject, DE20010
Toluidinblau, AllzweckqualitätFisher Scientific, GB2045836

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